Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w aorcie piersiowej myszy za pomocą tensometrycznej miografii komory o małej objętości

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63918

⸱

12 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Graduate Studies, Midwestern University, 2Department of Child Health, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona, Phoenix

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje koncepcje i techniczne zastosowanie techniki miografu tensometrycznego z wykorzystaniem wielokomorowego systemu miograficznego w eksperymentalnej ocenie ex vivo funkcji śródbłonka aorty myszy.

Streszczenie

Miografia tensometryczna w małej komorze objętościowej jest powszechnie stosowaną techniką do oceny kurczliwości naczyń krwionośnych małych i dużych naczyń krwionośnych u zwierząt laboratoryjnych i małych tętnic wyizolowanych z tkanek ludzkich. Technika ta pozwala naukowcom utrzymywać izolowane naczynia krwionośne w ściśle kontrolowanym i znormalizowanym (prawie fizjologicznym) otoczeniu, z możliwością dostosowania się do różnych czynników środowiskowych, jednocześnie rzucając wyzwanie izolowanym naczyniom za pomocą różnych środków farmakologicznych, które mogą indukować zwężenie lub rozszerzenie naczyń krwionośnych. Komora miografu stanowi również platformę do pomiaru reaktywności naczyń krwionośnych w odpowiedzi na różne hormony, inhibitory i agonistów, które mogą wpływać na funkcję mięśni gładkich i warstw śródbłonka oddzielnie lub jednocześnie. Ściana naczynia krwionośnego jest złożoną strukturą składającą się z trzech różnych warstw: błony wewnętrznej (warstwy śródbłonka), mediów (mięśni gładkich i włókien elastyny) oraz przydanki (kolagen i inna tkanka łączna). Aby uzyskać jasne zrozumienie właściwości funkcjonalnych każdej warstwy, kluczowe znaczenie ma dostęp do eksperymentalnej platformy i systemu, które pozwoliłyby na podejście kombinowane do badania wszystkich trzech warstw jednocześnie. Takie podejście wymaga dostępu do stanu półfizjologicznego, który naśladowałby środowisko in vivo w warunkach ex vivo. Miografia tensometryczna w komorze o małej objętości zapewniła idealne środowisko do oceny wpływu sygnałów środowiskowych, zmiennych eksperymentalnych lub farmakologicznych agonistów i antagonistów na właściwości naczyniowe. Przez wiele lat naukowcy wykorzystywali technikę miografu tensometrycznego do pomiaru funkcji śródbłonka i kurczliwości mięśni gładkich w odpowiedzi na różne czynniki. W tym raporcie do pomiaru funkcji śródbłonka w izolowanej aorcie myszy zastosowano tensometryczny system miograficzny o małej objętości komory. Niniejszy raport koncentruje się na tym, w jaki sposób miografia tensometryczna w komorze o małej objętości może być wykorzystana do oceny integralności funkcjonalnej śródbłonka w małych odcinkach dużej tętnicy, takiej jak aorta piersiowa.

Wprowadzenie

Przez ostatnie kilka dekad, system miografii w małej komorze był używany do pomiaru reaktywności różnych warstw ścian naczyń krwionośnych w odpowiedzi na różne czynniki farmakologiczne i neuroprzekaźniki w warunkach ex vivo, w czasie rzeczywistym. Reaktywność naczyniowa jest głównym składnikiem zdrowego, funkcjonalnego naczynia krwionośnego i ma kluczowe znaczenie dla regulacji przepływu krwi i perfuzji w naczyniach obwodowych i mózgowych1. W obrębie ściany naczynia krwionośnego interakcja między warstwami śródbłonka i mięśni gładkich jest głównym wyznacznikiem napięcia naczyniowego, na które stale wpływają również zmiany strukturalne w warstwie tkanki łącznej otaczającej ścianę naczynia krwionośnego (przydanka).

Warstwa śródbłonka kontroluje ruch naczyń krwionośnych poprzez uwalnianie kilku czynników rozszerzających naczynia krwionośne, w tym tlenku azotu (NO), prostacykliny (PGI2) i czynnika hiperpolaryzacyjnego pochodzącego ze śródbłonka (EDHF), lub poprzez wytwarzanie środków zwężających naczynia krwionośne, takich jak endotelina-1 (ET-1) i tromboksan (TXA2)2,3,4. Wśród tych czynników, NO został szeroko przebadany, a jego ważne role regulacyjne w innych krytycznych funkcjach komórkowych, takich jak zapalenie, migracja, przeżycie i proliferacja, były często cytowane w literaturze naukowej2,5.

W dziedzinie biologii naczyniowej, miografia komorowa dostarczyła fizjologom naczyniowym i farmakologom cennego i niezawodnego narzędzia do pomiaru funkcji śródbłonka w ściśle kontrolowanym systemie półfizjologicznym1. Obecnie naukowcy mają do dyspozycji dwa różne systemy miograficzne: miografia tensometryczna (izometryczna) drutowa (lub szpilkowa) i miografia ciśnieniowa. W systemie miografii drucianej naczynie krwionośne jest rozciągnięte między dwoma drutami lub szpilkami, co pozwala na izometryczny pomiar rozwoju siły lub napięcia w ścianie naczynia krwionośnego, podczas gdy miografia ciśnieniowa jest preferowaną platformą do pomiarów reaktywności naczyniowej w małych tętnicach oporowych, gdzie zmiany ciśnienia krwi są uważane za główny bodziec do zmian napięcia naczyniowego i wazomotorii. Istnieje ogólna zgoda co do tego, że w przypadku małych tętnic oporowych, takich jak tętnice krezkowe i mózgowe, miografia ciśnieniowa tworzy stan bliższy stanom fizjologicznym w ludzkim ciele. Miograf małokomorowy może być stosowany do naczyń o bardzo małych średnicach (200-500 μm) do znacznie większych naczyń, takich jak aorta.

Podczas gdy miograf przewodowy jest potężnym systemem do rejestrowania napięcia naczyń krwionośnych w warunkach izometrycznych, miograf ciśnieniowy jest bardziej odpowiednim systemem do pomiaru zmian średnicy naczynia w odpowiedzi na zmiany warunków izobarycznych. Zmiany średnicy naczynia w odpowiedzi na zmiany ciśnienia lub przepływu są znacznie większe w małej tętnicy mięśniowej (tętniczce) w porównaniu z dużymi tętnicami elastycznymi, takimi jak aorta. Z tych powodów miograf ciśnieniowy jest uważany za lepsze narzędzie dla małych naczyń krwionośnych o znacznej aktywności naczyniowej1. Jedną z innych praktycznych zalet wielokomorowej miografii tensometrycznej w małej objętości jest to, że można dostrzec udział różnych mechanizmów w reaktywności naczyniowej, badając wiele (do czterech) segmentów tej samej tętnicy i od tego samego zwierzęcia w celu zmniejszenia zmienności i uzyskania solidnych i rozstrzygających danych. Jest również stosunkowo łatwy w konfiguracji i konserwacji technicznej. Naczynia o prawie każdej wielkości można badać za pomocą miografu drucianego. Jest to bardziej opłacalne rozwiązanie do oceny funkcji naczyń krwionośnych i stanowi dobrą alternatywę dla miografii ciśnieniowej w eksperymentach, w których długość wypreparowanego naczynia jest zbyt krótka dla protokołu miografu ciśnieniowego.

Ten raport zawiera szczegółowy protokół oceny funkcji śródbłonka w izolowanym pierścieniu aorty piersiowej myszy za pomocą kołków montażowych w technice miografii tensometrycznej w komorze o małej objętości przy użyciu wielokomorowego systemu miograficznego DMT-620 (DMT-USA). Protokół ten wykorzystuje 6-miesięcznego samca myszy C57BL6 o średniej wadze od 25 do 35 g. Na szczęście protokół ten może być stosowany do różnych rodzajów zwierząt i wagi, biorąc pod uwagę szeroki zakres typów i średnic naczyń, do których można go stosować.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury chirurgiczne i opieka nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) Uniwersytetu Środkowo-Zachodniego (IACUC# AZ-3006, AZ-2936).

1. Przygotowanie bufora

UWAGA: Chociaż bufor roztworu soli fizjologicznej HEPES (HEPES-PSS) jest stabilny w temperaturze 4 °C przez 7 dni, zaleca się, aby wszystkie były świeżo przygotowane w dniu każdego eksperymentu. Wszystkie inne odczynniki i agoniści muszą być przygotowywani na świeżo do każdego doświadczenia. Bufor HEPES-PSS stosowany w tym protokole jest dobrze znanym buforem do badań naczyniowych ex vivo, który, jak wykazano, działa cytoprotekcyjnie przez ponad 12 godzin, zachowując jednocześnie reakcje rozszerzające naczynia krwionośne - główny cel tego eksperymentalnego protokołu6,7.

  1. Przygotować roztwór HEPES-PSS (pH 7,4) w następujący sposób: zmieszać 10 mmol/L HEPES, 6 mmol/L glukozy, 1,5 mmol/L CaCl2, 130 mmol/L NaCl, 4 mmol/L KCl, 4 mmol/L NaHCO3, 1,2 mmol/LMgSO4, 1,2 mmol/L KH2PO4 i 0,03 mmol/L EDTA.
  2. Przygotować bufor HEPES-PSS o wysokiej wartości K+. Jest on identyczny z roztworem HEPES-PSS, z tą różnicą, że zawiera 5 mmol/L HEPES, 65 mmol/L NaCl, 10 mmol/L glukozy, 1 mmol/L MgCl2, 80 mmol/L KCl i nie zawieraMgSO4 i EDTA.

2. Przygotowanie jednostki miografu

  1. Włączyć i ustawić łaźnię wodną na 37 °C. Zapewnić odpowiedni poziom wody.
  2. Umieścić dwie odpowiednio oznakowane zlewki w łaźni wodnej, jedną z 600 ml roztworu HEPES-PSS, a drugą ze 150 ml roztworu o wysokiej zawartości K+.
  3. Napowietrzać zlewkę z 300 ml roztworu HEPES-PSS gazem karbogenicznym (5%CO2 i 95%O2) przez co najmniej 10 minut.
  4. Dodać 30 ml napowietrzonego roztworu HEPES-PSS do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, odpowiednio oznaczyć (klatkę piersiową, numer identyfikacyjny myszy) i umieścić na lodzie. Pozostały napowietrzony roztwór HEPES-PSS należy przechowywać na lodzie do użycia podczas procesu rozwarstwiania aorty.
  5. Włączyć czterokomorowy miograf; dodać 6 ml roztworu HEPES-PSS do każdej komory miografu i ustawić temperaturę na 37 °C. Pozostawić roztwór w każdej komorze do napowietrzenia (mieszanką karbogenu) przez 30 minut i sprawdzić, czy komory osiągnęły pożądaną temperaturę 37 °C (wykorzystać ten okres oczekiwania do wypreparowania aorty myszy).
  6. Włącz sprzęt do zbierania danych z myografu i komputer.

3. Izolacja aorty myszy

  1. Znieczulić eksperymentalną mysz 5% inhalacją izofluranu i poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy (do tej demonstracji użyto 6-miesięcznego samca myszy C57BL/6J).
  2. Połóż mysz na desce chirurgicznej w pozycji leżącej na plecach i przymocuj przydatki do deski za pomocą taśmy chirurgicznej.
  3. Spryskaj okolice brzucha 70% alkoholem, aby sierść była całkowicie mokra, a luźne/suche włosy nie dostały się do nacięcia. Delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu.
  4. Użyj kleszczy, aby zlokalizować i odizolować skórę brzucha tuż poniżej wyrostka mieczykowatego mostka.
  5. Stwórz napięcie, unosząc skórę prosto do góry. Wykonaj cięcie nożyczkami i usuń powierzchowną skórę, odsłaniając klatkę piersiową.
  6. Podnieś wyrostek mieczykowaty i wykonaj boczne nacięcia tuż poniżej wyrostka wzdłuż brzegów podżebrowych.
  7. Przedłuż boczne nacięcia czaszki, aby usunąć przednią część klatki piersiowej.
  8. Usuń klatkę piersiową, wykonując cięcie przez kręgosłup, poniżej przepony i w szyi.
    UWAGA: Badacze mogą również usunąć aortę bezpośrednio od zwierzęcia, ale należy zachować ostrożność, aby chronić naczynie i wypłukać zakrzepłą krew z aorty. W protokole tym posłużono się przykładem usunięcia klatki piersiowej oraz starannego oczyszczenia i wypreparowania aorty. Przy nabraniu wprawy metoda ta może być wykonywana szybko i skutecznie i jest korzystna dla zachowania dodatkowej tkanki do innych badań, takich jak immunohistochemia, histologia i western blotting.
  9. Przenieść klatkę piersiową na przezroczystą płytkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym, wypełnioną lodowatym buforem HEPES-PSS i przypiąć ją po obu stronach.
    UWAGA: Użyj zestawu elastomerów silikonowych (tabela materiałów). Wymieszać bazę i utwardzacz (wagowo 10:1), następnie przelać do szklanej szalki Petriego i pozostawić do utwardzenia na 24 godziny w temperaturze 25 °C.
  10. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym, delikatnie odetnij i usuń serce oraz dołączoną aortę z klatki piersiowej, a następnie przenieś do czystej, przezroczystej naczynia pokrytej elastomerem silikonowym (Rysunek 1) .
  11. Następnie delikatnie usuń tłuszcz i tkankę łączną oraz zakrzepłą krew z aorty. Za pomocą ostrych, małych nożyczek wypreparuj i odizoluj całą aortę, zaczynając od obszaru łuku do dolnej części aorty zstępującej. Pamiętaj, że łuk aorty nie nadaje się do eksperymentów miograficznych, ale może być używany do badań histologicznych.
  12. Podczas rozwarstwiania należy stosować napowietrzony na zimno roztwór HEPES-PSS. Zmieniaj rozwiązanie co 10 minut lub gdy widoczność jest zagrożona, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Zaleca się, aby każdy pierścień aortalny został zamontowany w komorze miografu w ciągu 20 minut po rozwarstwieniu (max 60 min).

4. Montaż segmentów aorty na komorach miografu

  1. Przetnij wypreparowaną aortę na cztery segmenty po 2 mm każdy za pomocą ostrych małych nożyczek chirurgicznych. Użyj mini-linijki w naczyniu jako odniesienia.
  2. Umieść komorę miografu pod mikroskopem stereoskopowym z zoomem, aby łatwo uwidocznić szpilki i ustawić mikrometry tak, aby szpilki prawie się stykały (Rysunek 2).
  3. Upewnij się, że oba kołki przytrzymujące chusteczkę są prawidłowo wyrównane.
  4. Zwróć uwagę i unikaj ściskania aorty podczas montowania segmentów, aby zapobiec uszkodzeniu śródbłonka.
  5. W komorach zawierających już 5 ml podgrzanego i napowietrzonego buforu HEPES-PSS ostrożnie wsunąć każdy z 2 mm segmentów aorty na dwa kołki montażowe za pomocą kleszczy. Bądź bardzo delikatny podczas przesuwania segmentów aorty po szpilkach. Warstwa śródbłonka jest bardzo delikatna i bardzo łatwo odpada od strony światła.
  6. Powoli rozsuń szpilki, obracając mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby segment aorty nie zsunął się z szpilek podczas umieszczania komory z powrotem w jednostce miografu (Rysunek 3).
  7. Użyj wcześniej skalibrowanej siatki okularowej mikroskopu preparacyjnego, aby zmierzyć rzeczywistą i dokładną długość zamontowanego pierścienia aortalnego, umieszczając początek linijki na jednym końcu segmentu (oznaczonym jako koniec tkanki α1) i notując pomiar na drugim końcu segmentu aorty w podziałach oka (oznaczonych jako koniec tkanki α2)8. Wartości te będą używane podczas kroków normalizacji w sekcji 5.
  8. Umieść każdą komorę miografu z powrotem w urządzeniu i rozpocznij napowietrzanie komór w temperaturze 37 °C przez 30 minut
    UWAGA: Cztery segmenty aorty mogą być użyte jako powtórzenia do tego samego leczenia lub każdy segment aorty może być używany jednocześnie do różnych eksperymentów.

5. Normalizacja

UWAGA: Procedura normalizacji jest konieczna, aby zapewnić, że warunki eksperymentalne są odpowiednio ustandaryzowane, a zebrane dane są wiarygodne i powtarzalne. "IC1/IC100" lub "współczynnik normalizacji" definiuje się jako stosunek wewnętrznego obwodu tętnicy, przy którym można zarejestrować maksymalną odpowiedź na środek zwężający naczynia krwionośne (np. 60 mM KCl) podzielony przez obwód wewnętrzny, przy którym rejestruje się ciśnienie w ścianie przezściennej wynoszące 100 mm Hg (tj. IC100). Dlatego mnożąc IC100 przez ten stosunek, możemy określić wewnętrzny obwód tętnicy, na którym można ustalić optymalną odpowiedź (tj. IC1).

  1. Ustaw mikrometr tak, aby szpilki prawie się stykały.
  2. Ustaw siły na zero dla wszystkich komór miografu i pozwól mu się zrównoważyć przez kolejne 1-2 minuty.
  3. Zanotuj pierwszy odczyt średnicy z mikrometru. Jest to pozycja, w której odstęp między dwoma stykami jest uważany za zerowy (wymagany w kroku 5.7.).
  4. Otwórz ustawienia normalizacji oprogramowania do akwizycji danych w menu rozwijanym DMT; otworzy się nowy ekran z następującymi ustawieniami i wartościami domyślnymi:
    Kalibracja okularu (mm / dz): 0,36
    Ciśnienie docelowe (kPa): 13,3
    IC1/IC100: 0,9
    Czas uśredniania online: 2
    Czas opóźnienia (s): 60
    Odtwórz dźwięk po zakończeniu z opóźnieniem (pole wyboru)
    Dźwięki (z rozwijanym menu wyboru lub funkcją przeglądania)
  5. W zależności od liczby segmentów wybierz odpowiednią liczbę kanałów dostępnych na ekranie i rozpocznij nagrywanie wykresu.
  6. Użyj menu rozwijanego, aby wybrać interesujący Cię kanał; pojawi się ekran normalizacji.
  7. Wprowadź wartości stałe do okien w następujący sposób: Punkty końcowe tkanek α1; Punkty końcowe tkanek α2; Średnica sworznia: 40 μm; Wartość odczytu mikrometru z analogowej skali mikrometrycznej.
  8. W celu zapisania pierwszego punktu (początkowej wartości X lub X0) należy kliknąć przycisk Dodaj punkt. Po upływie 60 s zostaną wyświetlone wartości siły i ciśnienia efektywnego (ERTP) odpowiadające temu mikrometrowi, a pole odczytu mikrometru stanie się aktywne i dostępne.
  9. Rozpocznij rozciąganie naczynia, obracając mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Użyj pola odczytu mikrometru, aby wprowadzić wartość i kliknij przycisk Dodaj punkt (ponownie nastąpi czas opóźnienia wynoszący 60 s).
  10. Kontynuuj rozciąganie naczynia i kontynuuj dodawanie wartości mikrometrów, aż zobaczysz wartość mikrometra X1, która jest obliczonym ustawieniem mikrometru używanym do rozciągnięcia naczynia do IC1.
  11. Ustaw mikrometr na wartość X1.
    UWAGA: Znormalizowane (optymalne) napięcie dla 6-miesięcznej myszy C57BL6 wynosi 6 mN.
  12. Po normalizacji pozwól tkance odpocząć i wyrównać się przez 30 minut. W tym momencie nie ma potrzeby wymiany roztworu HEPES-PSS w komorach.
    UWAGA: Każda komora jest w stanie pomieścić 8 ml roztworu. Protokół ten jest napisany z użyciem 5 mL, co pozwala na pełne zanurzenie naczynia i kołków montażowych.
  13. Wykorzystaj czas odpoczynku i równowagi, aby przygotować następujące elementy.
    1. Przygotować materiał roboczy seryjnych rozcieńczeń acetylocholiny w wodzie destylowanej (woda RO) od najniższych do najwyższych stężeń w następujący sposób: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM i 1 mM. Trzymaj wszystkie probówki na lodzie na czas trwania eksperymentu.
    2. Przygotować 100 mM roztwór roboczy estru metylowego N-nitro-L-argininy (L-NAME) w wodzie podwójnie destylowanej i utrzymywać roztwór na lodzie przez czas trwania doświadczenia.
    3. Przygotować submaksymalną dawkę fenylefryny (10 μM) oznaczoną w oddzielnym zestawie doświadczeń.
      UWAGA: Okres równowagi jest niezbędny, aby segment naczynia krwionośnego mógł dostosować się do nowego środowiska w komorze miografu, zresetować gradienty jonów i osiągnąć stabilny poziom napięcia pasywnego przed poddaniem go różnym wyzwaniom farmakologicznym i mechanicznym.

6. Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w pierścieniach aortalnych

  1. Pod koniec 30-minutowego okresu równowagi opróżnij komory i dodaj 5 ml świeżego, ciepłego, napowietrzonego roztworu HEPES-PSS do każdej komory. Opróżniaj jedną komorę na raz, aby zminimalizować narażenie tkanek na powietrze. Opróżnianie komór odbywa się za pomocą pompy próżniowej ustawionej na 60 cmHg i zaworów miografu ustawionych na 6 s opóźnienia, aby zapewnić usunięcie 5 ml roztworu.
  2. W razie potrzeby ponownie wyreguluj pomiary siły, aby odczytać optymalne napięcie 6 mN. Bardzo ważne jest, aby ponownie dostosować siłę do optymalnego napięcia podczas każdego okresu inkubacji, a także przed każdym nowym zestawem eksperymentów. Odpocznij tkankę przez kolejne 15-20 minut.
  3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych, zmień numery śledzenia z 50:1 na 500:1 i naciśnij Start. Na tym etapie zarejestrowaną siłę dla każdej komory można zobaczyć w oprogramowaniu.
  4. Bezpośrednio przed rozpoczęciem nowego eksperymentu należy dodać odpowiednią etykietę na oprogramowaniu do pozyskiwania danych.
  5. Opróżnij komory jeszcze raz przed dodaniem 5 ml roztworu o wysokiej zawartości K+ do każdej komory. Jest to odpowiednie do testowania żywotności tkanki aorty i integralności odpowiedzi kurczliwości mięśni gładkich na depolaryzację błony przed użyciem tkanki do jakiegokolwiek innego protokołu eksperymentalnego. Pomaga to określić, czy segment naczynia krwionośnego nadaje się do dalszych eksperymentów.
  6. Opróżnij komory ponownie, gdy tylko reakcja skurczowa na roztwór o wysokiej zawartości K+ osiągnie plateau generowania siły (Rysunek 4).
    UWAGA: Nie pozostawiaj roztworu o wysokiej zawartości K+ w komorach na dłużej niż 3 minuty, ponieważ mogłoby to uszkodzić tkankę.
  7. Umyj chusteczkę roztworem HEPES-PSS 3x. Dodaj 5 ml roztworu o wysokiej zawartości K+ do każdej komory. Opróżnij komory, gdy tylko reakcja skurczowa na roztwór o wysokiej zawartości K+ osiągnie plateau w celu wytworzenia siły i przemyj tkankę 3x HEPES-PSS, zanim pozostawisz tkance na odpoczynek przez kolejne 15 minut.
    UWAGA: W niektórych laboratoriach segmenty krwi są poddawane roztworowi o wysokiej zawartości K+ trzy razy z rzędu, aby zapewnić zmienność naczynia krwionośnego przed rozpoczęciem eksperymentów miografowych. W tym protokole nowo wyizolowane segmenty aorty są dwukrotnie poddawane działaniu roztworu o wysokiej zawartości K+ przed użyciem tkanki do dalszych eksperymentów. Ważne jest, aby było to spójne we wszystkich eksperymentach.
  8. Użyj średniej z dwóch zarejestrowanych szczytów rozwoju siły (siły skurczu) w odpowiedzi na roztwór o wysokiej zawartości K+, aby znormalizować zarejestrowane wartości w odpowiedzi na inne środki zwężające naczynia krwionośne i rozszerzające naczynia krwionośne użyte w eksperymencie.
  9. Odpocznij tkankę przez 15-20 minut.
  10. Wstępnie naskurczyć segmenty aorty środkiem zwężającym naczynia krwionośne fenylefryną (PE) w już ustalonej dawce submaksymalnej (końcowe stężenie 10 μM w komorze).
    UWAGA: Submaksymalną dawkę fenylefryny (10 μM) określono w oddzielnym zestawie doświadczeń, w których odcinki aorty poddano rosnącym stężeniom roztworu fenylefryny przy końcowych stężeniach 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM i 50 μM. W rezultacie ustalono, że końcowe stężenie 10 μM fenylefryny może wytworzyć submaksymalną siłę skurczu (90% maksymalnej siły) w 2 mm odcinkach aorty, czyli tuż przed osiągnięciem plateau przez siłę skurczu. Powodem stosowania submaksymalnego stężenia fenylefryny jest uniknięcie problemów związanych z wysyceniem tkanki aorty lub odczuleniem na agonistę zwężającego naczynia krwionośne.
  11. Pozwól, aby krzywa skurczu wywołana przez PE osiągnęła plateau dla rozwoju napięcia (siły) (Rysunek 5).
  12. Przy plateau rozwoju napięcia do fenylefryny należy wykonać krzywą dawka-odpowiedź acetylocholiny, dodając 5 μl rosnących dawek roboczych roztworów podstawowych acetylocholiny w odstępach 3-minutowych w celu ustalenia końcowych stężeń acetylocholiny w komorze miografu w następujący sposób: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM i 1 μM (Rysunek 6).
    UWAGA: Po dodaniu każdej dawki acetylocholiny należy odczekać co najmniej 3 minuty (aż napięcie osiągnie plateau) przed dodaniem kolejnej dawki.
  13. Na każdym etapie należy bardzo powoli i z dala od pierścieni aortalnych odpipetować roztwór podstawowy acetylocholiny do komory, aby uniknąć zaburzeń tkanek.
  14. Po zakończeniu eksperymentu dawka-odpowiedź opróżnić komory i przemyć segmenty aorty ciepłym i napowietrzonym roztworem HEPES-PSS 3x, aby usunąć wszelkie pozostałości leku.
  15. Odpocznij tkankę przez 30 minut przed rozpoczęciem kolejnych etapów eksperymentu. Żywotność aorty jest sprawdzana przed każdym etapem eksperymentalnym przy użyciu roztworu HEPES-PSS o wysokiej zawartości K+. Jeśli wszystkie etapy przygotowania i doświadczenia zostaną wykonane prawidłowo, żywotność tkanki aorty pozostanie taka sama przez cały czas trwania eksperymentu (4-6 godzin).

7. Wpływ ogólnych inhibitorów produkcji NO na wazorelaksację za pośrednictwem śródbłonka

  1. Do tej części eksperymentu należy użyć tej samej tkanki aorty po dokładnym umyciu i odpoczynku segmentów przez co najmniej 30 minut.
    UWAGA: Wykorzystaj 30-minutowy czas odpoczynku do przygotowania 100 mM roztworu roboczego estru metylowego N-nitro-L-argininy (L-NAME) w wodzie podwójnie destylowanej i trzymaj roztwór na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
  2. Po odpoczynku segmentów aorty przez 30 minut, opróżnij komory i dodaj świeży, ciepły roztwór o wysokiej zawartości K+(60 mM KCl) do każdej komory.
    UWAGA: Ważne jest, aby w każdej części eksperymentu tkanka aorty była prowokowana roztworem o wysokiej zawartości K+ co najmniej raz. Zarejestrowany szczyt skurczu zostanie wykorzystany do normalizacji danych zebranych podczas tej części eksperymentu.
  3. Ponownie opróżnij komory, gdy tylko reakcja skurczowa na roztwór o wysokiej zawartości K+ osiągnie plateau i umyj tkankę roztworem HEPES-PSS 3x.
  4. W celu oceny udziału produkcji NO w obserwowanym wazorelaksacji wywołanym acetylocholiną (patrz punkt 6.), na tym etapie należy wstępnie inkubować segmenty aorty z ogólnym inhibitorem produkcji NO (L-NAME) poprzez dodanie 10 μL przygotowanego 100 mM roboczego roztworu podstawowego L-NAME do każdej komory miografu (zawierającej 5 ml roztworu buforowego) w celu osiągnięcia końcowego stężenia 200 μM w każdej komorze miografu.
    UWAGA: L-NAME jest nieselektywnym i silnym inhibitorem wszystkich izoform NOS (enzymu odpowiedzialnego za produkcję NO), dlatego jest uważany za skuteczne narzędzie do blokowania produkcji NO w ścianie naczynia krwionośnego9.
  5. Pozwól segmentom aorty odpocząć w czasie preinkubacji za pomocą L-NAME (30 min).
  6. Nie myj w tym momencie.
  7. Nie usuwając L-NAME, dodać submaksymalną dawkę fenylefryny (10 μM stężenie końcowe) do komory, aby wywołać skurcz aorty.
    UWAGA: Ze względu na hamujące działanie L-NAME na endogenną produkcję NO, nowo zarejestrowany pik skurczu aorty wywołanego fenylefryną będzie znacznie wyższy niż początkowy pik, który zarejestrowano przed inkubacją tkanki za pomocą L-NAME. Jest to oczekiwane ze względu na wpływ L-NAME na podstawową produkcję NO w ścianie aorty, co prowadzi do generowania większej siły (ze względu na większe wytwarzanie siły skurczu przez mięśnie gładkie).
  8. Poczekaj, aż krzywa skurczu wywołana fenylefryną osiągnie plateau dla rozwoju napięcia (siły skurczu).
  9. W tym momencie dodać acetylocholinę do komory miografu, aby osiągnąć końcowe stężenie 500 nM (jest to submaksymalne stężenie acetylocholiny, które zostało ustalone podczas doświadczeń opisanych w sekcji 5 protokołu).
  10. Poczekaj kilka minut, aby zarejestrować wszelkie możliwe zmiany w rozwoju siły, aż utworzony plateau ustabilizuje się (Rysunek 7).
    UWAGA: Ze względu na hamujące działanie L-NAME na zdolność warstwy śródbłonka do wytwarzania NO w odpowiedzi na acetylocholinę, nie oczekuje się, że zaobserwuje się jakiekolwiek zmiany w zarejestrowanym wytwarzaniu siły w odpowiedzi na fenylefrynę, ponieważ NOS śródbłonka aorty (eNOS) nie jest w stanie wytworzyć NO w odpowiedzi na zastosowanie acetylocholiny.
  11. Opróżnij komory i umyj chusteczkę ciepłym, napowietrzonym roztworem HEPES-PSS 3x.

8. Udział warstwy śródbłonka w wazorelaksacji aorty

  1. Aby podkreślić rolę warstwy śródbłonka w wazorelaksacji aorty, należy przetestować wazorelaksację wywołaną acetylocholiną w pozbawionych śródbłonka odcinkach aorty, w których usuwane są warstwy śródbłonka.
  2. Umieść komorę miografu pod mikroskopem i delikatnie przeprowadź mały drut (ten sam drut, który jest używany do miografii drucianej, może być tutaj użyty) przez światło aorty. Delikatnie przesuwaj drut przez światło (delikatny ruch okrężny) przez krótki czas. To wystarczy, aby usunąć śródbłonek lub błonę wewnętrzną.
  3. Przetnij aortę na pierścienie aortalne o średnicy 2 mm i zamontuj te pierścienie na komorze miografu, jak opisano wcześniej.
  4. Ustaw optymalne napięcie na 6 mN i pozwól tkance odpocząć przez 30 minut w napowietrzonym, ciepłym buforze HEPES-PSS
  5. Pod koniec 30-minutowego okresu równoważenia opróżnić komory i dodać 5 ml świeżego, ciepłego, napowietrzonego roztworu HEPES-PSS do każdej komory.
  6. Wyzeruj siłę dla wszystkich komór miografu, obracając mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
  7. Powoli obracaj mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zwiększyć odległość między szpilkami, aż zarejestrowana siła osiągnie pożądane optymalne napięcie dla aorty myszy (6 mN dla aorty myszy C57BL/6J). Odpocznij tkankę przez kolejne 15-20 minut przy optymalnym napięciu (6 mN).
  8. Opróżnij komory jeszcze 1x przed dodaniem 5 ml roztworu o wysokiej zawartości K+ do każdej komory.
  9. Ponownie opróżnij komory, gdy tylko reakcja skurczowa na roztwór o wysokiej zawartości K+ osiągnie plateau i umyj tkankę roztworem HEPES-PSS 3x. Odpocznij tkankę przez 15-20 minut
  10. Wstępnie skurczyć segmenty aorty środkiem zwężającym naczynia krwionośne fenylefryną (końcowe stężenie 10 μM w komorze).
    UWAGA: Ze względu na usunięcie śródbłonka podstawowa produkcja NO w ścianie aorty jest znacznie zmniejszona; W związku z tym oczekuje się, że szczyt skurczu wywołanego fenylefryną (szczyt wytwarzania siły) będzie wyższy w tkance aorty pozbawionej warstwy śródbłonka.
  11. Gdy siła indukowana fenylefryną osiągnie plateau, dodaj submaksymalne stężenie acetylocholiny do komory miografu, aby osiągnąć końcowe stężenie 500 nM.
    UWAGA: Jeśli usunięcie warstwy śródbłonka zostanie wykonane prawidłowo, nie nastąpią żadne zmiany w zarejestrowanej sile indukowanej fenylefryną, ponieważ produkcja NO indukowana acetylocholiną przez śródbłonek zostanie zmniejszona w wyniku usunięcia warstwy śródbłonka. Zarejestrowany ślad będzie bardzo podobny do tego zaobserwowanego w obecności L-NAME (sekcja 7.).
  12. Odczekaj 3 minuty, aby upewnić się, że zarejestrowany plateau dla rozwoju siły wywołanej fenylefryną nie zmienia się przed zakończeniem eksperymentu (Rysunek 8).
    UWAGA: Jeśli zastosowanie acetylocholiny powoduje spadek skurczu wywołanego przez fenylefrynę podczas pobytu na płaskowyżu, oznacza to, że warstwa śródbłonka nie została całkowicie usunięta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany tutaj protokół tensometrycznej miografii w małej komorze jest standardową metodą pomiaru reaktywności naczyniowej w tętnicach małych i dużych i pozwala na jednoczesne pomiary reaktywności naczyniowej w maksymalnie czterech segmentach naczyń krwionośnych pochodzących od tego samego małego laboratoryjnego zwierzęcia doświadczalnego. W niniejszym raporcie wykorzystujemy ten system konkretnie do pomiaru funkcji śródbłonka w izolowanej aorcie myszy (Rysunek 1). W tym protokole izolowane s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dziedzina biologii naczyniowej w dużym stopniu opiera się na narzędziach, które pomagają naukowcom ocenić funkcjonalną i strukturalną integralność ściany naczynia krwionośnego. Wymaga również zwrócenia szczególnej uwagi na bezpośrednie i pośrednie interakcje między trzema warstwami naczyń krwionośnych: błoną wewnętrzną, środkową i przydanką. Spośród tych trzech warstw błona wewnętrzna jest utworzona przez monowarstwę komórek śródbłonka i pełni bardzo ważną funkcję w regulacji zdrowia naczyń krwionośnych i hemostazy.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z National Institutes of Health (R15HL145646) i Midwestern University College of Graduate Studies.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetylocholinaSigmaAldrichA6625-100G
CaCl2SigmaAldrichC4901-1KG
Gaz karbonowy
FST91460-11
DMT 620 Wielokomorowy system
Kleszcze DumontFST91150-20
EDTASigmaAldrichE5134-10G
GlukozaSigmaAldrichG8270-1KG
HEPESSigmaAldrichH7006-1KG
KClSigmaAldrichP9541-1KG
KH2PO4SigmaAldrichP5655-1KG
InstrumentyLabChart ADIOprogramowanie do akwizycji danych
Źródło światłaVolpi14363
L-NameFischer Scientific50-200-7725
MgSO4SigmaAldrichM2643-500G
stereoskopowyLeicaS6D
NaClSigmaAldrichS5886-5KG
NaHCO3SigmaAldrichS5761-500G
System kąpieli organowejDMT720MO
FenylefrynaSigmaAldrichP6126-10G
PompaWelch2546B-01
OprogramowanieADI InstrumentyLabChart 8.1.20
Nożyczki sprężynoweFST15003-08
Sylgard 184 ZestawUsługi mikroskopii elektronowej24236-10elastomerów silikonowych
Regulator zbiornikaFischer Scientific10575147
System kąpieli wodnejFischer Scientific15-462-10
Nożyczki preparacyjne Matheson H103847 miograficzny DMT DMT 620 Mikroskop zestaw

Bibliografia

  1. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
  4. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  5. Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
  6. Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
  7. Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
  8. Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
  9. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
  10. Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
  11. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958(2021).
  12. Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157(2021).
  13. Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
  14. Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
  15. Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
  16. Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
  17. Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
  18. Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar wazorelaksacjifunkcja r db onkamyografia ma ych obj to cimyografia tensometrycznareaktywno naczyniowaaorta mysiapreparat pier cienia aortyhamowanie tlenku azotuodpowied na acetylocholin
Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w aorcie piersiowej myszy za pomocą tensometrycznej miografii komory o małej objętości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.