Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.
Artykuł metodologiczny
Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cytoszkielet jest odpowiedzialny za główną wewnętrzną organizację i reorganizację w komórce, a wszystko to bez kierownika, który kierowałby zmianami. Dzieje się tak zwłaszcza podczas mitozy lub mejozy, gdzie mikrotubule tworzą wrzeciono podczas podziału komórki. Wrzeciono to maszyneria używana do segregacji materiału genetycznego podczas podziału komórki. W kierunku tworzenia samoorganizujących się wrzecion in vitro, opracowaliśmy niedawno technikę rekonstytucji mikrotubul w wrzecionowate zespoły z minimalnym zestawem białek związanych z mikrotubulami i środków tłumiących. W szczególności użyto MAP65, który jest antyrównoległym środkiem sieciującym mikrotubule z roślin, homologiem Ase1 z drożdży i PRC1 z organizmów ssaków. Ten środek sieciujący samoorganizuje mikrotubule w długie, cienkie, przypominające wrzeciono samoorganizujące się zespoły mikrotubul. Zespoły te są również podobne do taktoidów ciekłokrystalicznych, a mikrotubule mogą być używane jako mezoskalowe mezozogeny. W tym miejscu przedstawiono protokoły tworzenia tych taktoidów mikrotubul, a także charakteryzowania kształtu zespołów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz ruchliwości składników za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu.
Wprowadzenie
Podział komórek poprzez mitozę jest jednym z najważniejszych procesów biologicznych dla podtrzymania życia. Włókna mikrotubul, złożone z dimerów tubuliny, są niezbędnymi elementami strukturalnymi tego procesu. Przejściowa maszyneria utworzona w metafazie, gdy chromosomy ustawiają się w środku komórki, nazywana jest wrzecionem mitotycznym ze względu na swój kształt, który jest jak wrzeciono krosna pokrytego nitkami (Rysunek 1A). W wielu organizmach dobrze wiadomo, że mikrotubule są używane w metafazie do wypychania i wciągania skondensowanych chromosomów do środka komórki, wyrównując je i łącząc z mikrotubulami, które rozerwą je w anafazie (Rysunek 1B, C). Wrzeciono tworzy się zarówno w mejozie (Rysunek 1B), jak i mitozie (Rysunek 1C), utworzonych z wielu nakładających się na siebie mikrotubul nie owiniętych wokół osi środkowej jak nić, ale biegnących równolegle do interfejsu. Tworzenie tych struktur opartych na mikrotubulach wymaga powiązanych białek, które sieciują się krzyżowo, i powiązanych enzymów, które mogą działać jako silniki, aby pomóc w popychaniu i przyciąganiu chromosomów1.
Badania wrzecion mejotycznych wykazały, że mikrotubule są krótkie, dynamiczne i nakładają się na siebie w usieciowanych tablicach2,3,4,5,6 (Rysunek 1Di). Ze względu na fizyczną organizację tych krótkich mikrotubul, wrzeciono mejotyczne jest podobne do ciekłokrystalicznego taktoidu (Rysunek 1E). Rzeczywiście, wykazano, że wrzeciona łączą się i łączą, jak można się spodziewać po taktoidach ciekłokrystalicznych5.
Wiele badań z lat sześćdziesiątych XX wieku wykorzystywało fiksację, sekcje szeregowe i mikroskopię elektronową, aby ustalić, że wewnątrz wrzeciona mitotycznego znajdują się dwa rodzaje mikrotubul7,8,9,10. Pierwszy typ nazywa się mikrotubulami kinetochorowymi, które łączą biegun wrzeciona z kinetochorem. Drugi typ nazywany jest mikrotubulami międzybiegunowymi lub polarnymi, które wyrastają poza chromosomy i nakładają się na siebie w strefie środkowej (Rysunek 1Dii)8,9,10. Trzeci typ nazywa się mikrotubulami astralnymi, które znajdują się na zewnątrz wrzeciona i łączą bieguny z krawędzią komórki; Te organizacje zajmujące się mikrotubulami znajdują się poza zakresem obecnej dyskusji. Ostatnio przeprowadzono badania nad interakcją między augmin6 a kompleksem pierścieni gamma-tubuliny wpływającym na centra zarodkowania dla mikrotubul, co skutkuje wrzecionem mitotycznym z krótszymi mikrotubulami, jak w Rysunek 1D.
Ponieważ mikrotubule są dłuższe niż szerokie, o wysokim współczynniku kształtu i wysokiej sztywności, są jak pomniejszone wersje cząsteczek ciekłokrystalicznych. W fizyce miękkiej materii atomy i cząsteczki zostały przybliżone przy użyciu minimalnych oddziaływań, aby wydedukować fizyczne mechanizmy przemian fazowych, w tym zarodkowanie i topnienie kryształów11. Podobnie, mikrotubule są obiektami mezoskalowymi, które są przeskalowanymi wersjami cząsteczek ciekłokrystalicznych, dając wgląd w fizykę dynamiki ciekłych kryształów, w tym zarodkowanie i wzrost faz nematycznych z izotropowych. Ponadto, jak omówiono powyżej, wrzeciono mejotyczne wykazuje właściwości podobne do właściwości ciekłokrystalicznego taktoidu, stanu nematycznego, który nukleuje się i rośnie ze stanu izotropowego cząsteczek ciekłokrystalicznych3,4,5. W przypadku taktoidów zarodkowanie i wzrost są podobne do innych kryształów (tj. wymagają stosunkowo wysokiego stężenia mezogenów [cząsteczek tworzących ciekłe kryształy]). Unikalny kształt "wrzeciona" taktoidu pochodzi z lokalnego wyrównania mezogenów ciekłokrystalicznych, które ustawiają się w fazie nematycznej (Rysunek 1E). Nie mogą tworzyć zaokrąglonego kryształu, ponieważ cząsteczki są wysoce asymetryczne. Biorąc pod uwagę naturę mikrotubul, być może nie jest zaskakujące, że mitotyczne wrzeciono-maszyneria wykonana z wysokiego lokalnego stężenia mikrotubul ma również ten sam kształt, niezależnie od tego, czy nazywa się je taktoidalnym, czy wrzecionowym. Taktoidy mogą być dwubiegunowe, z biegunami na zwężających się końcach (Rysunek 1Ei), lub jednorodne, z biegunami efektywnie ustawionymi na nieskończoność (Rysunek 1Eii).
Biorąc pod uwagę znaczenie formowania wrzeciona, podjęto wysiłki w kierunku samoorganizującego się tworzenia wrzeciona in vitro, demonstrując kondensację mikrotubul w wiązki za pomocą form jonowych12,13, czynniki tłumiące, które tworzą interakcje zubożenia14,15, oraz specyficzne białka sieciujące mikrotubule13,16,17,18,19,21. Co zaskakujące, chociaż wszystkie te środki działają w celu zwiększenia lokalnego stężenia mikrotubul, często skutkują długimi wiązkami mikrotubul, ale nie taktoidami. Jednym z powodów, dla których te wiązki są długie, może być to, że tworzące je mikrotubule są również długie. Niedawne prace z użyciem krótszych mikrotubul wykazały również dłuższe wiązki, które nie są zwężane na końcu15; W tym przypadku wiązki są utrzymywane razem z białkami motorycznymi, które powodują wydłużenie wiązek, a tym samym wydłużają je. Krótkie mikrotubule z nierozciągliwymi sieciownikami są potrzebne do stożkowych, wrzecionowatych zespołów, jak opisano tutaj.
Ostatnio opracowaliśmy technikę umożliwiającą tworzenie taktoidów mikrotubul za pomocą antyrównoległego środka sieciującego, MAP65, w obecności nukleujących stabilnych mikrotubul22. Mikrotubule musiały być krótkie, ale niewiele znanych regulatorów długości mikrotubul może zabezpieczyć mikrotubule przed niestabilnością dynamiczną lub wyżarzaniem od końca do końca. Zamiast tego GMPCPP użyto do zarodkowania i stabilizacji włókien po wzroście. Pozwoliło to na stworzenie dużej gęstości krótkich mikrotubul, które mogły samoorganizować się w taktoidy. Te taktoidy były jednorodne, gdy oglądało się je w warunkach dwójłomności. Oprócz krótkich mikrotubul, do utworzenia taktoidów zastosowano specyficzny antyrównoległy środek sieciujący, MAP65 (Rysunek 2). MAP65 jest białkiem związanym z mikrotubulami roślinnymi z rodziny mitotycznych środków sieciujących PRC1/Ase123. MAP65 występuje jako dimer, z silnym powinowactwem do wiązania się z samym sobą, a także z mikrotubulami24. W przeciwieństwie do wrzeciona mejotycznego i taktoidów obserwowanych za pomocą filamentów aktynowych25,26,27, które są dwubiegunowe i mają właściwości ciekłe ciekłych kryształów, zaobserwowano, że taktoidy mikrotubul są podobne do ciał stałych22,28.
Tutaj przedstawione są protokoły tworzenia taktoidów mikrotubul i charakteryzowania kształtu zespołów oraz mobilności składników za pomocą technik opartych na fluorescencji.
Protokół
UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, poszczególne etapy eksperymentu można przeprowadzić na blacie laboratoryjnym, stosując odpowiedni sprzęt ochronny (rękawiczki).
1. Silanizacja szkiełek nakrywkowych
UWAGA: Przed użyciem z powłoką z polimerowych szczotek zastosowaną w tych eksperymentach, szkiełka podstawowe muszą zostać poddane silanizacji. Jest to hydrofobowa obróbka silanizacyjna, która umożliwia wiązanie kopolimeru blokowego z hydrofobowym blokiem centralnym i tworzenie szczotek polimerowych. Poniższe kroki należy przeprowadzić w dygestorium, nosząc rękawiczki, aby uniknąć kontaktu z toksycznymi oparami. Dimetyldichlorolsilan jest silnie toksyczny i musi być obsługiwany z najwyższą ostrożnością.
- Przepłucz szkiełka nakrywkowe kolejno ddH2O, 70% etanolem i ddH2O. Po każdym płukaniu osusz je za pomocą bezpyłowych chusteczek laboratoryjnych. Pozwala to na usunięcie z powierzchni kurzu oraz cząsteczek organicznych lub rozpuszczalnych w wodzie przed przystąpieniem do obróbki.
- Umieść szkiełka nakrywkowe w metalowym statywie i przenieś go do urządzenia UV-Ozon (UVO). Naświetlaj szkiełka UVO przez 20 min, aby usunąć fluorescencję tła. Zamiast UVO można zastosować komorę plazmową.
- Za pomocą pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe z metalowego statywu użytego do obróbki UVO do innego metalowego statywu przeznaczonego do silanizacji. Nie używaj tych samych statywów do obu procesów, ponieważ podczas stosowania UVO dojdzie do silnego utlenienia. Wcześniej oczyść statywy wodą i etanolem, aby usunąć pozostałości chemikaliów z poprzednich użyć.
- Zanurz statyw ze szkiełkami nakrywowymi w pojemniku z 100% acetonem na 1 h. Przepłucz pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x ddH2O, aby całkowicie usunąć aceton.
- Zanurz statyw ze szkiełkami nakrywowymi w 100% etanolu na 10 min. Przepłucz pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x ddH2O, aby całkowicie usunąć etanol.
- Zanurz statyw ze szkiełkami nakrywowymi 3x w ddH2O na 5 min za każdym razem.
- Zanurz statyw ze szkiełkami nakrywowymi w 0,1 M KOH (50 mL 1 M KOH w 450 mL ddH2O) na 15 min. Przepłucz pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x ddH2O, aby całkowicie usunąć KOH.
- Zanurz statyw ze szkiełkami nakrywowymi 3x w ddH2O na 5 min za każdym razem.
- Pozostaw statyw ze szkiełkami nakrywowymi do wyschnięcia na noc w dygestorium lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Po całkowitym wysuszeniu statywu i szkiełek nakrywkowych, zanurz je na 5 min w 2% dimetyldichlorosilanie (DDS) w osobnym pojemniku przeznaczonym wyłącznie do silanów. Należy dopilnować, aby żadna wilgotna substancja nie miała kontaktu z silanem.
- Zanurz statyw i szkiełka nakrywkowe 2x w pojemniku z 100% etanolem na 5 min. Przepłucz pojemnik 3x wodą z kranu, a następnie 3x ddH2O.
- Zanurz statyw i szkiełka nakrywkowe 3x w ddH2O na 5 min za każdym razem.
- Pozostaw statyw ze szkiełkami nakrywowymi do wyschnięcia na noc w dygestorium lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Po tym końcowym etapie suszenia przenieś szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety z powrotem do kasetek na szkiełka. Tak przygotowane szkiełka można wykorzystać w ciągu kolejnych 1-2 miesięcy. Starsze szkiełka zaczną tracić powłokę i powinny zostać zutylizowane.
2. Przygotowanie tubuliny
UWAGA: Zakupiona tubulina jest dostarczana w formie liofilizowanego proszku, który jest albo nieznakowany, albo znakowany fluoroforami. Liofilizowaną tubulinę przechowuje się w zamrażarce w temperaturze −80 °C. Poniższa procedura służy do mieszania tubuliny nieznakowanej z tubuliną znakowaną w proporcji odpowiedniej do wizualizacji.
- Wyjąć z zamrażarki −80 °C jedną porcję nieoznaczonej tubuliny zawierającą 1 mg liofilizowanego proszku tubuliny i przechowywać na lodzie. Do probówki dodać 200 µL zimnego buforu PEM-80, aby uzyskać stężenie tubuliny 5 mg/mL. Przechowywać na lodzie przez 10 min do całkowitego rozpuszczenia liofilizatu.
- Wyjąć z zamrażarki −80 °C jedną porcję tubuliny oznakowanej rodaminą zawierającą 20 µg liofilizowanego proszku tubuliny i przechowywać na lodzie. Do probówki dodać 4 µL zimnego buforu PEM-80, aby uzyskać stężenie tubuliny 5 mg/mL. Przechowywać na lodzie przez 10 min do pełnego rozpuszczenia liofilizatu.
- Po rozpuszczeniu dodać 100 µL roztworu resuspenderowanej nieoznaczonej tubuliny do 4 µL roztworu tubuliny oznakowanej rodaminą. Pomieszać, pipetując bardzo powoli 6-7 razy. Jeśli widoczne są agregaty, odwirować rozpuszczoną tubulinę przez 10 min przy 90,000 x g, aby usunąć agregaty poprzez odrzucenie osadu i zachowanie supernatantu. Tak przygotowana mieszanina tubuliny będzie zawierać ok. 4% tubuliny oznakowanej.
- Pozostałe 100 µL nieoznaczonej tubuliny zamrozić metodą drop-freeze w ciekłym azocie (LN2) i przechowywać w temperaturze −80 °C do późniejszego przygotowania dodatkowych mieszanin tubuliny.
- Przygotowaną mieszaninę tubuliny oznakowanej podzielić na siedem probówek po 15 µL każda. Każda porcja może zostać wykorzystana do jednej komory eksperymentalnej. Pozostałe porcje zamrozić metodą drop-freeze i przechowywać w −80 °C do przyszłych eksperymentów.
3. Oczyszczanie MAP65
UWAGA: MAP65 nie jest dostępny w sprzedaży, w związku z czym musi zostać oczyszczony na potrzeby niniejszej pracy. Protokół ten został szczegółowo opisany we wcześniejszych publikacjach23,29.
- Przetransformuj plazmid MAP65 oraz plazmid GFP-MAP65 do szczepu bakterii BL21 w celu ekspresji białka.
- Hoduj bakterie BL21 do gęstości optycznej 0,6-1 przy 600 nm. Indukuj produkcję białka za pomocą operatora lac i hoduj bakterie przez noc.
- Odwirowuj kultury w celu uzyskania osadu i zlizuj bakterie.
- Zbierz lizat po wirowaniu i inkubuj go z kuleczkami zawierającymi jony niklu, które wiążą znacznik 6x-histydynowy.
- Eluuj białko przy użyciu imidazolu, a następnie przeprowadź odsalanie.
- Zamroź białko metodą drop-freezing w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze −80 °C; termin przydatności wynosi 1 rok.
4. Montaż komór przepływowych
UWAGA: Eksperymenty są przeprowadzane w komorach przepływowych wykonanych ze szkiełka przedmiotowego i silanizowanego szkiełka zakryjącego (Rysunek 3).
- Należy wziąć szkiełko przedmiotowe i oczyścić je kolejno za pomocą ddH2O, etanolu oraz ddH2O. Po każdym płukaniu szkiełko należy osuszyć za pomocą beztkaninowej chusteczki laboratoryjnej.
- Przy użyciu taśmy dwustronnej należy stworzyć kanał przepływowy. Odciąć kawałek taśmy o długości ~25-30 mm, używając rękawiczek. Przeciąć taśmę wzdłuż, aby uzyskać dwa cieńsze paski. Umieścić oba paski taśmy na szkiełku w odstępie około 5-8 mm.
UWAGA: Ponieważ grubość taśmy jest standaryzowana i wynosi około 80-100 µm, szerokość ścieżki między kawałkami taśmy będzie determinować objętość komory. - Na wierzchu kanału przepływowego należy umieścić przesilanizowane szkiełka nakrywkowe. Uszczelnić szkiełko przedmiotowe i nakrywkowe przy paskach taśmy dwustronnej, delikatnie dociskając obszar taśmy końcówką długopisu. Należy upewnić się, że uszczelnienie jest prawidłowe na całej powierzchni; po poprawnym uszczelnieniu taśma powinna zmienić kolor z półprzezroczystego na przezroczysty.
- Usunąć nadmiar taśmy z krawędzi, pozostawiając jedynie 1 mm od wlotu do komory przepływowej, odcinając taśmę żyletką.
- Oznaczyć komorę informacjami o parametrach eksperymentalnych, zgodnie z potrzebami.
5. Eksperymenty z taktoidami
UWAGA: Po przygotowaniu wszystkich odczynników i materiałów można ich użyć do nukleacji i polimeryzacji taktoidów mikrotubul w komorze przepływowej.
- Przygotować wszystkie niezbędne odczynniki. Rozmrozić je na lodzie i przechowywać w tej temperaturze podczas pracy. Przygotować kilka komór przepływowych do eksperymentów.
- Użyć jednej komory przepływowej dla każdego eksperymentu. Pokryć powierzchnie komory przepływowej szczotką polimerową, wprowadzając 20 µL 5% niejonowego blokowego kopolimerowego surfaktantu (Tabela materiałów) rozpuszczonego w PEM-80, dodając małe krople na obu końcach komory, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza wewnątrz. Przechowywać w komorze wilgotnej (np. w szalce Petri z mokrą, bezpyłową chusteczką laboratoryjną) do momentu użycia (co najmniej przez 5-7 min).
- W sterylnej probówce zmieszać następujące składniki, aby przygotować mieszaninę tubuliny i MAP: 9,5 µL PEM-80; 4 µL 10 mM GMPCPP; 4 µL 5% Pluronic-F127; 1 µL 1M DTT; 1 µL glukozy; 2 µL glikolu polietylenowego (PEG); 12 µL mieszaniny tubuliny o stężeniu 5 mg/mL (stężenie końcowe 13,6 µM) z kroku 2.5. oraz 5,5 µL roztworu roboczego MAP65, w którym 10% stanowi GFP-MAP65 do wizualizacji. Podczas mieszania przechowywać na lodzie.
UWAGA: Do pobierania lepkaego roztworu PEG zaleca się użycie pipety wypierającej. Można użyć zwykłych pipet po odcięciu końcówki w celu powiększenia otworu, jednak metoda ta jest mniej precyzyjna. - Wymieszać 5-6 razy za pomocą pipety.
- Bezpośrednio przed wprowadzeniem do komory, dodać 1 µL gotowego roztworu oksydazy glukozowej (0,5 mg/mL) i katalazy (0,15 mg/mL) (Deoxy) do mieszaniny tubuliny i MAP i wymieszać 7-8 razy. Podzielić całkowitą objętość roztworu (40 µL) na dwie porcje do użycia w osobnych komorach.
- Wprowadzić mieszaninę tubuliny i MAP do komór. Ponieważ w komorach znajduje się już niejonowy blokowy kopolimerowy surfaktant, nie można dodać więcej cieczy bez usunięcia starego roztworu. W tym celu należy użyć kawałka papieru filtracyjnego lub bezpyłowej chusteczki laboratoryjnej na drugim końcu komory, aby usunąć ciecz poprzez działanie kapilarne.
- Gdy próbka znajdzie się całkowicie wewnątrz komory, uszczelnić oba końce komory za pomocą 5-minutowej żywicy epoksydowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez ok. 30 min w celu nukleacji i wzrostu taktoidów mikrotubularnych.
6. Mikroskopia fluorescencyjna
- Do obrazowania taktoidów należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego.
UWAGA: Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem lub konfokalna mikroskopia z wirującym dyskiem dobrze eliminują fluorescencję tła pochodzącą z wolnej tubuliny, jednak taktoidy są widoczne również w zwykłej epi-fluorescencji, a nawet w mikroskopii światła przechodzącego po ich uformowaniu, co sprawia, że procedura ta jest dostępna bez specjalistycznego sprzętu. - Należy zastosować obiektyw o aperturze numerycznej (NA) 1,2 NA lub wyższej i powiększeniu 60x lub większym, aby zebrać wystarczającą ilość światła w fluorescencji. Obiektywy te często wymagają imersji w ddH2O lub oleju.
- Obrazy należy rejestrować za pomocą kamery CMOS lub CCD. Należy zastosować w kamerze efektywny rozmiar piksela wynoszący 108 nm.
UWAGA: Rozmiar piksela zależy od kamery i zastosowanego powiększenia, które w tym przypadku wynosiło 60x lub 100x przy wysokiej aperturze numerycznej (1,2 lub 1,49 NA). Przed kamerą można zastosować dodatkowe powiększacze obrazu w celu uzyskania wymaganego rozmiaru piksela. - Próbkę należy utrzymać w temperaturze 37 °C, korzystając z komory środowiskowej ustawionej na tę temperaturę. Alternatywnie można zastosować inne podgrzewacze stolika, w tym podgrzewacze nadmuchowe oraz pierścienie obiektywu z kontrolą temperatury z cyrkulującą ciepłą wodą.
- Należy użyć źródeł wzbudzenia odpowiednich dla wymaganej fluorescencji. Dla tubuliny znakowanej rodaminą należy użyć lasera 561 nm o mocy co najmniej 1 mW w miejscu próbki, a dla GFP-MAP65 lasera 488 nm o mocy co najmniej 1 mW w miejscu próbki.
UWAGA: W przypadku stosowania szerokopolowej mikroskopii epi-fluorescencyjnej należy użyć kostki filtracyjnej dla rodaminy z wzbudzeniem: 540 ± 12,5 nm, lustrem dichronicznym: cut-off 545 nm ± 12,5 nm i emisją: long pass 575 nm oraz kostki filtracyjnej dla GFP z wzbudzeniem: 480 ± 15 nm, lustrem dichronicznym: cut-off 505 nm ± 15 nm i emisją: long pass 515 nm. - Należy wykonać co najmniej 10 obrazów różnych obszarów, aby zobrazować ponad 100 taktoidów. Obrazy należy rejestrować w kanałach czerwonym i zielonym, a następnie zapisać je jako 16-bitowe obrazy tiff do analizy. Należy upewnić się, że moc oświetlenia i czasy ekspozycji są dobrane tak, aby skala intensywności kamery nie była nasycona.
7. Odzyskiwanie fluorescencji po fotoblaknięciu (FRAP)
UWAGA: Do badania mobilności wewnętrznych składników taktoidów wykorzystano metodę FRAP. Mechanizm działania FRAP polega na fotowybieleniu wybranego fragmentu tubuliny znakowanej rodaminą oraz taktoidu MAP65 znakowanego GFP, a następnie obserwowaniu w czasie powrotu fluorescencji w tym obszarze. Szybkość powrotu zależy od wymiany cząsteczek poddawanych fotowybielaniu. Szybkość ta może być zależna od dyfuzji i reakcji wiązania. W przypadku wiązania MAP65 z taktoidami możliwe jest oszacowanie szybkości wymiany wiązań. FRAP wykonuje się przy użyciu dodatkowego systemu laserowego 405 nm, który umożliwia skanowanie wiązki w dowolnym kształcie. Istnieje wiele możliwości przeprowadzenia FRAP, w tym wykorzystanie lampy transmitowanej i przysłony do fotowybielenia obszaru lokalnego14.
- Wybierz odizolowany taktoid w komorze, aby utworzyć obszar zainteresowania (ROI) obejmujący fragmenty taktoidów oraz otaczający roztwór.
- Do przeprowadzenia FRAP użyj mikroskopu z dodatkowym laserem 405 nm, aby jednocześnie wybić fluorescencję tubuliny i MAP65. Alternatywnie można zastosować jasną lampę przez przesłonę pola widzenia14. Dobierz empirycznie odpowiednią intensywność systemów wybijania fluorescencji, aby uniknąć uszkodzenia białek podczas procesu.
- Rejestruj taktoid w formie filmu będącego serią czasową przez 30-60 s przed wybijaniem fluorescencji, aby uzyskać informacje o intensywności przed procesem. Rejestruj oba kanały: czerwony i zielony.
- Wybij fluorescencję taktoidu, naświetlając ROI laserami lub lampą przez czas niezbędny do uzyskania efektu bez uszkodzenia taktoidu. Natężenie i czas określ empirycznie.
- Kontynuuj rejestrację filmu w obu kanałach kolorystycznych przez 5-10 min po wybijaniu fluorescencji lub do momentu, gdy odzyskiwanie sygnału osiągnie stan równowagi.
- Wizualnie sprawdź kanał GFP-MAP65 pod kątem odzyskiwania fluorescencji.
8. Analiza danych
UWAGA: Przeprowadzono analizę ilościową obrazów taktoidów, aby zbadać wpływ zmian środowiskowych wprowadzonych poprzez zastosowanie różnych czynników zagęszczających, warunków jonowych oraz dodatek innych czynników.
- Charakterystyka kształtu taktoidów
- Należy określić długość i szerokość taktoidów na obrazach czerwonych i zielonych uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej.
- Otwórz obrazy w programie FIJI/ImageJ.
- Jeśli surowe dane zostały zarejestrowane w formacie 16-bitowym, w razie potrzeby należy dostosować jasność i kontrast. Wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność i kontrast należy dostosować obraz tak, aby taktoid był wyraźnie widoczny. Należy wyregulować jasność i kontrast bez zatwierdzania ustawień, aby uniknąć przypadkowej zmiany danych dotyczących intensywności.
- Gdy taktoidy staną się wyraźnie widoczne, należy wybrać odpowiednie taktoidy do pomiaru (Rycina 4Bi). Należy upewnić się, że taktoidy są wyraźnie widoczne, nie nakładają się na żadne inne taktoidy ani agregaty oraz nie są zakrzywione ani wygięte, aby umożliwić zastosowanie narzędzi do pomiaru w linii prostej.
- Następnie należy sprawdzić, czy dla obrazów ustawiono prawidłowy rozmiar piksela. Obrazy mikroskopowe zawierają metadane dotyczące rozmiaru piksela. W przypadku korzystania z innej kamery, która nie posiada metadanych, lub zewnętrznych systemów powiększania obrazu, które mogą zmienić oczekiwany efektywny rozmiar piksela, należy dostosować rozmiar piksela ręcznie. W programie FIJI/ImageJ należy przejść do Analizuj > Ustawienie skali aby ustawić prawidłowy przelicznik pikseli.
- Używając Linia prosta narzędzie z paska narzędzi w programie FIJI/ImageJ, kliknij jeden koniec taktoidu i przeciągnij kursor do drugiego końca taktoidu (Rysunek 4Bii). Po wybraniu liniowego regionu zainteresowania (ROI), wybierz Analiza > Pomiar w celu pomiaru długości. Jeśli długość nie jest mierzona domyślnie, należy upewnić się, że ustawienia pomiaru obejmują długość w Analizuj > Ustawienie pomiarów okno dialogowe
UWAGA: Zazwyczaj podczas pomiaru za pomocą Linia prosta narzędzie to poda długość i kąt narysowanej linii. Na przykład, Rycina 4Bii przedstawia linię prostą narysowaną obok taktoidu w celu zwiększenia jego widoczności, jednak pomiar należy wykonać bezpośrednio na taktoidzie. - Po dokonaniu pomiaru należy użyć Tekst narzędzie na pasku narzędzi do etykietowania taktoidu. Utwórz pole tekstowe, dodaj etykietę numeryczną i wybierz Edytuj > Rysuj aby przypisać etykietę do obrazu. Zapisz obraz jako oddzielny plik ROI.
UWAGA: Odpowiednie etykietowanie i zapisywanie tego pliku pozwala badaczowi określić, który pomiar odpowiada któremu taktoidowi w surowych danych. Należy upewnić się, że każdy taktoid został zmierzony tylko raz. - Po zmierzeniu taktoidów dla całego obrazu, zapisz dane w Wyniki okno do pliku tekstowego rozdzielanego przecinkami lub tabulatorami (używając Plik > Zapisz jako) i otwórz dane w programie do arkuszy kalkulacyjnych, aby przekonwertować je na wartości liczbowe. Zbierz wszystkie dane (surowe dane obrazowe, obraz ROI oraz plik tekstowy z wynikami) w folderze, stosując odpowiednią konwencję nazewnictwa, aby zachować porządek w dokumentacji.
UWAGA: Chociaż pomiary długości taktoid są wykonywane ręcznie, ze względu na ich niewielką szerokość, w celu zmniejszenia błędu pomiarowego zaleca się zastosowanie innej metody pomiaru szerokości taktoid (patrz poniżej). - Używając programu ImageJ/FIJI, narysuj obszar liniowy za pomocą Linia prosta narzędzie. Narysuj linię jako symetralną długiej osi taktoidu (Rycina 4Bii).
- Wybierz Analizuj > Wykres Profil w celu utworzenia profilu intensywności liniowego dwusiecznego (|Rycina 4Biii). Pojawi się wykres. Aby pobrać i zapisać dane z wykresu, należy wybrać Lista przycisk w dolnym lewym rogu; spowoduje to wygenerowanie pliku tekstowego z listą danych o intensywności wzdłuż narysowanej linii. Zapisz plik tekstowy w formacie .csv lub .txt.
- Otwórz plik tekstowy w odpowiednim programie, takim jak MatLab, Python (sciPy) lub innym oprogramowaniu. Dopasuj dane intensywności do funkcji Gaussa o postaci:
, gdzie I(x) wartość skali szarości wzdłuż długości, Proszę podać tekst do tłumaczenia.; B jest poziomem tła; A jest amplitudą rozkładu Gaussa; µ jest średnią lub środkiem rozkładu Gaussa; i σ jest odchyleniem standardowym rozkładu Gaussa. - Raport 2σ jako szerokość taktoidu. Oszacuj intensywność mikrotubul w taktoidzie, obliczając pole pod krzywą Gaussa (z wyłączeniem tła).
UWAGA: Jeśli obrazy znajdują się w liniowym zakresie intensywności kamery i zostały wykonane przy tym samym czasie ekspozycji oraz intensywności wzbudzenia, można porównać zintegrowane intensywności, aby oszacować względną liczbę mikrotubul w taktoidzie.
- Analiza FRAP
UWAGA: Eksperymenty mające na celu zbadanie mobilności mikrotubul oraz białka MAP65 wykorzystywały technikę FRAP do rejestracji specyficznego fotowybielania i powrotu intensywności wynikającego z ruchu molekularnego (Rycina 5ADane z serii obrazów czasowych zostały poddane kwantyfikacji przy użyciu oprogramowania ImageJ/FIJI.- Użyj programu ImageJ/FIJI, aby otworzyć dane filmowe.
- Wyrównaj stosy (dane z serii czasowej) w czasie, aby usunąć dryft. Użyj StackReg wtyczka wraz z elementami pomocniczymi TurboReg wtyczka; instrukcje dotyczące korzystania z wtyczek znajdują się w odnośnikach internetowych podanych w Tabela materiałówWybierz translację, aby przesunąć pozycję klatek i w ten sposób zarejestrować obrazy.
- Po zarejestrowaniu obrazów w celu usunięcia dryftu, należy obrócić obraz tak, aby taktoid znajdował się w kadrze pionowo lub poziomo, wybierając Obraz > Transformuj > ObrócićWybierz kąt obrotu i zastosuj go. Podgląd aby określić, czy taktoid jest odpowiednio obrócony. Gdy podgląd wykaże, że taktoid jest ustawiony pionowo lub poziomo, należy wybrać Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. aby obrócić wszystkie obrazy w filmie.
- Użyj Prostokąt narzędzia zaznaczania na pasku narzędzi, aby utworzyć prostokątny obszar nad regionem fotowybielonym taktoidu. Zarejestruj zintegrowaną intensywność obszaru ROI dla każdej klatki za pomocą Obraz > Stosy > Stos pomiarowyUstaw typ pomiaru na Zintegrowana gęstość za pomocą Analizuj > Ustawienia pomiarówZapisz przeanalizowane dane dotyczące intensywności przedstawione w Wyniki okno jako plik tekstowy w formacie .csv lub .txt poprzez wybranie Plik > Zapisz jako.
UWAGA: Rysunek 5B przedstawia przykład surowych 16-bitowych danych intensywności zmierzonych dla kanałów mikrotubul i GFP-MAP65 w obszarze wybielania. - Ponieważ całkowita intensywność obrazów będzie z czasem globalnie spadać w wyniku fotoblaknięcia wywołanego obrazowaniem, należy skorygować to globalne fotoblaknięcie. W tym celu należy użyć obszaru ROI o tej samej wielkości (Krok 8.2.4.) i przenieść go w obszar tła obrazu, w którym nie są widoczne mikrotubule ani MAP65. Następnie należy zmierzyć zintegrowaną intensywność stosu obrazów, zgodnie z opisem w Kroku 8.2.4. Wyniki należy zapisać w drugim pliku tekstowym.
UWAGA: Rycina 5B przedstawia przykład surowych 16-bitowych danych intensywności zmierzonych dla kanałów mikrotubul oraz GFP-MAP65 w obszarze tła. - Aby skorygować zanikanie tła, należy podzielić intensywność sygnału w taktoidzie przez intensywność tła dla tego samego punktu czasowego. Oblicz Ipoprawione (t) Ponieważ nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o dostarczenie treści, którą należy przełożyć na język polski.
, gdzie IS (t) (sygnał) jest pomiarem wykonanym w regionie wybielonym, a IBG (t) (szum) to pomiar wykonany w obszarze tła (Rycina 5C). Pozwala to na obliczenie stosunku sygnału do szumu dla każdej klatki oraz odjęcie szumu. - Następnie należy przeskalować dane do zakresu od zera do jeden, korzystając z
, gdzie Imin i Imaksymalny oznaczają odpowiednio globalne minimum i maksimum Ipoprawione dane z całego okresu (Rycina 5C). - Dopasuj te dane do funkcji wykładniczego zaniku o postaci:
, gdzie A gdzie amplituda powrotu wynosi oraz τ jest stałą czasową powrotu (Rycina 5C).
Wyniki
Przy użyciu zaledwie niewielkiej liczby komponentów, dimerów tubuliny oraz sieciujących białek mikrotubul, mogą tworzyć się taktoidy mikrotubul (Rycina 2A). Choć niniejszy protokół opisuje inkubację w celu nukleacji i wzrostu mikrotubul w inkubatorze, proces nukleacji i wzrostu można obserwować bezpośrednio pod mikroskopem (procesy te kończą się w ciągu 30 min) (Rycina 2B). Stężenie tubuliny utrzymuje się na stałym poziomie 13.6 µm, a wiązanie MAP65-MT na poziomie 10%.
Rysunek 4 przedstawia poprawne dane. Taktoidy powinny być widoczne zarówno przy użyciu lasera 561 nm w kanale tubuliny, jak i 488 nm w kanale MAP65, wykazując przy tym idealną koincydencję (Rysunek 4A). Jedną z zagadek tego układu jest fakt, że szerokość taktoidów nie wydaje się zmieniać przy różnych modyfikacjach eksperymentalnych, w tym przy zmianie długości mikrotubul, stężenia MAP65 oraz rodzaju czynników zagęszczających (Rysunek 4B)22,28. Długość jest znacznie bardziej zmienna i zależy zarówno od długości mikrotubul, jak i od stężenia MAP65 (Rysunek 4B)22,28.
Podczas przeprowadzania FRAP zaobserwowano, że sygnał MAP65 ulega regeneracji, natomiast sygnał mikrotubul nie ulega regeneracji (Rysunek 5). Regeneracja w FRAP wynika z mobilności i ruchu obiektów znakowanych oraz poddanych fotowybielaniu. W przypadku MAP65 wybielone cząsteczki dysocjują i oddalają się od mikrotubuli, a na ich miejsce w dany obszar przemieszczają się nowe cząsteczki (Rysunek 5). Wiązanie MAP65 przebiega w stanie równowagi, zatem szybkość wiązania i odłączania jest taka sama (mierzona w liczbie cząsteczek na sekundę). W przypadku mikrotubul nie zaobserwowano regeneracji, co oznacza, że mikrotubule nie są w stanie opuścić taktoidu (Rysunek 5A, Bi, C). Ponadto nie zaobserwowano rozprzestrzeniania się zaciemnionego obszaru, co sugeruje, że mikrotubule są lokalnie nieruchome i nie tworzą cieczy w obrębie kształtu taktoidu.
Rycina 1: Różne modele formowania wrzeciona. Wrzeciono mitotyczne to struktura zbudowana z mikrotubul oraz powiązanych z nimi białek i enzymów, która ustawia i rozdziela chromosomy do dwóch nowych komórek potomnych podczas podziału komórki. (A) Zdjęcie repliki wrzeciona kroplowego z wczesnego średniowiecza z cienką przędzą z Holandii. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie obrazu z Wikimedia autorstwa Petera van der Sluijsa30. (B) Rekonstrukcja trójwymiarowa mikrotubul w różnych etapach mejozy II typu dzikiego. Mikrotubule przedstawiono na zielono, a chromosomy na szaro. Pasek skali = 1 µm. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Lantzsch et al.31. (C) Obraz mikroskopowy mikrotubul we wrzecionie mitotycznym dzielącej się komórki Sf9. Bieguny wrzeciona i mikrotubule wrzeciona są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym. Pasek skali = 5 µm. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Advani et al.32. (D) Różne modele organizacji mikrotubul wrzeciona mitotycznego i meiotycznego. (i) W przypadku wrzecion meiotycznych stworzonych z ekstraktów jąder komórkowych Xenopus, zaobserwowano wcześniej, że mikrotubule (zielone) są krótkie i dynamiczne w obrębie całego wrzeciona. Jest to podobne do organizacji bipolarnego taktoidu wewnątrz kryształu ciekłego. (ii) Kanoniczny model organizacji mikrotubul wewnątrz wrzeciona mitotycznego obejmuje dwa typy mikrotubul: mikrotubule interpolarne lub polarne (ciemnozielone), które krzyżują się w strefie środkowej wokół chromosomów, oraz mikrotubule kinetochorowe (jasnozielone), które są wiązkowane i rozciągnięte od bieguna do kinetochoru, aby pchać i ciągnąć chromosomy. Na wszystkich obrazach chromosomy przedstawiono w kolorze przezroczystego błękitu, a bieguny wrzeciona w ciemnozielonym. (E) Schematy mezogenów (zielone linie) w taktoidzie kryształu ciekłego dla taktoidów (i) bipolarnego i (ii) homogenicznego. Taktoidy bipolarne mają dwa bieguny na końcach taktoidu, a mezogeny zmieniają orientację, aby wskazywać na te bieguny. Taktoidy homogeniczne mają bieguny w nieskończoności, a mezogeny nie zmieniają orientacji wzdłuż długości taktoidu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Kondensacja mikrotubul. (A) Mikrotubule mogą być wiązane w pęki i sieciowane za pomocą różnych metod, w tym przez gatunki jonowe, siły wyczerpania wywołane przez czynniki zagęszczające oraz specyficzne sieciujące mikrotubule białka, takie jak MAP65. (i) Dimery tubuliny i białka MAP65 są mieszane w celu nukleacji i wzrostu mikrotubul. (ii) Mikrotubule nukleują i rosną z tubuliny, a MAP65 natychmiast wiąże się z mikrotubulami, innym monomerem MAP65 lub obiema tymi strukturami, co powoduje tworzenie pęków. (iii) Mikrotubule w sieciowanych pękach nukleują i rosną. (iv) Końcową konfiguracją jest taktoid mikrotubularny podobny do wrzeciona. (B) Seria czasowa nukleacji i wzrostu taktoidów mikrotubularnych w ciągu 105 min. Pasek skali = 5 µm. Rycina zaadaptowana z Edozie et al.22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Montaż komory przepływowej. Komorę przepływową wykonuje się przy użyciu szkiełka przedmiotowego, silanizowanej laminek oraz trwałej taśmy dwustronnej. Żółto zaznaczony obszar to ścieżka przepływu, przez którą przepływa i jest obserwowana próbka. Objętość komory przepływowej wynosi ~20 µL. Do uszczelnienia końców komory użyto epoksydy, aby zapobiec odparowaniu próbki podczas długotrwałego obrazowania trwającego kilka godzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Obrazy taktoidów oraz analiza długości i szerokości. (A) Przykładowe dane taktoidów utworzonych zgodnie z opisem i obrazowanych za pomocą konfokalnego mikroskopu z tarczą rotacyjną, przedstawiające (i) obrazowanie kanału mikrotubul z tubuliną znakowaną rhodaminą przy użyciu lasera 561 nm, (ii) obrazowanie kanału GFP-MAP65 przy użyciu lasera 488 nm oraz (iii) nałożony obraz z kanału mikrotubul (magenta) i kanału GFP-MAP65 (cyan). Obszary pokrywania się są wyświetlane jako białe i wykazują dokładną kolokalizację mikrotubul i MAP65. Pasek skali = 10 µm dla wszystkich obrazów w (A). (B) Kwantyfikacja długości i szerokości taktoidów. (i) Obraz taktoidu przeznaczonego do analizy bez etykiet. Pasek skali = 5 µm. (ii) Ten sam obraz co w (i), gdzie zaznaczono pomiary długości (linia ciągła z zakończeniami) i szerokości (linia przerywana). Pasek skali = 5 µm. (iii) Szerokość mierzono poprzez analizę profilu intensywności w poprzek taktoidu na symetrycznej dwusiecznej prostopadłej (linia przerywana) zaznaczonej w (ii). Profil intensywności dopasowano do funkcji Gaussa, aby określić amplitudę i szerokość taktoidu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Reprezentatywne dane i analiza FRAP. (A) Dane z serii czasowych mikroskopowych (i) taktoidu mikrotubularnego oraz (ii) GFP-MAP65, a także (iii) obraz nałożony obu kanałów z mikrotubulami w kolorze purpurowym i GFP-MAP65 w kolorze cyjanowym, które zostały poddane fotowybielaniu w czasie 63 s i obserwowane przez kolejne 5 min. (B) Ilościowa analiza intensywności (i) kanału mikrotubul w obszarze wybielonym (purpurowe okręgi) i w tle (ciemnoszare okręgi) oraz (ii) kanału GFP-MAP65 w obszarze wybielonym (cyjanowe kwadraty) i w tle (ciemnoszare kwadraty). (C) Dane zostały skorygowane o szum tła i przeskalowane dla kanału mikrotubul (purpurowe okręgi) oraz kanału GFP-MAP65 (cyjanowe kwadraty). Mikrotubule nie ulegają regeneracji, natomiast GFP-MAP65 ulega i może zostać dopasowany (ciemnoszara linia) do funkcji rosnącego zaniku wykładniczego w celu wyznaczenia amplitudy i skali czasowej regeneracji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dyskusja
Opisane tutaj metody zostały wykorzystane w kilku artykułach do stworzenia taktoidów mikrotubul (ryc. 2)22,28. Eksperymenty te są biologicznie istotne, aby pomóc w odkryciu zasad organizacyjnych, które kontrolują kształt i stabilność wrzeciona mitotycznego lub mejotycznego w większości typów komórek. Ponadto mikrotubule są modelowymi mezogenami ciekłokrystalicznymi, które mogą pomóc w dowiedzeniu się więcej o tym, jak ciekłe kryształy nukleują i rozwijają fazy nematyczne z faz izotropowych.
Opisana tutaj procedura ma kilka zalet w badaniu samoorganizacji mikrotubul. Po pierwsze, jest wysoce powtarzalny, ponieważ został wykonany w laboratorium przez wielu uczniów, w tym uczniów szkół średnich, z niewielką wiedzą lub szkoleniem przed rozpoczęciem pracy w laboratorium. Takuloidy są dwójłomne22, co pozwala na oglądanie ich w świetle przechodzącym oprócz mikroskopii fluorescencyjnej, dzięki czemu metoda ta jest dostępna dla wielu laboratoriów, a ta eksperymentalna procedura może być dostosowana do celów edukacyjnych, oprócz badań na najwyższym poziomie. Wreszcie, proces ten otwiera drogę do dalszego rozumienia i badania systemów biologicznych w uproszczonym, redukcjonistycznym podejściu, pozwalając zrozumieć, w jaki sposób każdy dodatkowy warunek, białko lub dodatek może zmienić samoorganizację taktoidów i, być może, ostatecznie, wrzeciona. Cele dla lepszej biomimikry obejmują aktywność, płynność i sortowanie polaryzacji włókien.
Może istnieć kilka czynników wpływających na eksperyment dający nieoczekiwane wyniki. Na przykład, jeśli taktoidy nie tworzą się (ryc. 2), ale obserwuje się wzory przypominające wachlarze, MAP65 prawdopodobnie nie jest obecny lub nie wiąże się z mikrotubulami22,28. Powinno to być oczywiste również w kanale fluorescencyjnym MAP65, ponieważ GFP-MAP65 nie będzie związany z mikrotubulami.
Jeśli tactoidy się nie tworzą, a tło pojawia się jako plamki na szkle, może to być spowodowane powłoką powierzchniową. Raz wykonana silanizacja trwa tylko 1 miesiąc na szkiełkach nakrywkowych. Kiedy się zużyje, tubulina będzie w stanie związać się z odsłoniętą powierzchnią w sposób niespecyficzny. To wiązanie będzie występować w dziwnych wzorach.
Jeśli taktoidy się nie tworzą, a tubulina jest obserwowana w agregatach o różnych kształtach i rozmiarach, może to być spowodowane rurką złej jakości. Tubulinę można odwirować w celu usunięcia początkowych agregatów, które mogą napędzać agregację poza szlakiem zamiast polimeryzacji mikrotubul. Jeśli powierzchnia wiąże się z tubuliną, może również zubożyć tubulinę w roztworze. Niskie stężenia tubuliny, poniżej stężenia krytycznego dla polimeryzacji mikrotubul, mogą prowadzić do powstania agregatów.
W eksperymentach FRAP, jeśli kanał MAP65 nie wykazuje żadnej regeneracji (ryc. 5), możliwe jest, że fotowybielanie powodowało fotouszkodzenie mikrotubul. Fotouszkodzenie powoduje miejscowe zniszczenie włókien. Można to sprawdzić, badając w nadawanym kanale. Taktoidy mikrotubul są widoczne w przesyłanym kanale poprzez wysoki współczynnik niedopasowania refrakcji do otaczającej wody. Fotouszkodzenie wywołane światłem pojawi się jako ślad po oparzeniu lub utrata kontrastu w obrazowaniu w świetle przechodzącym w miejscu ROI poddanego fotowybielaniu. Jeśli tak się stanie, moc lasera lub światła musi zostać zmniejszona, aby zahamować fotouszkodzenia białek.
W ramach tej procedury i podejścia napotkano kilka wyzwań. Jednym z problemów jest to, że pomiary długości są obecnie wykonywane ręcznie po kliknięciu na obraz. Ta metoda, choć prosta, może powodować dużą niepewność. Pomiar szerokości, który wykorzystuje przekrój poprzeczny i dopasowanie do Gaussa, jest lepszą metodą ilościowego określania rozmiaru. Podobną metodę można zastosować w odniesieniu do długości. Drugą kwestią jest to, że czasami taktoidy, ponieważ są tak długie i cienkie, mogą się zginać. To sprawia, że ilościowe określenie długości jest trudniejsze. Długość konturu można określić ilościowo za pomocą linii segmentowej, ale za każdym razem, gdy dodawany jest segment, pojawia się dodatkowa niepewność.
Z naukowego punktu widzenia podejście to wiąże się z pewnymi innymi wyzwaniami związanymi z jego wykorzystaniem jako modelu dla ciekłych kryształów lub wrzecion. Pierwszym wyzwaniem był długi, cienki kształt taktoidów tworzonych przez mikrotubule (ryc. 3 i ryc. 4). Jak zauważono we wcześniejszych publikacjach22, taktoidy mikrotubul są taktoidami jednorodnymi, a nie dwubiegunowymi. Oznacza to, że mikrotubule tworzące kształt nie zmieniają orientacji, aby wskazać końcówki struktury. Zamiast tego wszystkie mikrotubule są równoległe do długiej osi, a "bieguny" znajdują się w nieskończoności. Różni się to bardzo od taktoidów obserwowanych dla molekularnych ciekłych kryształów, a nawet dla aktyny lub DNA, które mogą również działać jako mezogeny ciekłokrystaliczne. W tych innych systemach taktoidy są dwubiegunowe i patrząc na nie w skrzyżowanych polaryzatorach, wykazują charakterystyczne oznaki reorientacji pręcików.
Drugim poważnym wyzwaniem w tym systemie jest to, że mikrotubule są nieruchome wewnątrz taktoidu. Wynika to jasno z eksperymentów i analiz FRAP, ponieważ odzysk mikrotubul jest bardzo niski. Ich stała natura sprawia, że taktoidy mikrotubul są mniej wartościowe niż wielkoskalowe analogi ciekłokrystaliczne. Faza nematyczna ciekłego kryształu powinna mieć zarówno właściwości ciekłe (płynne), jak i krystaliczne (zorganizowane). Chociaż kształt wydaje się odpowiedni dla wrzeciona, bezruch sprawia, że system jest mniej ekscytujący jako modelowe wrzeciono mitotyczne. Z drugiej strony, wydanie to daje możliwość zbadania, w jaki sposób można modyfikować eksperymenty, aby uzyskać większą płynność systemu.
Te wyzwania naukowe oferują ekscytujące możliwości, które pozwolą na zdobycie nowej wiedzy na temat systemu. Aby taktoidy mikrotubul były bardziej dwubiegunowe, można użyć krótszych mikrotubul. Istnieje jednak dodatkowe wyzwanie, ponieważ mikrotubule nie mają wielu dobrze scharakteryzowanych białek ograniczających, które kontrolowałyby długość, tak jak robi to aktyna. Zastosowanie zarodkowania i wzrostu wymaga użycia bardzo wysokich stężeń tubuliny i GMPCPP do wytworzenia krótkich mikrotubul. Wysokie stężenie tubuliny skutkuje większą liczbą filamentów w układzie, co utrudnia oddzielenie taktoidów od siebie. Dodanie nowych kapsli do mikrotubul, takich jak DARPin33, może pomóc w tej sytuacji. Drugi problem związany z unieruchomieniem mikrotubul można złagodzić poprzez dodanie białek motorycznych, takich jak kinezyna-534, które są tetramerami silników używanych w mitozie. Alternatywnie można zastosować sztuczne dimery dimerycznej kinezyny-115.
Innym sposobem na zwiększenie płynności byłoby umożliwienie mikrotubulom wykonywania ich dynamicznej niestabilności, czyli wzrostu i kurczenia się mikrotubul. Obecnie mikrotubule, które są wysiewane stabilnymi włóknami GMPCPP, a następnie ulegają dynamicznej niestabilności, są znacznie dłuższe niż pożądane, aby utworzyć wrzeciono lub taktoid, co skutkowałoby bardzo długimi organizacjami, takimi jak wentylatory lub wiązki. Tak więc dodanie dynamicznej niestabilności mikrotubul musiałoby być wykonane ostrożnie, aby zachować kształt taktoidalny. Dodanie powiązanych białek i enzymów, które mogą kontrolować długość, może złagodzić ten problem. Na przykład prawdopodobnie potrzebna byłaby depolimeryzacja kinezyny, takiej jak kinezyna-1335, lub enzymy odcinające, takie jak katanina36. Eksperymenty te są złożone i trudne, chociaż byłyby bardzo wnikliwe bez względu na to, co ujawnią wyniki. Niezależnie od tego, w jakim kierunku pójdą przyszłe eksperymenty, opracowana tutaj platforma do tworzenia taktoidów mikrotubul może ujawnić nowe informacje na temat fizycznych podstaw organizacji mikrotubul.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom Ross Lab z lata 2021, szczególnie K. Alice Lindsay, za ich pomoc. Praca ta była wspierana przez grant z NSF BIO-2134215, który wspierał S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee i J.L. Rossa. Grant z Fundacji KECK (Rae Anderson, USD, kierownik projektu) częściowo wsparł R. Brancha i P. Chauhana
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | Hydrofobowa obróbka powierzchni silanu. Można go ponownie użyć do trzech razy i przechowywać w temperaturze pokojowej przez rok. |
| 5-minutowa żywica epoksydowa | Bob Smith Industries | Do uszczelniania komór eksperymentalnych | |
| Aceton | Fisher | 32900HPLC | 100% |
| BL21 komórki | Bio Labs | C2527I | Kompetentne komórki bakteryjne używane do ekspresji MAP65 |
| Katalaza | Sigma | C30-500MG | Część systemu oczyszczania tlenu. Zapas 300 mg/ml jest wytwarzany w ddH2O i przechowywany w 10 μ l podwielokrotności w -20° C na okres do jednego roku. |
| Szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm lub 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | Do komór doświadczalnych |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | Mała cząsteczka, która służy do rozbijania wiązań dwusiarczkowych i usuwania tlenu. Kolba o pojemności 1 M jest wykonana z proszku (Sigma) w ddH2O. Roztwór jest podawany i przechowywany w temperaturze -20C przez okres do jednego roku. Podwielokrotności są używane 7-8 razy, a następnie odrzucane. |
| EGTA | Sigma | E3889-10G | Bufor tubulinowy składnik bazowy |
| Eppendorf 0,5 ml probówki | Eppendorf | 05 402 18 | Do przechowywania roztworów eksperymentalnych |
| Etanol Fisher | 111000200 | 200 proof | |
| Bibuła filtracyjna | Whatman | 1004-110 | Do czyszczenia i przeciągania roztworów przez komory doświadczalne |
| Mikroskop fluorescencyjny z wysokim NA obiektywy | Nikon | Ti-E, W2 Konfokalny | Do eksperymentów obrazowych |
| Zamrażarka -20° C | Fisherbrand | 13986148 | Do przechowywania odczynników |
| Zamrażarka -80° C | Thermo scientific | 328223H01-C | Do przechowywania białek. |
| Szklane pojemniki do silanizacji | Michaels | Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbki szkieł nakrywkowych | |
| Szkiełka szklane | Fisher | 12544-4 | Do komór doświadczalnych |
| Glukoza | Sigma | G7528-250G | Część systemu oczyszczania tlenu. Zapas 300 mg/ml jest wytwarzany w ddH2O i przechowywany w 10 μ l podwielokrotności w -20°C. |
| Oksydaza glukozowa | Sigma | G2133-250KU | Część systemu oczyszczania tlenu. Jest to przechowywane w 4° C na okres do jednego roku. |
| GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Wolno hydrolizowalny analog GTP stosowany do polimeryzacji i stabilizacji mikrotubul poprzez zmniejszenie dynamicznej niestabilności i spontanicznego stężenia krytycznego dla zarodkowania mikrotubul w celu uzyskania stałej długości. Kupujemy zapas o pojemności 10 mM od Jena Biosciences i przechowujemy go w temperaturze -20° C na okres do jednego roku. |
| Element grzejny do mikroskopu | górny stopnia Okolab | Do eksperymentów obrazowych | |
| Imidizol | Sigma | I2399 | Służy do elucji białka MAP65 z kulek niklu w celu oczyszczenia MAP65 |
| Kimwipes | Fisher | 34155 | Do czyszczenia i przeciągania roztworów przez komory doświadczalne. |
| KOH | Sigma | P250-500 | 1 M w ddH2O, świeży, aby zapobiec zakwaszeniu w miarę upływu czasu. |
| Ciekły azot Airgas | NI 230LT22 | Do upuszczania podwielokrotności zamrażania. Może być również używany do przechowywania (niezalecane) | |
| Białko MAP65 | Ram Dixit | Białko związane z mikrotubulami (MAP) o masie cząsteczkowej 65 kD, które jest antyrównoległym środkiem sieciującym mikrotubule. Oczyściliśmy nieznakowaną i znakowaną GFP wersję MAP65-1 z Arabidopsis thaliana. Mieszamy GFP-MAP65 z nieznakowanym MAP65 tak, że 10% białka jest znakowane. Zapas roboczy to 10,8 μ Rozwiązanie M. To roztwór roboczy jest przechowywany w 4° C i przerabiane na świeżo co tydzień. Protokół oczyszczania MAP65 i GFP-MAP65 jest podany w naszym poprzednim rozdziale dotyczącym metod (26). | |
| MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Składnik buforu tubuliny |
| Koraliki NTA-Nikiel | Qiagen | 30210 | Koraliki wymagane do oczyszczenia 6xHis oznaczone białka MAP65 |
| Optomicroscan | Nikon | 405 nm, który może skupić laser w dowolnym pożądanym kształcie obszaru zainteresowania | |
| PEM80 | Obojętny bufor bazowy do polimeryzacji tubuliny do roztworu wykonanego z 80 mM K-PIPES, pH 6,8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, przechowywany w temperaturze 4& C na okres do jednego roku. | ||
| Trwała taśma dwustronna | 3M - Scotch | 34-8724-5691-7 | Do komór doświadczalnych |
| szalka Petriego | Fisher | FB0875713 | Do komory wilgotnej |
| RURY | Sigma | P7643-100G | Bufor tubulinowy składnik bazowy |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | Kopolimer blokowy z dwoma hydrofilowymi blokami tlenku etylenu (PEO) na końcach i hydrofobowym blokiem środkowym z hydrofobowej powłoki powierzchniowej tlenku fenylenu (PPO), którego używamy, aby zapobiec wiązaniu się białek z powierzchnią. Pluronic-F127 jest kupowany w postaci proszku (Sigma) i rozpuszczany do 5% (w/v) roztworu w ddH2O na noc. Po rozpuszczeniu roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do jednego roku. |
| Glikol polietylenowy | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | Środek tłumiący stosowany do tworzenia sił zubożających, które wynoszą taktoidy na powierzchnię i pomagają organizować mikrotubule. Tworzymy 5% (w/v) roztwór 100 kDa PEG w PEM80. Roztwór jest przechowywany w 4° C przez okres do jednego roku i umieszczony na bujaku przed użyciem. Jest lepki, dlatego do pracy z nim zalecamy użycie pipety wyporowej. |
| Pipeta wyporowa | Eppendorf | Do pipetowania lepkich cieczy | |
| Stojaki na szkiełka nakrywkowe | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72240 | Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbka szkieł nakrywkowych |
| Lodówka 4° C | Fisherbrand | Do przechowywania odczynników | |
| Cytoszkielet | znakowany tubuliną | TL590M | liofilizowana tubulina znakowana rodaminą z mózgu świni jest kupowana (cytoszkielet) i przechowywana w temperaturze -80° C do momentu uwodnienia w PEM80 i stosowania przez okres do jednego roku. |
| Białko tubuliny | Cytoszkielet | T240 | liofilizowana tubulina 99% czysta, nieznakowana z mózgu świni jest kupowana (cytoszkielet) i przechowywana w -80° C do momentu uwodnienia w PEM80 i stosowania przez okres do jednego roku. |
| UV-Ozone | Jelight | Model 342 | Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbki szkieł nakrywkowych |
| Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | wtyczka do rejestracji danych szeregów czasowych w celu usunięcia dryfu |
| Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | wtyczka do rejestracji danych szeregów czasowych w celu usunięcia dryfu |
Bibliografia
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).
- Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. Oocyte meiotic spindle assembly and function. Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).
- Brugués, J., Needleman, D. Physical basis of spindle self-organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).
- Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles. Cell. 149 (3), 554-564 (2012).
- Gatlin, J. C., et al. Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules. Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).
- Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle. Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).
- Inoue, S., Sato, H. Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules. Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).
- Allenspach, A. L., Roth, L. E. Structural variations during mitosis in the chick embryo. Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).
- Theg, D. E. Cytoplasmic microtubules in different animal cells. Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).
- Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare. Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).
- Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. Principles of Condensed Matter Physics. , Cambridge University Press. (1995).
- Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines. Biophysical Journal. 101 (1), 205(2011).
- Needleman, D. J., et al. Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).
- Ross, J. L., Fygenson, D. K. Mobility of taxol in microtubule bundles. Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).
- Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. Cilia-like beating of active microtubule bundles. Science. 333 (6041), 456-459 (2011).
- Brandt, R., Lee, G. Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).
- Hirokawa, N. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173(1989).
- MacRae, T. H. Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).
- She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly. Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).
- Walczak, C. E., Shaw, S. L. A MAP for Bundling Microtubules. Cell. 142 (3), 364-367 (2010).
- Edozie, B., et al. Self-organization of spindle-like microtubule structures. Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).
- Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling. Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).
- Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).
- Scheff, D. R., et al. Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments. Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).
- Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).
- Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).
- Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. Crowder and surface effects on self-organization of microtubules. Physical Review E. 103 (6), 062408(2021).
- Stanhope, K. T., Ross, J. L. Microtubules, MAPs, and motor patterns. Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).
- Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons. , Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg (2022).
- Lantzsch, I., et al. Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans. eLife. 10, 58903(2021).
- Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60. Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).
- Pecqueur, L., et al. A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).
- Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
- Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP. Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).
- McNally, F. J., Vale, R. D. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell. 75 (3), 419-429 (1993).
Przedruki i uprawnienia
