Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63953

⸱

24 maja 2022

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

W tym artykule

Podsumowanie

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Streszczenie

Obecny protokół opisuje użycie cząsteczek lentiwirusowych do dostarczania krótkich RNA (shRNA) zarówno do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), jak i nerwowych komórek progenitorowych (NPC) pochodzących z hESC z wysoką wydajnością. Cząsteczki lentiwirusa zostały wygenerowane przez kotransfekcję komórek HEK293T przy użyciu wektorów wejściowych (przenoszących shRNA) wraz z plazmidami pakującymi (pAX i pMD2.G) przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleneniminy (PEI). Cząstki wirusa zagęszczono za pomocą ultrawirowania, w wyniku czego uzyskano średnie miana powyżej 5 x 107. Zarówno hESC, jak i NPC mogą być zakażone z dużą skutecznością przy użyciu tych cząstek lentiwirusowych, jak wykazano na podstawie selekcji puromycyny i stabilnej ekspresji w hESC, a także przejściowej ekspresji GFP w NPC. Co więcej, analiza western blot wykazała znaczne zmniejszenie ekspresji genów, na które ukierunkowane są shRNA. Ponadto komórki zachowały swoją pluripotencję, a także potencjał różnicowania, o czym świadczy ich późniejsze różnicowanie w różne linie OUN. Obecny protokół dotyczy dostarczania shRNA; jednak to samo podejście można zastosować do ektopowej ekspresji cDNA do badań nadekspresji.

Wprowadzenie

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) pochodzące z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty są pluripotencjalne i mogą być różnicowane na różne typy komórek w zależności od czynników zewnętrznych w warunkach in vitro1,2. Aby w pełni wykorzystać potencjał hESC, konieczne jest dysponowanie szybkimi i niezawodnymi metodami dostarczania genów do tych komórek. Konwencjonalnie stosowane techniki można ogólnie podzielić na dwa typy: niewirusowe i wirusowe systemy dostarczania genów3,4. Częściej stosowanymi niewirusowymi systemami dostarczania genów są lipofekcja, elektroporacja i nukleofekcja. Niewirusowe systemy dostarczania są korzystne ze względu na mniejszą liczbę mutacji insercyjnych i ogólny spadek immunogenności5,6. Jednak metody te skutkują niską wydajnością transfekcji i krótkim czasem trwania przejściowej ekspresji genów, co jest głównym ograniczeniem dla długoterminowych badań różnicowania7. Elektroporacja skutkuje lepszą wydajnością transfekcji w porównaniu z lipofekcją; Powoduje to jednak ponad 50% śmierć komórki8,9,10. Korzystając z nukleofekcji, przeżycie komórek i wydajność transfekcji można poprawić, łącząc lipofekcję i elektroporację, ale podejście to wymaga specyficznych dla komórek i specjalistycznego sprzętu, a zatem staje się dość kosztowne dla zastosowań na większą skalę11,12.

W przeciwieństwie do tego, wektory wirusowe wykazały zwiększoną skuteczność transfekcji, jak również ogólnie niską cytotoksyczność po transdukcji. Ponadto dostarczone geny ulegają stabilnej ekspresji, co sprawia, że metoda ta jest idealna do długoterminowych badań13. Do najczęściej stosowanych wektorów wirusowych do dostarczania genów do hESC należą wektory lentiwirusowe (LVS), które mogą zapewnić ponad 80% skuteczność transdukcji przy użyciu cząstek wirusa o wysokim mianie14,15. Lipofekcja i wytrącanie CaPO4 są jednymi z najczęściej stosowanych metod przejściowej transfekcji komórek HEK293T lub ich pochodnych za pomocą wektorów transferu genów wraz z plazmidami pakującymi w celu uzyskania cząstek lentiwirusowych16. Chociaż lipofekcja skutkuje dobrą wydajnością transfekcji i niską cytotoksycznością, technika ta jest utrudniona ze względu na jej koszt, a skalowanie w celu uzyskania cząstek lentiwirusa o wysokim mianie byłoby bardzo kosztowne. Wytrącanie CaPO4 skutkuje stosunkowo podobną wydajnością transfekcji do tych uzyskiwanych przy użyciu lipofekcji. Chociaż jest to opłacalne, wytrącanie CaPO4 powoduje znaczną śmierć komórek po transfekcji, co utrudnia standaryzację i unikanie różnic między partiami17. W tym scenariuszu opracowanie metody, która zapewnia wysoką wydajność transfekcji, niską cytotoksyczność i opłacalność, ma kluczowe znaczenie dla produkcji cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie, które mają być stosowane w hESC.

Polietylenina (PEI) to kationowy polimer, który może transfekować HEK293T komórki z wysoką wydajnością bez dużej cytotoksyczności i ma znikomy koszt w porównaniu do metod opartych na lipofekcji18. W tej sytuacji PEI może być stosowany do zastosowań na większą skalę w produkcji LVS o wysokim mianie poprzez zagęszczanie cząstek lentiwirusa z supernatantów hodowlanych przy użyciu różnych technik. W prezentowanym artykule opisano zastosowanie PEI do transfekcji komórek HEK293T oraz zagęszczenia wektora lentiwirusowego za pomocą ultrawirowania przez poduszkę sacharozową. Stosując tę metodę, regularnie uzyskujemy miana znacznie powyżej 5 x 107 j.m./ml z niskimi wahaniami między partiami. Metoda jest prosta, nieskomplikowana i opłacalna w przypadku zastosowań na dużą skalę w zakresie dostarczania genów do komórek hESC i komórek pochodzących z hESC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transfekcja komórek HEK293T przy użyciu odczynnika PEI lub Lipofectamine 3000

  1. Hodowla komórek HEK293T w DMEM + 10% FBS + 1x penicylina/streptomycyna w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z atmosferą 5%CO2 i 21%O2 aż do 90% zlewania się przed wysiewem do transfekcji. Do produkcji wirusa o wysokim mianie należy używać stosunkowo niskiej liczby komórek (najlepiej mniej niż P30).
  2. Wysiewaj 4 x 106 komórek w 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej na 100 mm płytce do hodowli tkankowej i hoduj przez noc w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .
  3. Dla każdej transfekcji rozcieńczyć plazmidowe DNA (zapasy 1 mg / ml) w 1 ml pożywki DMEM wolnej od surowicy w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, stosując następujący stosunek plazmidów wejściowych i pakujących:
    Wektor wejściowy = 10 μg
    psPAX2.0 = 7.5 μg
    pMD2.G = 5 μg
  4. Wiruj przez 10 s i wiruj probówkę przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, aby zebrać.
  5. Dodać 70 μl (1 mg/ml roztworu podstawowego) PEI do probówki, a następnie krótko wirować i wirować, jak opisano powyżej, aby zebrać. Objętość użytego PEI opiera się na stosunku 1:3 całkowitego DNA (μg):P EI (μg).
  6. W przypadku transfekcji na bazie lipofektaminy rozcieńczyć powyższe wektory w 500 μl pożywki DMEM bez surowicy zawierającej 45 μl odczynnika P dostarczonej w zestawie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  7. Rozcieńczyć 70 μl odczynnika L dostarczonego w zestawie przy użyciu 500 μl pożywki DMEM bez surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  8. Połączyć zawartość obu probówek i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić tworzenie się kompleksu.
  9. Dodać kroplami 1 ml kompleksu DNA/PEI lub 1 ml kompleksu DNA/lipofektamina do płytki zawierającej komórki i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5%CO2 i 21%O2.
  10. Po 6 godzinach należy zmienić na świeżą, kompletną pożywkę wzrostową (10 ml) i zawrócić komórki z powrotem do wilgotnego inkubatora w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .

2. Pobieranie LVS i ultrawirowanie

  1. Po 2 dniach od transfekcji zebrać pożywkę zawierającą wirusa i ponownie nałożyć na komórki 10 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.
  2. Po 3 dniach od transfekcji należy zebrać pożywkę zawierającą wirusa i połączyć ją z pożywką zawierającą wirusa zebraną w ciągu 2 dni.
  3. Odwirować supernatant wirusa przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia szczątków komórkowych.
  4. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra o wielkości porów 0,45 μm o niskim stopniu wiązania białek (PES lub SFCA) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do ultrawirowania. Przefiltrowany supernatant zawierający cząstki lentiwirusa może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 5 dni bez znaczącej utraty miana wirusa.
  5. Wysterylizuj probówki ultrawirówkowe zawierające kubki, myjąc je 70% etanolem przez 10 minut, wysusz na powietrzu, zamknij i utrzymuj w temperaturze 4 °C.
  6. Dodać 36 ml przefiltrowanej pożywki zawierającej cząstki lentiwirusa do sterylnej probówki ultrawirówkowej.
  7. Napełnij 5 ml sterylnej pasiaszki 4 ml sterylnego 20% roztworu sacharozy (przygotowanego w PBS) i dozuj go bezpośrednio na dno probówki ultrawirówki (UC) zawierającej LVS. Ważne jest, aby roztwór sacharozy nie mieszał się z pożywką i tworzył gradient na dnie probówki.
  8. Zrównoważyć wszystkie probówki ultrawirówkowe za pomocą pożywki DMEM bez surowicy, umieścić w zimnych kubkach na probówkę ultrawirówki i zamknąć pokrywki.
  9. Wirować probówki w temperaturze 125 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  10. Po odwirowaniu ostrożnie wyrzucić supernatant, odwracając zawartość probówki w pojemniku zawierającym wybielacz, nie naruszając osadu. Zaznacz granulkę, jeśli jest widoczna.
  11. Umieść probówkę ultrawirówki w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 200 μl sterylnego DPBS dokładnie na wierzchu osadu. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc w spokoju.
  12. Następnego dnia delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 40 razy.
  13. Krótko odwiruj z prędkością 13 000 x g w wirówce stołowej, aby rozdrobnić wszelkie zanieczyszczenia.
  14. Przenieść supernatant do nowej probówki i podzielić preparat wirusa na porcje 20 μl. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  15. Odstawić 5 μL preparatu do pomiaru miana wirusa.

3. Pomiar miana LVS dla wektorów opartych na pLKO.1

  1. Określić miano cząstek lentiwirusa za pomocą qPCR zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Dla krzywej wzorcowej należy przygotować pięć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń wzorcowego kontrolnego DNA (dostarczonego w zestawie), rozcieńczając 5 μl DNA do 45 μl H2O w każdym etapie. Użyj rozcieńczeń od 1:100 do 1:100 000, aby wygenerować krzywą standardową.
  3. Ustaw reakcje na lodzie w dwóch egzemplarzach w następujący sposób:
    2x qPCR master mix 10 μL
    Mieszanka gruntująca 2 μL
    Próbka lub wzorcowy DNA 2 μL
    Nie zawiera nukleazH2O, 6 μL
  4. Wykonuj qPCR w warunkach cyklicznych wymienionych w instrukcji zestawu, w sumie 35 cykli.
  5. Wykreśl wartości progowe cyklu (Ct) na osi Y w porównaniu z mianem wirusa na osi X.
  6. Wygeneruj regresję logarytmiczną przy użyciu czterech standardowych kontrolnych rozcieńczeń DNA (1:100 do 1:100 000), aby określić miano nieznanej próbki wirusa za pomocą równania linii trendu.

4. Pomiar miana LVS dla wektorów opartych na pll3.7

  1. Wysiewać 1 x 105 HEK293T komórek w każdym dołku płytki dołowej P12 w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej 24 godziny przed infekcjami.
  2. Uzupełnij pożywkę 8 μg/ml polibrenu i dodaj 1 ml do każdej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Rozcieńczyć cząsteczki wirusa za pomocą 4 μl, 2 μl, 1 μl, 0,5 μl i 0,1 μl skoncentrowanych cząstek lentiwirusowych w każdym z 1 ml pożywki zawierającej polibren.
  4. Zastąpić pożywkę z komórek HEK293T pożywką zawierającą wskazane ilości cząstek lentiwirusa wraz z 8 μg/ml polibrenu i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o atmosferze 5%CO2 i 21%O2.
  5. Następnego dnia należy zmienić pożywkę na świeżą i kontynuować hodowlę przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .
  6. Po 72 godzinach przemyć komórki PBS, trypsynizować w temperaturze 37 °C zgodnie z protokołem producenta i ponownie zawiesić w 1 ml PBS.
  7. Wykonaj sortowanie komórek FACS za pomocą sortera komórek, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Ustaw bramkę na 0% komórek dodatnich GFP przy użyciu niezakażonych komórek HEK293T i policz 50 000 zdarzeń dla każdej próbki, aby określić procent komórek dodatnich dla każdego rozcieńczenia wirusa.
  8. Do obliczenia miana cząstek lentiwirusa należy używać tylko objętości cząstek lentiwirusa, które dają komórki %GFP dodatnie w zakresie 2%-20%.

5. Zakażenie hESC i stabilna selekcja

  1. Umyj komórki 2 ml PBS rosnące w każdym dołku 6-dołkowej płytki wielodołkowej do hodowli komórkowych.
  2. Odłączyć komórki od płytki do hodowli komórkowej za pomocą 1 ml 1x odczynnika do dysocjacji komórek przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  3. Zebrać komórki w pożywce DMEM/F12 i odwirować przy 1,500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu zebrania osadu komórkowego.
  4. Aspirat, ponownie zawiesić komórki w 1 ml i policzyć za pomocą hemocytometru.
  5. Wykonać zawiesinę komórkową z 2 x 105 komórek/ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej mTeSR1 uzupełnionej 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), penicyliny/streptomycyny (P / S) i inhibitora 10 μM ROCK (RI).
  6. Zasiać 1 x 105 komórek na 50-krotnie rozcieńczonych, kompletnych płytkach P24-dołkowych pokrytych matrycą błony podstawnej w 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej i wyhodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .
  7. Następnego dnia zakażone hESC przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 należy zainfekować polibrenem o stężeniu 8 μg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.
  8. Po 8 godzinach zastąp pożywkę zawierającą wirusa świeżą pożywką wzrostową (-RI) i kontynuuj hodowlę, aż komórki zlewają się w 90%.
  9. Rozpocznij selekcję puromycyny (0,8 μg/ml), gdy komórki osiągną 90% zbieżności, co zwykle ma miejsce 48-72 godziny po zakażeniu.
  10. Po zakończeniu selekcji (zwykle 4-6 dni) podziel stabilne komórki (1:4) i roznaż komórki w celu kriokonserwacji i dalszej analizy.

6. Transdukcja nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z H9 (NPC)

UWAGA: NPC zostały pozyskane z komórek H9 przy użyciu protokołu hamowania dual-Smad, jak opisano wcześniej19.

  1. Krótko mówiąc, potraktuj komórki H9 odczynnikiem dysocjacji komórek w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby wytworzyć pojedyncze komórki i ponownie zawiesić w kompletnych pożywkach wzrostowych zawierających mTeSR1 uzupełnione 10 ng / ml zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF), penicyliną / streptomycyną (P / S) i inhibitorem 10 μM ROCK (RI). Wysiew na rozcieńczonych 6-dołkowych szalkach do hodowli komórkowych pokrytych Matrigelem w stosunku 1:50 o gęstości 60 000 komórek/cm2 (dzień 0).
  2. Zainicjuj różnicowanie, gdy komórki osiągną 95%-100% konfluencji, zmieniając na 100% pożywkę KSR zawierającą LDN193189 (200 nM) i SB431542 (10 μM) (dzień1).
  3. W drugim dniu należy ponownie zmienić nośnik ze 100% KSR uzupełnionym o LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) i XAV939 (5 μM).
  4. W 4. dniu różnicowania należy przejść na mieszaninę pożywki KSR (75%) i pożywki N2 (25%) z LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) i XAV939 (5 μM).
  5. Od 6 do 12 dnia stopniowo zmieniaj pożywkę na 100% N2 uzupełnioną o LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) i XAV939 (5 μM), zwiększając pożywkę N2 o 25% każdego dnia i zmieniając pożywkę co 2 dni.
  6. Dzień hodowli 12 NPC w pożywce N2:B27 uzupełnionej 20 ng/mL bFGF.
  7. Zasiać 2 x 105 komórek w każdym dołku rozcieńczonej w stosunku 1:50, kompletnej płytki P6 pokrytej matrycą błony podstawnej w 2 ml pożywki hodowlanej NPC i inkubować, aby umożliwić komórkom przyczepienie się.
  8. Następnego dnia należy zainfekować komórki cząstkami lentiwirusa w MOI 6 w obecności 8 μg/ml polibrenu.
  9. Po 8 godzinach zastąp pożywkę zawierającą wirusa świeżą pożywką wzrostową NPC.
  10. Następnego dnia powtórz infekcje i zmień pożywkę po 8 godzinach.
  11. Trzymaj komórki w kulturze przez 72 godziny przed zbiorem w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po transferze genów niezbędna jest wysoka żywotność hESC. Mimo wysiłków i optymalizacji protokołów mających na celu zmniejszenie śmiertelności komórek po elektroporacji hESC, po tym zabiegu nadal obserwuje się śmierć ponad 50% komórek, co towarzyszy niskiej wydajności transfekcji20. Transfer genów za pośrednictwem lentiwirusów zapewnia nie tylko wysoką wydajność transferu, ale wykazuje również wysoki poziom żywotności komórek po transdukcji. Poniższe wyniki przedstawiają dwa podejścia: jedno z wyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdolność do genetycznej modyfikacji komórek macierzystych do celów badawczych lub klinicznych jest ograniczona zarówno technologią, jak i podstawową wiedzą na temat biologii hESC. Techniki, które wykazały znaczny potencjał w mysich ESC, takie jak lipofekcja i elektroporacja, nie są wysoce skuteczne w przypadku hESC, które są notorycznie trudne do dostarczenia genów konwencjonalnymi metodami20. Koncepcja ta doprowadziła nie tylko do optymalizacji istniejących technik, ale także do opracowania nowat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Uniwersytetu Zjednoczonych Emiratów Arabskich (UAEU), grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) i # 12R010 (grant UAEU-AUA). Dziękujemy prof. Randallowi Morse'owi (Wadsworth Center, Albany, NY) za pomoc w redagowaniu manuskryptu pod względem stylu i gramatyki.

Wszystkie dane są dostępne na żądanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolInvitrogen31350010
38,5 ml, sterylne + certyfikowane bezpłatne cienkościenne ultraprzezroczyste probówki z otwartym topemBeckman CoulterC14292
AccutaseStem Cell Technologies7920
bFGF Rekombinowany ludzkiInvitrogenPHG0261
albumina surowicy bydlęcej FRAC VInvitrogen15260037
Corning Matrigel Podstawna membrana macierzynna, wolna od LDEVCorning354234
CyclopamineStem Cell Technologies72074
Pożywka DMEMInvitrogen11995073
DMEM Mieszanka składników odżywczych F12 Invitrogen11320033
DPBS bez: Ca i MgPAN BiotechP04-36500
Surowica do życia płoduInvitrogen10270106
GAPDH (14C10) Przeciwciało mAb królikaCST2118S
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekTechnologie komórek macierzystych7174
Hyklon Aminokwasy endogenne (NEAA) 100X RoztwórGE healthcareSH30238.01
L Glutamina, 100X Invitrogen2924190090
L2HGDH Przeciwciało poliklonalneProteintech15707-1-AP
L2HGDH shRNAMacrogenSeq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kitThermo FisherL3000001
mTesR1 kompletne podłożeStem Cell Technologies85850
Pożywka neuropodstawowa 1X CTSSuplement InvitrogenA1371201
Neuropan 2 100xPAN BiotechP07-11050
Suplement Neuropan 27 50xPAN BiotechP07-07200
Penicylina streptomycyna SOLInvitrogen15140122
pLKO.1 Wektor TRCAddgene10878
pLL3.7 wektor Addgene11795
pMD2.GAddgene12259
Odczynnik do infekcji polibrenemSigmaTR1003- G
Polietyleninina, rozgałęzionaSigma408727
psPAX2.0Addgene12260
PurmorphamineTocris4551/10
PuromycinInvitrogen
Inhibitor ROCK Y-27632
dichlorowodorek 		Tocris1254
SB 431542Tocris1614/10
Trypsyna .05% EDTA Invitrogen25300062
XAV 939Tocris3748/10
A1113802

Bibliografia

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
  4. Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105(2008).
  5. Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
  6. Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
  7. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  8. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
  9. Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
  10. Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
  12. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
  13. Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
  14. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  15. Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
  16. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991(2021).
  17. Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017(2016).
  18. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  19. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415(2017).
  20. Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
  21. Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
  22. Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
  23. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dostarczanie lentiwirusowetransfekcja shRNAludzkie embrionalne komórki macierzystekomórki progenitorowe neuronówtransfekcja polietylenoiminąkomórki HEK293Tultrawirowaniekoncentracja cząstek wirusowychWestern blotekspresja GFP
Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.