Artykuł metodologiczny

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

DOI:

10.3791/63917

⸱

23 czerwca 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzyby strzępkowe są skutecznymi mieszkańcami gleby i odgrywają główną rolę w ekosystemach glebowych, takich jak rozkład materii organicznej i nieorganicznej, a także regulacja poziomu składników odżywczych. Znajdują tam również wiele możliwości interakcji z wieloma innymi drobnoustrojami, takimi jak bakterie lub inne grzyby. Badanie interakcji grzybów na poziomie komórkowym może być jednak trudne ze względu na przypominającą czarną skrzynkę naturę gleby. Opracowywane są nowe narzędzia mikroprzepływowe do badania oddziaływań grzybów; Wyróżniono dwie platformy przeznaczone do badania interakcji bakteryjno-grzybowych i grzybowo-grzybowych. W obrębie tych mikrokanałów interakcje grzybowo-mikrobiologiczne mogą być monitorowane w kontrolowanych środowiskach fizykochemicznych przy wyższej rozdzielczości czasowej i przestrzennej niż było to wcześniej możliwe. Zastosowanie tych narzędzi przyniosło wiele nowych informacji biologicznych, takich jak obserwacja polarnego przyczepiania się bakterii do strzępek lub ujawnienie niescharakteryzowanych antagonizmów grzybów. Kluczową cechą tych metodologii jest łatwość użycia tego narzędzia przez osoby niebędące ekspertami, co pozwala na opracowanie wysoce przekładalnych technologii do wykorzystania w laboratoriach mikrobiologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gleba to wyjątkowo zróżnicowane środowisko zawierające obfitość mikroorganizmów, które odgrywają kluczową rolę w obiegu węgla i fosforu1,2. Grzyby strzępkowe są głównym składnikiem wielu ekosystemów jako rozkładające materię organiczną i nieorganiczną i mogą poprawiać odżywianie roślin poprzez tworzenie symbiotycznych relacji3,4. W glebie grzyby wchodzą w dynamiczne interakcje z wieloma drobnoustrojami, takimi jak inne grzyby5, bacteria6, viruses7 i nicienie8. Interakcje te mają znaczące konsekwencje dla zdrowia gleby i roślin. Jednak ze względu na brak odpowiednich systemów eksperymentalnych zdolnych do obrazowania oddziałujących mikroorganizmów w wysokiej rozdzielczości, wiele z nich pozostaje niezdefiniowanych.

Badania dotyczące interakcji bakterialsko-grzybowych (BFI) i interakcji grzybowo-grzybowych (FFI) mają cenne zastosowania w wielu dziedzinach, w tym w środkach przeciwdrobnoustrojowych w medycynie i środkach kontroli biologicznej w rolnictwie. Na przykład grzyb Coprinopsis cinerea wytwarza peptyd copsin, który, jak wykazano, wykazuje działanie przeciwbakteryjne przeciwko ludzkiemu patogenowi Listeria monocytogenes9. Podobnie, związek pochodzenia grzybowego, gryzeofulwina, jest szeroko stosowany w leczeniu infekcji grzybiczych u ludzi i jest dodatkowo w stanie hamować wzrost chorobotwórczego grzyba roślinnego Alternaria solani10,11. Wykazano również, że kilka szczepów bakterii Bacillus subtilis żyjącej w glebie jest skutecznymi środkami kontroli biologicznej grzybowego patogenu roślin Rhizoctonia solani12,13. Niemniej jednak, ze względu na ograniczenia związane z tradycyjnymi metodologiami, BFI i FFI są słabo poznane na poziomie pojedynczych komórek.

Konwencjonalne badania zazwyczaj badają BFI i FFI w makroskali za pomocą płytek agarowych z dwoma lub więcej gatunkami w konfrontacji. Ich wzajemne oddziaływanie jest oceniane poprzez pomiar tempa wzrostu i produkcji metabolitów konfrontowanych gatunków14,15,16; Jednak ta metodologia jest rozwiązywana tylko na poziomie kolonii. Aby zbadać interakcje na poziomie komórkowym, inokulanty bakteryjne i grzybowe mogą być hodowane na szklanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych agarem, które są następnie obrazowane pod mikroskopem17. Niemniej jednak śledzenie pojedynczego łącznika za pomocą szkiełek mikroskopowych może być trudne ze względu na brak ograniczenia, co oznacza, że trudniej jest uzyskać obrazy poklatkowe. Co więcej, możliwość przestrzennego uwięzienia innych mikroorganizmów w określonych regionach grzybni grzyba lub stworzenia określonych środowisk chemicznych, które mogą być na przykład zaburzone, nie jest możliwa w takich konfiguracjach. "" skrzynkowość gleby również komplikuje badanie interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie pojedynczych komórek18. Obserwując oddziałujące na siebie gatunki z dala od niesamowitej różnorodności mikrobiomu glebowego, można ocenić dokładny sposób, w jaki poszczególne elementy wchodzą w interakcje. W związku z tym istnieje ciągłe zapotrzebowanie na wszechstronne platformy, które umożliwiają obrazowanie pojedynczych komórek BFI i FFI w wysokiej rozdzielczości.

Technologie mikroprzepływowe, tak zwane systemy lab-on-a-chip, stanowią idealną platformę do badania BFI i FFI na poziomie pojedynczych komórek. Dziedzina mikrofluidyki, wywodząca się z technologii opracowanych dla analizy chemicznej i mikroelektroniki, została przyjęta przez nauki biologiczne19. Technologie mikroprzepływowe regulują małe objętości płynów w specjalnie zaprojektowanej sieci zminiaturyzowanych kanałów, mających co najmniej jeden wymiar w skali mikrometrowej, a ich zastosowanie w badaniach biologicznych rozszerza się20. W szczególności opracowano urządzenia mikroprzepływowe do badania wzrostu grzybów strzępkowych21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Jedną z zalet stosowania tej technologii jest to, że uwięzienie strzępek i dystrybucja składników odżywczych w mikrokanałach bardziej przypomina strukturę środowiska glebowego niż konwencjonalne metody agarowe31. Ostatnio platformy mikroprzepływowe zostały wykorzystane do badania interakcji między ludzkimi neutrofilami a patogenami grzybów32, bakteriami i korzeniami roślin33, a także grzybami i nicieniami34,35.

Jedną z wielu zalet korzystania z mikrofluidyki do badania oddziaływań mikrobiologicznych jest specyficzna kontrola środowiska mikrokanałowego. Na przykład, reżimy przepływu laminarnego mogą być wykorzystane do generowania zdefiniowanych gradientów stężeń, co jest szczególnie przydatne podczas badania chemotaksji bakteryjnej36. Kolejną zaletą jest to, że przezroczystość poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), niedrogiego, biokompatybilnego polimeru elastomerowego powszechnie stosowanego w produkcji urządzeń mikroprzepływowych, ułatwia obrazowanie pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej37. Podobnie, uwięzienie drobnoustrojów w mikrokanałach oznacza, że można przeprowadzać eksperymenty poklatkowe śledzące pojedyncze komórki, co pozwala na rejestrowanie i ilościowe określanie indywidualnych odpowiedzi komórkowych37. Wreszcie, ponieważ urządzenia mikroprzepływowe mogą być zaprojektowane tak, aby były przyjazne dla użytkownika, mogą być łatwo stosowane przez osoby niebędące ekspertami38.

Pogłębianie wiedzy na temat interakcji między mikroorganizmami żyjącymi w glebie jest ważne dla poprawy zrównoważonych praktyk zarządzania ekosystemami, które utrzymują różnorodność biologiczną i łagodzą wpływ zmian klimatycznych na środowiska lądowe39. W związku z tym opracowanie nowych narzędzi mikroprzepływowych ma zasadnicze znaczenie dla poszerzenia wiedzy na temat grzybów i ich interakcji na poziomie komórkowym. Niniejszy protokół skupi się na dwóch urządzeniach mikroprzepływowych wyprodukowanych do badania BFIs40 i FFIs41, jak przedstawiono w Rysunek 1.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Wizualna i schematyczna reprezentacja urządzeń do interakcji bakteryjno-grzybowej (BFI) i interakcji grzybowo-grzybowej (FFI). (A) Obraz urządzenia BFI. Czop grzybni umieszcza się przy wejściu do jednego z końców mikrokanałów, aby umożliwić wzrost strzępek do urządzenia. Wlot bakterii znajduje się na przeciwległym końcu. Podziałka liniowa = 5 mm. (B) Schematyczny przegląd urządzenia BFI, przedstawiający położenie wlotów bakterii i kierunek wzrostu strzępek przez mikrokanały interakcji. Kanały mają głębokość 10 μm, szerokość 100 μm i długość 7 mm, a łącznie jest ich 28 kanałów obserwacyjnych. (C) Test konfrontacji na płytce agarowej między Coprinopsis cinerea i Bacillus subtilis NCIB 3610, podziałka = 20 mm (po lewej). Obrazy mikroskopowe ukazujące interakcję między C. cinerea i B. subtilis NCIB 3610 w obrębie mikrokanału (środkowy i prawy), tj. biegunowe przyczepianie się bakterii do strzępek grzybów. Podziałka = 25 μm (środek) i 10 μm (prawo). (D) Obraz urządzenia FFI połączonego z płytką Petriego ze szklanym dnem, podwójnie zaszczepionej czopkami grzybni. Podziałka = 1 cm. (E) Schematyczny przegląd urządzenia FFI. Dwie zatyczki inokulantu grzybowego są wprowadzane do wlotów na obu końcach urządzenia, co pozwala na eksplorację mikrokanałów za pomocą łączników. Kanały kontrolne są podłączone tylko do jednego wlotu grzyba i mają ślepy zaułek, co zapobiega interakcjom między badanymi grzybami. Kanały interakcji łączą oba wloty grzybów i umożliwiają interakcje strzępkowe między osobami badanymi w mikrokanale. Każdy kanał interakcji składa się z 18 sekcji w kształcie rombu o łącznej długości 8,8 mm (490 x 430 μm na diament), głębokości 10 μm i obszarze łączącym między każdym diamentem o długości 20 μm. Typy kanałów są zduplikowane, podziałka liniowa = 1 mm. (F) Strefa interakcji między dwoma zbliżającymi się frontami strzępek, wyrastającymi z przeciwległych końców połączonego kanału interakcji. Obraz z mikroskopii kontrastu fazowego, podziałka = 250 μm. Panele na tym rysunku zostały zmodyfikowane z Stanley et al., 2014 (A-C)40 oraz Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Podsumowanie procedur opisanych w tym protokole jest wizualnie przedstawione w Rysunek 2.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie prezentowanej metodologii składające się z pięciu głównych sekcji szczegółowo opisanych w tym protokole. Projekty urządzeń tworzone są przy użyciu oprogramowania CAD (computered aided design) oraz formy wzorcowej wykonanej metodą fotolitografii (1). Jest on używany do odlewania poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), który jest następnie krojony w kostki na płyty i łączony z szalkami Petriego ze szklanym dnem w celu utworzenia urządzeń mikroprzepływowych (2). Drobnoustroje, które mają zostać włączone do badania, są hodowane (3) i wykorzystywane do zaszczepiania urządzeń (4). Interakcje są badane za pomocą mikroskopii i oznaczane ilościowo za pomocą technik analizy obrazu (5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Mistrz produkcji form

  1. Produkcja fotomasek
    1. Generuj projekty urządzeń mikroprzepływowych za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Wymiary prezentowanych urządzeń są podane w Rysunek 1, a więcej szczegółów na temat konkretnych cech konstrukcyjnych jest obszernie wymienionych w odpowiednich publikacjach40,41.
    2. Wyeksportuj plik projektu CAD w odpowiednim formacie (np. .dwg, .dxf). Wydrukuj maskę fotolitograficzną na klisz, wysyłając wyeksportowany plik projektu CAD do komercyjnego dostawcy w celu wydrukowania.
  2. Fotolitografia
    UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać w środowisku wolnym od kurzu i kontrolowanym przez światło, takim jak okap z przepływem laminarnym lub pomieszczenie czyste. Przedstawione tutaj warunki doświadczalne mają charakter orientacyjny i powinny być optymalizowane we własnym zakresie. Autorzy zalecają skorzystanie z konkretnych szkoleń i zapoznanie się z ustalonymi protokołami42.
    1. Przygotować wafel krzemowy o średnicy 100 mm, piecząc w piekarniku w temperaturze 200 °C przez 2 godziny. Płytkę krzemową należy obtoczyć metodą spinową fotorezystem SU-8 2010, dążąc do docelowej grubości 10 μm, stosując następujące warunki: 500 obr./min przez 10 s (przyspieszenie 100 obr./min) i 3 000 obr./min przez 45 s (przyspieszenie 300 obr./min).
      UWAGA: Fotorezystor SU-8 jest niebezpieczny, należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nim i unikać wdychania i kontaktu ze skórą. Jest łatwopalny, potencjalnie rakotwórczy i toksyczny dla środowiska.
    2. Piecz powlekaną wafel silikonowy w temperaturze 95 °C przez 2,5 minuty (pieczenie na miękko). Wystaw fotorezystor na działanie światła ultrafioletowego (UV) za pomocą filmowej maski fotolitograficznej i dawki energii 140 mJ/cm2 przy długości fali 365 nm za pomocą wyrównywacza maski.
    3. Piecz powlekaną płytkę silikonową w temperaturze 95 °C przez 3,5 minuty (pieczenie po ekspozycji). Zanurz i wymieszaj płytkę krzemową w roztworze wywoływacza na 3 minuty, aby odsłonić mikrofabrykowane struktury, usuwając nienaświetlony fotorezyst.
      UWAGA: Roztwór dewelopera może być łatwopalny, należy podjąć odpowiednie środki ostrożności podczas obsługi i przechowywania.
    4. Spłukiwać świeżym roztworem wywoływacza przez 10 s. Płukać alkoholem izopropylowym przez 10 s i wysuszyć na powietrzu. Użyj przefiltrowanego, sprężonego powietrza, aby upewnić się, że konstrukcje są dokładnie suche. Zmierz wysokość konstrukcji SU-8, na przykład za pomocą profilometru.
    5. Sylilonizować każdą formę wzorcową za pomocą 50 μl chlorotrimetylosilanu, stosując podciśnienie 50 mbar przez 2 godziny. Autorzy zauważają, że ponowna silanizacja formy wzorcowej nie została uznana za konieczną.
      UWAGA: Chlorotrimetylosilan jest substancją niebezpieczną. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz zapobiegać wdychaniu. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu i używać w dobrze wentylowanym miejscu.

2. Produkcja urządzeń

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane w środowisku wolnym od kurzu, takim jak okap z przepływem laminarnym.

  1. Przygotowanie płyt z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS)
    1. Przygotuj około 40 g PDMS, dokładnie mieszając bazę i utwardzacz w stosunku 10:1 za pomocą szpatułki w czystym plastikowym kubku. Odgazować mieszaninę w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza, umieszczając plastikowy kubek zawierający PDMS w komorze próżniowej (podciśnienie = 50 mbar) na 1 godzinę.
    2. Przymocuj formę główną do plastikowego uchwytu za pomocą przezroczystej taśmy. Wyczyść za pomocą sprężonego, przefiltrowanego powietrza, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu.
      UWAGA: Alternatywnie, folia aluminiowa może być uformowana wokół szklanej szalki Petriego, a następnie użyta do umieszczenia formy głównej i umieszczenia PDMS43.
    3. Wylej mieszaninę PDMS na środek formy wzorcowej, upewniając się, że znajduje się na równej powierzchni i pozostaw do osiadania.
      UWAGA: Mieszaninę PDMS należy wlewać jak najbliżej powierzchni formy wzorcowej i utrzymywać ciągły przepływ, aby zminimalizować wprowadzanie pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza można usunąć, kierując sprężone powietrze na pęcherzyk lub nabierając je za pomocą cienkiej igły.
    4. Przykryj formę główną luźno plastikową pokrywką, aby zapobiec osadzaniu się cząsteczek kurzu na powierzchni PDMS. Przenieść formę wzorcową do piekarnika i utwardzić przez noc w temperaturze 70 °C.
    5. Wyjmij główną formę z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia. Oderwij utwardzony PDMS od formy głównej i plastikowej ramy, uważając, aby nie uszkodzić formy głównej/PDMS.
    6. Umieść przezroczystą taśmę na mikrokanalikach wytłoczonych w PDMS, aby utrzymać powierzchnię wolną od kurzu. Upewnij się, że taśma została usunięta przed klejeniem.
    7. Pokrój PDMS na płyty (tj. jeśli w projekcie na formie głównej znajduje się wiele urządzeń, wiele z nich można wytworzyć z jednego odlewu) zgodnie z opisem w projekcie za pomocą zamontowanej gilotyny lub żyletki. Podczas cięcia bocznego otworu płyty BFI PDMS upewnij się, że mikrokanały są całkowicie otwarte (Rysunek 1A). W przypadku płyty FFI PDMS upewnij się, że każdy róg jest przycięty, aby umożliwić jej dopasowanie do szalki Petriego ze szklanym dnem pokazanej na Rysunek 1D.
    8. Przebić żądane otwory wlotowe/wylotowe zgodnie z konstrukcją urządzenia. Użyj precyzyjnego noża do wykrawania otworów wlotowych o średnicy 3.18 mm i 4.75 mm odpowiednio dla przykładowych urządzeń BFI i FFI.
  2. Klejenie płyt PDMS w celu tworzenia urządzeń
    UWAGA: W kolejnych krokach prania (2.2.1-2.2.2) używać myjki ultradźwiękowej wypełnionej oczyszczoną wodą (ddH2O) o częstotliwości 37 kHz. Mycie płyt PDMS pomaga zwiększyć skuteczność klejenia44 i zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Aby manipulować płytami PDMS, użyj czystych kleszczy i podnieś za pomocą otworów wlotowych, aby uniknąć uszkodzenia mikrokanalików lub powierzchni urządzenia.
    1. Zanurzyć płyty PDMS w 0,5 M NaOH i poddać sonikacji przez 5 min. Przepłukać sterylnym ddH2O. Przenieść płyty PDMS do 70% roztworu etanolu i sonikować przez 5 min. Przepłukać sterylnym ddH20.
    2. Zanurz płyty PDMS w sterylnym ddH2O i poddaj sonizacji przez 5 minut. Wyjmij płyty PDMS ze sterylnego ddH2O, wysusz za pomocą przefiltrowanego sprężonego powietrza i umieść na sterylnej kwadratowej szalce Petriego.
    3. Umieścić kwadratową szalkę Petriego zawierającą płyty PDMS w piecu o temperaturze 70 °C na 1 godzinę do wyschnięcia. Wyjmij z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia w środowisku wolnym od kurzu. Usuń kurz z powierzchni płyt PDMS za pomocą taśmy i/lub przefiltrowanego sprężonego powietrza.
    4. Aktywuj powierzchnie płyt PDMS i szalek Petriego ze szklanym dnem, które mają być łączone, za pomocą myjki plazmowej z następującymi ustawieniami: podciśnienie 0,75 mbar, moc 50%, czas powlekania 1 min. Umieść powierzchnie, które mają być aktywowane (a następnie klejone) skierowane do góry w myjce plazmowej.
    5. Usuń płyty PDMS i szalki Petriego ze szklanym dnem z myjki plazmowej i spoj, delikatnie umieszczając aktywowane powierzchnie w konforemnym konforemnym konformalnym kontakcie ze sobą. Płyty BFI i FFI PDMS należy przykleić do szalek Petriego ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i 50 mm (grubość szkła 0,17 mm), odpowiednio.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku podczas klejenia, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się mikrokanałów.
    6. Sprawdź, czy połączenie się udało, po prostu próbując ściągnąć płytę PDMS z szalki Petriego ze szklanym dnem za pomocą pęsety. Wizualizacja urządzeń za pomocą oka lub za pomocą mikroskopii ogólnej, aby upewnić się, że nie zapadają się wloty inokulacji ani mikrokanały.
      UWAGA: W przypadku warunków nasycenia (tj. warunków nasyconych wodą i/lub bogatych w składniki odżywcze) należy uwzględnić krok 2.2.7 protokołu. Jeśli wymagane są warunki nienasyconej wody, przejdź do kroku 2.2.8. Urządzenia mogą być napełniane wodą lub mediami.
    7. Napełnij urządzenia natychmiast po połączeniu, pipetując 100 μl żądanego roztworu dla urządzenia BFI (wlot bakteryjny i otwór boczny) lub 30 μl pożywki do każdego wlotu (łącznie 60 μl) dla urządzenia FFI. Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, rozproszą się one po około 10 minutach od napełnienia, ponieważ PDMS jest porowaty.
    8. Dodaj sterylny ddH2O (~100-200 μL) na szalce Petriego, aby utrzymać wilgotność.

3. Hodowla mikroorganizmów

UWAGA: Poniższe kroki zapewniają ogólną procedurę mikrobiologiczną dla hodowli grzybów i bakterii i powinny być przeprowadzane w sterylnych warunkach (tj. przy użyciu płomienia lub komory bezpieczeństwa mikrobiologicznego) odpowiednich dla poziomu hermetyczności wymaganego dla pożądanych mikrobów. Konkretne przykłady znajdują się na końcu każdej sekcji dla danego gatunku.

  1. Kultura grzybów
    1. Przygotuj żądaną pożywkę hodowlaną uzupełnioną agarem. Podłoże należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury 50 °C i przelać na szalki Petriego o średnicy 9 cm, utrzymując sterylne warunki.
    2. Użyj świdra korkowego, aby usunąć korek agaru o średnicy 4 mm zawierający grzybnię z kolonii bulionu w lodówce pożądanego szczepu grzyba, aby aktywować izolat. Przeprowadza się to w celu zapewnienia standaryzowanego i energicznego wzrostu grzyba przed inokulacją urządzenia.
      UWAGA: Mikroorganizmy mogą być również aktywowane z zapasu glicerolu, tj. izolatów grzybów przechowywanych na korkach agarowych w 50% roztworze glicerolu w temperaturze -70 °C41.
    3. Umieścić bok zatyczki z grzybnią stykającą się z powierzchnią agaru w środku niezaszczepionej szalki Petriego. Załóż pokrywkę na szalkę Petriego i zamknij przed inkubacją w temperaturze odpowiedniej dla pożądanego szczepu przez wymagany czas, zwykle około 3 do 4 dni.
      UWAGA: Przykładowe warunki hodowli Trichoderma rossicum: Agar z ekstraktem słodowym, inkubowany w temperaturze 25 °C w ciemności przez 48 godzin.
  2. Kultura bakteryjna
    1. Usuń żądany izolat bakteryjny z materiału źródłowego (np. glicerolu lub pojedynczej kolonii z płytki agarowej) na płytkę agarową, aby uzyskać pojedyncze kolonie bakteryjne i upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń45. Uszczelnij płytkę folią.
    2. Inkubować w temperaturze i czasie specyficznym dla badanego izolatu, aż do momentu zaobserwowania poszczególnych kolonii.
    3. Przygotuj żądany bulion kulturowy. Na przykład dodać 10 g tryptonu, 10 g NaCl i 5 g ekstraktu drożdżowego na 1 l ddH2O, aby przygotować pożywkę LB do hodowli B. subtilis. Podłoże należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
    4. Pozwól pożywce ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać pożywkę do sterylnej kolby hodowlanej w sterylnym środowisku.
    5. Dotknąć pojedynczej kolonii bakteryjnej z płytki agarowej za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania. Przenieść zaszczepioną pętlę do sterylnej pożywki hodowlanej, krótko dotykając cieczy pętlą.
    6. Kolbę należy zamknąć sterylną pokrywką lub folią i umieścić na noc w inkubatorze z wytrząsaniem, stosując ustawienia odpowiednie dla wybranego gatunku.
      UWAGA: Przykładowe warunki hodowli B. subtilis: i) kultura płynna - wzrost tlenowy w temperaturze 37 °C przy 200 obr./min w pożywce LB oraz ii) kultura płytkowa - temperatura pokojowa na płytce agarowej LB. Więcej informacji na temat hodowli różnych szczepów grzybów można znaleźć w dokumentach FFI/BFI40,41.

4. Inokulacja urządzenia

UWAGA: Następujące kroki powinny odbywać się wewnątrz okapu z przepływem laminarnym przy użyciu sterylnego sprzętu.

  1. Inokulacja grzybów
    1. Za pomocą wysterylizowanego świdra korkowego (ø = 4 mm) usunąć zatyczkę agarową z kolonii na obrzeżach 3-dniowej kultury (krok 3.1). Upewnij się, że rosnący front strzępki pozostaje nienaruszony.
    2. Wprowadzić zatyczkę do wlotu grzyba, grzybnią do dołu, z kierunkiem wzrostu czoła strzępki skierowanym w stronę otworów mikrokanałów, aby zachęcić do infiltracji kanałów strzępkami.
    3. Powtórzyć kroki 4.1.1-4.1.2 dla drugiego gatunku grzyba (w przypadku korzystania z urządzenia FFI), wprowadzając korek do przeciwległego wlotu. Jeśli korzystasz z urządzenia BFI, pomiń ten krok i przejdź do kroku 4.1.4.
    4. Uszczelnić szalkę Petriego przezroczystą folią i inkubować w temperaturze 25–28 °C w ciemności do momentu rozpoczęcia obrazowania. Określ czas inkubacji przed obrazowaniem w zależności od zamierzonego zdarzenia biologicznego, które ma być obserwowane, np. konfrontacji grzybów z grzybami, oraz tempa wzrostu gatunków uwzględnionych w urządzeniu.
  2. Inokulacja bakteryjna
    1. Rozcieńczyć bakterie z hodowli przez noc (krok 3.2) w stosunku 1:25, używając tej samej pożywki, jak opisano w kroku 3.2.3. Hodowla przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Przemyć bakterie przez granulowanie kultury za pomocą wirówki o sile 2000 x g przez 10 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości 0,9% m/v roztworu chlorku sodu.
    3. Odwirować ponownie, aby uzyskać osad. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w płynnym podłożu (np. C. cinerea minimalna pożywka do OD600 1). Zoptymalizuj wartość OD600 dla danego szczepu bakteryjnego.
    4. Wyjąć urządzenie BFI z inkubatora i otworzyć je w sterylnym środowisku. Odpipetować 10 μl zawiesiny do wlotu bakterii.
      UWAGA: Zoptymalizuj dokładne czasy inokulacji dla omawianych interakcji bakteryjno-grzybiczych. Na przykład, wprowadź bakterie do urządzenia BFI 18 godzin po inokulacji grzybów, jeśli używasz C. cinerea.
    5. Uszczelnić szalkę Petriego przezroczystą folią i inkubować w temperaturze 25 °C w ciemności do momentu rozpoczęcia obrazowania. Przechowuj urządzenie w pozycji pionowej.

5. Mikroskopia i analiza obrazu

  1. Mikroskopia
    UWAGA: Badacz powinien dobrać odpowiednią metodę obrazowania zgodną z charakterem eksperymentu, który ma być przeprowadzony, na przykład odwróconą epifluorescencję szerokopolową lub mikroskopię konfokalną. W tym miejscu przedstawiono ogólny przegląd, ponieważ szczegółowe informacje będą zależeć od atrybutów wybranego zestawu mikroskopowego.
    1. Włącz komputer mikroskopowy, główny korpus mikroskopu (jeśli dotyczy), kamerę, inkubator z kontrolowaną temperaturą i źródło światła. Upewnij się, że mikroskop został prawidłowo ustawiony, np. oświetlenie Köhlera zostało prawidłowo zastosowane w celu równomiernego oświetlenia próbki. Uruchom pakiet oprogramowania do obrazowania.
      UWAGA: W przypadku korzystania z inkubatora z kontrolowaną temperaturą ważne jest, aby przed rozpoczęciem eksperymentu pozwolić na wyrównanie temperatury mikroskopu przez kilka godzin.
    2. Zamontuj urządzenie mikroprzepływowe we wkładzie stolika. Upewnij się, że urządzenie jest dobrze zabezpieczone, tj. taśmą, aby zapobiec przemieszczeniu się urządzenia podczas aktywnego stage ruch.
    3. Zdobądź obrazy zaszczepionych urządzeń, np. eksperymenty jednopunktowe lub poklatkowe. Szczegółowe specyfikacje obrazowania dotyczące eksperymentów przeprowadzonych za pomocą urządzeń BFI i FFI znajdują się w odpowiednich wyżej wymienionych publikacjach40,41.
      UWAGA: Obrazy jasnego pola uzyskano przy użyciu mikroskopii kontrastu fazowego w celu wizualizacji proliferacji strzępek przez kanały wzrostu za pomocą oprogramowania do autofokusa i 10-krotnego powiększenia, 0,30 NA (przysłona numeryczna) lub 20-krotnego powiększenia, 0,45 NA. Wzbudzenie fluorescencyjnych białek reporterowych osiągnięto za pomocą silnika świetlnego z diodą elektroluminescencyjną o dużej mocy o długościach fal charakterystycznych dla fluoroforu.
    4. Eksportuj obrazy do odpowiedniego formatu w celu późniejszego przetwarzania obrazu. Na przykład .tiff.
  2. Analiza obrazu
    UWAGA: Autorzy zalecają Fiji46 jako narzędzie do analizy obrazu, ale dostępne są inne pakiety oprogramowania. Poniżej znajdują się przykłady analiz obrazowych przeprowadzonych z wykorzystaniem Fiji z prezentowanych publikacji dotyczących urządzeń BFI i FFI. Te kroki są specyficzne dla komputera Mac i mogą się nieznacznie różnić w przypadku korzystania z komputera PC.
    1. Pomiary szybkości wzrostu strzępek
      UWAGA: Ta metoda została użyta w manuskrypcie BFI40 do pomiaru tempa wzrostu poszczególnych strzępek.
      1. Pobierz, zainstaluj i uruchom Fidżi. Zaimportuj sekwencję obrazów z eksperymentu poklatkowego, wybierając opcję Plik > Importuj > Sekwencja obrazów. Znajdź folder, w którym są przechowywane dane, i wybierz pozycję Otwórz. W oknie Opcje sekwencji wybierz Preferencje, a następnie OK.
      2. Wybierz ikonę Linia prosta z głównego paska narzędzi. Umieść początek linii prostej na końcu rosnącej końcówki strzępka, klikając, a następnie jednocześnie przeciągając kursor do innego punktu w oknie. Pojawi się żółta linia z trzema polami wskazującymi początek, środek i koniec linii.
      3. Przejdź do następnej klatki w sekwencji obrazów, naciskając i przytrzymując Ctrl i >. Umieść koniec linii prostej na końcu rosnącego łącznika, zaznaczając i przeciągając kwadratowe pole do właściwej pozycji.
      4. Naciśnij i przytrzymaj Ctrl i M, aby zmierzyć długość linii w pikselach. Pojawi się okno Wyniki z zmierzonymi danymi. Zdefiniuj dane wyświetlane w oknie Wyniki w następujący sposób: kliknij okno Wyniki, a następnie wybierz Wyniki > Ustaw pomiary.
      5. Przejdź do następnej klatki w sekwencji obrazu, naciskając i przytrzymując Ctrl, a następnie >. Umieść początek linii prostej na końcu rosnącego łącznika, zaznaczając i przeciągając kwadratowe pole do właściwej pozycji.
      6. Naciśnij i przytrzymaj Ctrl, a następnie M, aby zmierzyć długość linii w pikselach. Pojawi się okno Wyniki z zmierzonymi danymi.
      7. Powtarzaj kroki 5.2.1.5-5.2.1.6, aż zakończysz mierzenie wzrostu strzępki w pikselach.
      8. Zaznacz wszystkie dane w oknie Wyniki. Skopiuj i wklej do innego programu, np. arkusza kalkulacyjnego, aby przetworzyć dane. Wykreśl wzrost strzępek (w pikselach lub mikrometrach) w funkcji czasu i oblicz średnie tempo wzrostu. Wykonać co najmniej trzy powtórzenia biologiczne w każdym doświadczeniu.
    2. Pomiary intensywności fluorescencji
      UWAGA: Metoda ta została wykorzystana w publikacji FFI41 do oceny zmiany intensywności fluorescencji w strzępkach Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP po kontakcie z Clonostachys rosea 016 w funkcji czasu.
      1. Pobierz, zainstaluj i uruchom Fidżi. Zaimportuj sekwencję obrazów z eksperymentu poklatkowego, wybierając opcję Plik > Importuj > Sekwencja obrazów. Znajdź folder, w którym są przechowywane dane, i wybierz pozycję Otwórz. W oknie Opcje sekwencji wybierz Preferencje, a następnie OK.
      2. Określ obszar zainteresowania (ROI), aby zmierzyć bezwzględną intensywność fluorescencji łącznika za pomocą prostokątnego narzędzia znajdującego się na głównym pasku narzędzi. Rozmiar kwadratu można zdefiniować dokładnie w następujący sposób: Edycja > Zaznaczenie > Określ; ROI można również zapisać do wykorzystania w przyszłości w Menedżerze ROI, wybierając opcję Edytuj > zaznaczenie > Dodaj do menedżera.
      3. Zmierz bezwzględną intensywność fluorescencji (średnią wartość szarości) w ramach zdefiniowanego ROI dla każdego obrazu w całej sekwencji obrazów lub stosie w następujący sposób: Stosy > obrazu > Zmierz stos. Okno wyników otworzy się automatycznie po przetworzeniu wszystkich obrazów w stosie.
        UWAGA: Dane wyświetlane w oknie Wyniki można zdefiniować w następujący sposób: kliknij w okno Wyniki, a następnie wybierz Wyniki, > Ustaw pomiary. Upewnij się, że wybrano opcję Średnia wartość szarości.
      4. Zaznacz wszystkie dane w oknie Wyniki. Skopiuj i wklej do innego programu, np. arkusza kalkulacyjnego, aby wykreślić bezwzględne intensywności fluorescencji określonego ROI w funkcji czasu.
      5. Powtórz kroki 5.2.2.2-5.2.2.4, aby zebrać pomiary bezwzględnej intensywności fluorescencji dla każdego ROI, tj. na łączniku będącym przedmiotem zainteresowania, obok łącznika będącego przedmiotem zainteresowania lub w obrębie odpowiedniego kanału kontrolnego.
      6. Oblicz odpowiednie względne intensywności fluorescencji w dowolnych jednostkach (AU), np. dzieląc bezwzględną intensywność fluorescencji ROI [strzępek zainteresowania] przez bezwzględną intensywność fluorescencji ROI [kanał kontrolny]. Więcej szczegółów można znaleźć w publikacji FFI41.
      7. Wykonać co najmniej trzy powtórzenia biologiczne w każdym doświadczeniu i wykreślić względne intensywności fluorescencji w funkcji czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki są prezentowane z przykładowych urządzeń BFI40 i FFI41. Pomiary szybkości wzrostu strzępek można łatwo uzyskać za pomocą tych urządzeń w połączeniu z podstawowymi technikami mikroskopowymi. Rysunek 3A-B ilustruje interakcje bakteryjno-grzybicze między strzępkami C. cinerea i B. subtilis NCIB 3610. Obecność B. subtilis hamuje wzrost C. cinerea po ok. 5 godzinach o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono protokół badania oddziaływań grzybowo-mikrobiologicznych z wykorzystaniem mikrofluidyki kanałowej. Autorzy dążą do wykazania wszechstronności tych urządzeń i zachęcają do adaptacji do zainteresowań badacza. Korzystając z przykładowych urządzeń BFI i FFI, można badać interakcje grzybowo-mikrobiologiczne bardziej szczegółowo niż było to wcześniej dostępne. Usuwając złożoność tła i niejednorodność gleby, moderując wzrost strzępek w taki sposób, że są one ograniczone do jednej warstwy i ściśle regulu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Wydziału Bioinżynierii w Imperial College London oraz The Leverhulme Trust (Numer grantu badawczego: RPG-2020-352).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarDifco Laboratories214010Służy do zestalania pożywki hodowlanej do hodowli bakterii i grzybów na szalkach Petriego
Folia aluminiowaFisher Scientific Ltd11759408
AutoCAD 2021Autodesk, USA
Autoklaw (VX-75)Systec
(5810R)Eppendorf
ChlorotrimetysilanMerck Life Sciences386529UWAGA: Chlorotrimetylosilian jest substancją niebezpieczną. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz zapobiegać wdychaniu. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu i używać w dobrze wentylowanym miejscu.
Świder korkowySLSCOR1000
Rozwiązanie deweloperskie (mr-Dev 600)Microresist TechnologiesUWAGA: roztwór wywoływacza mr-Dev 600 jest łatwopalny
Kolby ErlenmeyeraVWR214-1108np. 200 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb
Etanol (70% v/v) Fisher Scientific LtdE/0650DF/15Rozcieńczony od 99,8% (klasa odczynnika analitycznego)
FijiImageJPrzykładowy pakiet oprogramowania do przetwarzania obrazowania
Filtrowane, sprężone powietrzeDostępne w standardzie w większości laboratoriów. Alternatywnie można zastosować sprężarkę bezolejową z regulatorem powietrza.
Pęseta waflowa z płaskągłówką SLSINS5026
KleszczeFisher Scientific Ltd10008051Wygięta, ostra
Szalka Petriego ze szklanym dnemWorld Precision InstrumentsFD35-10035 mm
Szalka Petriego ze szklanym dnemWorld Precision InstrumentsFD5040-10050 mm
Szklane naczynia krystalizacyjneVWR216-1865Używany do mycia płyt PDMS
Szklane naczynia krystalizacyjneVWR216-1866Stosowane przy opracowywaniu form wzorcowych
Szklane butelki na podłożaFisher Scientific Ltd15456113np. 250 ml; wybierz rozmiar dokładnie dopasowany do swoich potrzeb
Szklana strzykawka (Hamilton)Fisher Scientific Ltd10625251Służy do dozowania chlorotrimetylosilianu
Płyta grzejna (HP 160 III BM)SAWATEC
Pętla inokulacyjnaVWRCOPA175CS01
Alkohol izopropylowySigma-AldrichW292907
Okap z przepływem laminarnymAir Science (PCR)Przykładowy okap z przepływem laminarnym używany do produkcji urządzeń
Pożywka LBFisher Scientific LtdBP9723-500Przykładowy bulion odżywczy do nocnej hodowli
bakteriiSilnik świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LedHUB)Omicron-Laserage Laserprodukte GmbHPrzykładowe źródło światła, które można wykorzystać do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych (fluorescencja)
MA6 Nakładka na maskę ultrafioletowąSuss Microtec
Ekstrakt słodowyVWR84618Służy do produkcji przykładowej pożywki do hodowli grzybów (agar z ekstraktem słodowym)
Pisarz masekMateriały stosowane4700DPPrzykład edytora masek, który można wykorzystać do wydrukowania maski fotograficznej do fotolitografii
Uchwyt z tworzywa sztucznegoUchwyt drukowany na zamówienie w 3D wyprodukowany na zamówienie
Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego  (BioMat2)z zamkniętym powietrzemMSC używany do hodowli drobnoustrojów i inokulacji urządzeń
WodaDostępne w standardzie w laboratoriach biologicznych. 
NaOHFisher Scientific LtdBP359-500
Oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements Advanced ResearchPakiet oprogramowania NikonExemplar do akwizycji obrazów
NIS-Elements Free ViewerPakiet oprogramowania NikonExemplar do przeglądania pozyskanych obrazów
Piekarnik (Binder BD115)Fisher Scientific Ltd15602126Służy do utwardzania poli(dimetylosiloksan)(PDMS)
Piekarnik (CLO-2AH-S)KOYOSłuży do przygotowania wafli krzemowych
ParafilmBemisHS234526B
szalki Petriego z folii, kwadratowe sterylneFisher Scientific Ltd11708573szalki Petriego 120,5 mm
, sterylneFisher Scientific Ltd1537036690 mm 
Maska fotolitograficznaMicro Lithography Services Ltd. Wielka Brytania
Odkurzacz plazmowy (Zepto)Diener Electronic100012601
Kubek plastikowySemadeni8323
Szpatułka plastikowaSemadeni3340
Przenośna waga precyzyjna (OHAUS Scout)Fisher Scientific Ltd15519631Służy do ważenia PDMS, media komponenty itp.
Nóż precyzyjnySyneoHS1251135P1183Średnica krawędzi tnącej: 3,18 mm
Nóż precyzyjny SyneoHS1871730P1183SŚrednica krawędzi tnącej: 4,75 mm
Profilometr BrukerDektak XT-stylus
ŻyletkiHä berle Labortechnik9156110
LodówkaHaden4-6 ° C
Kamera CCD Retiga R1QimagingPrzykładowa kamera, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Magiczna taśma klejącaOffice Depot396995419 mm niewidoczna taśma; przezroczysta taśma
Inkubator wstrząsający (Cole-Parmer SI500)Fisher Scientific Ltd10257954
Wafel krzemowyInseto100 mm
Szkło sodowo-wapniowe płytkaInseto125 mm x 125 mm x 2 mm. Służy do mocowania maski fotolitograficznej w nakładce
maski Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Spincoater SAWATECSM-180-BM
SU-8 2010 fotorezystorMicroChemUWAGA: Fotorezystor SU-8 jest niebezpieczny, należy zachować ostrożność podczas obsługi i unikać wdychania i kontaktu ze skórą. Łatwopalny, potencjalnie rakotwórczy i toksyczny dla środowiska.
Zestaw elastomerów Sylgard 184VWR634165SSłuży do przygotowania urządzeń z poli(dimetylosiloksanu)(PDMS)
Inkubator z kontrolowaną temperaturąInkubator OkolabExemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Mikroskop odwróconej epifluorescencji Ti2-EMikroskop NikonMEA54000Exemplar, który może być używany do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Myjka ultradźwiękowa S-LineFisher Scientific LtdFB15050
Eksykator próżniowyFisher Scientific Ltd10528861Odgazowanie silianizacji i PDMS należy przeprowadzać w oddzielnych eksykatorach
x10/0,3 NA Soczewka obiektywowa CFI Plan Fluor DLNikonMRH20105Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
x20/0,45 NA CFI Plan Fluor DL soczewka obiektywowaNikonMRH48230Exemplar soczewka obiektywowa, która może być używana do obrazowania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych
Wirówka Master Mold Wzór roztworów oczyszczona Milli-Q przezroczyste

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
  2. Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial functional profiles of phosphorus cycling in diverse agroecosystems. The ISME Journal. 14 (3), 757-770 (2020).
  3. Op De Beeck, M., et al. Regulation of fungal decomposition at single-cell level. The ISME Journal. 14 (4), 896-905 (2020).
  4. Bender, S. F., et al. Symbiotic relationships between soil fungi and plants reduce N2O emissions from soil. The ISME Journal. 8 (6), 1336-1345 (2014).
  5. Dullah, S., et al. Melanin production and laccase mediated oxidative stress alleviation during fungal-fungal interaction among basidiomycete fungi. IMA Fungus. 12 (1), 33(2021).
  6. Deveau, A., et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 335-352 (2018).
  7. Bian, R., et al. Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (7), 3779-3788 (2020).
  8. Jiang, X., Xiang, M., Liu, X. Nematode-trapping fungi. Microbiology Spectrum. 5 (1), (2017).
  9. Essig, A., et al. a novel peptide-based fungal antibiotic interfering with the peptidoglycan synthesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34953-34964 (2014).
  10. Tang, H. -Y., Zhang, Q., Li, H., Gao, J. -M. Antimicrobial and allelopathic metabolites produced by Penicillium brasilianum. Natural Product Research. 29 (4), 345-348 (2015).
  11. Bai, Y. -B., et al. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi In vitro and In vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (22), 6125-6132 (2019).
  12. Solanki, M. K., et al. Characterization of antagonistic-potential of two Bacillus strains and their biocontrol activity against Rhizoctonia solani in tomato. Journal of Basic Microbiology. 55 (1), 82-90 (2015).
  13. Jamali, H., Sharma, A., Srivastava, A. K. Biocontrol potential of Bacillus subtilis RH5 against sheath blight of rice caused by Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology. 60 (3), 268-280 (2020).
  14. Válková, H., Novotný, Č, Malachová, K., Šlosarčíková, P., Fojtík, J. Effect of bacteria on the degradation ability of Pleurotus ostreatus. Science of The Total Environment. 584-585, 1114-1120 (2017).
  15. Leyva-Rojas, J. A., Coy-Barrera, E., Hampp, R. Interaction with soil bacteria affects the growth and amino acid content of Piriformospora indica. Molecules. 25 (3), Basel, Switzerland. 572(2020).
  16. Dullah, S., et al. Fungal interactions induce changes in hyphal morphology and enzyme production. Mycology. 12 (4), 279-295 (2021).
  17. Marfetán, J. A., Romero, A. I., Folgarait, P. J. Pathogenic interaction between Escovopsis weberi and Leucoagaricus sp.: mechanisms involved and virulence levels. Fungal Ecology. 17, 52-61 (2015).
  18. Cortois, R., De Deyn, G. B. The curse of the black box. Plant and Soil. 350 (1), 27-33 (2012).
  19. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  20. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  21. Hanson, K. L., et al. Fungi use efficient algorithms for the exploration of microfluidic networks. Small. 2 (10), 1212-1220 (2006).
  22. Held, M., Edwards, C., Nicolau, D. V. Probing the growth dynamics of Neurospora crassa with microfluidic structures. Fungal Biology. 115 (6), 493-505 (2011).
  23. Thomson, D. D., et al. Contact-induced apical asymmetry drives the thigmotropic responses of Candida albicans hyphae. Cellular Microbiology. 17 (3), 342-354 (2015).
  24. Lee, K. K., Labiscsak, L., Ahn, C. H., Hong, C. I. Spiral-based microfluidic device for long-term time course imaging of Neurospora crassa with single nucleus resolution. Fungal Genetics and Biology. 94, 11-14 (2016).
  25. Asenova, E., Lin, H. Y., Fu, E., Nicolau, D. V., Nicolau, D. V. Optimal fungal space searching algorithms. IEEE Transactions on NanoBioscience. 15 (7), 613-618 (2016).
  26. Soufan, R., et al. Pore-scale monitoring of the effect of microarchitecture on fungal growth in a two-dimensional soil-like micromodel. Frontiers in Environmental Science. 6, (2018).
  27. Uehling, J. K., et al. Microfluidics and metabolomics reveal symbiotic bacterial-fungal interactions between Mortierella elongata and Burkholderia include metabolite exchange. Frontiers in Microbiology. 10, 2163(2019).
  28. Millet, L. J., et al. Increasing access to microfluidics for studying fungi and other branched biological structures. Fungal Biology and Biotechnology. 6 (8), 1-14 (2019).
  29. Baranger, C., Fayeulle, A., Le Goff, A. Microfluidic monitoring of the growth of individual hyphae in confined environments. Royal Society Open Science. 7 (8), 191535(2020).
  30. Aleklett, K., Ohlsson, P., Bengtsson, M., Hammer, E. C. Fungal foraging behaviour and hyphal space exploration in micro-structured Soil Chips. The ISME Journal. 15 (6), 1782-1793 (2021).
  31. Aleklett, K., et al. Build your own soil: exploring microfluidics to create microbial habitat structures. The ISME Journal. 12 (2), 312-319 (2018).
  32. Ellett, F., Jorgensen, J., Frydman, G. H., Jones, C. N., Irimia, D. Neutrophil interactions stimulate evasive hyphal branching by Aspergillus fumigatus. PLOS Pathogens. 13 (1), 1006154(2017).
  33. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  34. Schmieder, S. S., et al. Bidirectional propagation of signals and nutrients in fungal networks via specialized hyphae. Current Biology. 29 (2), 217-228 (2019).
  35. Tayyrov, A., Stanley, C. E., Azevedo, S., Künzler, M. Combining microfluidics and RNA-sequencing to assess the inducible defensome of a mushroom against nematodes. BMC Genomics. 20 (1), 243(2019).
  36. Stanley, C. E., Grossmann, G., Casadevall i Solvas, X., deMello, A. J. Soil-on-a-Chip: microfluidic platforms for environmental organismal studies. Lab on a Chip. 16 (2), 228-241 (2016).
  37. Stanley, C. E., vander Heijden, M. G. A. Microbiome-on-a-Chip: new frontiers in plant-microbiota research. Trends in Microbiology. 25 (8), 610-613 (2017).
  38. Ortseifen, V., Viefhues, M., Wobbe, L., Grünberger, A. Microfluidics for biotechnology: bridging gaps to foster microfluidic applications. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology. 8, 589074(2020).
  39. Jansson, J. K., Hofmockel, K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics. Current Opinion in Microbiology. 43, 162-168 (2018).
  40. Stanley, C. E., et al. Probing bacterial-fungal interactions at the single cell level. Integrative Biology (Camb). 6 (10), 935-945 (2014).
  41. Gimeno, A., et al. A versatile microfluidic platform measures hyphal interactions between Fusarium graminearum and Clonostachys rosea in real-time. Communications Biology. 4 (1), 262(2021).
  42. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  43. Stanley, C. E., et al. Fabrication and use of the dual-flow-RootChip for the imaging of Arabidopsis roots in asymmetric microenvironments. Bio-protocol. 8 (18), 3010(2018).
  44. Choi, C. -H., Lee, H., Weitz, D. A. Rapid patterning of PDMS microfluidic device wettability using syringe-vacuum-induced segmented flow in nonplanar geometry. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3170-3174 (2018).
  45. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Harting, R., et al. Pseudomonas strains induce transcriptional and morphological changes and reduce root colonization of Verticillium spp. Frontiers in Microbiology. 12, 652468(2021).
  48. Boenisch, M. J. Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during Fusarium head blight infection. , Staats-und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky. (2013).
  49. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlovsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum and V. dahliae with Brassica napus detected with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  50. Ghanem, N., Stanley, C. E., Harms, H., Chatzinotas, A., Wick, L. Y. Mycelial effects on phage retention during transport in a microfluidic platform. Environmental Science & Technology. 53 (20), 11755-11763 (2019).
  51. Alrifaiy, A., Lindahl, O. A., Ramser, K. Polymer-based microfluidic devices for pharmacy, biology and tissue engineering. Polymers. 4 (3), 1349-1398 (2012).
  52. Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 554-567 (2015).
  53. Hoelzle, D., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenia mikrofluidyczneinterakcje bakterii i grzyb winterakcje grzyb w i grzyb wobrazowanie o wysokiej rozdzielczo cimikroskopia fluorescencyjnamikrobiom glebowywzrost strz pektest na szalce Petriegoobrazowanie poklatkowe

Powiązane artykuły