Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Grzyby strzępkowe są skutecznymi mieszkańcami gleby i odgrywają główną rolę w ekosystemach glebowych, takich jak rozkład materii organicznej i nieorganicznej, a także regulacja poziomu składników odżywczych. Znajdują tam również wiele możliwości interakcji z wieloma innymi drobnoustrojami, takimi jak bakterie lub inne grzyby. Badanie interakcji grzybów na poziomie komórkowym może być jednak trudne ze względu na przypominającą czarną skrzynkę naturę gleby. Opracowywane są nowe narzędzia mikroprzepływowe do badania oddziaływań grzybów; Wyróżniono dwie platformy przeznaczone do badania interakcji bakteryjno-grzybowych i grzybowo-grzybowych. W obrębie tych mikrokanałów interakcje grzybowo-mikrobiologiczne mogą być monitorowane w kontrolowanych środowiskach fizykochemicznych przy wyższej rozdzielczości czasowej i przestrzennej niż było to wcześniej możliwe. Zastosowanie tych narzędzi przyniosło wiele nowych informacji biologicznych, takich jak obserwacja polarnego przyczepiania się bakterii do strzępek lub ujawnienie niescharakteryzowanych antagonizmów grzybów. Kluczową cechą tych metodologii jest łatwość użycia tego narzędzia przez osoby niebędące ekspertami, co pozwala na opracowanie wysoce przekładalnych technologii do wykorzystania w laboratoriach mikrobiologicznych.
Wprowadzenie
Gleba jest wyjątkowo zróżnicowanym środowiskiem, zawierającym obfitość mikroorganizmów, które odgrywają kluczową rolę w cyklach węgla i fosforu1,2. Grzyby nitkowate stanowią główny składnik wielu ekosystemów jako destruenci materii organicznej i nieorganicznej oraz mogą poprawiać odżywianie roślin poprzez tworzenie relacji symbiotycznych3,4. W glebie grzyby wchodzą w dynamiczne interakcje z wieloma mikrobami, takimi jak inne grzyby5, bakterie6, wirusy7 i nicienie8....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Podsumowanie procedur opisanych w niniejszym protokole zostało przedstawione graficznie na Ryc. 2.
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie zaprezentowanej metodologii, składającej się z pięciu głównych sekcji szczegółowo opisanych w niniejszym protokole. Projekty urządzeń są tworzone przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), a forma główna jest wytwarzana metod....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu egzemplarzowych urządzeń BFI40 oraz FFI41. Pomiary tempa wzrostu strzępek można łatwo przeprowadzić za pomocą tych urządzeń w połączeniu z podstawowymi technikami mikroskopowymi. Rysunek 3A-B ilustruje interakcje bakteryjno-grzybowe między strzępkami C. cinerea a B. subtilis NCIB 3610. Obecność B. subtilis hamuje wzrost C. .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono protokół badania oddziaływań grzybowo-mikrobiologicznych z wykorzystaniem mikrofluidyki kanałowej. Autorzy dążą do wykazania wszechstronności tych urządzeń i zachęcają do adaptacji do zainteresowań badacza. Korzystając z przykładowych urządzeń BFI i FFI, można badać interakcje grzybowo-mikrobiologiczne bardziej szczegółowo niż było to wcześniej dostępne. Usuwając złożoność tła i niejednorodność gleby, moderując wzrost strzępek w taki sposób, że są one ograniczone do jednej warstwy i ściśle regulu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Wydziału Bioinżynierii w Imperial College London oraz The Leverhulme Trust (Numer grantu badawczego: RPG-2020-352).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Służy do zestalania pożywki hodowlanej do hodowli bakterii i grzybów na szalkach Petriego |
| Folia aluminiowa | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoklaw (VX-75) | Systec | ||
| (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimetysilan | Merck Life Sciences | 386529 | UWAGA: Chlorotrimetylosilian jest substancją niebezpieczną. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz zapobiegać wdychaniu. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu i używać w dobrze wentylowanym miejscu. |
| Świder korkowy | SLS | COR1000 | |
| Rozwiązanie deweloperskie (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | UWAGA: roztwór wywoływacza mr-Dev 600 jest łatwopalny | |
| Kolby Erlenmeyera | VWR | 214-1108 | np. 200 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb |
| Etanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Rozcieńczony od 99,8% (klasa odczynnika analitycznego) |
| Fiji | ImageJ | Przykładowy pakiet oprogramowania do przetwarzania obrazowania | |
| Filtrowane, sprężone powietrze | Dostępne w standardzie w większości laboratoriów. Alternatywnie można zastosować sprężarkę bezolejową z regulatorem powietrza. | ||
| Pęseta waflowa z płaską | główką SLS | INS5026 | |
| Kleszcze | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Wygięta, ostra |
| Szalka Petriego ze szklanym dnem | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Szalka Petriego ze szklanym dnem | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Szklane naczynia krystalizacyjne | VWR | 216-1865 | Używany do mycia płyt PDMS |
| Szklane naczynia krystalizacyjne | VWR | 216-1866 | Stosowane przy opracowywaniu form wzorcowych |
| Szklane butelki na podłoża | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | np. 250 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb |
| Szklana strzykawka (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Służy do dozowania chlorotrimetylosilianu |
| Płyta grzejna (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Pętla inokulacyjna | VWR | COPA175CS01 | |
| Alkohol izopropylowy | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Okap z przepływem laminarnym | Air Science (PCR) | Przykładowy okap z przepływem laminarnym używany do produkcji urządzeń | |
| Pożywka LB | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Przykładowy bulion odżywczy do nocnej hodowli |
| bakteriiSilnik świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Przykładowe źródło światła, które można wykorzystać do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych (fluorescencja) | |
| MA6 Nakładka na maskę ultrafioletową | Suss Microtec | ||
| Ekstrakt słodowy | VWR | 84618 | Służy do produkcji przykładowej pożywki do hodowli grzybów (agar z ekstraktem słodowym) |
| Pisarz masek | Materiały stosowane | 4700DP | Przykład edytora masek, który można wykorzystać do wydrukowania maski fotograficznej do fotolitografii |
| Uchwyt z tworzywa sztucznego | Uchwyt drukowany na zamówienie w 3D wyprodukowany na zamówienie | ||
| Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego (BioMat2) | z zamkniętym powietrzem | MSC używany do hodowli drobnoustrojów i inokulacji urządzeń | |
| Woda | Dostępne w standardzie w laboratoriach biologicznych. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| Oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements Advanced Research | Pakiet oprogramowania Nikon | Exemplar do akwizycji obrazów | |
| NIS-Elements Free Viewer | Pakiet oprogramowania Nikon | Exemplar do przeglądania pozyskanych obrazów | |
| Piekarnik (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Służy do utwardzania poli(dimetylosiloksan)(PDMS) |
| Piekarnik (CLO-2AH-S) | KOYO | Służy do przygotowania wafli krzemowych | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | |
| szalki Petriego z folii, kwadratowe sterylne | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | szalki Petriego 120,5 mm |
| , sterylne | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Maska fotolitograficzna | Micro Lithography Services Ltd. Wielka Brytania | ||
| Odkurzacz plazmowy (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Kubek plastikowy | Semadeni | 8323 | |
| Szpatułka plastikowa | Semadeni | 3340 | |
| Przenośna waga precyzyjna (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Służy do ważenia PDMS, media komponenty itp. |
| Nóż precyzyjny | Syneo | HS1251135P1183 | Średnica krawędzi tnącej: 3,18 mm |
| Nóż precyzyjny | Syneo | HS1871730P1183S | Średnica krawędzi tnącej: 4,75 mm |
| Profilometr | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Żyletki | Hä berle Labortechnik | 9156110 | |
| Lodówka | Haden | 4-6 ° C | |
| Kamera CCD Retiga R1 | Qimaging | Przykładowa kamera, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych | |
| Magiczna taśma klejąca | Office Depot | 3969954 | 19 mm niewidoczna taśma; przezroczysta taśma |
| Inkubator wstrząsający (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Wafel krzemowy | Inseto | 100 mm | |
| Szkło sodowo-wapniowe płytka | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Służy do mocowania maski fotolitograficznej w nakładce | |
| maski Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 fotorezystor | MicroChem | UWAGA: Fotorezystor SU-8 jest niebezpieczny, należy zachować ostrożność podczas obsługi i unikać wdychania i kontaktu ze skórą. Łatwopalny, potencjalnie rakotwórczy i toksyczny dla środowiska. | |
| Zestaw elastomerów Sylgard 184 | VWR | 634165S | Służy do przygotowania urządzeń z poli(dimetylosiloksanu)(PDMS) |
| Inkubator z kontrolowaną temperaturą | Inkubator Okolab | Exemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych | |
| Mikroskop odwróconej epifluorescencji Ti2-E | Mikroskop Nikon | MEA54000 | Exemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych |
| Myjka ultradźwiękowa S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Eksykator próżniowy | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Odgazowanie silianizacji i PDMS należy przeprowadzać w oddzielnych eksykatorach |
| x10/0,3 NA Soczewka obiektywowa CFI Plan Fluor DL | Nikon | MRH20105 | Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych |
| x20/0,45 NA CFI Plan Fluor DL soczewka obiektywowa | Nikon | MRH48230 | Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych |
Bibliografia
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial fun....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
