Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63917

⸱

23 czerwca 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Streszczenie

Grzyby strzępkowe są skutecznymi mieszkańcami gleby i odgrywają główną rolę w ekosystemach glebowych, takich jak rozkład materii organicznej i nieorganicznej, a także regulacja poziomu składników odżywczych. Znajdują tam również wiele możliwości interakcji z wieloma innymi drobnoustrojami, takimi jak bakterie lub inne grzyby. Badanie interakcji grzybów na poziomie komórkowym może być jednak trudne ze względu na przypominającą czarną skrzynkę naturę gleby. Opracowywane są nowe narzędzia mikroprzepływowe do badania oddziaływań grzybów; Wyróżniono dwie platformy przeznaczone do badania interakcji bakteryjno-grzybowych i grzybowo-grzybowych. W obrębie tych mikrokanałów interakcje grzybowo-mikrobiologiczne mogą być monitorowane w kontrolowanych środowiskach fizykochemicznych przy wyższej rozdzielczości czasowej i przestrzennej niż było to wcześniej możliwe. Zastosowanie tych narzędzi przyniosło wiele nowych informacji biologicznych, takich jak obserwacja polarnego przyczepiania się bakterii do strzępek lub ujawnienie niescharakteryzowanych antagonizmów grzybów. Kluczową cechą tych metodologii jest łatwość użycia tego narzędzia przez osoby niebędące ekspertami, co pozwala na opracowanie wysoce przekładalnych technologii do wykorzystania w laboratoriach mikrobiologicznych.

Wprowadzenie

Gleba jest wyjątkowo zróżnicowanym środowiskiem, zawierającym obfitość mikroorganizmów, które odgrywają kluczową rolę w cyklach węgla i fosforu1,2. Grzyby nitkowate stanowią główny składnik wielu ekosystemów jako destruenci materii organicznej i nieorganicznej oraz mogą poprawiać odżywianie roślin poprzez tworzenie relacji symbiotycznych3,4. W glebie grzyby wchodzą w dynamiczne interakcje z wieloma mikrobami, takimi jak inne grzyby5, bakterie6, wirusy7 i nicienie8. Interakcje te mają istotne konsekwencje dla zdrowia gleby i roślin. Jednak ze względu na brak odpowiednich systemów eksperymentalnych zdolnych do obrazowania oddziałujących ze sobą mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością, wiele z nich pozostaje nieokreślonych.

Badania nad oddziaływaniami bakteria-grzyb (BFIs) oraz grzyb-grzyb (FFIs) znajdują cenne zastosowania w wielu dziedzinach, w tym w opracowywaniu środków przeciwdrobnoustrojowych w medycynie oraz biologicznych środków ochrony roślin w rolnictwie. Na przykład grzyb Coprinopsis cinerea produkuje peptyd copsynę, która wykazuje aktywność przeciwbakteryjną wobec ludzkiego patogenu Listeria monocytogenes9. Podobnie związek pochodzenia grzybowego, griseofulwina, jest powszechnie stosowany w leczeniu grzybic u ludzi i dodatkowo potrafi hamować wzrost fitopatogennego grzyba Alternaria solani10,11. Wykazano również, że kilka szczepów bytującej w glebie bakterii Bacillus subtilis stanowi skuteczne biologiczne środki kontroli grzybowego patogenu roślin Rhizoctonia solani12,13. Niemniej jednak, ze względu na ograniczenia związane z tradycyjnymi metodologiami, BFIs i FFIs są słabo poznane na poziomie pojedynczych komórek.

Konwencjonalne badania zazwyczaj analizują BFIs i FFIs w skali makro, wykorzystując płytki agarowe z dwoma lub więcej gatunkami w konfrontacji. Ich oddziaływanie ocenia się poprzez pomiar tempa wzrostu i produkcji metabolitów konfrontujących gatunków14,15,16; jednak metodologia ta ma rozdzielczość ograniczoną jedynie do poziomu kolonii. Aby badać interakcje na poziomie komórkowym, inokulaty bakteryjne i grzybowe można hodować na szklanych szkiełkach przedmiotowych pokrytych agarem, które następnie obrazuje się pod mikroskopem17. Niemniej jednak, śledzenie pojedynczej strzępki przy użyciu szkiełek przedmiotowych może być trudne ze względu na brak ograniczenia przestrzennego, co sprawia, że trudniej jest uzyskać obrazy time-lapse. Ponadto w takich układach nie ma możliwości przestrzennego ograniczenia innych mikroorganizmów w określonych obszarach grzybni lub stworzenia zdefiniowanych środowisk chemicznych, które można by na przykład modyfikować. Natura gleby jako „czarnej skrzynki” dodatkowo komplikuje badanie interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie pojedynczych komórek18. Obserwując oddziałujące gatunki w izolacji od ogromnej różnorodności mikrobiomu glebowego, można ocenić dokładny sposób interakcji poszczególnych członków. Zatem istnieje stałe zapotrzebowanie na wszechstronne platformy umożliwiające obrazowanie BFIs i FFIs na poziomie pojedynczych komórek z wysoką rozdzielczością.

Technologie mikroprzepływowe, tzw. systemy lab-on-a-chip, stanowią idealną platformę do badania BFIs i FFIs na poziomie pojedynczych komórek. Dziedzina mikroprzepływów, wywodząca się z technologii opracowanych dla analizy chemicznej i mikroelektroniki, została zaadaptowana przez nauki biologiczne19. Technologie mikroprzepływowe regulują małe objętości płynów w ramach specjalnie zaprojektowanej sieci zminiaturyzowanych kanałów, posiadających co najmniej jeden wymiar w skali mikrometrów, a ich zastosowanie w badaniach biologicznych stale rośnie20. W szczególności opracowano urządzenia mikroprzepływowe do badania wzrostu grzybów nitkowatych21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Jedną z zalet stosowania tej technologii jest fakt, że ograniczenie strzępek oraz rozkład składników odżywczych w mikrokanałach bardziej przypominają strukturę środowiska glebowego niż konwencjonalne metody na agarze31. Niedawno platformy mikroprzepływowe wykorzystano do badania oddziaływań między ludzkimi neutrofilami a patogenami grzybiczymi32, bakteriami a korzeniami roślin33, a także grzybami i nicieniami34,35.

Jedną z wielu zalet wykorzystania mikrofluidyki do badania oddziaływań mikrobiologicznych jest możliwość precyzyjnej kontroli środowiska w mikrokanale. Na przykład przepływy laminarne mogą być wykorzystane do generowania określonych gradientów stężeń, co jest szczególnie przydatne podczas badania chemotaksji bakteryjnej36. Inną zaletą jest to, że przezroczystość poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), niedrogiego, biokompatybilnego polimeru elastomerycznego powszechnie stosowanego w produkcji urządzeń mikrofluidycznych, ułatwia obrazowanie pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii w świetle przechodzącym i fluorescencyjnej37. Podobnie, ograniczenie mikroorganizmów w obrębie mikrokanałów umożliwia przeprowadzanie eksperymentów typu time-lapse z monitorowaniem pojedynczych komórek, co pozwala na rejestrację i kwantyfikację indywidualnych odpowiedzi komórkowych37. Wreszcie, ponieważ urządzenia mikrofluidyczne mogą być projektowane w sposób intuicyjny, mogą być one z łatwością wykorzystywane przez osoby niebędące ekspertami w tej dziedzinie38.

Pogłębianie wiedzy na temat oddziaływań między mikroorganizmami glebowymi jest istotne dla usprawnienia zrównoważonych praktyk zarządzania ekosystemami, które utrzymują bioróżnorodność i łagodzą wpływ zmian klimatu na środowiska lądowe39. W związku z tym opracowanie nowych narzędzi mikrofluidycznych jest kluczowe dla rozszerzenia rozumienia grzybów i ich oddziaływań na poziomie komórkowym. Niniejszy protokół koncentruje się na dwóch urządzeniach mikrofluidycznych stworzonych do badania BFIs40 oraz FFIs41 , przedstawionych na Rysunku 1.

figure-introduction-1
Rycina 1: Przedstawienie wizualne i schematyczne urządzeń do badania interakcji bakterio-grzybowych (BFI) oraz interakcji grzybowo-grzybowych (FFI). (A) Zdjęcie urządzenia BFI. Korek z grzybnią jest umieszczany przy wlocie na jednym z końców mikrokanałów, aby umożliwić wzrost strzępek do wnętrza urządzenia. Wlot bakterii znajduje się na przeciwległym końcu. Pasek skali = 5 mm. (B) Schematyczny przegląd urządzenia BFI, przedstawiający rozmieszczenie wlotów bakterii oraz kierunek wzrostu strzępek przez mikrokanały interakcyjne. Kanały mają głębokość 10 µm, szerokość 100 µm i długość 7 mm; łącznie znajduje się 28 kanałów obserwacyjnych. (C) Test konfrontacyjny na płytce z agarem pomiędzy Coprinopsis cinerea a Bacillus subtilis NCIB 3610, pasek skali = 20 mm (lewo). Zdjęcia mikroskopowe pokazujące interakcję między C. cinerea a B. subtilis NCIB 3610 wewnątrz mikrokanału (środek i prawo), tzn. polarne przyleganie bakterii do strzępek grzyba. Pasek skali = 25 µm (środek) i 10 µm (prawo). (D) Zdjęcie urządzenia FFI przyklejonego do szalki Petriego z szklanym dnem, z podwójnym inokulum w postaci korków z grzybnią. Pasek skali = 1 cm. (E) Schematyczny przegląd urządzenia FFI. Dwa korki z inokulum grzybowym są wprowadzane do wlotów na obu końcach urządzenia, co umożliwia eksplorację mikrokanałów przez strzępki. Kanały kontrolne są połączone tylko z jednym wlotem grzybowym i kończą się ślepo, co zapobiega interakcjom między badanymi grzybami. Kanały interakcyjne łączą oba wloty grzybowe i umożliwiają interakcje strzępek między badanymi organizmami wewnątrz mikrokanału. Każdy kanał interakcyjny składa się z 18 sekcji w kształcie rombu o całkowitej długości 8,8 mm (490 x 430 µm na romb), głębokości 10 µm i obszarach łączących pomiędzy każdym rombem o szerokości 20 µm. Typy kanałów są powielone, paski skali = 1 mm. (F) Strefa interakcji między dwoma zbliżającymi się frontami strzępek, rosnącymi z przeciwległych końców połączonego kanału interakcyjnego. Zdjęcie z mikroskopii kontrastowej, pasek skali = 250 µm. Panele na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie Stanley et al., 2014 (A-C)40 oraz Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Podsumowanie procedur opisanych w niniejszym protokole zostało przedstawione graficznie na Ryc. 2.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie zaprezentowanej metodologii, składającej się z pięciu głównych sekcji szczegółowo opisanych w niniejszym protokole. Projekty urządzeń są tworzone przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), a forma główna jest wytwarzana metodą fotolitografii (1). Służy ona do odlewania poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), który następnie jest cięty na płytki i przyklejany do szalek Petriego z szklanym dnem w celu utworzenia urządzeń mikrofluidycznych (2). Mikroorganizmy uwzględnione w badaniu są hodowane (3), a następnie wykorzystywane do inokulacji urządzeń (4). Interakcje są badane za pomocą mikroskopii i kwantyfikowane przy użyciu technik analizy obrazu (5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

1. Wykonanie formy matki

  1. Produkcja fotomasek
    1. Przygotuj projekty urządzeń mikroprzepływowych przy użyciu oprogramowania do wspomaganego projektowania komputerowego (CAD). Wymiary zaprezentowanych urządzeń podano na Rysunku 1, a bardziej szczegółowe informacje na temat konkretnych cech projektu zostały kompleksowo wyszczególnione w odpowiednich publikacjach40,41.
    2. Wyeksportuj plik projektu CAD w odpowiednim formacie (np. .dwg, .dxf). Wydrukuj foliową maskę do fotolitografii, przesyłając wyeksportowany plik projektu CAD do komercyjnego dostawcy usług druku.
  2. Fotolitografia
    UWAGA: Poniższe kroki należy przeprowadzać w środowisku wolnym od kurzu i z kontrolowanym oświetleniem, takim jak komora z laminarnym przepływem powietrza lub pomieszczenie typu clean room. Przedstawione tutaj warunki eksperymentalne mają charakter poglądowy i powinny zostać zoptymalizowane w danym laboratorium. Autorzy zalecają przejście odpowiedniego szkolenia oraz konsultację z uznanymi protokołami42.
    1. Przygotuj 100 mm płytkę krzemową poprzez wypalanie w piecu w temperaturze 200 °C przez 2 h. Na płytkę krzemową nanieś metodą spin-coatingu fotorezyst SU-8 2010, dążąc do uzyskania docelowej grubości 10 µm, stosując następujące warunki: 500 rpm przez 10 s (przyspieszenie 100 rpm/s) oraz 3 000 rpm przez 45 s (przyspieszenie 300 rpm/s).
      OSTRZEŻENIE: Fotorezyst SU-8 jest substancją niebezpieczną; należy zachować ostrożność podczas pracy, zapobiegając wdychaniu i kontaktowi ze skórą. Jest on łatwopalny, potencjalnie rakotwórczy i toksyczny dla środowiska.
    2. Wypal pokrytą płytkę krzemową w temperaturze 95 °C przez 2,5 min (soft bake). Naświetl fotorezyst światłem ultrafioletowym (UV), używając foliowej maski do fotolitografii i dawki energii 140 mJ/cm2 przy długości fali 365 nm za pomocą maskalni.
    3. Wypal pokrytą płytkę krzemową w temperaturze 95 °C przez 3,5 min (post exposure bake). Zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza i mieszaj przez 3 min, aby odsłonić mikrofabrykowane struktury poprzez usunięcie nienaświetlonego fotorezystu.
      OSTRZEŻENIE: Roztwór wywoływacza może być łatwopalny; należy zachować odpowiednie środki ostrożności podczas obchodzenia się z nim i jego przechowywania.
    4. Przepłucz świeżym roztworem wywoływacza przez 10 s. Przepłucz alkoholem izopropylowym przez 10 s i wysusz na powietrzu. Użyj przefiltrowanego sprężonego powietrza, aby upewnić się, że struktury są całkowicie suche. Zmierz wysokość struktur SU-8, na przykład za pomocą profilometru.
    5. Zasilanizuj każdą formę matrycową za pomocą 50 µL chlorotrimetylosilanu, stosując podciśnienie 50 mbar przez 2 h. Autorzy zauważają, że ponowna silanizacja formy matrycowej nie okazała się konieczna.
      OSTRZEŻENIE: Chlorotrimetylosilan jest substancją niebezpieczną. Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE) i obchodzić się z nim ostrożnie. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz zapobiegać wdychaniu. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu i używać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.

2. Fabrykacja urządzenia

UWAGA: Następujące kroki powinny być przeprowadzane w środowisku wolnym od kurzu, np. w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przygotowanie płyt z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS)
    1. Przygotować około 40 g PDMS, dokładnie mieszając bazę i czynnik sieciujący w stosunku 10:1 za pomocą szpatułki w czystym plastikowym kubku. Odgazować mieszaninę w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza, umieszczając plastikowy kubek z PDMS w komorze próżniowej (ciśnienie próżni = 50 mbar) na 1 h.
    2. Zamocować formę matryczną w plastikowym uchwycie za pomocą przezroczystej taśmy. Oczyścić sprężonym filtrowanym powietrzem w celu usunięcia wszelkich cząsteczek kurzu.
      UWAGA: Alternatywnie można uformować folię aluminiową wokół szklanej szalki Petriego, a następnie wykorzystać ją do umieszczenia formy matrycznej i utrzymania PDMS43.
    3. Wlać mieszaninę PDMS na środek formy matrycznej, upewniając się, że znajduje się ona na poziomej powierzchni, i pozostawić do ustabilizowania.
      UWAGA: Mieszaninę PDMS należy wlewać jak najbliżej powierzchni formy matrycznej, utrzymując ciągły przepływ, aby zminimalizować wprowadzanie pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza można usunąć, kierując sprężone powietrze na pęcherzyk lub wybierając je za pomocą cienkiej igły.
    4. Luźno przykryć formę matryczną plastikową pokrywką, aby zapobiec osadzaniu się cząsteczek kurzu na powierzchni PDMS. Przenieść formę matryczną do piekarnika i utwardzać przez noc w temperaturze 70 °C.
    5. Wyjąć formę matryczną z piekarnika i pozostawić do ostygnięcia. Oddzielić utwardzony PDMS od formy matrycznej i plastikowej ramy, uważając, aby nie uszkodzić formy matrycznej/PDMS.
    6. Nakleić przezroczystą taśmę na wytłoczone w PDMS mikrokanały, aby utrzymać powierzchnię wolną od kurzu. Należy upewnić się, że taśma zostanie usunięta przed procesem łączenia.
    7. Wyciąć PDMS na płyty (tj. jeśli projekt na formie matrycznej obejmuje wiele urządzeń, z jednego odlewu można wykonać wiele sztuk) zgodnie z projektem, używając zamontowanej gilotyny lub żyletki. Podczas wycinania bocznego otworu w płycie PDMS BFI należy upewnić się, że mikrokanały są całkowicie otwarte (Rysunek 1A). W przypadku płyty PDMS FFI należy upewnić się, że każdy róg jest przycięty, aby umożliwić dopasowanie do szalki Petriego z szklanym dnem pokazanej na Rysunku 1D.
    8. Wykonać odpowiednie otwory wlotowe/wylotowe zgodnie z projektem urządzenia. Użyć precyzyjnego wycinaka do wykonania otworów wlotowych o średnicy 3,18 mm i 4,75 mm odpowiednio dla przykładowych urządzeń BFI i FFI.
  2. Łączenie płyt PDMS w celu stworzenia urządzeń
    UWAGA: Następujące etapy mycia (2.2.1-2.2.2) wykorzystują myjkę ultradźwiękową wypełnioną wodą oczyszczoną (ddH2O) przy 37 kHz. Mycie płyt PDMS pomaga zwiększyć skuteczność łączenia44 i zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Do manipulowania płytami PDMS należy używać czystej pęsety i podnosić je za otwory wlotowe, aby uniknąć uszkodzenia mikrokanałów lub powierzchni urządzenia.
    1. Zanurzyć płyty PDMS w 0,5 M NaOH i poddać sonikacji przez 5 min. Przepłukać sterylną ddH2O. Przenieść płyty PDMS do 70% roztworu etanolu i poddać sonikacji przez 5 min. Przepłukać sterylną ddH20.
    2. Zanurzyć płyty PDMS w sterylnej ddH2O i poddać sonikacji przez 5 min. Wyjąć płyty PDMS ze sterylnej ddH2O, osuszyć za pomocą filtrowanego sprężonego powietrza i umieścić w sterylnej kwadratowej szalce Petriego.
    3. Umieścić kwadratową szalkę Petriego zawierającą płyty PDMS w piekarniku w temperaturze 70 °C na 1 h w celu osuszenia. Wyjąć z piekarnika i pozostawić do ostygnięcia w środowisku wolnym od kurzu. Usunąć wszelki kurz z powierzchni płyt PDMS za pomocą taśmy i/lub filtrowanego sprężonego powietrza.
    4. Aktywować powierzchnie płyt PDMS i szalek Petriego z szklanym dnem przeznaczonych do łączenia za pomocą oczyszczacza plazmowego przy następujących ustawieniach: ciśnienie próżni 0,75 mbar, moc 50%, czas powlekania 1 min. Umieścić powierzchnie do aktywacji (a następnie połączenia) skierowane do góry w oczyszczaczu plazmowym.
    5. Wyjąć płyty PDMS i szalki Petriego z szklanym dnem z oczyszczacza plazmowego i połączyć, delikatnie przykładając aktywowane powierzchnie do siebie w kontakcie konformalnym. Połączyć płyty PDMS BFI i FFI odpowiednio z szalkami Petriego z szklanym dnem o średnicy 35 mm i 50 mm (grubość szkła 0,17 mm).
      UWAGA: Należy uważać, aby nie przyłożyć zbyt dużego nacisku podczas łączenia, ponieważ może to doprowadzić do zapadnięcia się mikrokanałów.
    6. Sprawdzić poprawność połączenia, próbując po prostu odciągnąć płytę PDMS od szalki Petriego z szklanym dnem za pomocą pęsety. Zwizualizować urządzenia gołym okiem lub za pomocą ogólnej mikroskopii, aby upewnić się, że wloty do inokulacji lub mikrokanały nie uległy zapadnięciu.
      ​UWAGA: W przypadku warunków nasyconych (tj. nasyconych wodą i/lub bogatych w składniki odżywcze) należy uwzględnić krok 2.2.7 protokołu. Jeśli wymagane są warunki nienasycone wodnie, przejść do kroku 2.2.8. Urządzenia można wypełnić wodą lub pożywką.
    7. Wypełnić urządzenia natychmiast po połączeniu, pipetując 100 µL pożądanego roztworu do urządzenia BFI (wlot bakteryjny i otwór boczny) lub 30 µL pożywki do każdego wlotu (łącznie 60 µL) dla urządzenia FFI. Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, znikną one po około 10 min od napełnienia, ponieważ PDMS jest porowaty.
    8. Dodać sterylną ddH2O (~100-200 µL) do szalki Petriego, aby utrzymać wilgotność.

3. Hodowla drobnoustrojów

UWAGA: Poniższe kroki opisują ogólną procedurę mikrobiologiczną dotyczącą hodowli grzybów i bakterii i powinny być one wykonywane w warunkach sterylnych (np. z użyciem palnika lub komory bezpiecznej mikrobiologicznej) odpowiednich dla poziomu zabezpieczeń wymaganego dla danych drobnoustrojów. Na końcu każdej sekcji podano konkretne przykłady dla gatunku będącego przedmiotem zainteresowania.

  1. Kultura grzybów
    1. Przygotować pożądaną pożywkę uzupełnioną o agar. Sterylizować pożywkę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do 50 °C i przelać do szalek Petri o średnicy 9 cm, zachowując warunki sterylne.
    2. Za pomocą wycinaka do korka pobrać krążek agaru o średnicy 4 mm zawierający grzybnię z kolonii szczepu grzyba przechowywanego w lodówce w celu aktywacji izolatu. Czynność tę wykonuje się, aby zapewnić ustandaryzowany i intensywny wzrost grzyba przed inokulacją urządzenia.
      UWAGA: Mikroorganizmy można również aktywować z banku w glicerolu, tzn. izolaty grzybów przechowywane na krążkach agaru w 50% roztworze glicerolu w temperaturze -70 °C41.
    3. Umieścić stronę krążka z grzybnią w kontakcie z powierzchnią agaru w centrum nieinokulowanej szalki Petri. Nałożyć pokrywkę na szalkę Petri i uszczelnić ją przed inkubacją w temperaturze odpowiedniej dla danego szczepu przez wymagany czas, zazwyczaj około 3 do 4 dni.
      UWAGA: Przykładowe warunki hodowli dla Trichoderma rossicum: agar z ekstraktem słodowym, inkubacja w 25 °C w ciemności przez 48 h.
  2. Kultura bakterii
    1. Wyizolować pożądany izolat bakteryjny z materiału wyjściowego (np. z banku w glicerolu lub pojedynczą kolonię z płytki z agarem) poprzez posiew kreskowy na płytce z agarem, aby uzyskać pojedyncze kolonie bakterii i upewnić się, że nie występuje kontaminacja45. Uszczelnić płytkę folią.
    2. Inkubować w temperaturze i przez czas specyficzny dla danego izolatu, aż do pojawienia się pojedynczych kolonii.
    3. Przygotować pożądaną pożywkę płynną. Na przykład, dodać 10 g tryptonu, 10 g NaCl i 5 g ekstraktu drożdżowego na 1 L ddH2O, aby przygotować pożywkę LB do hodowli B. subtilis. Sterylizować pożywkę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min.
    4. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Przenieść pożywkę do sterylnej kolby hodowlanej w środowisku sterylnym.
    5. Dotknąć pojedynczej kolonii bakterii na płytce z agarem za pomocą sterylnej pętli do szczepienia. Przenieść zaszczepioną pętlę do sterylnej pożywki płynnej, krótko dotykając cieczy pętlą.
    6. Uszczelnić kolbę za pomocą sterylnej zakrętki lub folii i umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem na noc, stosując ustawienia odpowiednie dla wybranego gatunku.
      ​UWAGA: Przykładowe warunki hodowli dla B. subtilis: i) kultura płynna – wzrost tlenowy w 37 °C przy 200 rpm w pożywce LB oraz ii) kultura na płytce – temperatura pokojowa na płytce z agarem LB. Szczegółowe informacje na temat hodowli różnych szczepów grzybów znajdują się w artykułach dotyczących FFI/BFI40,41.

4. Inokulacja urządzenia

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy użyciu sterylnego sprzętu.

  1. Inokulacja grzybów
    1. Używając wysterylizowanego wycinaka do korka (ø = 4 mm), należy wyciąć krążek agaru z kolonii na obrzeżach 3-dniowej hodowli (krok 3.1). Należy upewnić się, że rosnący front strzępek pozostał nienaruszony.
    2. Krążek należy wprowadzić do wlotu dla grzybów, stroną z grzybnią do dołu, kierując kierunek wzrostu frontu strzępek w stronę otworów mikrokanałów, aby wspomóc infiltrację kanałów przez strzępki.
    3. Kroki 4.1.1-4.1.2 należy powtórzyć dla drugiego gatunku grzyba (w przypadku użycia urządzenia FFI), wprowadzając krążek do przeciwległego wlotu. W przypadku użycia urządzenia BFI należy pominąć ten krok i przejść do kroku 4.1.4.
    4. Szalkę Petriego należy szczelnie zamknąć przezroczystą folią i inkubować w temperaturze 25-28 °C w ciemności do momentu rozpoczęcia obrazowania. Czas inkubacji przed obrazowaniem należy określić w zależności od planowanego zdarzenia biologicznego do obserwacji, np. konfrontacji grzyb-grzyb, oraz szybkości wzrostu użytych gatunków wewnątrz urządzenia.
  2. Inokulacja bakterii
    1. Bakterie z hodowli nocnej (krok 3.2) należy rozcieńczyć w stosunku 1:25, używając tego samego medium hodowlanego, zgodnie z opisem w kroku 3.2.3. Hodować przez 3 h w temperaturze 37 °C.
    2. Bakterie należy przemyć, pelletując hodowlę w wirówce przy 2000 x g przez 10 min. Należy odlać nadsącz i resuspendować komórki w odpowiedniej objętości 0,9% w/v roztworu chlorku sodu.
    3. Ponownie odwirować w celu uzyskania pelletu. Należy odlać nadsącz i resuspendować komórki w medium ciekłym (np. medium minimalne dla C. cinerea) do uzyskania OD600 równego 1. Wartość OD600 należy zoptymalizować dla danego szczepu bakteryjnego.
    4. Należy wyjąć urządzenie BFI z inkubatora i otworzyć je w środowisku sterylnym. Do wlotu bakteryjnego należy nanieść pipetą 10 µL zawiesiny.
      ​UWAGA: Należy zoptymalizować dokładne czasy inokulacji dla rozważanych interakcji bakteria-grzyb. Na przykład, w przypadku użycia C. cinerea, bakterie należy wprowadzić do urządzenia BFI 18 h po inokulacji grzyba.
    5. Szalkę Petriego należy szczelnie zamknąć przezroczystą folią i inkubować w temperaturze 25 °C w ciemności do momentu rozpoczęcia obrazowania. Urządzenie należy przechowywać w pozycji pionowej.

5. Mikroskopia i analiza obrazu

  1. Mikroskopia
    UWAGA: Badacz powinien wybrać odpowiednią metodę obrazowania zgodną z charakterem prowadzonego eksperymentu, na przykład odwróconą epifluorescencję szerokopolową lub mikroskopię konfokalną. Przedstawiono tutaj ogólny opis, ponieważ szczegóły będą zależeć od parametrów wybranego zestawu mikroskopowego.
    1. Włączyć komputer sterujący mikroskopem, korpus mikroskopu (jeśli dotyczy), kamerę, inkubator z kontrolą temperatury oraz źródła światła. Upewnić się, że mikroskop został prawidłowo skonfigurowany, np. że zastosowano prawidłowe oświetlenie Köhlera w celu uzyskania równomiernego oświetlenia próbki. Uruchomić oprogramowanie do obrazowania.
      UWAGA: Przy użyciu inkubatora z kontrolą temperatury ważne jest, aby temperatura mikroskopu ustabilizowała się przez kilka godzin przed rozpoczęciem eksperymentu.
    2. Zamontować urządzenie mikrofluidyczne w uchwycie stolika. Upewnić się, że urządzenie jest dobrze zabezpieczone, np. za pomocą taśmy, aby zapobiec jego przesunięciu podczas aktywnego ruchu stolika.
    3. Pozyskać obrazy z zaszczepionych urządzeń, np. w ramach eksperymentów jednopunktowych lub poklatkowych (time-lapse). Szczegółowe specyfikacje obrazowania istotne dla eksperymentów przeprowadzonych z urządzeniami BFI i FFI znajdują się w odpowiednich, wspomnianych wcześniej publikacjach40,41.
      UWAGA: Obrazy w jasnym polu pozyskano za pomocą mikroskopii kontrastowej w celu wizualizacji proliferacji strzępek w kanałach wzrostu, wykorzystując oprogramowanie do autofocusingu oraz obiektywy o powiększeniu 10x, 0,30 NA (apertura numeryczna) lub 20x, 0,45 NA. Wzbudzenie fluorescencyjnych białek reporterowych osiągnięto za pomocą wysokiej mocy silnika LED o długościach fal specyficznych dla danego fluoroforu.
    4. Wyeksportować obrazy do formatu odpowiedniego dla późniejszego przetwarzania obrazów, na przykład .tiff.
  2. Analiza obrazu
    UWAGA: Autorzy rekomendują program Fiji46 jako narzędzie do analizy obrazu, choć dostępne są inne pakiety oprogramowania. Poniżej znajdują się przykłady analiz obrazu przeprowadzonych w programie Fiji na podstawie zaprezentowanych publikacji dotyczących urządzeń BFI i FFI. Kroki te są specyficzne dla systemu Mac i mogą się nieco różnić w przypadku korzystania z komputera PC.
    1. Pomiary szybkości wzrostu strzępek
      UWAGA: Metoda ta została zastosowana w manuskrypcie BFI40 do pomiaru szybkości wzrostu poszczególnych strzępek.
      1. Pobrać, zainstalować i uruchomić program Fiji. Zaimportować sekwencję obrazów z eksperymentu poklatkowego, wybierając File > Import > Image Sequence. Znaleźć folder, w którym przechowywane są dane, i wybrać Open. W oknie Sequence Options wybrać Preferences, a następnie OK.
      2. Wybrać ikonę Straight Line z głównego paska narzędzi. Umieścić początek linii prostej na czubku rosnącej strzępki, klikając, a następnie przeciągając kursor do innego punktu w oknie. Pojawi się żółta linia z trzema polami wskazującymi początek, punkt środkowy i koniec linii.
      3. Przejść do następnej klatki w sekwencji obrazów, naciskając i przytrzymując Ctrl oraz >. Umieścić koniec linii prostej na czubku rosnącej strzępki, zaznaczając i przeciągając kwadratowe pole w odpowiednią pozycję.
      4. Nacisnąć i przytrzymać Ctrl oraz M , aby zmierzyć długość linii w pikselach. Pojawi się okno Results z zmierzonymi danymi. Zdefiniować dane wyświetlane w oknie Results w następujący sposób: kliknąć w oknie Results , a następnie wybrać Results > Set Measurements.
      5. Przejść do następnej klatki w sekwencji obrazów, naciskając i przytrzymując Ctrl , a następnie >. Umieścić początek linii prostej na czubku rosnącej strzępki, zaznaczając i przeciągając kwadratowe pole w odpowiednią pozycję.
      6. Nacisnąć i przytrzymać Ctrl , a następnie M, aby zmierzyć długość linii w pikselach. Pojawi się okno Results z zmierzonymi danymi.
      7. Powtarzać kroki 5.2.1.5-5.2.1.6 aż do zakończenia pomiaru wzrostu strzępki w pikselach.
      8. Zaznaczyć wszystkie dane w oknie Results . Skopiować i wkleić je do innego programu, np. arkusza kalkulacyjnego, aby przetworzyć dane. Wykreślić wzrost strzępek (w pikselach lub mikrometrach) jako funkcję czasu i obliczyć średnie szybkości wzrostu. Wykonać co najmniej trzy powtórzenia biologiczne na eksperyment.
    2. Pomiary intensywności fluorescencji
      UWAGA: Metoda ta została zastosowana w publikacji FFI41 w celu oceny zmiany intensywności fluorescencji w strzępkach Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP po kontakcie z Clonostachys rosea 016 jako funkcji czasu.
      1. Pobrać, zainstalować i uruchomić program Fiji. Zaimportować sekwencję obrazów z eksperymentu poklatkowego, wybierając File > Import > Image Sequence. Znaleźć folder, w którym przechowywane są dane, i wybrać Open. W oknie Sequence Options wybrać Preferences , a następnie OK.
      2. Określić obszar zainteresowania (ROI) do pomiaru bezwzględnej intensywności fluorescencji strzępki za pomocą narzędzia prostokąta znajdującego się na głównym pasku narzędzi. Rozmiar kwadratu można zdefiniować dokładnie w następujący sposób: Edit > Selection > Specify; ROI można również zapisać do późniejszego wykorzystania w ROI Manager, wybierając Edit > Selection > Add to Manager.
      3. Zmierzyć bezwzględną intensywność fluorescencji (średnią wartość szarości) w zdefiniowanym ROI dla każdego obrazu w całej sekwencji lub stosie obrazów w następujący sposób: Image > Stacks > Measure Stack. Okno Results otworzy się automatycznie po przetworzeniu wszystkich obrazów w stosie.
        UWAGA: Dane wyświetlane w oknie Results można zdefiniować w następujący sposób: kliknąć w oknie Results , a następnie wybrać Results > Set Measurements. Upewnić się, że zaznaczono opcję Mean Gray Value.
      4. Zaznaczyć wszystkie dane w oknie Results . Skopiować i wkleić je do innego programu, np. arkusza kalkulacyjnego, aby wykreślić bezwzględne intensywności fluorescencji określonego ROI jako funkcję czasu.
      5. Powtarzać kroki 5.2.2.2-5.2.2.4, aby zebrać pomiary bezwzględnej intensywności fluorescencji dla każdego ROI, t.j. na badanej strzępce, obok badanej strzępki lub w odpowiadającym im kanale kontrolnym.
      6. Obliczyć odpowiednie względne intensywności fluorescencji w jednostkach arbitralnych (AU), np. dzieląc bezwzględną intensywność fluorescencji ROI [badana strzępka] przez bezwzględną intensywność fluorescencji ROI [kanał kontrolny]. Szczegółowe informacje znajdują się w publikacji FFI41.
      7. Wykonać co najmniej trzy powtórzenia biologiczne na eksperyment i wykreślić względne intensywności fluorescencji jako funkcję czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu egzemplarzowych urządzeń BFI40 oraz FFI41. Pomiary tempa wzrostu strzępek można łatwo przeprowadzić za pomocą tych urządzeń w połączeniu z podstawowymi technikami mikroskopowymi. Rysunek 3A-B ilustruje interakcje bakteryjno-grzybowe między strzępkami C. cinerea a B. subtilis NCIB 3610. Obecność B. subtilis hamuje wzrost C. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono protokół badania oddziaływań grzybowo-mikrobiologicznych z wykorzystaniem mikrofluidyki kanałowej. Autorzy dążą do wykazania wszechstronności tych urządzeń i zachęcają do adaptacji do zainteresowań badacza. Korzystając z przykładowych urządzeń BFI i FFI, można badać interakcje grzybowo-mikrobiologiczne bardziej szczegółowo niż było to wcześniej dostępne. Usuwając złożoność tła i niejednorodność gleby, moderując wzrost strzępek w taki sposób, że są one ograniczone do jednej warstwy i ściśle regulu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Wydziału Bioinżynierii w Imperial College London oraz The Leverhulme Trust (Numer grantu badawczego: RPG-2020-352).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarDifco Laboratories214010Służy do zestalania pożywki hodowlanej do hodowli bakterii i grzybów na szalkach Petriego
Folia aluminiowaFisher Scientific Ltd11759408
AutoCAD 2021Autodesk, USA
Autoklaw (VX-75)Systec
(5810R)Eppendorf
ChlorotrimetysilanMerck Life Sciences386529UWAGA: Chlorotrimetylosilian jest substancją niebezpieczną. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz zapobiegać wdychaniu. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu i używać w dobrze wentylowanym miejscu.
Świder korkowySLSCOR1000
Rozwiązanie deweloperskie (mr-Dev 600)Microresist TechnologiesUWAGA: roztwór wywoływacza mr-Dev 600 jest łatwopalny
Kolby ErlenmeyeraVWR214-1108np. 200 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb
Etanol (70% v/v) Fisher Scientific LtdE/0650DF/15Rozcieńczony od 99,8% (klasa odczynnika analitycznego)
FijiImageJPrzykładowy pakiet oprogramowania do przetwarzania obrazowania
Filtrowane, sprężone powietrzeDostępne w standardzie w większości laboratoriów. Alternatywnie można zastosować sprężarkę bezolejową z regulatorem powietrza.
Pęseta waflowa z płaskągłówką SLSINS5026
KleszczeFisher Scientific Ltd10008051Wygięta, ostra
Szalka Petriego ze szklanym dnemWorld Precision InstrumentsFD35-10035 mm
Szalka Petriego ze szklanym dnemWorld Precision InstrumentsFD5040-10050 mm
Szklane naczynia krystalizacyjneVWR216-1865Używany do mycia płyt PDMS
Szklane naczynia krystalizacyjneVWR216-1866Stosowane przy opracowywaniu form wzorcowych
Szklane butelki na podłożaFisher Scientific Ltd15456113np. 250 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb
Szklana strzykawka (Hamilton)Fisher Scientific Ltd10625251Służy do dozowania chlorotrimetylosilianu
Płyta grzejna (HP 160 III BM)SAWATEC
Pętla inokulacyjnaVWRCOPA175CS01
Alkohol izopropylowySigma-AldrichW292907
Okap z przepływem laminarnymAir Science (PCR)Przykładowy okap z przepływem laminarnym używany do produkcji urządzeń
Pożywka LBFisher Scientific LtdBP9723-500Przykładowy bulion odżywczy do nocnej hodowli
bakteriiSilnik świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LedHUB)Omicron-Laserage Laserprodukte GmbHPrzykładowe źródło światła, które można wykorzystać do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych (fluorescencja)
MA6 Nakładka na maskę ultrafioletowąSuss Microtec
Ekstrakt słodowyVWR84618Służy do produkcji przykładowej pożywki do hodowli grzybów (agar z ekstraktem słodowym)
Pisarz masekMateriały stosowane4700DPPrzykład edytora masek, który można wykorzystać do wydrukowania maski fotograficznej do fotolitografii
Uchwyt z tworzywa sztucznegoUchwyt drukowany na zamówienie w 3D wyprodukowany na zamówienie
Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego  (BioMat2)z zamkniętym powietrzemMSC używany do hodowli drobnoustrojów i inokulacji urządzeń
WodaDostępne w standardzie w laboratoriach biologicznych. 
NaOHFisher Scientific LtdBP359-500
Oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements Advanced ResearchPakiet oprogramowania NikonExemplar do akwizycji obrazów
NIS-Elements Free ViewerPakiet oprogramowania NikonExemplar do przeglądania pozyskanych obrazów
Piekarnik (Binder BD115)Fisher Scientific Ltd15602126Służy do utwardzania poli(dimetylosiloksan)(PDMS)
Piekarnik (CLO-2AH-S)KOYOSłuży do przygotowania wafli krzemowych
ParafilmBemisHS234526B
szalki Petriego z folii, kwadratowe sterylneFisher Scientific Ltd11708573szalki Petriego 120,5 mm
, sterylneFisher Scientific Ltd1537036690 mm 
Maska fotolitograficznaMicro Lithography Services Ltd. Wielka Brytania
Odkurzacz plazmowy (Zepto)Diener Electronic100012601
Kubek plastikowySemadeni8323
Szpatułka plastikowaSemadeni3340
Przenośna waga precyzyjna (OHAUS Scout)Fisher Scientific Ltd15519631Służy do ważenia PDMS, media komponenty itp.
Nóż precyzyjnySyneoHS1251135P1183Średnica krawędzi tnącej: 3,18 mm
Nóż precyzyjny SyneoHS1871730P1183SŚrednica krawędzi tnącej: 4,75 mm
Profilometr BrukerDektak XT-stylus
ŻyletkiHä berle Labortechnik9156110
LodówkaHaden4-6 ° C
Kamera CCD Retiga R1QimagingPrzykładowa kamera, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Magiczna taśma klejącaOffice Depot396995419 mm niewidoczna taśma; przezroczysta taśma
Inkubator wstrząsający (Cole-Parmer SI500)Fisher Scientific Ltd10257954
Wafel krzemowyInseto100 mm
Szkło sodowo-wapniowe płytkaInseto125 mm x 125 mm x 2 mm. Służy do mocowania maski fotolitograficznej w nakładce
maski Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Spincoater SAWATECSM-180-BM
SU-8 2010 fotorezystorMicroChemUWAGA: Fotorezystor SU-8 jest niebezpieczny, należy zachować ostrożność podczas obsługi i unikać wdychania i kontaktu ze skórą. Łatwopalny, potencjalnie rakotwórczy i toksyczny dla środowiska.
Zestaw elastomerów Sylgard 184VWR634165SSłuży do przygotowania urządzeń z poli(dimetylosiloksanu)(PDMS)
Inkubator z kontrolowaną temperaturąInkubator OkolabExemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Mikroskop odwróconej epifluorescencji Ti2-EMikroskop NikonMEA54000Exemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Myjka ultradźwiękowa S-LineFisher Scientific LtdFB15050
Eksykator próżniowyFisher Scientific Ltd10528861Odgazowanie silianizacji i PDMS należy przeprowadzać w oddzielnych eksykatorach
x10/0,3 NA Soczewka obiektywowa CFI Plan Fluor DLNikonMRH20105Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
x20/0,45 NA CFI Plan Fluor DL soczewka obiektywowaNikonMRH48230Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Wirówka Master Mold Wzór roztworów oczyszczona Milli-Q przezroczyste

Bibliografia

  1. Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
  2. Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial functional profiles of phosphorus cycling in diverse agroecosystems. The ISME Journal. 14 (3), 757-770 (2020).
  3. Op De Beeck, M., et al. Regulation of fungal decomposition at single-cell level. The ISME Journal. 14 (4), 896-905 (2020).
  4. Bender, S. F., et al. Symbiotic relationships between soil fungi and plants reduce N2O emissions from soil. The ISME Journal. 8 (6), 1336-1345 (2014).
  5. Dullah, S., et al. Melanin production and laccase mediated oxidative stress alleviation during fungal-fungal interaction among basidiomycete fungi. IMA Fungus. 12 (1), 33(2021).
  6. Deveau, A., et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 335-352 (2018).
  7. Bian, R., et al. Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (7), 3779-3788 (2020).
  8. Jiang, X., Xiang, M., Liu, X. Nematode-trapping fungi. Microbiology Spectrum. 5 (1), (2017).
  9. Essig, A., et al. a novel peptide-based fungal antibiotic interfering with the peptidoglycan synthesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34953-34964 (2014).
  10. Tang, H. -Y., Zhang, Q., Li, H., Gao, J. -M. Antimicrobial and allelopathic metabolites produced by Penicillium brasilianum. Natural Product Research. 29 (4), 345-348 (2015).
  11. Bai, Y. -B., et al. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi In vitro and In vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (22), 6125-6132 (2019).
  12. Solanki, M. K., et al. Characterization of antagonistic-potential of two Bacillus strains and their biocontrol activity against Rhizoctonia solani in tomato. Journal of Basic Microbiology. 55 (1), 82-90 (2015).
  13. Jamali, H., Sharma, A., Srivastava, A. K. Biocontrol potential of Bacillus subtilis RH5 against sheath blight of rice caused by Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology. 60 (3), 268-280 (2020).
  14. Válková, H., Novotný, Č, Malachová, K., Šlosarčíková, P., Fojtík, J. Effect of bacteria on the degradation ability of Pleurotus ostreatus. Science of The Total Environment. 584-585, 1114-1120 (2017).
  15. Leyva-Rojas, J. A., Coy-Barrera, E., Hampp, R. Interaction with soil bacteria affects the growth and amino acid content of Piriformospora indica. Molecules. 25 (3), Basel, Switzerland. 572(2020).
  16. Dullah, S., et al. Fungal interactions induce changes in hyphal morphology and enzyme production. Mycology. 12 (4), 279-295 (2021).
  17. Marfetán, J. A., Romero, A. I., Folgarait, P. J. Pathogenic interaction between Escovopsis weberi and Leucoagaricus sp.: mechanisms involved and virulence levels. Fungal Ecology. 17, 52-61 (2015).
  18. Cortois, R., De Deyn, G. B. The curse of the black box. Plant and Soil. 350 (1), 27-33 (2012).
  19. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  20. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  21. Hanson, K. L., et al. Fungi use efficient algorithms for the exploration of microfluidic networks. Small. 2 (10), 1212-1220 (2006).
  22. Held, M., Edwards, C., Nicolau, D. V. Probing the growth dynamics of Neurospora crassa with microfluidic structures. Fungal Biology. 115 (6), 493-505 (2011).
  23. Thomson, D. D., et al. Contact-induced apical asymmetry drives the thigmotropic responses of Candida albicans hyphae. Cellular Microbiology. 17 (3), 342-354 (2015).
  24. Lee, K. K., Labiscsak, L., Ahn, C. H., Hong, C. I. Spiral-based microfluidic device for long-term time course imaging of Neurospora crassa with single nucleus resolution. Fungal Genetics and Biology. 94, 11-14 (2016).
  25. Asenova, E., Lin, H. Y., Fu, E., Nicolau, D. V., Nicolau, D. V. Optimal fungal space searching algorithms. IEEE Transactions on NanoBioscience. 15 (7), 613-618 (2016).
  26. Soufan, R., et al. Pore-scale monitoring of the effect of microarchitecture on fungal growth in a two-dimensional soil-like micromodel. Frontiers in Environmental Science. 6, (2018).
  27. Uehling, J. K., et al. Microfluidics and metabolomics reveal symbiotic bacterial-fungal interactions between Mortierella elongata and Burkholderia include metabolite exchange. Frontiers in Microbiology. 10, 2163(2019).
  28. Millet, L. J., et al. Increasing access to microfluidics for studying fungi and other branched biological structures. Fungal Biology and Biotechnology. 6 (8), 1-14 (2019).
  29. Baranger, C., Fayeulle, A., Le Goff, A. Microfluidic monitoring of the growth of individual hyphae in confined environments. Royal Society Open Science. 7 (8), 191535(2020).
  30. Aleklett, K., Ohlsson, P., Bengtsson, M., Hammer, E. C. Fungal foraging behaviour and hyphal space exploration in micro-structured Soil Chips. The ISME Journal. 15 (6), 1782-1793 (2021).
  31. Aleklett, K., et al. Build your own soil: exploring microfluidics to create microbial habitat structures. The ISME Journal. 12 (2), 312-319 (2018).
  32. Ellett, F., Jorgensen, J., Frydman, G. H., Jones, C. N., Irimia, D. Neutrophil interactions stimulate evasive hyphal branching by Aspergillus fumigatus. PLOS Pathogens. 13 (1), 1006154(2017).
  33. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  34. Schmieder, S. S., et al. Bidirectional propagation of signals and nutrients in fungal networks via specialized hyphae. Current Biology. 29 (2), 217-228 (2019).
  35. Tayyrov, A., Stanley, C. E., Azevedo, S., Künzler, M. Combining microfluidics and RNA-sequencing to assess the inducible defensome of a mushroom against nematodes. BMC Genomics. 20 (1), 243(2019).
  36. Stanley, C. E., Grossmann, G., Casadevall i Solvas, X., deMello, A. J. Soil-on-a-Chip: microfluidic platforms for environmental organismal studies. Lab on a Chip. 16 (2), 228-241 (2016).
  37. Stanley, C. E., vander Heijden, M. G. A. Microbiome-on-a-Chip: new frontiers in plant-microbiota research. Trends in Microbiology. 25 (8), 610-613 (2017).
  38. Ortseifen, V., Viefhues, M., Wobbe, L., Grünberger, A. Microfluidics for biotechnology: bridging gaps to foster microfluidic applications. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology. 8, 589074(2020).
  39. Jansson, J. K., Hofmockel, K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics. Current Opinion in Microbiology. 43, 162-168 (2018).
  40. Stanley, C. E., et al. Probing bacterial-fungal interactions at the single cell level. Integrative Biology (Camb). 6 (10), 935-945 (2014).
  41. Gimeno, A., et al. A versatile microfluidic platform measures hyphal interactions between Fusarium graminearum and Clonostachys rosea in real-time. Communications Biology. 4 (1), 262(2021).
  42. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  43. Stanley, C. E., et al. Fabrication and use of the dual-flow-RootChip for the imaging of Arabidopsis roots in asymmetric microenvironments. Bio-protocol. 8 (18), 3010(2018).
  44. Choi, C. -H., Lee, H., Weitz, D. A. Rapid patterning of PDMS microfluidic device wettability using syringe-vacuum-induced segmented flow in nonplanar geometry. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3170-3174 (2018).
  45. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Harting, R., et al. Pseudomonas strains induce transcriptional and morphological changes and reduce root colonization of Verticillium spp. Frontiers in Microbiology. 12, 652468(2021).
  48. Boenisch, M. J. Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during Fusarium head blight infection. , Staats-und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky. (2013).
  49. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlovsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum and V. dahliae with Brassica napus detected with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  50. Ghanem, N., Stanley, C. E., Harms, H., Chatzinotas, A., Wick, L. Y. Mycelial effects on phage retention during transport in a microfluidic platform. Environmental Science & Technology. 53 (20), 11755-11763 (2019).
  51. Alrifaiy, A., Lindahl, O. A., Ramser, K. Polymer-based microfluidic devices for pharmacy, biology and tissue engineering. Polymers. 4 (3), 1349-1398 (2012).
  52. Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 554-567 (2015).
  53. Hoelzle, D., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Urz dzenia mikrofluidyczneinterakcje bakterii i grzyb winterakcje grzyb w i grzyb wobrazowanie o wysokiej rozdzielczo cimikroskopia fluorescencyjnamikrobiom glebowywzrost strz pektest na szalce Petriegoobrazowanie poklatkowe
Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.