Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63931

⸱

15 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology, Neurobiology and Biophysics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 2Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Dynamiczna mikroskopia różnicowa (DDM) łączy w sobie cechy dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii. W tym artykule przedstawiono proces wykorzystania DDM do scharakteryzowania odtworzonych sieci cytoszkieletów poprzez ilościowe określenie subdyfuzyjnej i zamkniętej w klatce dynamiki cząstek w sieciach wimentynowych oraz ruchu balistycznego aktywnych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych miozyną.

Streszczenie

Komórki mogą pełzać, samoleczyć się i dostosowywać swoją sztywność dzięki niezwykle dynamicznemu cytoszkieletowi. W związku z tym odtworzenie sieci biopolimerów cytoszkieletu może prowadzić do powstania wielu aktywnych i elastycznych materiałów. Jednak inżynieria takich materiałów o precyzyjnie dostrojonych właściwościach wymaga zmierzenia, w jaki sposób dynamika zależy od składu sieci i metod syntezy. Kwantyfikacja takiej dynamiki jest wyzwaniem ze względu na różnice w czasie, przestrzeni i przestrzeni formułowania sieci złożonych. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób technika analizy Fouriera, różnicowa mikroskopia dynamiczna (DDM), może określić ilościowo dynamikę sieci biopolimerowych i jest szczególnie dobrze przystosowana do badań sieci cytoszkieletów. DDM pracuje nad sekwencjami czasowymi obrazów uzyskanych przy użyciu szeregu modalności mikroskopowych, w tym konfokalnego skanowania laserowego, fluorescencji szerokokątnej i obrazowania w jasnym polu. Z takich sekwencji obrazów można wyodrębnić charakterystyczne czasy dekoracji fluktuacji gęstości w rozpiętości wektorów falowych. Opracowano również przyjazny dla użytkownika pakiet Pythona o otwartym kodzie źródłowym do przeprowadzania analizy DDM. Dzięki temu pakietowi można mierzyć dynamikę znakowanych składników cytoszkieletu lub osadzonych cząstek znacznikowych, jak pokazano tutaj na podstawie danych dotyczących pośrednich sieci włókien (wimentyny) i aktywnych sieci aktyna-mikrotubule. Użytkownicy, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia w programowaniu lub przetwarzaniu obrazów, będą mogli wykonać DDM przy użyciu tego pakietu oprogramowania i powiązanej dokumentacji.

Wprowadzenie

Cytooszkielet to sieć filamentów białkowych rozciągająca się przez cytoplazmę komórek eukariotycznych, łącząca powierzchnię komórki z jądrem. Posiada on unikalne właściwości materiałowe, zapewniając ochronę mechaniczną przed dużymi i powtarzającymi się obciążeniami mechanicznymi, a jednocześnie napędzając dynamiczne zmiany kształtu komórki1. Rekonstytuowane sieci cytooszkieletu mogą wykazywać szereg interesujących zachowań dynamicznych, od uwięzienia wbudowanych cząsteczek po ruch balistyczny napędzany przez motory molekularne2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Metody analizy dynamiki takich sieci obejmują śledzenie ruchu wbudowanych mikrosfer znacznikowych6,7,12,13,14, analizę obrazu w celu śledzenia wielkości gęstych skupisk białek w czasie8, dynamiczne rozpraszanie światła15, cyfrową welocymetrię obrazową cząstek (PIV)4,16,17,18,19, obliczanie gęstości widmowej mocy obrazów w czasie19 oraz analizę kymograficzną20. Wraz z prowadzeniem coraz większej liczby badań nad rekonstytuowanymi sieciami cytooszkieletu, niezależnie od tego, czy mają one na celu zrozumienie mechaniki komórkowej, czy materii aktywnej, coraz bardziej niezbędne stają się solidne, bezstronne i powtarzalne metody charakteryzowania dynamiki. Dyferencjalna mikroskopia dynamiczna (DDM)21,22, stosunkowo nowa technika wykorzystywana do badania dynamiki cytooszkieletu, jest właśnie taką metodą, która efektywnie kwantyfikuje dynamikę przy niewielkiej liczbie parametrów definiowanych przez użytkownika. Dzięki opisanemu tutaj pakietowi oprogramowania badacze z niewielkim doświadczeniem w programowaniu lub analizie obrazu będą mogli wykorzystać DDM we własnej pracy.

DDM jest techniką analizy obrazu służącą do wyznaczania dynamiki próbki. Podobnie jak śledzenie cząstek (particle tracking) czy welocymetria obrazu cząstek (particle image velocimetry), DDM wymaga serii obrazów w czasie (często tysięcy obrazów), zazwyczaj rejestrowanych za pomocą mikroskopu. W przeciwieństwie do śledzenia cząstek, poszczególne cechy lub koraliki znacznikowe nie muszą być lokalizowane (ani nawet być lokalizowalne) na obrazie. W odróżnieniu zarówno od śledzenia cząstek, jak i welocymetrii obrazu cząstek, w metodzie DDM odzyskuje się dynamikę zespołu przy stosunkowo niewielkiej liczbie parametrów określonych przez użytkownika. W DDM obrazy są analizowane w przestrzeni Fouriera w celu określenia czasu zaniku fluktuacji gęstości dla zakresu liczb falowych, q, gdzie q = 2πu, a u jest wartością częstotliwości przestrzennych, figure-introduction-1. Uzyskuje się informacje podobne do tych z rozpraszania, ale przy użyciu obrazów w przestrzeni rzeczywistej nabytych za pomocą mikroskopu21,22,23. Dzięki temu można wykorzystać różne metody generowania kontrastu w mikroskopii, takie jak mikroskopia fluorescencyjna w szerokim polu22,24, fluorescencyjna konfokalna25, polaryzacyjna26, ciemnopola27 lub fluorescencyjna z arkuszem światła (light-sheet)28. Co więcej, obrazy wykorzystane do analizy DDM mogą zostać użyte do śledzenia cząstek lub welocymetrii obrazu cząstek w celu uzyskania uzupełniających informacji.

Połączenie cech dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii optycznej sprawia, że DDM jest potężną i wszechstronną techniką. Od czasu pierwszego opisu autorstwa Cerbino i Trappe z 2008 roku21, w którym wykazano możliwość pomiaru dyfuzji koloidalnych cząstek o rozmiarze 73 nm za pomocą DDM, metoda ta była wykorzystywana do pomiaru płynących koloidów29, agregacji koloidalnej30,31, wiskoelastyczności nematycznych kryształów ciekłych26, dynamiki żeli koloidalnych32, grubienia pian33, nanocząstek w środowiskach ograniczonych34,35,36,37, ruchliwości bakterii38,39,40,41, dyfuzji słabo rozpraszających klastrów białkowych42, fal kapilarnych na granicach faz cieczy43 oraz innych układów. Osoby poszukujące pełniejszego zestawienia publikacji wykorzystujących DDM mogą odwołać się do szczegółowych artykułów przeglądowych na ten temat22,23,44,45.

Metoda DDM była również wykorzystywana do badania dynamiki sieci biologicznych. Drechsler i wsp. użyli DDM do pomiaru dynamiki aktyny w żywych oocytach Drosophila 46. Burla i wsp. ilościowo określili dynamikę cząsteczek znacznikowych w sieciach hialuronianu oraz kompozytach hialuronianu i kolagenu47. Udokumentowano również kilka zastosowań DDM do badania dynamiki cząsteczek znacznikowych w zrekonstruowanych sieciach cytoszkieletu9,10, transportu cząsteczek DNA w takich sieciach48,49 oraz dynamiki aktywnych sieci zrekonstruowanych11,50,51. Zaletą DDM w pomiarze dynamiki w takich układach jest fakt, że poszczególne cząsteczki lub molekuły nie muszą być lokalizowane ani śledzone. Dzięki temu, na przykład, dynamikę cząsteczek DNA w środowiskach zatłoczonych można mierzyć za pomocą DDM pomimo trudności w śledzeniu tak małych i niesferycznych molekuł. Ponadto, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, można zastosować znakowanie wielobarwne, aby selektywnie mierzyć dynamikę poszczególnych składników w złożonym kompozycie.

Aby przeprowadzić DDM, wykonuje się sekwencję obrazów w czasie, I(x,y,t). Dla określonego czasu opóźnienia, Δt, wyszukuje się wszystkie (lub podzbiór) par obrazów oddzielonych tym odstępem czasu. Kwadrat transformaty Fouriera różnicy każdej pary,

figure-introduction-2

zostaje obliczona i uśredniona. Wartość ta, figure-introduction-3, jest uśredniana radialnie, pod warunkiem że dynamika jest izotropowa. Pozwala to na wyznaczenie macierzy DDM (zwanej również funkcją struktury obrazu), figure-introduction-4. Proces ten przedstawiono graficznie na Rysunku 1. Aby określić dynamikę próbki na podstawie tej macierzy DDM, przyjmuje się, że macierz DDM ma postać

figure-introduction-5

gdzie A to amplituda, która zależy od parametrów mikroskopu i struktury próbki, B to tło, które zależy od szumu w obrazach, a f (q, Δt) to pośrednia funkcja rozprosania (ISF), która zawiera informacje o dynamice21,22. W prostych przypadkach,

figure-introduction-6

gdzie τ jest charakterystycznym czasem rozpadu lub dekorelacji. Taka ISF była wykorzystywana w kilku badaniach z zastosowaniem DDM w systemach ergodycznych, takich jak rozcieńczone zawiesiny koloidalne21,24,27,37,40,52. Jednak do modelowania różnych typów dynamiki można wykorzystać inne formy ISF. Na przykład, w celu zamodelowania ISF dla próbek polidyspersyjnych można zastosować rozwinięcie kumulantowe w postaci

figure-introduction-7

gdzie μ jest miarą polidyspersyjności42,53; jeśli fluktuacje gęstości zanikają w dwóch osobnych trybach, można zastosować ISF w postaci

figure-introduction-8 26, 54, 55, 56, 57;

inne ISF mogą być wykorzystywane do badania pływających mikroorganizmów lub innych aktywnych cząstek38,39,40,41,58,59.

figure-introduction-9
Rysunek 1: Przegląd analizy DDM. Na podstawie serii czasowej obrazów obliczana jest transformata Fouriera różnic obrazów w celu wyznaczenia macierzy DDM. Macierz DDM można dopasować do modelu, aby określić skalę czasową fluktuacji gęstości dla zakresu wartości q. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W niniejszym materiale opisano zastosowanie pakietu oprogramowania do analizy DDM opracowanego w języku Python, PyDDM. Pakiet ten opiera się na pracach wykonanych w naszych laboratoriach badawczych oraz w innych opublikowanych badaniach z ostatnich kilku lat. Głównymi motywacjami do stworzenia tego oprogramowania była potrzeba (1) śledzenia i przechowywania metadanych oraz parametrów wykorzystywanych w analizie; (2) zapewnienia dokładnej dokumentacji z szczegółowymi przykładami analizy od początku do końca; oraz (3) stworzenia prostego sposobu wdrażania różnych (lub tworzenia nowych) modeli matematycznych do dopasowania danych (np. dodanie modeli ISF, takich jak te opracowane niedawno dla filamentów aktywnych60, byłoby proste). Istnieją również inne pakiety oprogramowania do analizy DDM, choć nie wszystkie są dobrze udokumentowane i napisane w języku programowania o otwartym kodzie źródłowym. Przykładowo, dostępny jest kod w języku C++ z obliczeniami na procesorach GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, kod w języku C++ wykorzystujący transformaty Fouriera w czasie w celu przyspieszenia obliczeń (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, wersje w językach MATLAB i Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, kod w języku MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 oraz kod w języku MATLAB z kwantyfikacją niepewności (https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Ponieważ pakiet PyDDM jest dobrze udokumentowany i zapewnia dużą elastyczność w sposobie obliczania i analizowania macierzy DDM, mamy nadzieję, że okaże się on użyteczny dla badaczy chcących wdrożyć metodę DDM, niezależnie od ich doświadczenia w programowaniu czy analizie obrazu. 

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób ten pakiet oprogramowania może być wykorzystany do ilościowego określenia dynamiki sieci cytoszkieletu zrekonstruowanych in vitro. Jest to realizowane przy użyciu dwóch różnych zestawów danych obrazowych: (1) obrazów submikronowych cząsteczek znacznika osadzonych w sieci vimentyny, wykonanych za pomocą mikroskopii w polu jasnym oraz (2) obrazów fluorescencyjnie znakowanych filamentów aktyny i mikrotubul w splątanej sieci kompozytowej z aktywnością napędzaną przez miozynę, wykonanych za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Analizy tych dwóch zbiorów danych podkreślają istotne zalety DDM, w tym możliwość analizy obrazów wykonanych za pomocą różnych metod obrazowania (np. w polu jasnym lub fluorescencji konfokalnej), wyodrębniania dynamiki zarówno z osadzonych znaczników, jak i ze znakowanych filamentów oraz ilościowego określania różnych rodzajów dynamiki (np. subdyfuzyjnej, ograniczonej lub balistycznej).

Protokół

UWAGA: Plik Jupyter Notebook zawierający kod do każdego etapu poniższego protokołu znajduje się w następnym repozytorium GitHub: https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Plik PDF tego dokumentu jest zawarty w  Pliku uzupełniającym 1. Ponadto szczegółowy opis kodu oraz dokumentacja każdej funkcji i klasy są dostępne na stronie internetowej  https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Instalacja oprogramowania

  1. Aby móc korzystać z przykładowych plików analizy DDM, należy zainstalować Jupyter Notebook do uruchamiania kodu. Należy również zainstalować inne wymagane popularne pakiety Pythona, w tym NumPy oraz Matplotlib. Wszystkie te pakiety są dołączone do dystrybucji Anaconda (patrz:  https://www.anaconda.com/products/individual). 
  2. Zainstaluj pakiet Pythona xarray63. Pakiet ten jest niezbędny do organizacji i przechowywania metadanych oraz parametrów analizy. W przypadku korzystania z dystrybucji Anaconda, zainstaluj xarray (wraz z zalecanymi zależnościami) za pomocą polecenia:
    conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck
  3. Zainstaluj pakiet PyYAML za pomocą polecenia:
    conda install -c anaconda yaml
    Pakiet ten jest niezbędny do odczytywania metadanych dotyczących obrazów do analizy oraz parametrów ustawionych przez użytkownika dla procesu analizy i dopasowania.
  4. Zainstaluj pakiet PyDDM, pobierając go z repozytorium GitHub lub korzystając z polecenia git:
    git clone https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Planowanie sesji obrazowania

  1. Wybierz optymalną dostępną metodę obrazowania oraz ustawienia optyczne. Jak wspomniano, DDM można stosować w połączeniu z wieloma metodami mikroskopii.
  2. Aby pomóc w zaplanowaniu odpowiedniego obiektywu i rozmiaru obrazu, wyznacz zakres liczb falowych, q, które będą badane, w zależności od rozmiaru piksela i całkowitego rozmiaru obrazu. Na podstawie tych obliczeń potwierdź, czy wybrany powiększenie i pole widzenia są optymalne dla danego eksperymentu. W przypadku obrazów analizowanych w niniejszej pracy, dla aktywnej kompozytowej sieci aktyna-mikrotubule zastosowano obiektyw 60x 1.4 NA oraz rozmiar obrazu 256 x 256 pikseli przy rozmiarze piksela 0.83 µm. W przypadku obrazów kulek osadzonych w sieci vimentyny zastosowano obiektyw 100x 1.4 NA oraz rozmiar obrazu 512 x 512 pikseli przy rozmiarze piksela 0.13 µm.
    UWAGA: Minimalna wartość q jest określona wzorem 2π/NΔx, gdzie rozmiar obrazu (zakładając, że jest kwadratowy) wynosi N × N pikseli przy rozmiarze piksela Δx. Maksymalna wartość q to mniejsza z wartości π/Δx oraz 2π NA/λ, gdzie NA to apertura numeryczna obiektywu obrazującego, a λ to długość fali światła (w przypadku obrazowania w polu jasnym NA można zastąpić wartością (NAobiektywu + NAkondensora)/2).
  3. Następnie rozważ zakres skal czasowych do zbadania. Zazwyczaj analiza DDM jest przeprowadzana na sekwencjach składających się z co najmniej 1000 klatek.
    1. Aby wyznaczyć odpowiednią częstotliwość klatek, weź pod uwagę przewidywany czas, w jakim elementy próbki przemieszczą się o dystans rzędu minimalnej rozdzielczej skali długości (odpowiadającej maksymalnemu q).
    2. Biorąc pod uwagę górną granicę badanych skal czasowych, należy pamiętać, że zazwyczaj uśrednia się widma mocy z setek różnic obrazów dla danego czasu opóźnienia Δt, aby uzyskać wystarczającą statystykę w celu redukcji szumu. Zatem należy pozyskać sekwencje obrazów dłuższe niż badana maksymalna skala czasowa.
      ​UWAGA: Jeśli znany jest przewidywany współczynnik dyfuzji, D, lub prędkość, v, można oszacować przewidywane charakterystyczne czasy zaniku, korzystając ze wzorów τ = 1/Dq2 lub τ = 1/vq wraz z zakresem q, który został wyznaczony na podstawie pola widzenia i rozmiaru piksela. Zakres oczekiwanych wartości τ w dostępnym zakresie q może pomóc w wyborze częstotliwości klatek oraz liczby klatek do pozyskania.

3. Przygotowanie próbek i akwizycja obrazów

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przygotowania próbek i ustawień obrazowania zastosowanych dla danych przedstawionych w sekcji wyników reprezentatywnych znajdują się w poprzednich publikacjach autorów11,51,64 oraz w Pliku uzupełniającym 2.

  1. Biorąc pod uwagę skale czasu i długości, które mają zostać zbadane, należy pozyskać sekwencje obrazów składające się idealnie z ponad 1000 klatek.
    UWAGA: Kod analizuje obrazy kwadratowe lub kwadratowe obszary zainteresowania (ROI) w obrębie obrazu, dlatego należy odpowiednio dostosować rozmiar klatki.
  2. Sekwencje obrazów należy zapisać jako trójwymiarowy stos TIFF w skali szarości. Alternatywnie, zainstalowany pakiet może odczytywać format ND2 stosowany w systemach Nikon Instruments. Jeśli obrazy zostały zapisane w innym formacie, należy użyć programu ImageJ lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazów, aby przekonwertować je na stos TIFF.
    ​UWAGA: W przypadku korzystania z plików ND2 konieczna jest instalacja pakietu nd2reader z adresu  https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader.

4. Konfiguracja parametrów

  1. Utwórz kopię przykładowego pliku parametrów example_parameter_file.yml, który znajduje się w repozytorium kodu PyDDM w folderze examples. Otwórz ten plik YAML za pomocą edytora tekstu, takiego jak NotePad++ lub edytora tekstu w JupyterLab. Przykład pliku parametrów YAML użytego w analizie danych przedstawionych w sekcji wyników reprezentatywnych znajduje się w Pliku uzupełniającym 2.
  2. W skopiowanym pliku YAML podaj katalog danych oraz nazwę pliku odpowiadającą sekwencji obrazów do analizy. W sekcji metadanych podaj rozmiar piksela oraz częstotliwość klatek.
  3. W sekcji Analysis_parameters podaj szczegóły dotyczące sposobu obliczania macierzy DDM. Niektóre z tych parametrów są opcjonalne.
    1. W minimalnym zakresie podaj wartości dla parametrów number_lag_times oraz last_lag_time. Odpowiadają one odpowiednio do liczby różnych czasów opóźnienia, dla których ma zostać obliczona macierz DDM, oraz do najdłuższego czasu opóźnienia (w klatkach), który należy zastosować. Dla danych kulek znacznikowych w sieciach vimentyny użytych w tej pracy, parametry number_lag_times i last_lag_time wynosiły odpowiednio 60 i 1000. Kod obliczy macierz DDM dla czasów opóźnienia od 1 klatki (lub innego minimalnego czasu opóźnienia, jeśli określono opcjonalny parametr first_lag_time) do last_lag_time z rozmieszczeniem logarytmicznym.
      UWAGA: Jeśli pozyskano M klatek, można obliczyć macierz DDM dla czasu opóźnienia aż do M-1. Jednak ze względu na słabą statystykę przy tak dużym czasie opóźnienia, dane będą prawdopodobnie zaszumione. Najdłuższy czas opóźnienia, dla którego obliczana jest macierz DDM, zależy od szczegółów danych, ale sugerujemy wypróbowanie wartości wynoszącej około jednej trzeciej całkowitego czasu trwania serii obrazów.
  4. W sekcji Fitting_parameters podaj szczegóły dotyczące dopasowania macierzy DDM lub pośredniej funkcji rozproszenia (ISF). Podaj nazwę modelu w parametrze model. Określ wartość początkową, dolną oraz górną granicę dla każdego z parametrów dopasowania w wybranym modelu.
    ​UWAGA: Aby wyświetlić listę możliwych modeli dopasowania, uruchom funkcję print_fitting_models. Modele można również znaleźć w dokumentacji online na stronie internetowej PyDDM.

5. Obliczanie macierzy DDM

  1. Inicjalizuj instancję klasy DDM_Analysis. W tym celu przekaż metadane i parametry analizy omówione powyżej, podając do DDM_Analysis nazwę pliku YAML wraz z pełną ścieżką dostępu. Alternatywnie można przekazać metadane i parametry w formie struktury danych słownika Pythona.
  2. Uruchom funkcję calculate_DDM_matrix, aby obliczyć macierz DDM. Obliczenia te mogą zająć kilka minut lub więcej, w zależności od rozmiaru klatki i liczby czasów opóźnienia. Typowe czasy wykonania przedstawiono na Rysunku 2.
  3. Przejrzyj zwrócone dane, które będą znajdować się w strukturze danych z pakietu xarray znanej jako Dataset. Struktura ta jest przechowywana pod atrybutem ddm_dataset.
    UWAGA: W tej strukturze danych przechowywana będzie nie tylko macierz DDM, ale także powiązane zmienne i metadane. Zostanie ona również zapisana na dysku w formacie Network Common Data Form (netCDF).
  4. Przejrzyj wygenerowane i wyświetlone wykresy oraz rysunki. Rysunki te są również zapisywane jako plik PDF w katalogu danych.
    1. Upewnij się, że jeden z wygenerowanych wykresów przedstawia uśredniony dla zespołu kwadrat modułu obrazów po transformacji Fouriera, figure-protocol-1 jako funkcję q. Domyślnie kod wykorzystuje tę wartość do oszacowania parametru tła B. Oszacuj tło z figure-protocol-2, zakładając, że w granicy dużych wartości q dąży ona do B/2, gdzie B oznacza tło.
    2. Jeśli figure-protocol-3 nie osiąga plateau przy dużych wartościach q, zastosuj inną metodę szacowania B. Aby to zrobić, ustaw parametr background_method w pliku YAML lub jako opcjonalny argument słownikowy funkcji calculate_DDM_matrix. Więcej szczegółów na temat metod szacowania B znajduje się w sekcji wyników reprezentatywnych.

figure-protocol-4
Rycina 2: Czas obliczeń potrzebny do wyznaczenia macierzy DDM. Na wykresach (A) i (B) przedstawiono czas obliczania macierzy DDM, figure-protocol-5. We wszystkich przypadkach wykorzystano film składający się z 5000 klatek o rozmiarze obrazu 512 x 512 pikseli. Macierz DDM obliczono dla 30 czasów opóźnienia, rozmieszczonych logarytmicznie między 1 klatką (0,01 s) a 1000 klatkami (10 s). Kod uruchomiono na komputerze stacjonarnym Intel i7-10700 2,90 GHz z 32 GB RAM. Na wykresie (A) pokazano wpływ zmiany liczby różnic obrazów wykorzystywanych do obliczenia macierzy DDM dla każdego czasu opóźnienia. W tym celu obrazy poddano binowaniu, aby uzyskać rozmiar obrazu 256 x 256. Dla każdego czasu opóźnienia Δt odejmowano obrazy oddzielone o tę wartość Δt, a otrzymaną macierz poddawano transformacie Fouriera. Dla danego Δt można było wykorzystać wszystkie pary obrazów oddzielone o tę wartość Δt (kolor niebieski), tylko niezakładające się pary obrazów (np. klatki 1 i 10, 10 i 19 itd.; kolor brązowy) lub maksymalnie 300 par obrazów dla każdego Δt. Na wykresie (B) pokazano wpływ zmiany rozmiaru obrazu na czas obliczeń. Obrazy binowano poprzez grupowanie pikseli 2 x 2, 4 x 4 lub 8 x 8, co skutkowało odpowiednio rozmiarami obrazu 256 x 256, 128 x 128 lub 64 x 64. W każdym przypadku do obliczenia macierzy DDM dla każdego Δt wykorzystano około 300 par obrazów. (C) Z macierzy DDM można wyznaczyć pośrednią funkcję rozpraszania (ISF). Przedstawiono to dla trzech przypadków z wykresu (A). Niebieskie punkty danych (bez przesunięcia) odpowiadają ISF przy zastosowaniu maksymalnej liczby par obrazów dla każdego Δt; brązowe punkty danych (z przesunięciem 0,1) odpowiadają ISF przy zastosowaniu niezakładających się par obrazów dla każdego Δt; a różowe punkty danych (z przesunięciem 0,2) odpowiadają ISF przy zastosowaniu maksymalnie 300 par obrazów dla każdego Δt. ISF wyznaczona przy użyciu niezakładających się par obrazów wykazuje większy szum przy długich Δt. W tym przypadku przy długich Δt wykorzystano niewiele par obrazów (np. dla Δt wynoszącego 1000 klatek wykorzystano tylko 4 pary obrazów). (D) Poprzez dopasowanie ISF do funkcji wykładniczej wyznaczono charakterystyczny czas zaniku, τ, dla każdej liczby falowej, q. Kolorem różowym zaznaczono wyniki po binowaniu oryginalnych obrazów 2 x 2, co dało rozmiar obrazu 256 x 256. Kolorem szarym zaznaczono wyniki po binowaniu 8 x 8, co dało rozmiar obrazu 64 x 64. Dzięki binowaniu danych tracone są informacje o dynamice przy wyższych liczbach falowych, ale obliczanie macierzy DDM dla obrazów 64 x 64 jest około 16x szybsze niż dla obrazów 256 x 256. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Dopasowanie macierzy DDM lub ISF

  1. Zainicjuj instancję klasy DDM_Fit. W tym celu przekaż do DDM_Fit nazwę pliku YAML zawierającego metadane obrazów oraz parametry dopasowania.
  2. Zdecyduj, który model macierzy DDM lub ISF należy zastosować do dopasowania danych. Wylistuj dostępne modele, wykonując funkcję print_fitting_models. Określ model do użycia w pliku parametrów YAML lub korzystając z funkcji reload_fit_model_by_name.
  3. Ustaw wartości początkowe oraz granice dla każdego parametru w wybranym modelu w dostarczonym pliku parametrów YAML. Aby zmienić wartość początkową dowolnego parametru, użyj funkcji set_parameter_initial_guess. Ustaw granice parametrów za pomocą funkcji set_parameter_bounds. Na przykład, jak pokazano w Supplementary File 2, dla danych dotyczących kulek znacznikowych w sieci wimentyny, wartość początkowa czasu zaniku wynosiła 1 s, a granice tego parametru wynosiły 0.01 s i 2000 s.
  4. Wykonaj dopasowanie za pomocą funkcji fit. Przypisz zmienną do wyniku tej funkcji, aby łatwo uzyskać dostęp do rezultatów.
    ​UWAGA: Funkcja ta może przyjmować wiele opcjonalnych argumentów. Zobacz dokumentację kodu i dostarczone przykłady, aby zapoznać się z listą takich argumentów oraz sytuacjami, w których należy rozważyć ustawienie ich na wartości inne niż domyślne.

7. Interpretacja wyników dopasowania

  1. Wygeneruj wykresy w celu sprawdzenia dopasowania oraz qzależność parametrów dopasowania za pomocą funkcji fit_report.
    UWAGA: Funkcja ta wygeneruje serię wykresów, które zostaną również zapisane w formacie PDF. Opcjonalne argumenty tej funkcji mogą zostać wykorzystane do zmodyfikowania generowanych wykresów.
  2. Wśród wygenerowanych wykresów znajdzie się rycina z czterema podwykresami (układ 2 x 2), przedstawiająca macierz DDM lub ISF (w zależności od wybranego modelu dopasowania) w czterech qwartości (określone jako opcjonalny argument funkcji fit_report), wraz z obliczoną macierzą DDM lub ISF przy użyciu modelu i parametrów najlepszego dopasowania. Aby w sposób interaktywny wykreślić macierz DDM lub ISF wraz z najlepszym dopasowaniem, należy użyć klasy Browse_DDM_Fits, zgodnie z przykładami zamieszczonymi w przypadku korzystania ze środowiska Jupyter Notebook.
  3. Z wykresu charakterystycznego czasu zaniku τ w zależności od liczby falowej q, należy określić, czy dynamika odpowiada ruchowi dyfuzyjnemu, subdyfuzyjnemu, balistycznemu, czy też innemu rodzajowi ruchu. Można to zrobić, analizując zależność potęgową między τ i q.
    ​UWAGA: Na wykresie w skali logarytmicznej dla τ kontra q wygenerowane przez funkcję fit_report, wyświetlone zostaną trzy linie odpowiadające dopasowaniom do prawa potęgowego w określonym zakresie q wartości. Ciągła czarna linia odpowiada dopasowaniu τ kontra q do prawa potęgowego, τ = 1 / Kqβ, gdzie K i β są parametrami wolnymi. Pomarańczowa przerywana linia odpowiada dopasowaniu do prostej dyfuzji, τ = 1 / Dq2, gdzie D jest współczynnikiem dyfuzji. Niebieska linia kropka-kreska odpowiada dopasowaniu do τ = 1 / vq, gdzie v jest prędkością.

8. Zapisywanie wyników

  1. Wyniki dopasowania zostaną zapisane w zbiorze danych xarray. Aby zapisać tę strukturę danych na dysku, należy użyć funkcji to_netcdf biblioteki xarray lub wbudowanego w język Python modułu pickle. Do ładowania tych plików netCDF należy użyć funkcji open_dataset biblioteki xarray.
  2. Aby zapisać wyniki dopasowania wraz z danymi w pliku arkusza kalkulacyjnego, należy użyć funkcji save_fit_results_to_excel.

Wyniki

W niniejszej sekcji przedstawiamy przykłady analiz wykonanych za pomocą PyDDM na podstawie dwóch różnych serii eksperymentów. W pierwszej serii eksperymentów submikronowe kulek znacznikowe osadzono w sieciach składających się z białka filamentów pośrednich – wimentyny – a następnie obrazowano przy użyciu obiektywu 100x w trybie jasnego pola z częstotliwością 100 frames/s (Rysunek 3A). Wimentyna jest eksprymowana w komórkach mezenchymalnych i stanowi kluczowy czynnik warunkujący właściwości mechaniczne cytoplazmy65 oraz stabilność mechaniczną jądra w komórkach wykonujących migrację w ograniczonej przestrzeni66,67. Do tej pory zrekonstytuowane sieci wimentyny badano głównie za pomocą reologii makroskopowej64,68,69, podczas gdy ich dynamika otrzymała stosunkowo niewielką uwagę13,70,71. Dodatkowe szczegóły tych eksperymentów można znaleźć w Pliku uzupełniającym 2. W drugiej serii eksperymentów przygotowano aktywne sieci cytoszkieletu z aktyny, mikrotubul i miozyny. Spektralnie odmienne znaczniki fluorescencyjne pozwoliły na obrazowanie filamentów aktyny i mikrotubul przy użyciu dwukolorowego konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem i obiektywem 60x z częstotliwością 2,78 frames/s (Rysunek 3B,C). Filamenty aktyny i mikrotubule są istotnymi czynnikami napędzającymi dynamiczne zmiany kształtu komórek, a ich działanie jest koordynowane przez oddziaływania mechaniczne i biochemiczne72. Dodatkowe szczegóły tych eksperymentów można znaleźć w11. Pojedyncze klatki z sekwencji obrazów zarejestrowanych w tych eksperymentach przedstawiono na Rysunku 3.

figure-results-1
Rycina 3: Obrazy z analizowanej serii czasowej. (A) Obraz w świetle przechodzącym kulek o średnicy 0.6 µm w sieci wimentyny. (B,C) Obrazy (B) mikrotubul i (C) aktyny w aktywnym kompozycie aktyna-mikrotubula, wykonane przy użyciu obiektywu 60x w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym, z wykorzystaniem światła wzbudzenia 561 nm dla obrazowania mikrotubul i 488 nm dla obrazowania aktyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W celu obrazowania kulek znacznikowych w sieciach vimentyny zarejestrowano filmy składające się z 5000 klatek o rozmiarze 512 x 512 pikseli przy częstotliwości 100 klatek/s. Na ich podstawie obliczono macierz DDM dla 60 logarytmicznie rozmieszczonych czasów opóźnienia w przedziale od 1 do 1000 klatek, czyli od 0,01 s do 10 s. Aby oszacować tło, B, obliczono średnią z kwadratów obrazów po przekształceniu Fouriera, figure-results-2, i przyjęto, że jest ona równa figure-results-355,73. Przyjęto założenie, że dla największych 10% wartości q wielkość ta jest równa B/2 oraz że B jest niezależne od q. Jest to domyślna metoda szacowania B w tym pakiecie, jednak możliwe jest zastosowanie innych metod poprzez ustawienie parametru background_method na inną wartość.

Po wyznaczeniu parametrów A(q) i B na podstawie figure-results-4, z macierzy DDM można wyodrębnić funkcję rozproszenia pośredniego (ISF). Przykładowe funkcje ISF przedstawiono na rycinie 4. Na rycinie 4A pokazano ISF dla obrazów kulek o średnicy 0,6 µm osadzonych w sieci o stężeniu wimentyny 19 µM. Na rycinie 4B przedstawiono ISF dla tych samych kulek w sieci o stężeniu wimentyny 34 µM. Co interesujące, w żadnym z tych przypadków ISF nie zanikła do zera. Przy dużych czasach opóźnienia ISF powinna dążyć do zera dla układów ergodycznych. Oznacza to, że w takich układach fluktuacje gęstości powinny ulec całkowitej dekorelacji w długich przedziałach czasowych. Fakt, że ISF w tym przypadku nie zanikła do zera, mógł wynikać z niedokładnych szacunków A(q) i B, które zostały wykorzystane do wyznaczenia ISF z obliczonej macierzy DDM. Warto zauważyć, że zastosowana tutaj metoda może zawyżać wartość B w określonych scenariuszach62. Bardziej prawdopodobne jest jednak, że dynamika kulek znacznikowych jest rzeczywiście nieergodyczna, ponieważ kulki mają rozmiar porównywalny z rozmiarem oczek sieci i mogą zatem zostać uwięzione. Inne dane potwierdziły stwierdzoną nieergodyczność. Mianowicie rozmiar kulek, 0,6 µm, był większy niż obliczona średnia wartość rozmiaru oczek, która wynosiła 0,4 µm dla stężenia 19 µM i 0,3 µm dla stężenia 34 µM. Dodatkowo wyniki śledzenia pojedynczych cząsteczek tych kulek znacznikowych, przedstawione w dalszej części, również wykazały ruch ograniczony.

figure-results-5
Rycina 4: Pośrednie funkcje rozpraszania przy kilku liczbach falowych dla sieci wimentyny. ISF przedstawiono jako funkcję czasu opóźnienia dla wartości q od około 1 do 9 µm-1. (A) ISF z obrazów kulek o rozmiarze 0,6 µm w sieci wimentyny przy stężeniu wimentyny 19 µM. (B) ISF z obrazów kulek o rozmiarze 0,6 µm w sieci wimentyny przy stężeniu wimentyny 34 µM. Płaskowyż ISF przy długim czasie opóźnienia na poziomie znacznie powyżej zera wskazuje na nieergodyczność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Z uwagi na to, że dynamika jest prawdopodobnie nieergodyczna, funkcje ISF dopasowano do formy figure-results-6, gdzie C jest czynnikiem nieergodyczności 32. Taka forma ISF była stosowana w poprzednich badaniach dynamiki nieergodycznej, na przykład w przypadku żeli koloidalnych32,74 lub cząstek śledzących w sieciach aktyna-mikrotubul 10. Czarne linie przerywane na Rysunku 4 przedstawiają dopasowania wraz z danymi. Na podstawie tych dopasowań można teraz przeanalizować zależność czasu zaniku, τ, oraz parametru nieergodyczności, C, od q.

figure-results-7
Rysunek 5: Zależność czasu zaniku od liczby falowej dla sieci wimentyny. Na podstawie dopasowań do ISF wyznaczono czas zaniku τ dla zakresu wartości q. Dla przejrzystości nie pokazujemy wartości τ dla każdego q, lecz jedynie zestaw rozmieszczony logarytmicznie. Kolorem niebieskim (brązowym) oznaczono dane z obrazów kulek 0,6 µm w sieciach wimentyny o stężeniu 19 µM (34 µM). Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe dla τ z wielu filmów (cztery filmy dla danych dla sieci 19 µM [niebieski] i pięć filmów dla danych dla sieci 34 µM [brązowy]). Czerwone linie przerywno-kropkowane wyznaczają szacowane granice rozdzielczości czasowej i przestrzennej, zgodnie z opisem w wynikach. Ciągła czarna linia przedstawia skalowanie figure-results-8 , co wskazywałoby na ruch dyfuzyjny. Żaden z zestawów danych nie wykazuje takiego skalowania. Zamiast tego, kulki w sieci 19 µM wykazują ruch subdyfuzyjny (figure-results-9 przy β > 2), a kulki w sieci 34 µM wykazują ruch ograniczony lub uwięziony (caged motion). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Czasy zaniku charakteryzowały się znaczną niepewnością, zarówno przy niskich q i wysoki q ekstremów, co widać w Rysunek 5Słupki błędów na tym wykresie przedstawiają odchylenie standardowe dla czterech analizowanych filmów w przypadku niższego stężenia wimentyny lub pięciu filmów analizowanych dla wyższego stężenia. Aby zrozumieć źródło dużej niepewności w tych ekstremach, należy wziąć pod uwagę rozdzielczość czasową i przestrzenną. Przybliżone granice rozdzielczości zaznaczono trzema czerwonymi liniami kreskowo-kropkowanymi. Dwie linie poziome odpowiadają minimalnemu i maksymalnemu badanemu czasowi opóźnienia. Biorąc pod uwagę częstotliwość klatek wynoszącą 100 kl./s oraz maksymalny czas opóźnienia odpowiadający 1000 klatkom (20% całkowitego czasu trwania filmu), precyzja pomiaru została utracona w przypadku dynamiki zachodzącej szybciej niż w 0,01 s lub wolniej niż w 10 s. Przy niższym qwartości p, wartości dopasowane dla τ wynosiły powyżej 10 s. W związku z tym należy spodziewać się dużych niepewności w przypadku czasów zaniku przekraczających maksymalny czas opóźnienia. W górnym zakresie q-zakresie czas zaniku zbliżał się do minimalnego czasu opóźnienia wynoszącego 0,01 s, lecz pozostawał powyżej tej wartości. W tych wyższych wartościach ograniczeniem nie była rozdzielczość czasowa, lecz q wartości, czynnikiem ograniczającym może być rozdzielczość przestrzenna. Biorąc pod uwagę rozmiar piksela wynoszący 0.13 µm, największa wartość dla q dotyczyło 24 µm-1Jednak rozdzielczość ograniczona dyfrakcyjnie nie zawsze pozwala na dokładne pomiary dynamiki przy tak wysokich częstotliwościach przestrzennych. Przyjmując przybliżenie rozdzielczości optycznej jako figure-results-10 prowadzi do górnej granicy liczby falowej wynoszącej około 16 µm-1biorąc pod uwagę apertura numeryczna obiektywu, NA, wynosząca 1,4 oraz długość fali światła, figure-results-11Jest to oznaczone pionową czerwoną linią kreskowo-kropkowaną w Rycina 5Rzeczywiście, dane charakteryzowały się dużym poziomem szumu przy wysokich wartościach qJeszcze przed osiągnięciem tej przybliżonej górnej granicy q, zwiększona niepewność w zakresie τ zaobserwowano, co mogło wynikać z przeszacowania qmaksymalnyGorsza niż przewidywana rozdzielczość optyczna może wynikać z zastosowania obiektywu imersyjnego do obrazowania próbki w środowisku wodnym poza szkiełkiem nakrywką lub z nieprawidłowego ustawienia soczewki kondensora.

W przypadku kulek o średnicy 0,6 µm osadzonych w sieci o mniejszym stężeniu (19 µM wimentyny), na wykresie log-log czasu zaniku w funkcji liczby falowej można zaobserwować, że czas zaniku malał wraz z liczbą falową w sposób zgodny z prawem potęgowym (Rycina 5). Nie wydaje się jednak, aby proces ten przebiegał zgodnie z oczekiwaniami dla normalnego ruchu dyfuzyjnego, w którym figure-results-12. Zamiast tego  τ malało gwałtowniej wraz ze wzrostem q. Wskazuje to na ruch subdyfuzyjny, który często występuje w przypadku kulek w środowiskach o dużym zagęszczeniu, takich jak w tym przypadku. Dopasowanie  τ(q) w zakresie od 1,4 µm-1 do 12,3 µm-1 do prawa potęgowego o postaci  τ = 1/Kqβ  pozwala wyznaczyć parametry transportu K = 0,0953 μmβ / s oraz β = 2,2. Dla osób bardziej przyzwyczajonych do analizowania dyfuzji normalnej i subdyfuzji w kategoriach średniego kwadratu przemieszczenia (MSD) cząstek znacznika jako funkcji czasu opóźnienia (tj. MSD = K' Δtα), pomocne może być uznanie, że wykładnik skalowania subdyfuzyjnego w równaniu MSD, α, jest równoważny α = 2 / β. Innymi słowy, wartość  β = 2,2 jest zgodna z wykładnikiem skalowania subdyfuzyjnego w równaniu MSD wynoszącym α = 0,9. Aby dopasować  τ(q) w tym zakresie wartości q za pomocą PyDDM, należy określić indeksy  tablicy q, korzystając z parametru Good_q_range w pliku YAML lub przekazując opcjonalny argument forced_qs do funkcji generate_fit_report. Zakres q od 1,4 µm-1 do 12,3 µm-1 odpowiadałby w tym przypadku indeksom tablicy q od 15 do 130.

W przypadku kulek o średnicy 0.6 µm w bardziej skoncentrowanej sieci (34 µM), czas zaniku wykazywał niewielką zależność od q. Jest to prawdopodobnie spowodowane nieergodycznością kulek w sieci o mniejszym rozmiarze oczek. Aby zbadać nieergodyczność w tym układzie, parametr nieergodyczności, C, należy przedstawić jako funkcję q, jak pokazano na Rysunku 6. Dla kulek 0.6 µm w sieci wimentyny o stężeniu 19 µM, C ≈ 0.2 przy niewielkiej zależności od q (nie pokazano). Jednak w przypadku sieci z 34 µM wimentyny oraz sieci o jeszcze wyższym stężeniu 49 µM wimentyny, logarytm C był proporcjonalny do q2, co przedstawiono na Rysunku 6. Taka zależność między C a q jest oczekiwana dla ruchu ograniczonego. W przypadku kulek uwięzionych w kieszeniach sieci, oczekuje się, że MSD osiągnie plateau przy odpowiednio długich czasach opóźnienia (tj. figure-results-13, gdzie figure-results-14 to MSD, a δ2 to maksymalne MSD). Ponieważ ISF można wyrazić za pomocą MSD jako figure-results-15, a nieergodyczne ISF dąży do C przy długich czasach opóźnienia (tj. figure-results-16), otrzymuje się zależność figure-results-17 32,75. Zatem można wykorzystać C(q) do wyznaczenia δ2, co pozwoliło uzyskać wartości δ2 = 0.017 μm2 oraz 0.0032 μm2 odpowiednio dla sieci wimentyny 34 i 49 µM (co odpowiada wartościom δ = 0.13 μm i 0.057 μm).

figure-results-18
Rycina 6: Parametr nieergodyczności w funkcji wektora falowego dla sieci wimentyny. Na podstawie dopasowań do ISF wyznaczono parametr nieergodyczności C dla zakresu wartości q. Kolorem beżowym (tan) zaznaczono dane z obrazów kulek 0,6 µm w sieciach wimentyny o stężeniu wimentyny 34 µM (49 µM – kolor czerwony). Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe dla τ z wielu filmów (pięć filmów dla danych z sieci 34 µM [beżowy] i cztery filmy dla danych z sieci 49 µM [czerwony]). Oś y ma skalę logarytmiczną. Obserwuje się zależność C od q zgodną z figure-results-19, co pozwala na wyznaczenie maksymalnego średniokwadratowego przesunięcia, δ2. Dopasowania do figure-results-20 przedstawiono w postaci linii ciągłych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Można zastosować inne metody w celu wyznaczenia rozmiaru ograniczenia δ z danych, a także wykładnika subdyfuzyjnego otrzymanego z analizy  τ(q) dla kulek w sieci wimentyny o stężeniu 19 µM. Po pierwsze, można wykorzystać metodę opisaną przez Bayles i wsp.76 oraz Edera i wsp.77, aby wyznaczyć MSD z macierzy DDM. Warto zauważyć, że metoda ta nie wymaga dopasowania macierzy DDM. Należy jedynie obliczyć macierz DDM, D(q, Δt), oraz figure-results-21 (z których można wyznaczyć A(q) i B). Następnie, aby wyznaczyć MSD, stosuje się zależność figure-results-22. Należy pamiętać, że ta metoda wyznaczania MSD zakłada, iż rozkład przemieszczeń cząstek jest gaussowski, choć wcześniejsze prace wykazały, że w pewnych przypadkach MSD wyznaczone z DDM są zgodne z MSD z trackingu cząstek, nawet gdy przemieszczenia mają charakter niegaussowski73. W przypadku tego układu, zgodnie z oczekiwaniami78, występuje niegaussowski charakter rozkładu dużych przemieszczeń, co widać na Ryc. S1. W pakiecie PyDDM należy uruchomić funkcję extract_MSD, która zwraca figure-results-23. Po drugie, do wyznaczenia MSD można zastosować tracking pojedynczych cząstek. Chociaż DDM może być używany do analizy obrazów, w których wysoka gęstość cząstek lub ograniczona rozdzielczość optyczna uniemożliwiają dokładną lokalizację cząstek, w przypadku obrazów kulek o średnicy 0,6 µm w sieciach wimentyny byliśmy w stanie zlokalizować i śledzić kuleczki przy użyciu oprogramowania trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)79. Ten pakiet oprogramowania do trackingu cząstek wykorzystuje algorytmy opisane przez Crockera i Griera80.

figure-results-24
Rysunek 7: Średnie przesunięcie kwadratowe w funkcji czasu opóźnienia dla sieci wimentyny. MSD wyznaczono dwiema metodami. Po pierwsze, MSD obliczono z macierzy DDM (oznaczone wypełnionymi symbolami). Następnie MSD wyznaczono, wykorzystując śledzenie pojedynczych cząstek (SPT) w celu znalezienia trajektorii cząstek (otwarte symbole). Słupki błędów wyznaczono w ten sam sposób, jak opisano w legendach do dwóch poprzednich rysunków. (A) MSD dla kulek 0,6 µm w sieci wimentyny 19 µM wskazują na ruch subdyfuzyjny, przy dobrej zgodności między dwiema metodami wyznaczania MSD. (B) MSD dla kulek 0,6 µm w sieci wimentyny 49 µM wskazują na ruch uwięziony (caged motion), przy dobrej zgodności między dwiema metodami wyznaczania MSD oraz z maksymalną wartością MSD wyznaczoną z parametru nieergodyczności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zależność MSD od czasu opóźnienia dla kulek o rozmiarze 0.6 µm w sieci wimentyny o stężeniu 19 µM oraz w sieci wimentyny o stężeniu 49 µM przedstawiono na Rysunku 7. W obu przypadkach MSD wyznaczone metodą DDM były zgodne z MSD uzyskanymi za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek (SPT). Ponadto, dla sieci o mniejszym stężeniu, wykładnik skalowania subdyfuzyjnego (α w figure-results-25) wynosił około 0.9. Jest to zgodne ze skalowaniem  τ(q) według wzoru  figure-results-26 uzyskanym poprzez dopasowanie ISF w celu wyznaczenia  τ(q) (tj. 2/2.2 = 0.9). W przypadku sieci o większym stężeniu, MSD osiąga plateau przy dłuższych czasach opóźnienia. Maksymalna wartość MSD wyznaczona poprzez analizę zależności parametru nieergodyczności od q (pokazana na Rysunku 7B za pomocą poziomej linii przy δ2 = 0.0032 μm2) była w przybliżeniu równa wartości, do której dążyły plateau MSD zarówno w SPT, jak i w DDM. Na Rysunku 7A widoczna jest rozbieżność między wartościami MSD dla najdłuższych czasów opóźnienia wyznaczonymi za pomocą DDM i SPT. Choć może to wynikać z ograniczonej liczby trajektorii o długim czasie opóźnienia, możliwe jest również, że dalsza optymalizacja zakresu wartości q, dla których macierz DDM jest wykorzystywana do szacowania figure-results-27 dla każdego czasu opóźnienia (tak jak zrobili to Bayles i wsp.76 oraz Edera i wsp.77), poprawiłaby nasze wyniki; taka optymalizacja będzie przedmiotem przyszłych prac.

Eksperymenty te, w których zarejestrowano sekwencje obrazów kulek znacznikowych osadzonych w sieci włókien pośrednich vimentyny, pozwoliły na przeprowadzenie niezależnych analiz: DDM (przy użyciu opisanego tutaj pakietu) oraz SPT (przy użyciu trackpy). Obie analizy mogą ujawnić stopień subdyfuzji i długość uwięzienia, co umożliwia zastosowanie dwóch niezależnych technik analizy obrazu w celu uzyskania komplementarnych parametrów. Istnieją dodatkowe wielkości, które można porównać w ramach SPT i DDM. Na przykład heterogeniczność dynamiki próbki może objawiać się jako niegaussowskość w rozkładzie przemieszczeń cząstek (tj. rozkład van Hove'a) wyznaczonym z SPT, a także w ISF wyznaczonym z DDM, który pasuje do funkcji wykładniczej rozciągniętej34,35. Rysunek S1 przedstawia rozkład van Hove'a dla cząstek 0.6 µm w sieciach vimentyny i omawia wykładnik rozciągnięcia uzyskany z dopasowania ISF – parametry te były stosowane wspólnie w poprzednich badaniach w celu wykazania heterogenicznej dynamiki cząstek w systemach biomimetycznych9,10,47 lub innych środowiskach zatłoczonych 34. Jako kolejny przykład, ISF można obliczyć z trajektorii cząstek zmierzonych za pomocą SPT i porównać z ISF uzyskanymi metodą DDM. Choć średnie kwadratowe przemieszczenia i rozkłady przemieszczeń są parametrami najczęściej wyciąganymi z analizy SPT, można również obliczyć ISF z trajektorii cząstek, figure-results-28, stosując figure-results-29 (patrz Rysunek S2). Ten ISF można porównać z ISF wygenerowanymi przez DDM i wykorzystać do ujawnienia dynamiki niewidocznej w MSD59.

Choć pozyskiwanie obrazów cząstek znacznika wewnątrz sieci może pozwolić na zastosowanie komplementarnych metod analizy SPT i DDM, należy zauważyć, że przewagą DDM nad SPT jest fakt, iż nie wymaga ona obrazów kulek (lub innych obiektów), które można łatwo zlokalizować i śledzić. Aby zademonstrować tę kwestię, przedstawiamy w dalszej części analizę aktywnych sieci filamentów aktynowych i mikrotubul, w których znakowanie fluorescencyjne aktyny i tubuliny umożliwia obrazowanie obu typów filamentów, rozróżnialnych dzięki zastosowaniu różnych fluoroforów, przy użyciu wielokolorowego konfokalnego mikroskopu skaningowego.

Obrazy sieci aktyna i mikrotubul z aktywnością napędzaną przez miozynę (miozyna II mięśnia szkieletowego królika; Cytoskeleton #MY02) zostały pozyskane za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego. Szczegóły eksperymentów i wyniki zostały opisane wcześniej11, a przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki pochodzą z analizy dwóch filmów dostarczonych w materiałach uzupełniających (filmy S1 i S4) do publikacji11. Obie sekwencje obrazów zostały zarejestrowane z częstotliwością 2,78 klatek/s przez 1000 klatek.

Aby przeanalizować te obrazy, obliczono macierz DDM dla 50 czasów opóźnienia w zakresie od 0,4 s do 252 s (od 1 klatki do 700 klatek). Następnie macierz DDM dopasowano do modelu figure-results-30, gdzie pośrednia funkcja rozpraszania wynosiła figure-results-31. Istnieją zatem cztery parametry dopasowania: A, τ, s oraz B. Wyniki tych dopasowań przedstawiono na Rysunku 8. Zaobserwowano, że macierz DDM dla konkretnej wartości q wykazywała plateau przy krótkich czasach opóźnienia, wzrastała wraz z czasem opóźnienia, a następnie osiągała plateau (lub wykazywała oznaki początku plateau) przy dużych czasach opóźnienia. Macierz DDM dla niższych wartości q nie osiągnęła plateau przy długich czasach opóźnienia. Należy zatem spodziewać się niskiej dokładności pomiaru czasu zaniku dla tych dynamik przy niskich wartościach q (duża skala długości).

Charakterystyczne czasy zaniku, τ, uzyskane z dopasowań do macierzy DDM, przedstawiono na Rysunku 9. Wyniki zaprezentowano dla aktywnej kompozytowej sieci aktyna i mikrotubul (podobnie jak w filmie S111) oraz dla aktywnej sieci aktynowej (podobnie jak w filmie S411). Obie sieci przygotowano przy tych samych stężeniach aktyny i miozyny, jednak sieć składającą się z samej aktyny utworzono bez tubuliny, zgodnie z opisem w11. Dla tych dwóch typów aktywnych sieci zaobserwowano zależność potęgową figure-results-32. Skalowanie to wskazuje na ruch balistyczny oraz na to, że napędzany miozyną skurcz i przepływ dominują nad ruchem termicznym filamentów. Z zależności τ = (vq)-1 wyznaczono charakterystyczną prędkość, v, wynoszącą około 10 nm/s dla aktywnej sieci aktyna-mikrotubule oraz 75 nm/s dla aktywnej sieci aktynowej. Wartości te są zgodne z analizą PIV (Particle Image Velocimetry) tych samych filmów przedstawionych w11. Skalowanie  figure-results-33 nie było zachowane dla niższych wartości q w przypadku aktywnej kompozytowej sieci aktyna-mikrotubule. Prawdopodobnie wynika to z faktu, że rzeczywiste czasy zaniku dla tej kompozytowej sieci aktyna-mikrotubule przy niższych wartościach q są dłuższe niż maksymalny czas opóźnienia w obliczonej macierzy DDM. Maksymalny czas opóźnienia zaznaczono poziomą czerwoną linią na Rysunku 9, a czasy zaniku odchyliły się od oczekiwanego skalowania  figure-results-34 w pobliżu tych dłuższych czasów.

figure-results-35
Rycina 8: Macierz DDM w funkcji czasu opóźnienia dla aktywnej sieci kompozytowej aktyna i mikrotubul. Macierz DDM dla kilku wartości q przedstawiono jako funkcję czasu opóźnienia na podstawie filmu z sieci kompozytowej składającej się z 2,9 µM monomerów aktyny, 2,9 µM dimerów tubuliny i 0,24 µM miozyny. Dane te przedstawiają analizę wyłącznie kanału mikrotubul z wielokolorowej serii czasowej obrazów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-36
Rysunek 9: Czas zaniku w funkcji liczby falowej dla aktywnych sieci aktynowo-mikrotubularnych. Na podstawie dopasowania macierzy DDM wyznaczono czas zaniku, τ, jako funkcję liczby falowej, q. Przedstawiono zależność  τ od q dla obrazów aktywnej sieci aktynowo-mikrotubularnej (analiza tylko kanału mikrotubul) zaznaczonej kolorem brązowym oraz dla obrazów aktywnej sieci aktynowej zaznaczonej kolorem zielonym. Obie sieci mają takie same stężenia aktyny i miozyny (odpowiednio 2.9 µM i 0.24 µM); kompozyt aktynowo-mikrotubularny zawiera 2.9 µM dimerów tubuliny. Czas zaniku dla aktywnej sieci aktynowej jest znacznie krótszy niż dla aktywnej sieci aktynowo-mikrotubularnej, co wskazuje na szybszy ruch aktywnej sieci aktynowej. W obu przypadkach dynamika jest balistyczna, ponieważ dane wykazują trend zgodny z figure-results-37 . Wstawka: wykres ISF w funkcji czasu opóźnienia przeskalowanego przez liczbę falową (Δt × q) pokazuje nałożenie się funkcji ISF w zakresie wartości q . Wskazuje to również na ruch balistyczny. Funkcje ISF przedstawione na wstawce pochodzą z aktywnej sieci aktynowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W przypadku tych danych dla sieci aktywnych zdecydowaliśmy się na dopasowanie macierzy DDM, figure-results-38. Stoi to w sprzeczności z podejściem zastosowanym dla danych dotyczących kulek w sieci wimentyny, gdzie A (q) i B szacowano bez dopasowania w celu wyizolowania ISF, f (q, Δt). W tym przypadku, dla danych sieci aktywnej, A i B pozostawiono jako parametry dopasowania, ponieważ metody stosowane do szacowania B nie prowadziły do dobrych wyników dopasowania. Domyślną metodą szacowania B jest obliczenie figure-results-39 i przyjęcie, że przy dużych q wartość ta dąży do B/2. Jednak metoda ta przeszacowała B dla tych danych, co objawiło się tym, że podczas obliczania ISF z B oszacowanego w ten sposób (nie pokazano), wartości ISF były większe niż 1 przy krótkich czasach opóźnienia (podczas gdy powinny zmieniać się od maksimum wynoszącego 1 do zera lub pewnego parametru nieergodyczności wraz ze wzrostem czasu opóźnienia). Można wybrać inne metody szacowania B za pomocą parametru background_method. Jedną z tych metod jest szacowanie B jako minimum macierzy DDM przy krótkich czasach opóźnienia (ustawione za pomocą background_method=1). Podobnej metody użyli Bayles i wsp.76, choć nie założyli oni, że B jest stałe względem q. Inną opcją jest szacowanie B jako średniej wartości dla wszystkich czasów opóźnienia macierzy DDM przy maksymalnym q (ustawione za pomocą background_method=2). Te różne metody szacowania tła, a także wyniki dla B jako wolnego parametru dopasowania, przedstawiono na Rysunku 10. Z tych wykresów widać, że amplituda, A, nie osiągnęła zera przy największych badanych wartościach q , ponieważ figure-results-40 nie osiągnęło plateau przy dużych q (Rysunek 10B), a D(qmax, Δt) zmieniało się z plateau dla krótkich czasów opóźnienia do plateau dla dłuższych czasów opóźnienia (tzn. przy qmax wystąpiło niezerowe A; Rysunek 10D). Zatem ani szacowanie B jako figure-results-41, ani jako figure-results-42 nie byłoby właściwe. Przed podjęciem decyzji o tym, jak (lub czy w ogóle) szacować B, należy przeanalizować figure-results-43 względem q oraz D(qmax, Δt) względem Δt.

figure-results-44
Rysunek 10: Tło w funkcji liczby falowej dla aktywnych sieci aktyna i mikrotubul. Na podstawie dopasowania macierzy DDM można wyznaczyć tło, B, jako funkcję liczby falowej, q. Przedstawiono zależność  B  od q dla obrazów aktywnej sieci aktyna i mikrotubul (analiza tylko kanału mikrotubul) wyznaczoną z tych dopasowań (symbole fioletowe). Trzy linie ciągłe na panelu (A) pokazują szacunki tła wyznaczone bez dopasowania. Górna, najciemniejsza linia w (A) przedstawia szacunkowe tło wyznaczone za pomocą figure-results-45, co może być właściwe, jeśli figure-results-46 osiąga stałą wartość (plateau) dla dużych q. Z panelu (B) wynika, że figure-results-47 nie osiągnęła jeszcze stałej wartości dla największych badanych q. Zatem stosowanie tej metody prowadzi do przeszacowania tła. Dolna linia w (A) przedstawia szacunkowe tło wyznaczone za pomocą figure-results-48. Jeśli macierz DDM wykazuje plateau dla krótkich czasów opóźnienia, jak pokazano na panelu (C) czerwoną linią, metoda ta może być odpowiednia do szacowania tła. Środkowa, najjaśniejsza linia w (A) przedstawia szacunkowe tło wyznaczone z figure-results-49. Metoda ta może być właściwa, jeśli dla qmax amplituda, A, osiągnęła zero. Z panelu (D) wynika, że amplituda jest różna od zera, w związku z czym metoda ta przeszacowuje tło. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Rozkłady prawdopodobieństwa przesunięć cząsteczek. Rozkłady prawdopodobieństwa przesunięć cząsteczek wykazują niegaussowski charakter dla stężeń wimentyny 34 µM i 49 µM. Śledzenie pojedynczych cząsteczek kulek o średnicy 0,6 µm przeprowadzono w sieciach wimentyny o różnych stężeniach. W rozkładach przesunięć dla trzech warunków przedstawiono różne czasy opóźnienia. (A) Rozkład przesunięć cząsteczek w sieci wimentyny o stężeniu 19 µM został dopasowany do funkcji Gaussa. Szerokość rozkładu Gaussa rośnie wraz ze wzrostem czasu opóźnienia. (B) Rozkład przesunięć cząsteczek w sieci wimentyny o stężeniu 34 µM wykazuje większy charakter niegaussowski, szczególnie przy dużych przesunięciach, niż w przypadku stężenia 19 µM. (C) Rozkład przesunięć cząsteczek w sieci wimentyny o stężeniu 49 µM również wykazuje charakter niegaussowski. Co więcej, szerokości rozkładów nie zwiększają się wraz z czasem opóźnienia tak znacząco, jak w próbkach o niższych stężeniach wimentyny, co wskazuje na ruch ograniczony. Niegaussowskie rozkłady van Hove’a (obserwowane we wszystkich próbkach wimentyny, lecz najbardziej wyraźne przy wyższych stężeniach) wiążą się z heterogeniczną dynamiką, często spotykaną w transporcie cząsteczek w środowiskach zatłoczonych i ograniczonych. Innym wskaźnikiem heterogenicznego transportu, wyznaczanym z analizy DDM, jest wykładnik rozciągania używany do dopasowania pośredniej funkcji rozpraszania (parametr s w równaniu dla ISF zastosowanym tutaj: figure-results-50 + figure-results-51). Średnie wykładniki rozciągania w zakresie q od 0,4 µm-1 do 9,4 µm-1 wynoszą, od najwyższego do najniższego stężenia wimentyny, odpowiednio 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 oraz 0,86 ± 0,04 (średnia ± odchylenie standardowe). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Funkcje rozpraszania pośredniego uzyskane metodami DDM i SPT. Przedstawiono funkcje rozpraszania pośredniego (ISF) dla pięciu różnych liczb falowych. Zależność ISF od czasu opóźnienia wyznaczoną metodą DDM naniesiono za pomocą okrągłych markerów, natomiast ISF obliczoną z trajektorii pojedynczych cząsteczek (SPT) za pomocą pustych kwadratów. Czarne linie przerywane przedstawiają dopasowania do funkcji ISF uzyskanych metodą DDM. Funkcję ISF oblicza się z trajektorii pojedynczych cząsteczek, figure-results-52, stosując figure-results-53. Na panelu (A) pokazano ISF dla cząsteczek o rozmiarze 0.6 µm w sieciach wimentyny o stężeniu 19 µM. Na panelu (B) pokazano ISF dla cząsteczek o rozmiarze 0.6 µm w sieciach wimentyny o stężeniu 34 µM. Rozbieżności w funkcjach ISF uzyskanych metodami DDM i SPT wynikają prawdopodobnie z ograniczonej liczby trajektorii o długim czasie opóźnienia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Protokół użycia DDM. Przedstawiono dane wejściowe i wyjściowe poszczególnych kroków opisanych w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Szczegóły przygotowania próbek i przykładowe pliki parametrów dla sieci vimentyny. Przedstawiono szczegółowe kroki przygotowania próbek oraz akwizycji obrazów sieci vimentyny. Dodatkowo udostępniono przykładowy plik parametrów do analizy danych zaprezentowanych w sekcji wyników reprezentatywnych dla sieci vimentyny. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Opisany tutaj pakiet oprogramowania wykorzystuje DDM do analizy fluktuacji gęstości obserwowanych w obrazach uzyskanych za pomocą mikroskopu optycznego. W pierwszej kolejności przedstawiono reprezentatywne wyniki z danych dotyczących cząstek znacznikowych osadzonych w sieciach wimentyny. Analiza takich danych może być wykorzystana do scharakteryzowania rozmiaru siatki i sztywności sieci, podobnie jak śledzenie pojedynczych cząstek było wykorzystywane w wielu wcześniejszych badaniach sieci cytoszkieletów 6,12,13. Zaletą stosowania DDM w porównaniu ze śledzeniem pojedynczych cząstek jest to, że DDM nie wymaga lokalizacji cząstek. Dlatego nawet na obrazach, na których gęstość cząstek jest zbyt wysoka lub cząstki są zbyt małe, aby można je było zlokalizować i śledzić, DDM może nadal określać dynamikę. Śledzenie pojedynczych cząstek byłoby korzystne w przypadku kontroli zmienności między cząstkami. W przypadku DDM można znaleźć uśrednioną dynamikę zespołu, podczas gdy przy śledzeniu pojedynczej cząstki można obliczyć zarówno MSD pojedynczej cząstki, jak i MSD uśrednione zespołowo. Jednak DDM może być używany do badania dynamiki heterogenicznej poprzez analizowanie wielu obszarów zainteresowania w dużym polu widzenia.

Następnie przedstawiono reprezentatywne wyniki z danych włókien znakowanych fluorescencyjnie w sieci aktywnej złożonej z dwóch różnie znakowanych typów włókien cytoszkieletu11. Na podstawie tych danych scharakteryzowano ruch balistyczny bez konieczności lokalizowania jakichkolwiek cech na obrazie. Ponieważ DDM ekstrahuje uśrednioną dynamikę zespołu przy niewielkiej liczbie danych wejściowych użytkownika, ułatwia to porównywanie serii obrazów uzyskanych w różnych warunkach (np. porównywanie próbek o różnych proporcjach aktyny do mikrotubul lub próbek o różnych stężeniach miozyny, jak to miało miejsce w50). Dodatkowo, korzystając z obrazowania fluorescencyjnego, możemy badać dynamikę różnych elementów sieci za pomocą wielokolorowego znakowania. Dokonano tego w 11,50, gdzie dynamika aktyny i mikrotubul była oddzielnie analizowana w aktywnej sieci kompozytowej aktyna-mikrotubula przy użyciu obrazowania wielokolorowego. W sekcji wyników reprezentatywnych pokazano tylko wyniki z kanału mikrotubul, ale w poprzedniej pracy porównaliśmy dynamikę włókien mikrotubuli i aktyny11.

Zauważamy, że te reprezentatywne wyniki pokazują albo pasywną subdyfuzję, albo aktywny ruch balistyczny. Co ważne, DDM może być wykorzystywany do analizy układów, w których występuje przecięcie w rodzaju dynamiki w pośrednich skalach czasowych lub długościowych. Jako przykłady, Kurzthaler i in. wykorzystali DDM z systemem aktywnych koloidów Janusa do zbadania aktywnego ruchu kierowanego w krótkich skalach czasowych i randomizacji orientacji w dłuższych skalach czasowych59; Giavazzi i wsp. użyli DDM z gruboziarnistą pianką i znaleźli skrzyżowanie w dynamice odpowiadającej skali długości pęcherzyka33; a Cho i in. użyli DDM z żelami koloidalnymi i znaleźli trzy rozróżnialne reżimy w różnych skalach długości, rozciągających się od klastrów fraktalnych do całej sieci32.

Dane zawarte w sekcji wyników reprezentatywnych uzyskano za pomocą mikroskopii jasnego pola i laserowo-skaningowej mikroskopii konfokalnej. Jednak, jak wspomniano wcześniej, DDM może być stosowany z wieloma modalnościami obrazowania. W przypadku każdej metody obrazowania użytkownicy powinni wziąć pod uwagę ustawienia optyczne, takie jak stopień przekroju optycznego lub głębia ostrości. Wysoki stopień przekroju optycznego może zmniejszyć sygnał od nieostrych obiektów, ale nie będzie w stanie dokładnie zmierzyć dynamiki w skalach czasowych większych niż skala czasu, w której obiekty poruszają się poza głębią ostrości25,28. Bardziej szczegółowe omówienie tego, jak głębia ostrości zależna od q wpływa na analizę DDM, można znaleźć w22. W przypadku obrazowania w jasnym polu użytkownicy mogą być również zmuszeni do rozważenia grubości próbki. Podczas gdy w przypadku próbek słabo rozpraszających, grubsze próbki mogą dostarczyć więcej sygnału42, próbki mętne mogą wymagać modyfikacji analizy w celu uwzględnienia rozpraszania wielokrotnego81. Wreszcie, w przypadku metod obrazowania, które nie są niezmiennicze w przestrzeni liniowej (to znaczy, gdy intensywność zarejestrowana przez kamerę obiektu zależy od tego, gdzie ten obiekt znajduje się w płaszczyźnie próbki x-y), może być konieczne uwzględnienie liniowej wariancji przestrzeni, jak wykazano w przypadku DDM27 w ciemnym polu.

Dla tych, którzy rozpoczynają pracę z DDM, pragniemy podkreślić znaczenie rozważenia rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Podczas sprawdzania wyznaczonych czasów zaniku w funkcji liczby falowej ważne jest, aby zaznaczyć granice swojej rozdzielczości (tj. maksymalne i minimalne czasy opóźnienia oraz maksymalną liczbę falową, jak pokazano na rysunku 5). Przed zebraniem danych należy dokładnie przemyśleć te ograniczenia, aby można było wybrać optymalny obiektyw, rozmiar obrazu, liczbę klatek na sekundę i czas trwania filmu. Inną ważną kwestią jest sposób oszacowania parametru tła B. W literaturze przedmiotu stosowano wiele metod szacowania tła, a skutki przeszacowania lub niedoszacowania B opisano we wcześniejszych publikacjach62,77. Jak pokazano na rysunku 10, PyDDM umożliwia użytkownikom implementację różnych metod szacowania B i sugerujemy, aby nowi użytkownicy wypróbowali te metody i ocenili, które są odpowiednie do użycia.

Mocną stroną tego pakietu jest jego dokładna dokumentacja i przewodniki z przykładowymi danymi, przechowywanie i organizacja metadanych w celu śledzenia sposobu przeprowadzania analiz oraz elastyczność w sposobie analizy macierzy DDM (różne modele dopasowania, wiele metod szacowania parametru tła B, możliwość znalezienia MSD). Istnieje jednak wiele aspektów tego kodu, które można ulepszyć. Obecnie kod nie został zoptymalizowany pod kątem dużej szybkości obliczeń. Metody przyspieszające obliczenia zostały zgłoszone61,62 i zostaną zaimplementowane w przyszłych wersjach. Ponadto planujemy wdrożyć ostatnio zgłoszone metody, aby lepiej oszacować niepewności i wykorzystać symulacje do kierowania użytkowników do odpowiedniego modelu ISF62. Mamy nadzieję, że w przypadku innych ulepszeń użytkownicy skontaktują się z nami z sugestiami.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Część tych badań została sfinansowana przez National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award no. R15GM123420, przyznana R.M.R.-A. i R.J.M.), Cottrell Scholar Award od Research Corporation for Science Advancement (nagroda nr 27459, przyznana R.J.M.) oraz William M. Keck Foundation Research Grant (przyznana R.M.R-A.). GHK dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Holenderskiej Rady ds. Badań Naukowych (NWO; numer projektu VI.C.182.004 Programu Talentów NWO).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera CMOS, Orca-Flash 4.0Hamatsu
F-127, PluronicSigma, Aldrich
Jupyter, Notebook
Nanodrop, Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse, mikroskopNikon
PLL-PEG-bioSuSos AG, Dü bendorf, Szwajcaria
Koraliki polistyrenoweSigma Aldrich
Minikaseta do dializy białkowejThermo Fisher
PyDDMUniversity of San DiegoN/A Oprogramowanieopen source dostępne w https://github.com/rmcgorty/PyDDM
, , ,, , , , ,

Bibliografia

  1. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  2. Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).
  3. Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).
  4. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  5. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).
  6. Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).
  7. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  8. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  9. Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).
  10. Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  11. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  12. Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).
  13. Köster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).
  14. Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).
  15. Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  16. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  17. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  18. Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).
  19. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).
  20. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).
  21. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  22. Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).
  23. Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).
  24. He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).
  25. Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).
  26. Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).
  27. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).
  28. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).
  29. Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).
  30. Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).
  31. Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).
  32. Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).
  33. Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).
  34. He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).
  35. Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).
  36. Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).
  37. Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).
  38. Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).
  39. Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).
  40. Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).
  41. Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).
  42. Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).
  43. Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).
  44. Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).
  45. Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).
  46. Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).
  47. Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).
  48. Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).
  49. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  50. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  51. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).
  52. Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).
  53. Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).
  54. Giavazzi, F., Haro-Pérez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).
  55. Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).
  56. Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).
  57. Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).
  58. Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).
  59. Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
  60. Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., Löwen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).
  61. Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).
  62. Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).
  63. Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).
  64. Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).
  65. Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).
  66. Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).
  67. Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).
  68. Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).
  69. Pawelzyk, P., Mücke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).
  70. Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).
  71. Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).
  72. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  73. Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).
  74. Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).
  75. Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).
  76. Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).
  77. Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).
  78. Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).
  79. soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo (2021).
  80. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  81. Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sieci biopolimerowezrekonstytuowany cyto szkieletanaliza DDMmikroskopia konfokalnasieci aktynowo mikrotubularnesieci vimentynyredni kwadrat przemieszczeniarednia funkcja rozpraszania
Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.