Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Summary

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Abstract

Cytoszkielet jest odpowiedzialny za główną wewnętrzną organizację i reorganizację w komórce, a wszystko to bez kierownika, który kierowałby zmianami. Dzieje się tak zwłaszcza podczas mitozy lub mejozy, gdzie mikrotubule tworzą wrzeciono podczas podziału komórki. Wrzeciono to maszyneria używana do segregacji materiału genetycznego podczas podziału komórki. W kierunku tworzenia samoorganizujących się wrzecion in vitro, opracowaliśmy niedawno technikę rekonstytucji mikrotubul w wrzecionowate zespoły z minimalnym zestawem białek związanych z mikrotubulami i środków tłumiących. W szczególności użyto MAP65, który jest antyrównoległym środkiem sieciującym mikrotubule z roślin, homologiem Ase1 z drożdży i PRC1 z organizmów ssaków. Ten środek sieciujący samoorganizuje mikrotubule w długie, cienkie, przypominające wrzeciono samoorganizujące się zespoły mikrotubul. Zespoły te są również podobne do taktoidów ciekłokrystalicznych, a mikrotubule mogą być używane jako mezoskalowe mezozogeny. W tym miejscu przedstawiono protokoły tworzenia tych taktoidów mikrotubul, a także charakteryzowania kształtu zespołów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz ruchliwości składników za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu.

Introduction

Podział komórek poprzez mitozę jest jednym z najważniejszych procesów biologicznych dla podtrzymania życia. Włókna mikrotubul, złożone z dimerów tubuliny, są niezbędnymi elementami strukturalnymi tego procesu. Przejściowa maszyneria utworzona w metafazie, gdy chromosomy ustawiają się w środku komórki, nazywana jest wrzecionem mitotycznym ze względu na swój kształt, który jest jak wrzeciono krosna pokrytego nitkami (Rysunek 1A). W wielu organizmach dobrze wiadomo, że mikrotubule są używane w metafazie do wypychania i wciągania skondensowanych chromosomów do środka komórki, wyrównując je i łącząc z mikrotubulami, które rozerwą je w anafazie (Rysunek 1B, C). Wrzeciono tworzy się zarówno w mejozie (Rysunek 1B), jak i mitozie (Rysunek 1C), utworzonych z wielu nakładających się na siebie mikrotubul nie owiniętych wokół osi środkowej jak nić, ale biegnących równolegle do interfejsu. Tworzenie tych struktur opartych na mikrotubulach wymaga powiązanych białek, które sieciują się krzyżowo, i powiązanych enzymów, które mogą działać jako silniki, aby pomóc w popychaniu i przyciąganiu chromosomów¹.

Badania wrzecion mejotycznych wykazały, że mikrotubule są krótkie, dynamiczne i nakładają się na siebie w usieciowanych tablicach^2,3,4,5^,6 (Rysunek 1Di). Ze względu na fizyczną organizację tych krótkich mikrotubul, wrzeciono mejotyczne jest podobne do ciekłokrystalicznego taktoidu (Rysunek 1E). Rzeczywiście, wykazano, że wrzeciona łączą się i łączą, jak można się spodziewać po taktoidach ciekłokrystalicznych⁵.

Wiele badań z lat sześćdziesiątych XX wieku wykorzystywało fiksację, sekcje szeregowe i mikroskopię elektronową, aby ustalić, że wewnątrz wrzeciona mitotycznego znajdują się dwa rodzaje mikrotubul^7,8,9,10. Pierwszy typ nazywa się mikrotubulami kinetochorowymi, które łączą biegun wrzeciona z kinetochorem. Drugi typ nazywany jest mikrotubulami międzybiegunowymi lub polarnymi, które wyrastają poza chromosomy i nakładają się na siebie w strefie środkowej (Rysunek 1Dii)^8,9,10. Trzeci typ nazywa się mikrotubulami astralnymi, które znajdują się na zewnątrz wrzeciona i łączą bieguny z krawędzią komórki; Te organizacje zajmujące się mikrotubulami znajdują się poza zakresem obecnej dyskusji. Ostatnio przeprowadzono badania nad interakcją między augmin⁶ a kompleksem pierścieni gamma-tubuliny wpływającym na centra zarodkowania dla mikrotubul, co skutkuje wrzecionem mitotycznym z krótszymi mikrotubulami, jak w Rysunek 1D.

Ponieważ mikrotubule są dłuższe niż szerokie, o wysokim współczynniku kształtu i wysokiej sztywności, są jak pomniejszone wersje cząsteczek ciekłokrystalicznych. W fizyce miękkiej materii atomy i cząsteczki zostały przybliżone przy użyciu minimalnych oddziaływań, aby wydedukować fizyczne mechanizmy przemian fazowych, w tym zarodkowanie i topnienie kryształów¹¹. Podobnie, mikrotubule są obiektami mezoskalowymi, które są przeskalowanymi wersjami cząsteczek ciekłokrystalicznych, dając wgląd w fizykę dynamiki ciekłych kryształów, w tym zarodkowanie i wzrost faz nematycznych z izotropowych. Ponadto, jak omówiono powyżej, wrzeciono mejotyczne wykazuje właściwości podobne do właściwości ciekłokrystalicznego taktoidu, stanu nematycznego, który nukleuje się i rośnie ze stanu izotropowego cząsteczek ciekłokrystalicznych^3,4,5. W przypadku taktoidów zarodkowanie i wzrost są podobne do innych kryształów (tj. wymagają stosunkowo wysokiego stężenia mezogenów [cząsteczek tworzących ciekłe kryształy]). Unikalny kształt "wrzeciona" taktoidu pochodzi z lokalnego wyrównania mezogenów ciekłokrystalicznych, które ustawiają się w fazie nematycznej (Rysunek 1E). Nie mogą tworzyć zaokrąglonego kryształu, ponieważ cząsteczki są wysoce asymetryczne. Biorąc pod uwagę naturę mikrotubul, być może nie jest zaskakujące, że mitotyczne wrzeciono-maszyneria wykonana z wysokiego lokalnego stężenia mikrotubul ma również ten sam kształt, niezależnie od tego, czy nazywa się je taktoidalnym, czy wrzecionowym. Taktoidy mogą być dwubiegunowe, z biegunami na zwężających się końcach (Rysunek 1Ei), lub jednorodne, z biegunami efektywnie ustawionymi na nieskończoność (Rysunek 1Eii).

Biorąc pod uwagę znaczenie formowania wrzeciona, podjęto wysiłki w kierunku samoorganizującego się tworzenia wrzeciona in vitro, demonstrując kondensację mikrotubul w wiązki za pomocą form jonowych^12,13, czynniki tłumiące, które tworzą interakcje zubożenia^14,15, oraz specyficzne białka sieciujące mikrotubule^{13,16,17,18,19,21}. Co zaskakujące, chociaż wszystkie te środki działają w celu zwiększenia lokalnego stężenia mikrotubul, często skutkują długimi wiązkami mikrotubul, ale nie taktoidami. Jednym z powodów, dla których te wiązki są długie, może być to, że tworzące je mikrotubule są również długie. Niedawne prace z użyciem krótszych mikrotubul wykazały również dłuższe wiązki, które nie są zwężane na końcu¹⁵; W tym przypadku wiązki są utrzymywane razem z białkami motorycznymi, które powodują wydłużenie wiązek, a tym samym wydłużają je. Krótkie mikrotubule z nierozciągliwymi sieciownikami są potrzebne do stożkowych, wrzecionowatych zespołów, jak opisano tutaj.

Ostatnio opracowaliśmy technikę umożliwiającą tworzenie taktoidów mikrotubul za pomocą antyrównoległego środka sieciującego, MAP65, w obecności nukleujących stabilnych mikrotubul²². Mikrotubule musiały być krótkie, ale niewiele znanych regulatorów długości mikrotubul może zabezpieczyć mikrotubule przed niestabilnością dynamiczną lub wyżarzaniem od końca do końca. Zamiast tego GMPCPP użyto do zarodkowania i stabilizacji włókien po wzroście. Pozwoliło to na stworzenie dużej gęstości krótkich mikrotubul, które mogły samoorganizować się w taktoidy. Te taktoidy były jednorodne, gdy oglądało się je w warunkach dwójłomności. Oprócz krótkich mikrotubul, do utworzenia taktoidów zastosowano specyficzny antyrównoległy środek sieciujący, MAP65 (Rysunek 2). MAP65 jest białkiem związanym z mikrotubulami roślinnymi z rodziny mitotycznych środków sieciujących PRC1/Ase1²³. MAP65 występuje jako dimer, z silnym powinowactwem do wiązania się z samym sobą, a także z mikrotubulami²⁴. W przeciwieństwie do wrzeciona mejotycznego i taktoidów obserwowanych za pomocą filamentów aktynowych^25,26,27, które są dwubiegunowe i mają właściwości ciekłe ciekłych kryształów, zaobserwowano, że taktoidy mikrotubul są podobne do ciał stałych^22,28.

Tutaj przedstawione są protokoły tworzenia taktoidów mikrotubul i charakteryzowania kształtu zespołów oraz mobilności składników za pomocą technik opartych na fluorescencji.

Protocol

UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, części eksperymentu mogą być wykonywane na stole laboratoryjnym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego (rękawic).

1. Silanizacja szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Szkiełka nakrywkowe muszą być silanizowane, aby mogły być używane z polimerową powłoką szczotkową stosowaną w tych eksperymentach. Jest to hydrofobowy zabieg silanizacyjny, który umożliwia kopolimerowi blokowemu z hydrofobowym blokiem centralnym związanie się i utworzenie szczotki polimerowej. Poniższe czynności należy wykonać w dygestorium, aby zapobiec narażeniu na toksyczne opary podczas noszenia rękawiczek. Dimetylodichlorolisilan jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością.

1. Przepłukać szkiełka nakrywkowe odpowiednio ddH₂O, 70% etanolem i ddH₂O. Osusz je niestrzępiącymi się chusteczkami laboratoryjnymi między każdym płukaniem. Usuwa to kurz i rozpuszczalne w wodzie lub cząstki organiczne z powierzchni przed obróbką.
2. Umieść szkiełka nakrywkowe w metalowym stojaku na szkiełka nakrywkowe i przenieś je do maszyny UV-Ozone (UVO). Naświetlać szkiełka nakrywkowe UVO przez 20 minut, aby usunąć fluorescencję tła. Zamiast UVO można zastosować komorę plazmową.
3. Za pomocą pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe z metalowego stojaka używanego do obróbki UVO na inny metalowy stojak używany do silanizacji. Nie używaj tych samych stojaków do obu, ponieważ spowoduje to wysoki poziom utleniania po zastosowaniu UVO. Wstępnie wyczyść stojaki wodą i etanolem, aby nie pozostały żadne pozostałości chemikaliów po poprzednich użyciach.
4. Zanurz ruszt z szkiełkami nakrywkowymi w pojemniku ze 100% acetonem na 1 godzinę. Wypłucz pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x DDH₂O, aby usunąć cały aceton.
5. Zanurz stojak z szkiełkami nakrywkowymi w 100% etanolu na 10 minut. Wypłucz pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x ddH₂O, aby usunąć cały etanol.
6. Zanurz stojak z szkiełkami nakrywkowymi 3x w ddH₂O na 5 minut każdy.
7. Zanurzyć stojak z szkiełkami nakrywkowymi w 0,1 M KOH (50 ml 1 M KOH w 450 ml ddH₂O) na 15 minut. Wypłukać pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x ddH₂O, aby usunąć całe KOH.
8. Zanurz stojak ze szkiełkami nakrywkowymi 3x w ddH₂O na 5 minut każdy.
9. Wysusz stojak z szkiełkami nakrywkowymi na powietrzu przez noc w dygestoriach lub okapie z przepływem laminarnym.
10. Po całkowitym wysuszeniu stojaka i szkiełek nakrywkowych zanurz je na 5 minut w 2% dimetylodichlorosilanie (DDS) pobranym w innym pojemniku, który jest używany specjalnie do silanu. Nie pozwól, aby nic, co nie jest suche, miało kontakt z silanem.
11. Zanurz ruszt i szkiełka nakrywkowe 2x w pojemniku ze 100% etanolem na 5 min. Wypłucz pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x ddH₂O.
12. Zanurz ruszt i szkiełka nakrywkowe 3x w ddH₂O na 5 minut każdy.
13. Wysusz stojak z szkiełkami nakrywkowymi na powietrzu przez noc w dygestoriach lub okapie z przepływem laminarnym.
14. Po tym ostatnim etapie suszenia przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem do pudełek nakrywkowych za pomocą pęsety. Te szkiełka nakrywkowe można stosować w ciągu najbliższych 1-2 miesięcy. Stare szkiełka nakrywkowe zaczną tracić powłokę i należy je wyrzucić.

2. Przygotowanie tubuliny

UWAGA: Zakupiona tubulina występuje w postaci liofilizowanego proszku, który jest albo nieoznakowany, albo oznakowany fluoroforami. Liofilizowana tubulina jest przechowywana w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Poniższa procedura służy do mieszania nieznakowanej tubuliny z znakowaną tubuliną w proporcji dobrej do wizualizacji.

1. Wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80 °C jedną porcję nieznakowanej tubuliny zawierającej 1 mg liofilizowanej tubuliny w proszku i przechowywać na lodzie. Dodać 200 μl zimnego PEM-80 do probówki, aby doprowadzić stężenie tubuliny do 5 mg/ml. Trzymaj go na lodzie przez 10 minut, aby rozpuścić cały liofilian.
2. Wyjąć z zamrażarki w temperaturze -80 °C jedną porcję tubuliny znakowanej rodaminą, zawierającą 20 μg liofilizowanej tubuliny w proszku i przechowywać na lodzie. Dodać 4 μl zimnego PEM-80 do probówki, aby doprowadzić stężenie tubuliny do 5 mg/ml. Trzymaj go na lodzie przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić liofiliat.
3. Po rozpuszczeniu dodać 100 μl nieznakowanego roztworu tubuliny z ponownie zawieszoną rurkiną do 4 μl roztworu tubuliny znakowanej rodaminą. Pipetę 6x-7x bardzo powoli mieszać. Jeśli agregaty są widoczne, odwirować rozpuszczoną tubulinę przez 10 minut w temperaturze 90 000 x g w celu usunięcia kruszywa poprzez odrzucenie osadu i zachowanie supernatantu. Ta mieszanka tubuliny spowoduje powstanie ~ 4% znakowanej tubuliny.
4. Pozostałe 100 μl nieznakowanej tubuliny zamrozić kroplowo w ciekłym azocie (LN₂) i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu wykorzystania do dodatkowych mieszanek tubuliny.
5. Pobrać oznakowaną tubulinę, mieszaninę i podwielokrotność do siedmiu probówek po 15 μl każda. Każda podwielokrotność może być użyta w pojedynczej komorze doświadczalnej. Pozostałe podwielokrotności należy zamrozić w kroplach i przechowywać w temperaturze -80 °C do celów przyszłych eksperymentów.

3. Oczyszczanie MAP65

UWAGA: MAP65 nie jest dostępny na rynku i dlatego musi zostać oczyszczony do tej pracy. Protokół został wcześniej rozwinięty w kilku publikacjach^23,29.

1. Przekształć plazmid MAP65 i plazmid GFP-MAP65 w szczep bakterii BL21 w celu ekspresji białek.
2. Hoduj bakterie BL21 do gęstości optycznej 0,6-1 przy 600 nm. Indukuj produkcję białka za pomocą operatora lac i hoduj bakterie przez noc.
3. Osadzaj kultury i lizuj bakterie.
4. Zbierz lizat po odwirowaniu i inkubuj go z kulkami, które mają dostępny jon niklu do wiązania znacznika 6x-histydyny.
5. Odeluj białko za pomocą imidazolu i odsol je.
6. Białko należy zamrozić w kroplach ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w ciągu 1 roku.

4. Montaż komór przepływowych

UWAGA: Eksperymenty są przeprowadzane w komorach przepływowych wykonanych ze szkiełka szklanego i silanizowanego szkła nakrywkowego (Rysunek 3).

1. Weź szklane szkiełko i wyczyść je kolejno za pomocą ddH₂O, etanolu i ddH₂O. Osusz niestrzępiącą się chusteczką laboratoryjną między każdym płukaniem.
2. Użyj kawałka taśmy dwustronnej, aby utworzyć ścieżkę przepływu. Za pomocą rękawiczek przytnij taśmę do długości ~25-30 mm. Podziel taśmę wzdłuż, aby utworzyć dwa cieńsze paski. Umieść dwa paski taśmy na szkiełku w odległości około 5-8 mm między nimi.
   UWAGA: Ponieważ grubość taśmy jest znormalizowana do około 80-100 μm, szerokość ścieżki między kawałkami taśmy będzie określać objętość w komorze.
3. Umieść silanizowane szkiełka nakrywkowe na ścieżce przepływu. Przymocuj szkiełko i szkiełko nakrywkowe do dwustronnych pasków taśmy, delikatnie naciskając obszar taśmy grzbietem długopisu. Upewnij się, że masz dobre uszczelnienie na całym obszarze; Taśma powinna zmienić kolor z półprzezroczystego na przezroczysty, gdy uszczelnienie jest dobrze wykonane.
4. Usuń dodatkową taśmę na krawędziach, pozostawiając tylko 1 mm od wejścia do komory przepływowej, przecinając taśmę żyletką.
5. W razie potrzeby oznaczyć komorę informacjami o parametrach doświadczalnych.

5. Eksperymenty z taktoidami

UWAGA : Gdy wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne zostaną wygenerowane, mogą być użyte do nukleacji i polimeryzacji taktoidów mikrotubul w komorze przepływowej.

1. Zbierz wszystkie odczynniki, które mają być użyte. Rozmrozić je na lodzie i przechowywać na lodzie podczas pracy. Wykonaj kilka komór przepływowych do eksperymentów.
2. Do każdego eksperymentu należy używać jednej komory przepływowej. Pokryj powierzchnie komory przepływowej szczotką polimerową, przepływając 20 μl 5% niejonowego kopolimerowego środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów) rozpuszczonego w PEM-80, z małymi kroplami na obu końcach komory, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza wewnątrz. Przechowuj go w wilgotnej komorze (tj. na szalce Petriego z mokrą, niestrzępiącą się chusteczką laboratoryjną) do momentu, gdy będzie gotowy do użycia (co najmniej 5-7 minut).
3. W sterylnej probówce wymieszaj następujące elementy, aby utworzyć mieszaninę Tubulin-MAP: 9,5 μl PEM-80; 4 μL 10 mM GMPCPP; 4 μL 5% Pluronic-F127; 1 μL 1M DTT; 1 μL glukozy; 2 μL glikolu polietylenowego (PEG); 12 μl mieszanki tubuliny 5 mg/ml (13,6 μM stężenie końcowe) z etapu 2.5; i 5,5 μl materiału roboczego MAP65, gdzie 10% to GFP-MAP65 do wizualizacji. Trzymaj na lodzie podczas mieszania.
   UWAGA: Do pracy z lepkim roztworem PEG zaleca się używanie pipety wyporowej. Zwykłe pipety mogą być używane po odcięciu końcówki, aby powiększyć otwór; Jednak ta metoda jest mniej dokładna.
4. Wymieszać 5x-6x pipetując.
5. Tuż przed dodaniem do komory dodać 1 μl wstępnie zmieszanego roztworu oksydazy glukozowej (0,5 mg/ml) i katalazy (0,15 mg/ml) (Deoxy) do mieszaniny tubulina-MAP i wymieszać 7x-8x. Podzielić całkowitą objętość roztworu (40 μl) na dwie porcje, które należy umieścić w oddzielnych komorach.
6. Przelać mieszaninę tubulina-MAP do komór. Ponieważ komory mają już w sobie niejonowy surfaktant kopolimerowy blokowy, nie można dodać więcej cieczy bez usunięcia starej cieczy. Aby to zrobić, użyj kawałka bibuły filtracyjnej lub niestrzępiącej się chusteczki laboratoryjnej na drugim końcu komory, aby usunąć płyn poprzez działanie kapilarne.
7. Gdy próbka znajdzie się całkowicie w komorze, uszczelnij dwa końce komory za pomocą 5-minutowej żywicy epoksydowej i utrzymuj ją w temperaturze 37 °C przez ~ 30 minut, aby zanukleować i wyhodować taktoidy mikrotubul.

6. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania taktoidów.
   UWAGA: Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem lub mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem są dobre do usuwania fluorescencji tła z wolnej tubuliny, ale taktoidy są również widoczne przez regularną epi-fluorescencję, a nawet mikroskopię światła przechodzącego po ich uformowaniu, dzięki czemu ta procedura jest dostępna bez specjalistycznego sprzętu.
2. Użyj obiektywu z aperturą numeryczną (NA) o nasłoneczności 1.2 NA lub większej i powiększeniu 60x lub większym, aby zebrać wystarczającą ilość światła podczas fluorescencji. Obiektywy te często wymagają zanurzenia w ddH₂O lub oleju.
3. Nagrywaj obrazy za pomocą kamery CMOS lub CCD. Użyj efektywnego rozmiaru piksela w aparacie 108 nm.
   UWAGA: Rozmiar piksela zależy od aparatu i zastosowanego powiększenia, które w tym przypadku wynosiło 60x lub 100x przy dużej przysłonie numerycznej (1.2 lub 1.49 NA). Dodatkowe ekspandery obrazu mogą być używane przed kamerą, aby osiągnąć wymagany rozmiar piksela.
4. Utrzymać próbkę w temperaturze 37 °C, korzystając z komory środowiskowej ustawionej na tę temperaturę. Alternatywnie można zastosować inne grzałki stopniowe, w tym podgrzewacze sceniczne gorącego powietrza i obiektywne kołnierze z regulacją temperatury z cyrkulacją ciepłej wody.
5. Używaj źródeł wzbudzenia, które są odpowiednie dla potrzebnej fluorescencji. W przypadku tubuliny rodaminy należy użyć lasera o długości fali 561 nm o mocy co najmniej 1 mW w próbce, a w przypadku GFP-MAP65 należy użyć lasera o długości fali 488 nm i mocy co najmniej 1 mW w próbce.
   UWAGA: W przypadku korzystania z szerokokątnej mikroskopii epifluorescencyjnej należy użyć kostki filtra rodaminowego o wzbudzeniu: 540 ± 12,5 nm, dichroicznym: 545 nm ± 12,5 nm odcięciu i emisji: 575 nm długości przepustowej oraz kostce filtra GFP o wzbudzeniu: 480 ± 15 nm, dichroicznym: 505 nm ± 15 nm odcięciu i emisji: 515 nm długości przepustowej.
6. Zrób co najmniej 10 zdjęć różnych obszarów, aby sfotografować ponad 100 taktoidów. Rób obrazy zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym i zapisuj je jako 16-bitowe obrazy tiff do analizy. Upewnij się, że moc oświetlenia i czasy naświetlania są takie, aby skala intensywności aparatu nie była nasycona.

7. Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)

UWAGA: Do zbadania mobilności wewnętrznych składników taktoidów użyto FRAP. FRAP działa poprzez fotowybielanie wybranej części tubuliny znakowanej rodaminą i taktoidu MAP65 znakowanego GFP, a następnie obserwowanie odzyskiwania fluorescencji w czasie w tym regionie. Tempo odzysku zależy od rotacji gatunków poddawanych fotobieleniu. Ta szybkość obrotu może zależeć od reakcji dyfuzji i wiązania. W przypadku wiązania MAP65 z taktoidami można oszacować wiążące kursy wymiany. FRAP wykonywany jest za pomocą dodatkowego systemu laserowego o długości fali 405 nm, który może skanować laser w dowolnym kształcie. Istnieje wiele możliwości wykonania FRAP, w tym użycie lampy nadawczej i przysłony do fotowybielania lokalnego obszaru¹⁴.

1. Wybierz izolowany taktoid w komorze, aby utworzyć obszar zainteresowania (ROI) obejmujący części taktoidów i otaczający roztwór.
2. Użyj mikroskopu z dodatkowym laserem 405 nm dla FRAP, aby jednocześnie fotowybielać zarówno tubulinę, jak i MAP65. Alternatywnie, jasna lampa może być używana przez ogranicznik pola iris¹⁴. Dostosuj empirycznie określoną intensywność systemów fotowybielania, aby uniknąć uszkodzenia białek podczas wybielania.
3. Nagraj tactoid jako film z serii czasowej przez 30-60 s przed fotowybielaniem, aby uzyskać informacje o intensywności przed wybielaniem. Nagraj zarówno kanał czerwony, jak i zielony.
4. Fotowybielaj taktoid, naświetlając ROI za pomocą laserów lub lampy tak długo, jak to konieczne, aby fotowybielać bez uszkadzania tantydu. Określ intensywność i czas empirycznie.
5. Kontynuuj nagrywanie filmu w obu kanałach kolorów przez 5-10 minut po fotowybielaniu lub do momentu, gdy wydaje się, że powrót do zdrowia osiągnął równowagę.
6. Sprawdź wzrokowo kanał GFP-MAP65 pod kątem przywrócenia.

8. Analiza danych

UWAGA: Przeprowadzono analizę ilościową obrazów taktoidów, aby dowiedzieć się o skutkach zmian środowiskowych narzuconych przez różne czynniki stłoczenia, warunki jonowe i dodanie innych czynników.

1. Charakterystyka kształtu taktoidalnego
   1. Określ ilościowo długość i szerokość taktoidów na podstawie czerwonych i zielonych obrazów wykonanych za pomocą mikroskopii konfokalnej.
   2. Otwórz obrazy za pomocą FIJI/ImageJ.
   3. Jeśli surowe dane są pobierane w formacie 16-bitowym, w razie potrzeby dostosuj jasność i kontrast. Wybierz Obraz > Dostosuj jasność i kontrast >, aby dostosować obraz, aby móc wyraźnie widzieć ekran dotykowy. Dostosuj jasność i kontrast bez stosowania ustawienia, aby przypadkowo nie zmienić danych intensywności.
   4. Gdy taktoidy są wyraźnie widoczne, wybierz dobre taktoidy do pomiaru (Rysunek 4Bi). Upewnij się, że tactoidy są wyraźnie widoczne, nie nakładają się na żadne inne styki lub agregaty i nie są zakrzywione ani wygięte, aby można było używać narzędzi pomiarowych w linii prostej.
   5. Następnie sprawdź, czy dla obrazów ustawiono prawidłowy rozmiar pikseli. Obrazy mikroskopowe zawierają metadane dotyczące rozmiaru piksela. W przypadku korzystania z innego aparatu, który nie ma metadanych ani zewnętrznych systemów rozszerzania obrazu, które mogą zmienić oczekiwany efektywny rozmiar w pikselach, dostosuj rozmiar piksela ręcznie. W FIJI/ImageJ przejdź do opcji Analizuj > ustaw skalę, aby ustawić prawidłową konwersję pikseli.
   6. Korzystając z narzędzia Linia prosta z paska narzędzi w FIJI/ImageJ, kliknij jeden koniec taktoidu i przeciągnij kursor na drugi koniec taktoidu (Rysunek 4Bii). Po wybraniu zwrotu z inwestycji linii wybierz opcję Analizuj > Zmierz, aby zmierzyć długość. Jeśli długość nie jest mierzona domyślnie, upewnij się, że pomiar został ustawiony tak, aby uwzględniał długość w oknie dialogowym Analizuj > ustawianie pomiarów.
      UWAGA: Zazwyczaj, podczas pomiaru za pomocą narzędzia >Linia prosta, podaje długość i kąt narysowanej linii. Na przykład, Rysunek 4Bii pokazuje linię prostą narysowaną z boku taktoidu, aby ten ostatni był widoczny, ale pomiar należy wykonać bezpośrednio na ekranie dotykowym.
   7. Po wykonaniu pomiaru użyj narzędzia Tekst na pasku narzędzi, aby oznaczyć styk. Utwórz pole tekstowe, dodaj etykietę numeryczną i wybierz pozycję Edytuj > Rysuj, aby przymocować etykietę do obrazu. Zapisz obraz jako osobny plik ROI.
      UWAGA: Etykietowanie i zapisywanie tego pliku pozwala badaczowi dowiedzieć się, który pomiar odpowiada któremu taktoidowi z surowych danych. Upewnij się, że zmierzyłeś każdy styk raz.
   8. Po zmierzeniu wartości taktycznych dla całego obrazu zapisz dane w oknie Wyniki w pliku tekstowym rozdzielanym przecinkami lub tabulatorami (za pomocą polecenia Plik > Zapisz jako) i otwórz dane w arkuszu kalkulacyjnym, aby przeanalizować dane w liczbach. Zbierz wszystkie dane razem (surowe dane obrazu, obraz ROI i plik tekstowy z wynikami) do folderu z odpowiednią konwencją nazewnictwa, aby wszystko było uporządkowane.
      UWAGA: Chociaż pomiary długości taktoidów są wykonywane ręcznie, biorąc pod uwagę, że szerokości styków dotykowych są wąskie, lepiej jest zastosować inną metodę pomiaru szerokości taktoidu (patrz poniżej), aby zmniejszyć błąd pomiaru.
   9. Korzystając z narzędzia ImageJ/FIJI, narysuj obszar linii za pomocą narzędzia Linia prosta. Narysuj linię jako dwusieczną prostopadłą do długiej osi taktoidalnej (Rysunek 4Bii).
   10. Wybierz opcję Analizuj profil wykresu > , aby utworzyć profil intensywności dwusiecznej liniowej (Rysunek 4Biii). Pojawi się fabuła. Aby pobrać i zapisać dane z wykresu, wybierz przycisk Lista w lewym dolnym rogu; Spowoduje to wygenerowanie listy plików tekstowych z danymi o intensywności wzdłuż narysowanej linii. Zapisz plik tekstowy jako plik .csv lub .txt.
   11. Otwórz plik tekstowy w odpowiednim programie, takim jak MatLab, Python (sciPy) lub innym programie. Dopasuj dane intensywności do funkcji Gaussa w postaci: , gdzie I(x) to wartość skali szarości wzdłuż długości, x; B to poziom tła; A jest amplitudą Gaussa; μ jest średnią lub środkiem gaussowskim; a σ jest odchyleniem standardowym Gaussa.
   12. Raport 2σ jako szerokość urządzenia dotykowego. Oszacuj intensywność mikrotubul w taktoidalnym, obliczając obszar pod Gaussem (bez tła).
       UWAGA: Jeśli obrazy mieszczą się w liniowym zakresie intensywności kamery i są wykonywane przy tym samym czasie ekspozycji i intensywności wzbudzenia, zintegrowane intensywności można porównać w celu oszacowania względnej liczby mikrotubul w ekranie dotykowym.
2. Analiza FRAP
   UWAGA: W eksperymentach mających na celu przetestowanie ruchliwości mikrotubul i MAP65 wykorzystano FRAP do zarejestrowania specyficznego fotowybielania i odzyskiwania intensywności w wyniku ruchu molekularnego (Rysunek 5A). Dane zostały określone ilościowo na podstawie danych szeregów czasowych obrazu przy użyciu ImageJ/FIJI.
   1. Użyj ImageJ/FIJI, aby otworzyć dane filmu.
   2. Zarejestruj stosy (dane szeregów czasowych) w czasie, aby usunąć dryf. Użyj wtyczki StackReg wraz z pomocniczą wtyczką TurboReg; Instrukcje dotyczące korzystania z wtyczek znajdują się pod linkami internetowymi podanymi w Tabeli materiałów. Wybierz translację, aby przesunąć położenie ramek, a tym samym zarejestrować obrazy.
   3. Po zarejestrowaniu obrazów w celu usunięcia dryfu obróć obraz tak, aby styk dotykowy znajdował się w ramce pionowo lub poziomo, wybierając opcję Obraz > Przekształć > Obróć. Wybierz kąt do obrócenia i użyj opcji Podgląd, aby określić, czy tactoid jest wystarczająco obrócony. Gdy podgląd pokaże, że ekran dotykowy jest pionowy lub poziomy, wybierz przycisk OK, aby obrócić wszystkie obrazy w filmie.
   4. Użyj narzędzia Zaznaczanie prostokąta na pasku narzędzi, aby utworzyć prostokątny przekrój nad fotowybielonym obszarem wybielonego taktoidu. Rejestruj zintegrowaną intensywność obszaru ROI dla każdej klatki za pomocą funkcji Image > Stacks > Measure Stack. Ustaw typ pomiaru na Zintegrowana gęstość za pomocą opcji Analizuj > Ustaw pomiary. Zapisz analizowane dane intensywności wyświetlane w oknie Wyniki jako plik tekstowy w formacie .csv lub .txt, wybierając opcję Plik > Zapisz jako.
      UWAGA: Rysunek 5B pokazuje przykład surowych 16-bitowych danych o intensywności zmierzonych dla kanałów mikrotubul i GFP-MAP65 w obszarze wybielania.
   5. Ponieważ ogólna intensywność obrazów będzie z czasem globalnie zanikać z powodu fotowybielania spowodowanego obrazowaniem, to globalne fotowybielanie musi zostać skorygowane. Aby to zrobić, użyj tego samego rozmiaru ROI (krok 8.2.4.) i przenieś go do obszaru w tle obrazu, w którym nie są widoczne żadne mikrotubule ani MAP65. Zmierz zintegrowaną intensywność stosu zgodnie z opisem w kroku 8.2.4. Zapisz wyniki jako drugi plik tekstowy.
      UWAGA: Rysunek 5B pokazuje przykład surowych 16-bitowych danych o intensywności zmierzonych dla kanałów mikrotubuli i GFP-MAP65 w obszarze tła.
   6. Aby skorygować zanikanie tła, podziel intensywność sygnału na ekranie dotykowym przez intensywność tła dla tego samego punktu czasowego. Oblicz I_poprawione (t) jako: , gdzie I_S (t) (sygnał) jest pomiarem wykonanym na wybielonym obszarze, a I_BG (t) (szum) jest pomiarem wykonanym na obszarze tła (Rysunek 5C). Oblicza to stosunek sygnału do szumu dla każdej klatki i odejmuje również szum.
   7. Następnie przeskaluj dane do zakresu od zera do jednego za pomocą , gdzie I_min i _{I max} oznaczają odpowiednio globalne minimum i maksimum _poprawionych danych w całym czasie (Rysunek 5C).
   8. Dopasuj te dane do zanikającego wykładnika postaci: , gdzie A to amplituda odzysku, a τ to skala czasowa odzysku (Rysunek 5C).

Results

Z niewielką liczbą komponentów, dimerów tubulinowych i mikrotubul, mogą tworzyć się taktoidy mikrotubul (Rysunek 2A). Chociaż ten protokół opisuje inkubację w celu zarodkowania i hodowli mikrotubul w inkubatorze, zarodkowanie i wzrost można obserwować bezpośrednio pod mikroskopem (które są zakończone w ciągu 30 minut) (Rysunek 2B). Stężenie tubuliny utrzymuje się na stałym poziomie 13,6 μm, a wiązanie MAP65-MT na poziomie 10%.

Rysunek 4 przedstawia dane zakończone sukcesem. Taktoidy powinny być widoczne zarówno za pomocą lasera o długości fali 561 nm w kanale tubuliny, jak i o długości fali 488 nm w kanale MAP65, które idealnie na siebie nakładają się (Rysunek 4A). Jedną z tajemnic systemu było to, że szerokość taktoidów nie wydaje się zmieniać pod wpływem różnych zmian eksperymentalnych, w tym zmiany długości mikrotubul, stężenia MAP65 i czynników stłoczenia (Rysunek 4B)^22,28. Długość jest znacznie bardziej zmienna i zależy zarówno od długości mikrotubul, jak i stężenia MAP65 (Rysunek 4B)^22,28.

Podczas wykonywania FRAP zaobserwowano, że sygnał MAP65 jest odzyskiwany, ale sygnał mikrotubuli nie jest odzyskiwany (Rysunek 5). Odzysk w FRAP wynika z mobilności i ruchu oznakowanych i wybielonych obiektów. W przypadku MAP65 zaciemnione cząsteczki dysocjują i oddalają się od mikrotubul, a nowe przemieszczają się do regionu (Rysunek 5). Wiązanie MAP65 jest w równowadze, więc szybkość wiązania i rozwiązywania jest równa (mierzona w cząsteczkach na sekundę). W przypadku mikrotubul nie zaobserwowano odzysku, co oznacza, że mikrotubule nie są w stanie opuścić taktoidalnego (Rysunek 5A, Bi, C). Co więcej, nie zaobserwowano rozprzestrzeniania się pociemniałego obszaru, co sugeruje, że mikrotubule są lokalnie nieruchome i nie są płynem w kształcie dotykowym.

Rysunek 1: Różne modele formacji wrzeciona. Wrzeciono mitotyczne to maszyna wykonana z mikrotubul i związanych z nimi białek i enzymów, która wyrównuje i rozdziela chromosomy na dwie nowe komórki potomne podczas podziału komórki. (A) Obraz wczesnośredniowiecznej repliki wrzeciona opadającego z cienką przędzą z Holandii. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie obrazu Wikimedia autorstwa Petera van der Sluijs³⁰. (B) Trójwymiarowa rekonstrukcja mikrotubul w różnych stadiach mejozy typu dzikiego II. Mikrotubule są pokazane na zielono, a chromosomy na szaro. Podziałka liniowa = 1 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Lantzsch et al.³¹. (C) Obraz mikroskopowy mikrotubul w wrzecionie mitotycznym dzielącej się komórki Sf9. Bieguny wrzeciona i mikrotubule wrzeciona są oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym. Podziałka = 5 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Advani et al.³². (D) Różne modele organizacji mikrotubul wrzecion mitotycznych i mejotycznych. (i) Wcześniej obserwowane dla wrzecion mejotycznych utworzonych z ekstraktów z jaj Xenopus, mikrotubule (zielone) zostały wydedukowane jako krótkie i dynamiczne w całym wrzecionie. Jest to podobne do dwubiegunowej organizacji taktoidalnej wewnątrz ciekłego kryształu. (ii) Kanoniczny model organizacji mikrotubul wewnątrz wrzeciona mitotycznego ma dwa rodzaje mikrotubul: mikrotubule międzypolarne lub polarne (ciemnozielone), które sieciują się w strefie środkowej wokół chromosomów i mikrotubule kinetochorowe (jasnozielone), które są wiązane i rozciągane od bieguna do kinetochoru, aby popychać i ciągnąć chromosomy. Na wszystkich obrazach chromosomy są pokazane w kolorze przezroczystym niebieskim, a bieguny wrzeciona są przedstawione w kolorze ciemnozielonym. (E) Schematy mezogenów (zielonych linii) w taktoidach ciekłokrystalicznych dla (i) taktoidów dwubiegunowych i (ii) jednorodnych. Taktoidy dwubiegunowe mają dwa bieguny na końcu taktoidu, a mezogeny zmieniają orientację, aby wskazać te bieguny. Jednorodne taktoidy mają bieguny w nieskończoności, a mezogeny nie zmieniają orientacji wzdłuż długości taktoidu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kondensacja mikrotubul. (A) Mikrotubule mogą być wiązane i sieciowane różnymi metodami, w tym za pomocą różnych form jonowych, sił zubożających spowodowanych przez czynniki stłoczające i specyficzne mikrotubule sieciujące, takie jak MAP65. (i) Dimery tubuliny i białka MAP65 miesza się w celu zarodkowania i wzrostu mikrotubul. (ii) Mikrotubule nuklekują się i rosną z tubuliny, a MAP65 natychmiast wiąże się z mikrotubulami, innym monomerem MAP65 lub obydwoma i powoduje wiązanie. (iii) Mikrotubule w usieciowanych wiązkach zarodkują i rosną. (iv) Ostateczna konfiguracja to taktoid mikrotubuli podobny do wrzeciona. (B) Szeregi czasowe taktoidów mikrotubul zarodkujących i rosnących w ciągu 105 minut. Podziałka = 5 μm. Rysunek zaczerpnięty z Edozie et al.²². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zespół komory przepływowej. Komora przepływowa wykonana jest za pomocą szkiełka szklanego, silanizowanego szkła nakrywkowego oraz trwałej taśmy dwustronnej. Obszar podświetlony na żółto to ścieżka przepływu, w której próbka jest przepływana i obserwowana. Objętość komory przepływowej wynosi ~20 μL. Żywica epoksydowa została użyta do uszczelnienia końców komory, aby zapobiec parowaniu próbki podczas długotrwałego obrazowania przez kilka godzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazy dotykowe oraz analiza długości i szerokości. (A) Przykładowe dane taktoidów utworzonych zgodnie z opisem i zobrazowanych przy użyciu konfokalnego wirującego dysku, pokazujące (i) obrazowanie kanału mikrotubuli rurki znakowanej rodaminą za pomocą lasera 561 nm, (ii) obrazowanie kanału GFP GFP za pomocą lasera 488 nm oraz (iii) scalony obraz nakładki z kanału mikrotubuli (magenta) i kanału GFP-MAP65 (cyjan). Nakładające się obszary są wyświetlane jako białe i pokazują, że mikrotubule i MAP65 dokładnie się kolokalizują. Podziałka liniowa = 10 μm dla wszystkich obrazów w (A). (B) Kwantyfikacja długości i szerokości stykoidu. (i) Obraz taktoidu do analizy bez etykiet. Podziałka liniowa = 5 μm. (ii) Ten sam obraz, co w (i), gdzie oznaczone są wymiary długości (linia ciągła z zakończeniami linii) i szerokości (linia przerywana). Podziałka liniowa = 5 μm. (iii) Szerokość zmierzono, biorąc pod uwagę profil natężenia w poprzek styku dotykowego na dwusiecznej prostopadłej (linia przerywana) oznaczonej w ppkt (ii). Profil intensywności został dopasowany do funkcji Gaussa, aby ujawnić amplitudę i szerokość taktoidu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne dane i analiza FRAP. (A) Dane szeregów czasowych mikroskopii (i) mikrotubul taktoidowych i (ii) GFP-MAP65, oraz (iii) obraz nakładki obu kanałów z mikrotubulami w kolorze purpurowym i GFP-MAP65 w kolorze błękitnym, które zostały fotobielone w czasie 63 s i obserwowane przez dodatkowe 5 minut. (B) Ilościowo określona intensywność (i) kanał mikrotubuli w obszarze wybielonym (purpurowe koła) i tle (ciemnoszare kółka) oraz (ii) kanał GFP-MAP65 w obszarze wybielonym (kwadraty błękitne) i tło (ciemnoszare kwadraty). (C) Dane zostały skorygowane o szum tła i przeskalowane dla kanału mikrotubul (purpurowe okręgi) i kanału GFP-MAP65 (cyjan kwadraty). Mikrotubule nie odzyskują się, ale GFP-MAP65 tak i może być dopasowany (ciemnoszara linia) do rosnącego rozpadu wykładniczego, aby znaleźć amplitudę i skalę czasową odzyskiwania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisane tutaj metody zostały wykorzystane w kilku artykułach do stworzenia taktoidów mikrotubul (ryc. 2)^22,28. Eksperymenty te są biologicznie istotne, aby pomóc w odkryciu zasad organizacyjnych, które kontrolują kształt i stabilność wrzeciona mitotycznego lub mejotycznego w większości typów komórek. Ponadto mikrotubule są modelowymi mezogenami ciekłokrystalicznymi, które mogą pomóc w dowiedzeniu się więcej o tym, jak ciekłe kryształy nukleują i rozwijają fazy nematyczne z faz izotropowych.

Opisana tutaj procedura ma kilka zalet w badaniu samoorganizacji mikrotubul. Po pierwsze, jest wysoce powtarzalny, ponieważ został wykonany w laboratorium przez wielu uczniów, w tym uczniów szkół średnich, z niewielką wiedzą lub szkoleniem przed rozpoczęciem pracy w laboratorium. Takuloidy są dwójłomne²², co pozwala na oglądanie ich w świetle przechodzącym oprócz mikroskopii fluorescencyjnej, dzięki czemu metoda ta jest dostępna dla wielu laboratoriów, a ta eksperymentalna procedura może być dostosowana do celów edukacyjnych, oprócz badań na najwyższym poziomie. Wreszcie, proces ten otwiera drogę do dalszego rozumienia i badania systemów biologicznych w uproszczonym, redukcjonistycznym podejściu, pozwalając zrozumieć, w jaki sposób każdy dodatkowy warunek, białko lub dodatek może zmienić samoorganizację taktoidów i, być może, ostatecznie, wrzeciona. Cele dla lepszej biomimikry obejmują aktywność, płynność i sortowanie polaryzacji włókien.

Może istnieć kilka czynników wpływających na eksperyment dający nieoczekiwane wyniki. Na przykład, jeśli taktoidy nie tworzą się (ryc. 2), ale obserwuje się wzory przypominające wachlarze, MAP65 prawdopodobnie nie jest obecny lub nie wiąże się z mikrotubulami^22,28. Powinno to być oczywiste również w kanale fluorescencyjnym MAP65, ponieważ GFP-MAP65 nie będzie związany z mikrotubulami.

Jeśli tactoidy się nie tworzą, a tło pojawia się jako plamki na szkle, może to być spowodowane powłoką powierzchniową. Raz wykonana silanizacja trwa tylko 1 miesiąc na szkiełkach nakrywkowych. Kiedy się zużyje, tubulina będzie w stanie związać się z odsłoniętą powierzchnią w sposób niespecyficzny. To wiązanie będzie występować w dziwnych wzorach.

Jeśli taktoidy się nie tworzą, a tubulina jest obserwowana w agregatach o różnych kształtach i rozmiarach, może to być spowodowane rurką złej jakości. Tubulinę można odwirować w celu usunięcia początkowych agregatów, które mogą napędzać agregację poza szlakiem zamiast polimeryzacji mikrotubul. Jeśli powierzchnia wiąże się z tubuliną, może również zubożyć tubulinę w roztworze. Niskie stężenia tubuliny, poniżej stężenia krytycznego dla polimeryzacji mikrotubul, mogą prowadzić do powstania agregatów.

W eksperymentach FRAP, jeśli kanał MAP65 nie wykazuje żadnej regeneracji (ryc. 5), możliwe jest, że fotowybielanie powodowało fotouszkodzenie mikrotubul. Fotouszkodzenie powoduje miejscowe zniszczenie włókien. Można to sprawdzić, badając w nadawanym kanale. Taktoidy mikrotubul są widoczne w przesyłanym kanale poprzez wysoki współczynnik niedopasowania refrakcji do otaczającej wody. Fotouszkodzenie wywołane światłem pojawi się jako ślad po oparzeniu lub utrata kontrastu w obrazowaniu w świetle przechodzącym w miejscu ROI poddanego fotowybielaniu. Jeśli tak się stanie, moc lasera lub światła musi zostać zmniejszona, aby zahamować fotouszkodzenia białek.

W ramach tej procedury i podejścia napotkano kilka wyzwań. Jednym z problemów jest to, że pomiary długości są obecnie wykonywane ręcznie po kliknięciu na obraz. Ta metoda, choć prosta, może powodować dużą niepewność. Pomiar szerokości, który wykorzystuje przekrój poprzeczny i dopasowanie do Gaussa, jest lepszą metodą ilościowego określania rozmiaru. Podobną metodę można zastosować w odniesieniu do długości. Drugą kwestią jest to, że czasami taktoidy, ponieważ są tak długie i cienkie, mogą się zginać. To sprawia, że ilościowe określenie długości jest trudniejsze. Długość konturu można określić ilościowo za pomocą linii segmentowej, ale za każdym razem, gdy dodawany jest segment, pojawia się dodatkowa niepewność.

Z naukowego punktu widzenia podejście to wiąże się z pewnymi innymi wyzwaniami związanymi z jego wykorzystaniem jako modelu dla ciekłych kryształów lub wrzecion. Pierwszym wyzwaniem był długi, cienki kształt taktoidów tworzonych przez mikrotubule (ryc. 3 i ryc. 4). Jak zauważono we wcześniejszych publikacjach²², taktoidy mikrotubul są taktoidami jednorodnymi, a nie dwubiegunowymi. Oznacza to, że mikrotubule tworzące kształt nie zmieniają orientacji, aby wskazać końcówki struktury. Zamiast tego wszystkie mikrotubule są równoległe do długiej osi, a "bieguny" znajdują się w nieskończoności. Różni się to bardzo od taktoidów obserwowanych dla molekularnych ciekłych kryształów, a nawet dla aktyny lub DNA, które mogą również działać jako mezogeny ciekłokrystaliczne. W tych innych systemach taktoidy są dwubiegunowe i patrząc na nie w skrzyżowanych polaryzatorach, wykazują charakterystyczne oznaki reorientacji pręcików.

Drugim poważnym wyzwaniem w tym systemie jest to, że mikrotubule są nieruchome wewnątrz taktoidu. Wynika to jasno z eksperymentów i analiz FRAP, ponieważ odzysk mikrotubul jest bardzo niski. Ich stała natura sprawia, że taktoidy mikrotubul są mniej wartościowe niż wielkoskalowe analogi ciekłokrystaliczne. Faza nematyczna ciekłego kryształu powinna mieć zarówno właściwości ciekłe (płynne), jak i krystaliczne (zorganizowane). Chociaż kształt wydaje się odpowiedni dla wrzeciona, bezruch sprawia, że system jest mniej ekscytujący jako modelowe wrzeciono mitotyczne. Z drugiej strony, wydanie to daje możliwość zbadania, w jaki sposób można modyfikować eksperymenty, aby uzyskać większą płynność systemu.

Te wyzwania naukowe oferują ekscytujące możliwości, które pozwolą na zdobycie nowej wiedzy na temat systemu. Aby taktoidy mikrotubul były bardziej dwubiegunowe, można użyć krótszych mikrotubul. Istnieje jednak dodatkowe wyzwanie, ponieważ mikrotubule nie mają wielu dobrze scharakteryzowanych białek ograniczających, które kontrolowałyby długość, tak jak robi to aktyna. Zastosowanie zarodkowania i wzrostu wymaga użycia bardzo wysokich stężeń tubuliny i GMPCPP do wytworzenia krótkich mikrotubul. Wysokie stężenie tubuliny skutkuje większą liczbą filamentów w układzie, co utrudnia oddzielenie taktoidów od siebie. Dodanie nowych kapsli do mikrotubul, takich jak DARPin³³, może pomóc w tej sytuacji. Drugi problem związany z unieruchomieniem mikrotubul można złagodzić poprzez dodanie białek motorycznych, takich jak kinezyna-5³⁴, które są tetramerami silników używanych w mitozie. Alternatywnie można zastosować sztuczne dimery dimerycznej kinezyny-1¹⁵.

Innym sposobem na zwiększenie płynności byłoby umożliwienie mikrotubulom wykonywania ich dynamicznej niestabilności, czyli wzrostu i kurczenia się mikrotubul. Obecnie mikrotubule, które są wysiewane stabilnymi włóknami GMPCPP, a następnie ulegają dynamicznej niestabilności, są znacznie dłuższe niż pożądane, aby utworzyć wrzeciono lub taktoid, co skutkowałoby bardzo długimi organizacjami, takimi jak wentylatory lub wiązki. Tak więc dodanie dynamicznej niestabilności mikrotubul musiałoby być wykonane ostrożnie, aby zachować kształt taktoidalny. Dodanie powiązanych białek i enzymów, które mogą kontrolować długość, może złagodzić ten problem. Na przykład prawdopodobnie potrzebna byłaby depolimeryzacja kinezyny, takiej jak kinezyna-13³⁵, lub enzymy odcinające, takie jak katanina³⁶. Eksperymenty te są złożone i trudne, chociaż byłyby bardzo wnikliwe bez względu na to, co ujawnią wyniki. Niezależnie od tego, w jakim kierunku pójdą przyszłe eksperymenty, opracowana tutaj platforma do tworzenia taktoidów mikrotubul może ujawnić nowe informacje na temat fizycznych podstaw organizacji mikrotubul.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Dichlorodimethylsilane	GE Healthcare	118945	Hydrofobowa obróbka powierzchni silanu. Można go ponownie użyć do trzech razy i przechowywać w temperaturze pokojowej przez rok.
5-minutowa żywica epoksydowa	Bob Smith Industries		Do uszczelniania komór eksperymentalnych
Aceton	Fisher	32900HPLC	100%
BL21 komórki	Bio Labs	C2527I	Kompetentne komórki bakteryjne używane do ekspresji MAP65
Katalaza	Sigma	C30-500MG	Część systemu oczyszczania tlenu. Zapas 300 mg/ml jest wytwarzany w ddH2O i przechowywany w 10 μ l podwielokrotności w -20° C na okres do jednego roku.
Szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm lub 22 mm x 30 mm)	Fisher	12544-AP	Do komór doświadczalnych
Dithiothreitol	Sigma	43815-5G	Mała cząsteczka, która służy do rozbijania wiązań dwusiarczkowych i usuwania tlenu. Kolba o pojemności 1 M jest wykonana z proszku (Sigma) w ddH2O. Roztwór jest podawany i przechowywany w temperaturze -20C przez okres do jednego roku. Podwielokrotności są używane 7-8 razy, a następnie odrzucane.
EGTA	Sigma	E3889-10G	Bufor tubulinowy składnik bazowy
Eppendorf 0,5 ml probówki	Eppendorf	05 402 18	Do przechowywania roztworów eksperymentalnych
	Etanol Fisher	111000200	200 proof
Bibuła filtracyjna	Whatman	1004-110	Do czyszczenia i przeciągania roztworów przez komory doświadczalne
Mikroskop fluorescencyjny z wysokim NA obiektywy	Nikon	Ti-E, W2 Konfokalny	Do eksperymentów obrazowych
Zamrażarka -20° C	Fisherbrand	13986148	Do przechowywania odczynników
Zamrażarka -80° C	Thermo scientific	328223H01-C	Do przechowywania białek.
Szklane pojemniki do silanizacji	Michaels		Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbki szkieł nakrywkowych
Szkiełka szklane	Fisher	12544-4	Do komór doświadczalnych
Glukoza	Sigma	G7528-250G	Część systemu oczyszczania tlenu. Zapas 300 mg/ml jest wytwarzany w ddH2O i przechowywany w 10 μ l podwielokrotności w -20°C.
Oksydaza glukozowa	Sigma	G2133-250KU	Część systemu oczyszczania tlenu. Jest to przechowywane w 4° C na okres do jednego roku.
GMPCPP	Jenna Bioscience	NU-4055	Wolno hydrolizowalny analog GTP stosowany do polimeryzacji i stabilizacji mikrotubul poprzez zmniejszenie dynamicznej niestabilności i spontanicznego stężenia krytycznego dla zarodkowania mikrotubul w celu uzyskania stałej długości. Kupujemy zapas o pojemności 10 mM od Jena Biosciences i przechowujemy go w temperaturze -20° C na okres do jednego roku.
Element grzejny do mikroskopu		górny stopnia Okolab	Do eksperymentów obrazowych
Imidizol	Sigma	I2399	Służy do elucji białka MAP65 z kulek niklu w celu oczyszczenia MAP65
Kimwipes	Fisher	34155	Do czyszczenia i przeciągania roztworów przez komory doświadczalne.
KOH	Sigma	P250-500	1 M w ddH2O, świeży, aby zapobiec zakwaszeniu w miarę upływu czasu.
Ciekły azot Airgas		NI 230LT22	Do upuszczania podwielokrotności zamrażania. Może być również używany do przechowywania (niezalecane)
Białko MAP65	Ram Dixit		Białko związane z mikrotubulami (MAP) o masie cząsteczkowej 65 kD, które jest antyrównoległym środkiem sieciującym mikrotubule. Oczyściliśmy nieznakowaną i znakowaną GFP wersję MAP65-1 z Arabidopsis thaliana. Mieszamy GFP-MAP65 z nieznakowanym MAP65 tak, że 10% białka jest znakowane. Zapas roboczy to 10,8 μ Rozwiązanie M. To roztwór roboczy jest przechowywany w 4° C i przerabiane na świeżo co tydzień. Protokół oczyszczania MAP65 i GFP-MAP65 jest podany w naszym poprzednim rozdziale dotyczącym metod (26).
MgSO4	Sigma	MKCJ940	Składnik buforu tubuliny
Koraliki NTA-Nikiel	Qiagen	30210	Koraliki wymagane do oczyszczenia 6xHis oznaczone białka MAP65
Optomicroscan	Nikon		405 nm, który może skupić laser w dowolnym pożądanym kształcie obszaru zainteresowania
PEM80			Obojętny bufor bazowy do polimeryzacji tubuliny do roztworu wykonanego z 80 mM K-PIPES, pH 6,8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, przechowywany w temperaturze 4& C na okres do jednego roku.
Trwała taśma dwustronna	3M - Scotch	34-8724-5691-7	Do komór doświadczalnych
szalka Petriego	Fisher	FB0875713	Do komory wilgotnej
RURY	Sigma	P7643-100G	Bufor tubulinowy składnik bazowy
Pluronic-F127	Sigma	P2443-250G	Kopolimer blokowy z dwoma hydrofilowymi blokami tlenku etylenu (PEO) na końcach i hydrofobowym blokiem środkowym z hydrofobowej powłoki powierzchniowej tlenku fenylenu (PPO), którego używamy, aby zapobiec wiązaniu się białek z powierzchnią. Pluronic-F127 jest kupowany w postaci proszku (Sigma) i rozpuszczany do 5% (w/v) roztworu w ddH2O na noc. Po rozpuszczeniu roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do jednego roku.
Glikol polietylenowy	Affymetrix Inc	19966 500 GM	Środek tłumiący stosowany do tworzenia sił zubożających, które wynoszą taktoidy na powierzchnię i pomagają organizować mikrotubule. Tworzymy 5% (w/v) roztwór 100 kDa PEG w PEM80. Roztwór jest przechowywany w 4° C przez okres do jednego roku i umieszczony na bujaku przed użyciem. Jest lepki, dlatego do pracy z nim zalecamy użycie pipety wyporowej.
Pipeta wyporowa	Eppendorf		Do pipetowania lepkich cieczy
Stojaki na szkiełka nakrywkowe	Mikroskopia elektronowa Sciences	72240	Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbka szkieł nakrywkowych
Lodówka 4° C	Fisherbrand		Do przechowywania odczynników
Cytoszkielet	znakowany tubuliną	TL590M	liofilizowana tubulina znakowana rodaminą z mózgu świni jest kupowana (cytoszkielet) i przechowywana w temperaturze -80° C do momentu uwodnienia w PEM80 i stosowania przez okres do jednego roku.
Białko tubuliny	Cytoszkielet	T240	liofilizowana tubulina 99% czysta, nieznakowana z mózgu świni jest kupowana (cytoszkielet) i przechowywana w -80° C do momentu uwodnienia w PEM80 i stosowania przez okres do jednego roku.
UV-Ozone	Jelight	Model 342	Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbki szkieł nakrywkowych
Stackreg	Biomedical Imaging Group	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	wtyczka do rejestracji danych szeregów czasowych w celu usunięcia dryfu
Turboreg	Biomedical Imaging Group	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	wtyczka do rejestracji danych szeregów czasowych w celu usunięcia dryfu