Określanie powinowactwa wiązania (KD) przeciwciał znakowanych radioaktywnie do unieruchomionych antygenów

Podsumowanie

Tutaj opisana jest metoda określania powinowactwa (K_D) przeciwciał znakowanych radioaktywnie do unieruchomionych antygenów. K_D jest stałą dysocjacji równowagi, którą można wyznaczyć na podstawie eksperymentu wiązania nasycenia, mierząc całkowite, specyficzne i niespecyficzne wiązanie przeciwciała znakowanego radioaktywnie w różnych stężeniach z jego antygenem.

Streszczenie

Określenie powinowactwa wiązania (K_D) jest ważnym aspektem charakterystyki przeciwciał znakowanych radioaktywnie (rAb). Zazwyczaj powinowactwo wiązania jest reprezentowane przez stałą dysocjacji równowagi, K_D, i można je obliczyć jako stężenie przeciwciała, przy którym połowa miejsc wiązania przeciwciał jest zajęta w stanie równowagi. Metodę tę można uogólnić na dowolne znakowane radioaktywnie przeciwciało lub inne rusztowania białkowe i peptydowe. W przeciwieństwie do metod opartych na komórkach, wybór unieruchomionych antygenów jest szczególnie przydatny do walidacji powinowactwa wiązania po długotrwałym przechowywaniu przeciwciał, rozróżniania powinowactwa wiązania ramion regionu wiązania antygenu fragmentacyjnego (Fab) w bispecyficznych konstruktach przeciwciał oraz określania, czy istnieje zmienność ekspresji antygenu między różnymi liniami komórkowymi. Metoda ta polega na unieruchomieniu określonej ilości antygenu do określonych studzienek na łamliwej 96-dołkowej płytce. Następnie zablokowano niespecyficzne wiązanie we wszystkich studzienkach albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Następnie rAb dodano w gradiencie stężeń do wszystkich studzienek. Wybrano zakres stężeń, aby umożliwić rAb osiągnięcie saturacji, tj. stężenia przeciwciała, przy którym wszystkie antygeny są w sposób ciągły związane przez rAb. W wyznaczonych studzienkach bez unieruchomionego antygenu można określić niespecyficzne wiązanie rAb. Odejmując niespecyficzne wiązanie od całkowitego wiązania w studzienkach z unieruchomionym antygenem, można określić specyficzne wiązanie rAb z antygenem. K_D rAb obliczono na podstawie otrzymanej krzywej wiązania nasycenia. Na przykład powinowactwo wiązania określono przy użyciu znakowanego radioaktywnie amiwantamabu, bispecyficznego przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i cytoplazmatycznym białkom przejścia mezenchymalno-nabłonkowego (cMET).

Wprowadzenie

Przeciwciała znakowane radioaktywnie (rAb) mają różnorodne zastosowania w medycynie. Podczas gdy większość z nich jest wykorzystywana w onkologii jako środki obrazowania i terapeutyczne, istnieją zastosowania obrazowania w stanach zapalnych związanych z reumatologią, kardiologią i neurologią¹. Obrazowanie rAbs ma wysoką czułość wykrywania zmian chorobowych i może pomóc w selekcji pacjentów do leczenia^2,3,4,5. Są one również stosowane w terapii ze względu na ich specyficzność dla odpowiednich antygenów. W strategii znanej jako teranostyka ten sam rAb jest używany zarówno do obrazowania, jak i leczenia⁶.

Idealnie, przeciwciało wybrane do radioznakowania to przeciwciało, które już udowodniono, że ma wysokie powinowactwo wiązania i swoistość przy użyciu metod nieznakowanych radioaktywnie. Znakowanie radioaktywne przeciwciał można osiągnąć poprzez bezpośrednią modyfikację chemiczną przeciwciał za pomocą radionuklidu, który tworzy stabilne wiązania kowalencyjne (np. jod radiotwórczy) lub pośrednio poprzez koniugację z chelatatorami, które następnie koordynują się z radiometalami^7,8. Bezpośrednie znakowanie radioaktywne, np. jodem promieniotwórczym, specyficznie modyfikuje reszty tyrozyny i histydyny na przeciwciałie. Jeśli te reszty są ważne dla wiązania antygenu, to ta radiokoniugacja zmieni powinowactwo wiązania. I odwrotnie, istnieje wiele ustalonych protokołów koniugacji i pośredniego znakowania radioaktywnego przeciwciał. Na przykład powszechnym chelatatorem używanym do wiązania cyrkonu-89 (⁸⁹Zr) do obrazowania PET przeciwciał jest p-izotiocyjanatobenzyl-desferrioksamina (DFO), która jest losowo sprzężona z resztami lizyny przeciwciała^9,10. Jeśli w regionie wiążącym antygen znajdują się reszty lizyny, koniugacja w tych miejscach może sterycznie utrudniać wiązanie antygenu, a tym samym upośledzać wiązanie przeciwciało-antygen. W związku z tym różne metody radiokoniugacji stosowane do pośredniego lub bezpośredniego znakowania radioaktywnego przeciwciał mogą potencjalnie wpływać na immunoreaktywność, definiowaną jako zdolność radiokoniugatu przeciwciała do wiązania się ze swoim antygenem^7,11. Metody koniugacji specyficzne dla miejsca mogą obejść to ograniczenie, ale techniki te wymagają inżynierii przeciwciał w celu włączenia dodatkowych reszt cysteiny lub wiedzy specjalistycznej w zakresie reakcji enzymatycznych na resztach węglowodanowych^{12,13,14,15,16}. Po znakowaniu radioizotopem przeciwciała ważne jest, aby sprawdzić, czy immunoreaktywność jest zachowana w ramach charakterystyki rAb. Jednym ze sposobów pomiaru immunoreaktywności jest określenie powinowactwa wiązania rAb.

Celem tego protokołu jest opisanie procesu określania powinowactwa do wiązania dla rAb za pomocą ustalonego testu nasycenia radioligandów w celu ilościowego określenia wiązania rAb-antygen. Trend wiązania jest nakreślony w Rysunek 1. Ilość związanego antygenu będzie się zwiększać, gdy więcej rAb zostanie dodane do ustalonej ilości unieruchomionego antygenu. Gdy wszystkie miejsca wiążące antygen zostaną nasycone, zostanie osiągnięte plateau, a dodanie większej ilości rAb nie będzie miało wpływu na ilość związanego antygenu. W tym modelu stała dysocjacji równowagi (K_D) jest stężeniem przeciwciała, które zajmuje połowę receptorów antygenu ¹⁷. K_D oznacza, jak dobrze przeciwciało wiąże się ze swoim celem przy niższym_{K D} odpowiadającym wyższemu powinowactwu wiązania. Wcześniej informowano, że idealny rAb powinien mieć K_D 1 nanomolowy lub mniej¹⁸. Jednak nowsze rAb zostały opracowane z K_D w niskim zakresie nanomolowym i są uważane za odpowiednie do nieinwazyjnych zastosowań obrazowania^19,20,21,22. Innym parametrem, który można określić w teście nasycenia radioligandami rAb, jest B_max, który odpowiada maksymalnej ilości wiązania antygenu. W razie potrzeby B_max można użyć do obliczenia liczby cząsteczek antygenu.

Rysunek 1: Reprezentatywna krzywa wiązania nasycenia. Procent związanego antygenu jest wykreślany w stosunku do rosnących stężeń przeciwciał dodanych do ustalonej ilości antygenu. Wyskakujące okienka pokazują wiązanie w różnych punktach. Pokazane jest stężenie i wiązanie odpowiadające odpowiednio K_{, D, i} B_max. Ta figura została stworzona z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten test jest szczególnie ważny dla radioznakowanych bispecyficznych konstruktów przeciwciał, aby określić K_D dla każdego ramienia regionu wiążącego antygen fragmentu (Fab) radioznakowanego bispecyficznego przeciwciała wiążącego się z odpowiednimi antygenami. Protokół ten może być wykorzystany do określenia K_D każdego ramienia Fab oddzielnie na unieruchomionych antygenach w celu niezależnego scharakteryzowania, czy powinowactwo wiązania każdego ramienia Fab dla odpowiedniego antygenu zostało naruszone po radiokoniugacji. Protokół ten wykazano poprzez zastosowanie znakowanego radioaktywnie amiwantamabu, bispecyficznego przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i cytoplazmatycznym białkom przejścia mezenchymalno-nabłonkowego (cMET)¹⁹. Jako przykłady wykorzystano również znakowane radioizotopowo przeciwciała jednoramienne, w których jedno ramię Fab wiąże się z EGFR (α-EGFR) lub cMET (α-cMET), a drugie ramię Fab jest kontrolą izotypu, zostały również użyte jako przykłady¹⁹. Protokół ten jest również odpowiedni dla każdego znakowanego radioaktywnie przeciwciała ze znanym antygenem, który można unieruchomić. W tym protokole seria rozcieńczeń rAb jest dodawana do ustalonej ilości unieruchomionego antygenu w wyznaczonych studzienkach specyficznych dla każdego ramienia Fab rAb. rAb jest również dodawany do studzienek, które zostały zablokowane tylko albuminą surowicy bydlęcej (BSA), bez antygenu, w celu określenia niespecyficznego wiązania. Aby określić specyficzne wiązanie, niespecyficzne wiązanie z unieruchomionym antygenem jest odejmowane od całkowitego wiązania rAb. Otrzymana krzywa wiązania nasycenia jest następnie używana do wyznaczenia K_D, jak opisano powyżej.

Jedną z zalet tej metody jest większa odtwarzalność przy użyciu oczyszczonych antygenów w porównaniu z użyciem linii komórkowych jako źródła antygenów, biorąc pod uwagę, że poziomy ekspresji antygenu mogą być zaburzone podczas hodowli komórkowej i że różne linie komórkowe mają różne poziomy ekspresji antygenu. W przypadku znakowanych radioaktywnie przeciwciał bispecyficznych, linie komórkowe, które wyrażają tylko jeden z antygenów bez drugiego, mogą być niedostępne, co sprawiłoby, że scharakteryzowanie powinowactwa wiązania poszczególnych ramion Fab byłoby bardzo trudne. Warto zauważyć, że kluczową przewagą metody testu saturacji radioligandem nad metodami nieznakowanymi radioaktywnie jest specyficzna charakterystyka powinowactwa wiązania rAb bez udziału niesprzężonej frakcji rAb. Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, obecnie nie ma technik oczyszczania, które pozwoliłyby oddzielić rAb od jego macierzystego niesprzężonego przeciwciała. Biorąc pod uwagę stosunkowo mały rozmiar chelatora i radionuklidu, ich udział w ogólnej masie cząsteczkowej rAb jest nieznaczny w chromatografii wykluczającej rozmiar. Tak więc produkt uzyskany w wyniku dowolnej techniki znakowania radioaktywnego jest prawie zawsze mieszaniną rAb i jego macierzystego niesprzężonego przeciwciała. Scharakteryzowanie powinowactwa wiązania za pomocą testu nasycenia znakowanego radioaktywnie zapewnia, że badanym produktem jest wyłącznie rAb.

Protokół

UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 2, aby zapoznać się z graficzną reprezentacją protokołu.

Rysunek 2: Schemat protokołu. Etykiety rzędów i kolumn są wskazane jako wskazówki dotyczące ustawiania łamliwej płytki 96-dołkowej. Przewidywane wiązanie pokazano w przykładowym studzience dla antygenu i BSA. Zakrzywiona strzałka oznacza rAb, który ma zostać wypłukany ze studzienek tylko za pomocą BSA. Ta figura została stworzona z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie bufora

1. Przygotować 50 ml buforu immobilizacyjnego (wodny roztwór 50 mM Na₂CO_{3 ;} pH = 9,0).
   1. Odważyć 191 mg_NaHCO3 i 23,9 mg_Na2CO₃ na bibułce wagowej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 40 ml wody o mocy 18 MΩ i wiruj do rozpuszczenia. W razie potrzeby dostosuj pH do 9,0 przed doprowadzeniem całkowitej objętości do 50 ml za pomocą wody o mocy 18 MΩ.
2. Przygotować około 200 ml buforu płuczącego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) zawierająca 0,05% Tween-20), dodając 200 ml PBS, a następnie 100 μl Tween-20 do butelki o pojemności 250 ml.
3. Przygotować 50 ml buforu wiążącego (PBS zawierający 0,05% Tween-20 i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)).
   1. Odważyć 50 mg BSA na bibułce wagowej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 50 ml PBS, a następnie 25 μl Tween-20 do probówki. Delikatnie zmieszaj.
4. Przygotować 50 ml buforu blokującego (3% BSA w PBS).
   1. Odważyć 1,5 g BSA na papierze wagowym i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 50 ml PBS i delikatnie wymieszaj.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, zaleca się przechowywanie wszystkich do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.

2. Unieruchomienie antygenowe

1. Rozcieńczyć antygen w buforze immobilizacyjnym do osiągnięcia stężenia 5 μg/ml.
2. Dodać 100 μl na studzienkę antygenu na dno 24 dołków łamliwej 96-dołkowej płytki o płaskim dnie w układzie 8 x 3 (kolumny 1-3 dla rzędów A-H). Przykryj płytkę taśmą uszczelniającą.
   UWAGA: Upewnij się, że powierzchnia płytki studzienki została poddana obróbce, aby zmaksymalizować adsorpcję zmieszanych domen hydrofobowych i hydrofilowych. Te wstępnie obrobione płyty są dostępne w handlu.
3. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
4. Następnego dnia umyj płytkę 3x buforem do mycia.
   1. Energicznie odwróć talerz w zlewie, aby pozbyć się płynu i postukaj talerzem o stos ręczników papierowych, aby usunąć nadmiar płynu.
   2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 300 μl buforu płuczącego na studzienkę do studzienek zawierających antygen. Usunąć płyn zgodnie z opisem w ppkt 2.4.1. Powtórz etap prania w sumie trzy razy.

3. Blokowanie nieokreślonych stron za pomocą BSA

1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 300 μl buforu blokującego na studzienkę do 24 dołków pokrytych antygenem i 24 pustych dołków płytki 96-dołkowej (kolumny 1-6 dla rzędów A-H).
2. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia.
3. Przemyć płytkę łącznie trzykrotnie w ilości 300 μl na studzienkę buforu do mycia. Patrz krok 2.4, aby uzyskać szczegółowy opis mycia płyty.
    

4. Seryjne rozcieńczenia i dodawanie roztworu rAb

UWAGA: Poniższe kroki obejmują radioaktywność. Czynności te powinny być wykonywane wyłącznie przez osoby przeszkolone w zakresie bezpieczeństwa radiacyjnego. Badacze powinni założyć podwójne rękawice i wykonywać czynności z odpowiednią osłoną.

1. Zsyntetyzować badany rAb przy użyciu wybranej metody. Pliki rAb użyte jako przykład zostały zsyntetyzowane zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁹.
   UWAGA: Protokół ten koncentruje się na charakterystyce rAb po znakowaniu radioizotopem.
2. Wykonać 8 x 3-krotne seryjne rozcieńczenia (przeznaczone dla rzędów A-H na płytce) rAb w buforze wiążącym.
   UWAGA: Stężenia seryjnych rozcieńczeń będą się różnić dla każdego rAb. Szczegóły są omówione w sekcji Dyskusja. Jeżeli współczynnik rozcieńczenia ulegnie zmianie, objętość potrzebna do każdego rozcieńczenia powinna zostać ponownie obliczona, aby zapewnić objętość wystarczającą do 1) związania rAb w każdym dołku, 2) zasiania następnego rozcieńczenia oraz 3) porcjowania roztworu wzorcowego rAb do zliczania promieniowania gamma w celu zmierzenia radioaktywności całkowitego rAb dodanego do każdego studzienki.
   1. Obliczyć objętość podstawowego rAb potrzebną do przygotowania 1,2 ml roztworu o pierwszym stężeniu (oznaczone jako A).
   2. Dodać 800 μl buforu wiążącego do probówek mikrowirówek oznaczonych B, C, D, ... do H. Dodać 1,2 ml pomniejszone o objętość obliczoną w kroku 4.2.1 wiązania buforu z probówką do mikrowirówki oznaczoną A.
   3. Dodać objętość podstawowego rAb obliczoną w ppkt 4.2.1 do probówki A. Delikatnie odwiruj, aby wymieszać, a następnie odwiruj za pomocą mini mikrowirówki, aby zebrać cały płyn na dnie probówki.
   4. Dodać 400 μl z probówki A do probówki B. Zwirować, aby wymieszać, a następnie odwirować za pomocą mini mikrowirówki. Powtórz dodawanie od B do C, C do D, ..., G do H.
3. Dodać 100 μl na studzienkę z każdego rozcieńczenia do trzech studzienek unieruchomionych antygenem i trzech studzienek zablokowanych tylko BSA. Na przykład dodać rozcieńczenie A do studzienek A1-A3 (antygen) i A4-A6 (BSA).
4. Dodać 100 μl każdego rozcieńczenia do probówek do mikrowirówek oznaczonych A std - H std. Zachowaj te probówki jako wzorce rAb do oznaczenia w liczniku gamma.
5. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc.

5. Umyj płytki i oznacz radioaktywność

1. Oznaczyć probówki do mikrowirówek dla każdej studzienki (A1 do A6, B1 do B6 ... przez H1-H6). W razie potrzeby użyj dwóch różnych kolorowych markerów do oznaczenia kolorami próbek - jeden dla studzienek pokrytych antygenem, a drugi dla studzienek tylko z BSA.
2. Zassać rAb z każdej studzienki za pomocą aspiratora próżniowego.
3. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 300 μl buforu płuczącego do każdej studzienki. Zassać bufor do mycia. Powtórz pranie w sumie pięć razy.
4. Rozbij studzienki na odpowiednie probówki do mikrowirówek.
5. Policz radioaktywność w probówkach za pomocą licznika gamma. Policz najpierw probówki z antygenem (H1, H2, H3 do A1, A2, A3), a następnie te z samym BSA (H4, H5, H6 do A4, A5, A6). Aby zminimalizować zakłócenia, należy oddzielnie policzyć wzorce dla każdego rozcieńczenia (od H std do A std) w innym czasie.

6. Analiza danych

UWAGA: Pliki uzupełniające zawierają odpowiednie szablony arkuszy kalkulacyjnych i analiz statystycznych do analizy i wykreślania danych.

1. W arkuszu kalkulacyjnym oblicz łączne, specyficzne i niespecyficzne powiązanie dla każdej próbki (zobacz szablon arkusza kalkulacyjnego dołączony jako plik uzupełniający).
   1. Obliczyć "Aktywność związaną" jako liczbę na minutę (CPM) próbki (uzyskanej z licznika gamma) podzieloną przez CPM odpowiedniego wzorca. Oblicz "% Bound" jako Bound Activity razy 100.
   2. Obliczyć "Całkowity związek, mol/l" przez pomnożenie "% związany" przez stężenie (mol/l) dodanego rAb. Oblicz "Całkowite związanie, mol", mnożąc "Całkowite związanie, mol/L" przez objętość dodanego rAb w litrach (0,0001 L).
   3. Obliczyć "Specyficzne wiązanie, mol", odejmując "Całkowite związanie, mol" rozcieńczeń BSA od rozcieńczeń antygenu tak, że A1 łączy się z A4, A2 z A5, A3 z A6, B1 z B4 itd.
   4. Oblicz "Wiązanie niespecyficzne, mol", odejmując "Wiązanie specyficzne, mol" od "Całkowite wiązanie, mol" dla każdego dołka.
2. W oprogramowaniu do kreślenia analizy statystycznej wykreśl stężenie dodanego rAb (nmol/l) na osi x w porównaniu z wiązaniem (mol) na osi y. Utwórz oddzielne grupy, aby wykreślić w trzech całkowitych wiązaniach, wiązaniach specyficznych i niespecyficznych. Przeprowadzić nieliniową analizę pasowania, wybierając następujące parametry w używanym oprogramowaniu (Tabela materiałów; patrz szablon analizy statystycznej załączony jako plik uzupełniający).
   1. Wybierz opcję Nowa analiza. W obszarze Analizy XY wybierz opcję Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej). Upewnij się, że wszystkie dane są zaznaczone w obszarze Analizuj które zestawy danych?, a następnie wybierz przycisk OK.
   2. Na karcie Model w obszarze Powiązanie - Nasycenie wybierz opcję Jedna witryna — Powiązanie specyficzne. Na karcie Pewność wybierz pozycję Zidentyfikuj "niejednoznaczne" pasowania. Pozostaw wszystkie inne parametry jako domyślne i wybierz Ok.
      UWAGA: Spowoduje to obliczenie K_{, D} i Bmax dla wiązania całkowitego, specyficznego i niespecyficznego. K_D specyficznego wiązania to K_D w nmol/L rAb związanego z antygenem.

Wyniki

Ta metoda oblicza powinowactwo wiązania (K_D) dla rAb na podstawie testu wiązania saturacji, gdzie różne stężenia rAb zostały dodane do ustalonej ilości unieruchomionego antygenu. Krzywa wiązania powinna podążać za wzrostem logarytmicznym, gdzie początkowo jest stroma, a następnie stabilizuje się w miarę nasycenia antygenu. Aby zapewnić, że oznaczone K_D jest dokładne, stężenia rAb muszą być wystarczająco wysokie, aby osiągnąć nasycenie. W tym teście znakowane radioaktywnie przeciwciała sprzężono z DF...

Dyskusja

W ramach opracowywania rAb ważne jest, aby upewnić się, że rAb wiąże się specyficznie ze swoim celem z wysokim powinowactwem wiązania. Określenie powinowactwa wiązania może poinformować, czy na immunoreaktywność rAb wpływa radiokoniugacja za pomocą testu saturacji radioligandów przy użyciu unieruchomionego antygenu. Określenie wiązania rAb z BSA można wykorzystać do ilościowego określenia niespecyficznego wiązania w celu dokładniejszego pomiaru specyficznego wiązania z unieruchomionym antygenem. Metoda ta testuje wiązani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Licznik gamma	Hidex	Hidex Automatyczny licznik
Oprogramowanie GraphPad Prism	GraphPad		w wersji 9.2; używane do analiz statystycznych w tym badaniu
Immuno łamliwe płytki 96-dołkowe MaxiSorp	Thermo Scientific	473768
Taśma uszczelniająca do mikropłytek	Corning	4612
Microsoft Excel
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Microsoft (PBS)	Gibco	14190144
Wodorowęglan sodu	JT Baker	3506-01
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949