Artykuł metodologiczny

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63968

⸱

12 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Centre for Mechanochemical Cell Biology and Division of Biomedical Sciences, Warwick Medical School, University of Warwick, 2National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Powierzchnia żywej komórki stanowi wszechstronną platformę aktywną dla licznych procesów komórkowych, które powstają w wyniku interakcji błony plazmatycznej z leżącą poniżej korą aktyny. W ciągu ostatnich dziesięcioleci odtworzone, minimalne systemy oparte na wspieranych dwuwarstwach lipidowych w połączeniu z sieciami włókien aktynowych okazały się bardzo pomocne w odkrywaniu podstawowych mechanizmów i konsekwencji sieci aktynowych na uwięzi błonowej, a także w badaniu funkcji poszczególnych białek związanych z błoną. W tym miejscu opisujemy, jak odtworzyć takie aktywne układy kompozytowe in vitro, które składają się z dwuwarstwowych warstw lipidowych połączonych za pomocą białek wiążących aktynę związanych z błoną z dynamicznymi włóknami aktyny i silnikami miozyny, które można łatwo zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Konstrukcja z otwartą komorą pozwala na montaż systemu krok po kroku i systematyczną kontrolę wielu parametrów, takich jak stężenie białka łącznikowego, stężenie aktyny, długość filamentu aktyny, stosunek aktyny do miozyny, a także poziom ATP. Na koniec omówimy, jak kontrolować jakość systemu, jak wykrywać i rozwiązywać często występujące problemy oraz niektóre ograniczenia tego systemu w porównaniu z powierzchnią żywej komórki.

Wprowadzenie

Błona plazmatyczna żywej komórki zwierzęcej nieustannie oddziałuje z przylegającym do niej cytoszkieletem aktynowym, tworząc wspólnie aktywny materiał kompozytowy, który realizuje szereg funkcji komórkowych1,2. Aby badać procesy zachodzące na tym interfejsie błony lipidowej i aktyny, bardzo pomocna okazała się rekonstrukcja sieci cytoszkieletu na powierzchni wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLB). To podejście oparte na systemie minimalnym pozwala na precyzyjną kontrolę składników sieci cytoszkieletu oraz składu lipidów. W porównaniu do wolnostojących błon lipidowych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych, płaska geometria SLB umożliwia efektywne wykorzystanie najnowocześniejszych technik mikroskopowych, takich jak super-rozdzielczość3,4, fluorescencja z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF)5,6,7 lub mikroskopia rozproszeniowa interferometryczna8, w celu badania organizacji przestrzennej i dynamiki sieci cytoszkieletu. TIRF zapewnia najwyższy kontrast dla komponentów znakowanych fluorescencyjnie, ponieważ sygnał z niezwiązanych cząsteczek znakowanych w roztworze, które przyczyniają się do tła, jest minimalny.

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół tworzenia sieci akto-miozynowych przytwierdzonych do wspieranych dwuwarstw lipidowych, które są powszechnie stosowane w tej dziedzinie do badania fizyki aktywnych sieci quasi-2D9,10,11 oraz ich wpływu na organizację błony3,5,12,13,14,15,16 (Rycina 1). Podejście to nie ogranicza się do sieci opartych na aktynie, lecz może zostać łatwo dostosowane do badania mikrotubul, filamentów pośrednich lub sieci kompozytowych o mieszanej naturze, a także do analizy różnych oddziaływań między białkami błon lipidowych a komponentami cytoszkieletu przy użyciu metod mikroskopii czułej powierzchniowo.

Aby zachować przejrzystość niniejszego protokołu, pominięto szczegółowy opis oczyszczania i znakowania białek aktyny i miozyny oraz szczegóły dotyczące strojenia i kontrolowania kurczliwości oraz organizacji sieci aktynomiozynowych. Należy odwołać się do innych protokołów opublikowanych wraz z niniejszym w kolekcji metod JoVE: In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.

figure-introduction-1
Rycina 1: Schemat aktywnego układu kompozytowego aktyna-błona in vitro. Utworzono w programie Biorender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

1. Odczynniki i sprzęt

  1. Przygotować świeże bufory zgodnie z listą w Tabeli 1. Należy użyć ultraczystej wody dejonizowanej o rezystywności 18,2 MΩ·cm w 25 °C. Wszystkie bufory należy wysterylizować, przepuszczając je przez filtry 0,22 µm pod próżnią. Bufory stosowane w chromatografii kolumnowej należy odgazować.
  2. Oczyścić aktynę mięśni szkieletowych zgodnie z wcześniejszym opisem18,19. Do końcowego oczyszczonego roztworu G-aktyny dodać 20% glicerolu i przygotować alikwoty o objętości 500 µL (do znakowania lub eksperymentów masowych) oraz 10 µL (do poszczególnych eksperymentów). Alikwoty zamrozić gwałtownie poprzez zanurzenie probówek w ciekłym azocie na 30 s, a następnie przechowywać w −80 °C do 18 miesięcy.
    UWAGA: Alternatywnie można zakupić komercyjnie oczyszczoną aktynę lub proszek acetonowy.
  3. Znakować oczyszczoną G-aktynę mięśni szkieletowych dowolnymi fluorescencyjnymi barwnikami maleimidowymi zgodnie z wcześniejszym opisem5. Stężenie i stopień znakowania białka określić spektrofotometrycznie, stosując skorygowaną wartość A290nm dla aktyny (εactin = 26 600 M-1cm-1) oraz Aλmax barwnika. Przygotować alikwoty po 10 µL, zamrozić gwałtownie przez zanurzenie probówek w ciekłym azocie na 30 s i przechowywać w −80 °C do 18 miesięcy.
    UWAGA: Znakowanie za pomocą esterów NHS sprzęgających się z lizyną spowoduje powstanie niefunkcjonalnej aktyny i należy go unikać.
  4. Oczyścić miozynę II mięśni szkieletowych zgodnie z protokołem20. Przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE z użyciem 10% żelu poliakryloamidowego, a następnie barwienie Coomassie, aby określić stopień czystości białka21. Oczyszczoną miozynę II mięśni szkieletowych przechowywać w −20 °C w formie ciekłej w buforze do miozyny II z 50% glicerolem.
    UWAGA: Przechowywana miozyna II może być używana do 2 lat.
  5. Znakować oczyszczoną miozynę II dowolnymi fluorescencyjnymi barwnikami maleimidowymi zgodnie z wcześniejszym opisem5. Unikać znakowania motorów miozynowych barwnikami estrowymi NHS. Stężenie i stopień znakowania określić spektrofotometrycznie, stosując skorygowaną wartość A280nm dla miozyny II oraz Aλmax barwnika. Odzyskaną miozynę II (nieznakowaną lub znakowaną) przechowywać w 4 °C i zużyć w ciągu 6 tygodni.
  6. Oczyszczanie białka capping protein
    1. Pozyskać mysie białko capping protein zgodnie z wcześniejszym protokołem22. Przeprowadzić SDS-PAGE z użyciem 10% żelu poliakryloamidowego, a następnie barwienie Coomassie, aby określić stopień czystości białka. Stężenie zmierzyć, wykorzystując A280nm białka capping protein (εCP = 99 530 M-1cm-1).
    2. Do roztworu białka dodać 20% glicerolu i przygotować alikwoty po 5 µL w probówkach PCR 200 µL. Zanurzyć probówki w ciekłym azocie i przechowywać w −80 °C do 2 lat.
      UWAGA: Aktywność białka capping protein sprawdza się poprzez polimeryzację określonych ilości fluorescencyjnej G-aktyny w obecności różnych ilości białka capping protein. Następnie obrazuje się filamenty pod mikroskopem i ilościowo określa rozkład ich długości. Im wyższe względne stężenie białka capping protein, tym krótszy rozkład filamentów aktynowych. Patrz Köster et al.5.
  7. Wyekspresować fluorescencyjne białko łącznikowe membrana-aktyna, np. w tym protokole użyto 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE); ekspresować je w Escherichia Coli Bl21DE3* i oczyścić zgodnie z wcześniejszym opisem23. Stężenie białka określić spektrofotometrycznie.
  8. Przechowywać białko w małych alikwotach w buforze do chromatografii żelowej (lub innym odpowiednim buforze) z 20% glicerolem w −80 °C. W tych warunkach białko jest stabilne przez ponad 2 lata.
    UWAGA: Wybór białka łącznikowego aktyna-membrana oraz markera fluorescencyjnego zależy od rodzaju stawianego pytania badawczego. W ostatnich latach opracowano szeroką gamę strategii wiązania z lipidami, w tym białka z tagiem histydynowym24, system biotyna-streptawidyna25 oraz jednoniciowe DNA26.
  9. Przygotowanie pęcherzyków wielolamellarnych (MLVs)
    UWAGA: Schemat postępowania od MLVs do wspieranych dwuwarstw lipidowych przedstawiono na Rysunku 2.
    1. Umieścić 5-10 bursztynowych fiolek szklanych w szklance 200 mL. Napełnić szklankę 2% roztworem czyszczącym w ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia fiolek. Sonicować je w łaźni wodnej przez 30 min przy pełnym impulsie w 65 °C.
    2. Wyjąć fiolki z roztworu i dokładnie wypłukać wodą destylowaną. Umieścić fiolki w szklance zawierającej 2 N NaOH i sonicować przez 20 min. Na tym etapie ogrzewanie nie jest wymagane.
    3. Wyjąć fiolki z roztworu NaOH i dokładnie wypłukać wodą destylowaną. Suszyć fiolki w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza ustawionej na 65 °C przez 2 h lub dłużej.
    4. Przechowywać oczyszczone fiolki w czystej szklance zamkniętej przezroczystą folią do 6 tygodni.
      OSTROŻNIE: Poniższe kroki należy wykonywać w dygestorium chemicznym. Chloroformem i roztworami lipidów należy operować za pomocą szczelnych szklanych strzykawek Hamiltona, aby uniknąć zanieczyszczenia plastikiem.
    5. Wypłukać strzykawki Hamiltona i kilka bursztynowych fiolek szklanych wielokrotnie czystym chloroformem. Wyjąć proszek lipidowy przechowywany w ampułkach szklanych z zamrażarki −20 °C i dodać odpowiednie objętości chloroformu, aby rozpuścić proszki lipidowe do stężeń 10-25 mg/mL.
    6. Przenieść roztwór z ampułki do świeżo oczyszczonej bursztynowej fiolki szklanej i odpowiednio ją oznakować. Ten krok należy wykonywać w lodzie, aby ograniczyć odparowywanie chloroformu.
    7. Przygotować roztwór stokowy DOPC o stężeniu 10-25 mg/mL oraz DGS-NTA-Ni2+ o stężeniu 1-10 mg/mL.
    8. Aby przygotować roboczą mieszaninę lipidową, wziąć czystą fiolkę szklaną i wypłukać ją 2x chloroformem. Dodać do fiolki 300 µL czystego chloroformu, aby służył on jako baza do lepszego mieszania składników. Nie wpłynie to na końcowe stężenia lipidów, ponieważ cały chloroform zostanie odparowany w następnych krokach.
    9. Dodać do fiolki odmierzone objętości stokowych roztworów lipidów, aby przygotować żądane robocze mieszaniny lipidowe. Docelowe stężenie lipidów w buforze do rehydratacji lipidów wynosi 4 mM. Osuszyć mieszaninę lipidową pod powolnym strumieniem gazu N2 w dygestorium chemicznym w temperaturze pokojowej. Krok ten może trwać do 30 min dla każdej fiolki.
    10. Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalnika poddać film lipidowy suszeniu w eksykatorem próżniowym przez >2 h w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu. Resuspender osuszony miks lipidowy w buforze do rehydratacji lipidów do końcowego stężenia lipidów 4 mM.
    11. Inkubować przez 5-10 min, aby umożliwić rehydratację lipidów. Wymieszać roztwór lipidowy w vortexie przez około 30 s w celu utworzenia MLVs.
    12. Przygotować alikwoty MLVs o objętości 0,5-1 mL w probówkach do mikrocentryfugi 1,5 mL. Zanurzyć probówki w ciekłym azocie, zamknąć przezroczystą folią i przechowywać w −20 °C (do 6 tygodni).
      UWAGA: Stężenia stokowe lipidów dobrano tak, aby objętości były wystarczająco duże dla niezawodnego pipetowania strzykawkami Hamiltona. Jeśli objętości niezbędne do przygotowania stoku są zbyt duże, by rozpuścić wysuszony proszek lipidowy, należy wykonać wielokrotne rozcieńczenia stoku, aby zapewnić powtarzalne mieszanie różnych lipidów.
  10. Przygotowanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUVs)
    1. Wyjąć alikwot MLVs z przechowywania w −20°C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Zamrozić gwałtownie pęcherzyki, zanurzając probówkę do mikrocentryfugi w ciekłym azocie na 15-30 s, a następnie natychmiast umieścić ją w łaźni wodnej ustawionej na 45 °C, aż roztwór całkowicie się rozmrozi (1-2 min). Powtórzyć powyższy cykl zamrażania i rozmrażania 10x-15x, aż roztwór stanie się mniej mętny.
      UWAGA: Temperaturę łaźni wodnej należy ustawić powyżej temperatury przejścia mieszaniny lipidowej poddawanej rozmrażaniu, aby umożliwić jednorodne mieszanie lipidów.
    2. Urównoważyć mini-ekstruder strzykawkowy wyposażony w poliwęglanową membranę filtracyjną o rozmiarze porów 80 nm za pomocą buforu do rehydratacji SUVs. Upewnić się, że w systemie nie ma wycieków ani pęcherzyków powietrza. Chociaż metoda ekstruzji pozwala uzyskać monodyspersyjne SUVs przy minimalnym uszkodzeniu lipidów, mieszaniny lipidowe o ładunku ujemnym mogą przylegać do membrany poliwęglanowej.
    3. Ostrożnie przepuścić rozmrożony roztwór lipidowy przez uprzednio urównoważony ekstruder z jednej strony na drugą, a następnie z powrotem. Powtórzyć cykl 5x-10x, aż roztwór lipidowy stanie się wyraźnie przejrzysty, co wskazuje na utworzenie SUVs o średnicy ok. 100 nm.
    4. Odwirować wyekstruhowaną zawiesinę (lub poddać roztwór sonikacji końcówką; patrz uwaga poniżej) przy 15 000 x g przez 60 min w 4 °C, aby wytrącić resztki lipidowe w osadzie. Zebrać górne 80% roztworu, nie naruszając osadu i nie tworząc pęcherzyków. Przenieść nadosad zawierający SUVs do nowej probówki do mikrocentryfugi i przechowywać w lodzie do 6 dni.
      UWAGA: Alternatywą dla wirowania jest sonikacja końcówkowa wykonana w następujący sposób: Włączyć sonikator z mikrokońcówką i ustawić następujące parametry: Amplituda = 30% maksimum, czas włączenia (ON) = 10 s, czas wyłączenia (OFF) = 60 s. Oczyścić końcówkę mikrosonikatora wodą dejonizowaną, a następnie 2 N NaOH, chloroformem i ponownie wodą dejonizowaną. Zanurzyć końcówkę sonikatora w każdym z tych roztworów i sonicować przez 1-2 cykle przy użyciu powyższych ustawień. Zanurzyć czystą końcówkę w roztworze pęcherzyków po cyklach zamrażania-rozmrażania i sonicować przez 3-6 cykli w lodzie, aż roztwór stanie się przejrzysty.
    5. Po wirowaniu sprawdzić, czy nie występują oznaki wysokiej degradacji lipidów lub nieudanej ekstruzji, takie jak powstanie cienkiego, białkawego filmu i/lub wyraźnie widocznego osadu. W takich przypadkach nie kontynuować pracy i powtórzyć etapy przygotowania SUVs.
      UWAGA: Okres trwałości SUVs może być różny dla różnych mieszanin lipidowych. SUVs wykonane z DOPC: DGS-NTA-Ni2+ są stabilne do 6 dni na potrzeby tych eksperymentów. Wskazówki dotyczące rozwiązywania typowych problemów znajdują się w Tabeli 2.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat przedstawiający przebieg procesu od przygotowania pęcherzyków wielolamellarnych i małych pęcherzyków jednolamellarnych po tworzenie wspomaganych lipidowych dwuwarstw. Utworzono w programie Biorender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Rekonstytucja sieci aktynowych przymocowanych do błony

  1. Przygotowanie komór pomiarowych
    1. Należy pobrać 3–5 prostokątnych szkiełek nakrywkowych i umieścić je w naczyniu Coplina. Włączyć myjkę ultradźwiękową i ustawić temperaturę na 65 °CNapełnić naczynie Coplina 2% roztworem czyszczącym tak, aby całkowicie zakryć szkiełka nakrywkowe, a następnie umieścić je w myjce ultradźwiękowej na 30 min w trybie pełnego impulsu.
    2. Za pomocą tępych pęset z powłoką PTFE należy pojedynczo wyjmować szkiełka nakrywkowe z naczynia. Następnie należy je dokładnie wypłukać wodą destylowaną i umieścić w innym naczyniu Coplina wypełnionym 2 N NaOH.
    3. Poddaj szkiełka podstawowe sonikacji przez 20 min w pełnym trybie impulsowym. Wyjmuj szkiełka pojedynczo, dokładnie płucz je wodą destylowaną i umieszczaj w innym słoiku Coplina wypełnionym wodą destylowaną.
      UWAGA: Opcjonalnie można poddać szkiełka przykrywki sonikacji w wodzie destylowanej przez 20 min, a następnie ponownie opłukać je wodą destylowaną.
    4. Bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu, należy przenieść słoik z szkiełkami nakrywkowymi do dygestorium wyposażonego w N2 zasilanie gazem
    5. Zoptymalizuj ciśnienie powietrza w N2 strumień gazu metodą prób i błędów w taki sposób, aby był on wystarczający do usunięcia wody z powierzchni szkiełka podstawowego, ale nie na tyle silny, by je stłuc. Wyreguluj przepływ N2 gaz równolegle do płaszczyzny szkiełka nakrywki, aby zmniejszyć ryzyko jego pęknięcia.
    6. Za pomocą rękawiczek i pęsety wyjmować po kolei szkiełka nakrywkowe ze słoika, aby osuszyć je pod N2 strumienia. Osuszyć obie strony każdego szkiełka zakryjącego i umieścić je w czystej plastikowej kasecie z pokrywą. Pojemnik ze szkiełkami zakrywającymi umieścić w eksyكاتهm, aby uniknąć kontaktu z cząsteczkami kurzu znajdującymi się w powietrzu.
      UWAGA: N2Wysuszone szkiełka nakrywkowe można przechowywać w eksykatorze, w którym zachowują one właściwości hydrofilowe przez maksymalnie 2 dni. Strategia ta może być przydatna w sytuacjach, gdy do eksperymentu wymagane są liczne dwuwarstwy lub gdy eksperyment trwa dłużej niż 8 h.
    7. Należy wziąć autoklawowane probówki do PCR i odciąć ich nakrętki oraz dolne stożkowate części za pomocą ostrego skalpela chirurgicznego. Następnie należy brać pojedynczo przecięte w połowie cylindryczne probówki, nakładać klej utwardzany promieniami UV na gładką krawędź każdej z nich i umieszczać je odwrócone na świeżo oczyszczonym szkiełku nakrywce w taki sposób, aby krawędź przylegała płasko do szkiełka.
    8. Po umieszczeniu cylindra na szkiełku nakrywkowym nie należy przesuwać go bocznie, aby zapobiec rozlaniu się kleju do przestrzeni centralnej komory. Prostokątne szkiełka nakrywkowe mogą pomieścić do trzech komór reakcyjnych, natomiast szkiełka okrągłe mogą pomieścić tylko jedną, umieszczoną w centrum (Rycina 1).
    9. Umieść szkiełka nakrywkowe z komorami w oczyszczaczu UV-ozonowym z O2 dostarczyć i odessać (lub użyć iluminatora UV). Włączyć światło UV i naświetlać przez 3–5 min, aby umożliwić polimeryzację adhezywu. Zastosować dłuższe naświetlanie (10–15 min), aby zwiększyć hydrofilowość szkiełka podstawowego, a tym samym poprawić jakość dwuwarstwy lipidowej.
    10. Suche komory z próbkami naświetlanymi promieniami UV należy przechowywać do 8 h w małych plastikowych pudełkach (np. w pustych prostokątnych pudełkach na szkiełka nakrywkowe) owiniętych folią przezroczystą, aby ograniczyć kontakt z cząsteczkami kurzu w powietrzu.
      UWAGA: Stały strumień O22 w obecności światła UV powstaje ozon oraz rodniki tlenowe, które mogą usunąć zanieczyszczenia organiczne z powierzchni szkiełka podstawowego. Próżnia zapobiegnie wyciekowi toksycznego ozonu powstającego podczas tego procesu.
    11. Wyjmij szkiełka nakrywkowe i sprawdź szczelność komór, napełniając je wodą destylowaną. Pojemność każdej komory wynosi do ~150 µL próbki. Nieszczelne komory należy odrzucić.
      UWAGA: Inną skuteczną i bezpieczną opcją czyszczenia jest cleaner plazmowy. Ustawienia czasu i mocy zależą od modelu, jednak należy uważać, aby nie poddać szkiełek przedmiotowych nadmiernej obróbce plazmą, ponieważ doprowadzi to do zmniejszenia mobilności lipidów. Obróbka powierzchniowa może wpływać na mobilność lipidów.27, co zaobserwowano podczas przedłużonego traktowania roztworem czyszczącym (>45 min) lub NaOH (>30 min).
  2. Przygotowanie wspieranych dwuwarstw lipidowych
    1. Przemyj każdą komorę buforem do formowania SLB (lub 1x PBS), aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia powierzchniowe, pozostawiając 100 µL buforu na końcu. Zaznaczyć poziom buforu na 100 µL markerem permanentnym, aby w sposób powtarzalny śledzić zmiany objętości.
    2. Dodaj 2 µL 0,1 M CaCl22 do komory. Poprawia to adsorpcję pęcherzyków do powierzchni szkła, co usprawnia tworzenie dwuwarstwy w kolejnym kroku. Dodać 8 µL roztworu SUV (z kroku 1.10) do każdej komory i inkubować przez 15 min w temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Objętość dodawanej mieszaniny SUV można oszacować, obliczając całkowitą liczbę lipidów (przy średniej powierzchni 0,72 nm2) niezbędne do całkowitego pokrycia odsłoniętej powierzchni hydrofilowej dołka dwiema warstwami lipidowymi.
    3. Wypłucz niezwiązane pęcherzyki buforem do mobilności aktyny (1x KMEH). Najpierw usuń 50 µL buforu do tworzenia SLB, pozostawiając jedynie 50 µL w komorze próbkowej. Po drugie, należy dodać 100 µL dodaj 1x KMEH do komory. Delikatnie wymieszaj, a następnie usuń 100 µL buforu, nie dotykając dna.
      UWAGA: Podczas płukania należy zachować ostrożność. Należy upewnić się, że końcówka pipety nie dotyka dna komory. Pipetę należy trzymać pod kątem tak, aby strumień buforu był skierowany na ściankę komory, a nie bezpośrednio na dwuwarstwę, ponieważ bezpośredni strumień może doprowadzić do jej rozpadu. Należy uważać, aby podczas pipetowania nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, gdyż mogą one dotrzeć do lipidowej dwuwarstwy i spowodować w niej defekty.
    4. Powtórz płukanie 10-krotnie, dodając 100 µL 1x KMEH i usunięcia 100 µL.
    5. Dodaj 10 µL o stężeniu 1 mg/mL βDodać kazeinę do dwuwarstwy, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5–10 min. β-kazeina blokuje obszary na szkiełku podstawnym, w których nie utworzyła się dwuwarstwa. Odmyć β-kazeinę 3x z 1x KMEH, zgodnie z opisem w kroku 2.2.3., i uzupełnić poziom buforu do 100 µL znacznik
  3. Dodanie łącznika błona-aktyna
    1. W czasie β-inkubacji z kazeiną (krok 2.2.5.), pobrać alikwot białka łączącego membranę z aktyną z −80 °C, rozmrozić szybko w temperaturze 37 °Ca następnie przechowywać w lodzie. Rozcieńczyć alikwot w buforze do rozcieńczania białek do stężenia 1 µM.
    2. Należy dodać białko łącznikowe do określonego stężenia końcowego (zazwyczaj 5–20 nM) i delikatnie wymieszać. Aby zapewnić szybką równowagę białka w komorze, należy dodać objętości większe niż 20 µL poprzez wcześniejsze zmieszanie białka łącznika z 1x KMEH.
    3. Inkubować przez 40 min w temperaturze pokojowej. Przemyć 3 razy. przy użyciu 1x buforu KMEH w celu usunięcia niezwiązanego białka HSE (jak w kroku 2.2.3.). Przywrócić poziom buforu w każdej komorze do 100 µL znacznik. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania.
  4. Ocena jakości dwuwarstwy lipidowej
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny, którego nie trzeba wykonywać za każdym razem. Zalecamy przeprowadzenie tej oceny przy każdym przygotowywaniu świeżych SUV z zamrożonych zapasów MLV.
    1. Włącz mikroskop, lasery wzbudzenia oraz kamery detekcyjne. Upewnij się, że laser jest skalibrowany, obiektyw jest czysty, a oprogramowanie jest gotowe do akwizycji obrazów.
    2. Nanieś olej imersyjny na obiektyw 100x, zamocuj próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość obiektywu na dwuwarstwę. Upewnij się, że położenie lasera jest takie, aby następowało całkowite wewnętrzne odbicie na próbce. Użyj lasera wzbudzającego o długości fali 488 nm, aby sprawdzić rozkład intensywności fluorescencji białka 10xHis-YFP-EzrinABD związanego z dwuwarstwą.
      UWAGA: Bilayery dobrej jakości charakteryzują się jednorodnym rozkładem intensywności fluorescencji w dużej skali. Bilayery złej jakości wykazują intensywne i niejednorodne plamy fluorescencyjne.
    3. Aby określić integralność dwuwarstwy, należy przeprowadzić analizę FRAP.
      1. Wybierz obszar zainteresowania na dwuwarstwie i zarejestruj kilka obrazów pola widzenia, stosując warunki obrazowania zapewniające stosunek sygnału do szumu na poziomie 5:1 lub wyższym. Wstrzymaj rejestrację i przymknij przysłonę pola mikroskopu TIRF, aby skupić skoncentrowaną wiązkę lasera na małym, okrągłym obszarze dwuwarstwy w celu lokalnego wybielenia fluoroforów.
      2. Włącz laser z maksymalną mocą wyjściową, aby przeprowadzić fotowybiałanie niewielkiego obszaru przez 3–10 s, a następnie wyłącz laser. Ponownie otwórz przysłonę pola do pierwotnego promienia, przywróć warunki obrazowania do ustawień sprzed wybiałania i natychmiast wznowij rejestrację powrotu sygnału fluorescencyjnego w polu widzenia.
    4. Należy sprawdzić, czy dwuwarstwa jest płynna. Dobre dwuwarstwy z prawidłową dyfuzją boczną regenerują się szybko, podczas gdy wadliwe dwuwarstwy regenerują się powoli lub w ogóle (Rysunek 3). Jeśli dwuwarstwa nie regeneruje się, należy zapoznać się z sekcją rozwiązywania problemów i rozpocząć procedurę od nowa. Obrazy należy zapisać w formacie 16-bitowym TIFF. W celu ilościowego oszacowania współczynnika dyfuzji należy przejść do kroku 3 poniżej.
  5. Polimeryzacja fluorescencyjnej aktyny
    UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, należy rozpocząć polimeryzację aktyny podczas inkubacji białka HSE w celu jego wiązania z dwuwarstwą (krok 2.3.) lub podczas oceny jakości dwuwarstwy (krok 2.4.).
    1. Wymieszać nieznakowaną i znakowaną fluorescencyjnie G-aktynę w stosunku molowym 10:1, a następnie uzupełnić objętość buforem G (G-Buffer) tak, aby stężenie G-aktyny wynosiło 20 µMStężenie, przy którym aktyna zostanie ostatecznie spolimeryzowana, będzie wynosić 1/4 tej wartości. Do mieszaniny należy dodać 1/10 buforu ME 10x w celu uzyskania roztworu 1x, a następnie inkubować przez 2 min. Krok ten zastępuje Ca2+ jony związane z G-aktyną w obecności Mg2+ jonów. Należy upewnić się, że objętość końcowa jest wielokrotnością 10 µL.
    2. Dodaj żądaną ilość białka blokującego w następujący sposób. Szybko rozmroź fiolkę ze stoki białka blokującego w temperaturze 37 °C następnie przechowywać w lodzie. Rozcieńczyć buforem G w taki sposób, aby stężenie białka cappingowego było dwukrotnością pożądanego stężenia końcowego w mieszaninie do polimeryzacji. Dodać objętość rozcieńczonego roztworu białka cappingowego równą objętości mieszaniny aktyny z kroku 2.5.1.
    3. Na koniec do mieszaniny reakcyjnej należy dodać taką samą objętość świeżego 2x buforu docelowego. Końcowa objętość roztworu powinna być czterokrotnością objętości mieszaniny aktyny z etapu 2.5.2. Należy upewnić się, że końcowe stężenie KMEH wynosi 1x, ATP 1 mM, BSA 1 mg/mL, a aktyny G 5 µM.
      Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 45–60 min, aby umożliwić zajście polimeryzacji.
      UWAGA: Jest to tzw. strategia buforu docelowego, w której jedna objętość Mg2+ G-aktynę (krok 2.5.1.) miesza się z jedną objętością mieszaniny białek blokujących (krok 2.5.2.) i dwiema objętościami 2-krotnego buforu docelowego (krok 2.5.3.). Ułatwia to zwiększanie lub zmniejszanie ilości aktyny oraz zmianę względnego stężenia białka blokującego (lub dowolnego innego modulatora aktyny; Rycina 4).
  6. Dodanie fluorescencyjnych filamentów aktynowych
    1. Odetnij kilka 200 µL końcówki za pomocą ostrego ostrza lub nożyczek, aby uzyskać tępe końce. Ostrożnie odpipetuj wymaganą objętość 5 µM spolimeryzowaną aktynę (z kroku 2.5.3.) za pomocą końcówki do pipety o zaokrąglonym wylocie (aby zapobiec ścinaniu filamentów aktynowych) i przenieść ją do czystej, autoklawowanej probówki PCR.
    2. Do probówki należy dodać 1x KMEH w celu uzyskania odpowiedniej objętości >20 µL i delikatnie wymieszać, aby uniknąć ścinania F-aktyny. Z zamontowanej komory z próbką odessać objętość buforu równą objętości dodanej cieczy.
    3. Należy dodać roztwór spolimeryzowanej aktyny do komory i delikatnie pipetować go w górę i w dół 3 razy, nie dotykając dwuwarstwy na dnie. Pozwala to na równomierny rozkład filamentów aktynowych na dwuwarstwie. Następnie należy zamocować próbkę w mikroskopie TIRF (patrz krok 2.4.1. i krok 2.4.2.).
    4. Można zarejestrować proces wiązania F-aktyny do dwuwarstwy. Inkubować przez 20–30 min. Po osiągnięciu stanu stacjonarnego po dodaniu F-aktyny zarejestrować kilka obrazów z różnych pól widzenia. Obserwować zmianę w organizacji przestrzennej 10xHis-YFP-EzrinABD przed (homogeniczna) i po organizacji aktyny.
      UWAGA: Wobec braku aktyny HYE jest rozmieszczone równomiernie w obrębie dwuwarstwy lipidowej. Po dodaniu filamentów aktynowych HYE kolokalizuje z F-aktyną. Stopień kolokalizacji zależy od powinowactwa białka łącznika do aktyny; im silniejsze powinowactwo, tym wyższy stopień kolokalizacji i wolniejsza mobilność boczna białka łącznika (Rysunek 5).
  7. Dodanie miozyny II
    1. Po 30 minutach inkubacji z aktyną ponownie umieść próbkę pod mikroskopem (jeśli została z niego zdjęta). Sprawdź sygnał w kanałach białka łącznikowego oraz F-aktyny. W razie potrzeby dostosuj warunki obrazowania.
    2. Wybierz odpowiedni obszar o jednorodnym sygnale białka łącznika i równomiernie rozproszonych filamentach aktynowych, wolny od artefaktów, w celu przeprowadzenia długotrwałego nagrania poklatkowego. Przed dodaniem miozyny zarejestruj 10–15 klatek z częstotliwością 0,1–0,2 Hz, a następnie wstrzymaj nagrywanie. Za pomocą końcówki do pipety o zaokrąglonym końcu (aby zapobiec ścinaniu filamentów miozyny) pobierz wymaganą objętość odzyskanej miozyny II mięśniowej z fiolki z zapasem i przenieś ją do czystej, autoklawowanej probówki PCR.
    3. Niezwłocznie dodaj do probówki 1x KMEH w celu uzyskania odpowiedniej objętości >20 µL i delikatnie wymieszać. Na tym etapie można również dodać ATP, mieszaninę regenerującą ATP, środki fotostabilizujące itp. Ostrożnie usunąć objętość buforu równą objętości próbki z zamontowanej komory pomiarowej, tak aby jej nie naruszyć.
    4. Ostrożnie dodaj roztwór miozyny do komory z próbką. Nie pipetuj roztworu w górę i w dół, aby nie naruszyć filamentów związanych z powierzchnią. Natychmiast wznowij rejestrację time-lapse i obserwuj system w miarę jego przejścia ze stanu przed dodaniem miozyny do napędzanych ATP kurczliwych przepływów akto-miozynowych i formowania się asterów, aż do stanu zaklinowania po wyczerpaniu ATP (patrz: reprezentatywne wyniki).
    5. Wykonaj zdjęcia tła dla wszystkich kanałów, używając próbki zawierającej sam bufor. Zapisz wszystkie obrazy jako 16-bitowe pliki .tiff. Patrz Tabela 2 po wskazówki dotyczące rozwiązywania typowych problemów.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Ocena jakości dwuwarstw za pomocą szybkiego testu FRAP. Wsparte lipidowe dwuwarstwy (SLB) przygotowane z lipidów DOPC i Ni-NTA (98:2 mol%) są pokryte HYE (linkerem błonowo-aktynowym z tagiem 10xHis-YFP). Po wypłukaniu niezwiązanych białek, fluorescencyjna dwuwarstwa jest obrazowana pod mikroskopem TIRF. Mały obszar dwuwarstwy zostaje poddany fotowybielaniu przy użyciu wysokiej mocy lasera, a następnie rejestrowany jest powrót fluorescencji. (A) Dobra dwuwarstwa zawsze wykazuje szybki powrót, z oczekiwanym współczynnikiem dyfuzji 1-1,5 µm2/s dla zastosowanego w tym przypadku składu lipidów. (B) Wadliwe dwuwarstwy wykazują bardzo wolny powrót lub brak powrotu fluorescencji. (C) Reprezentatywne obrazy wadliwych dwuwarstw: (C-i) dwuwarstwa z dziurami, (C-ii) dwuwarstwa z dużymi, nieruchomymi plamami lipidowymi oraz (C-iii) dwuwarstwa z małymi, nieruchomymi kropkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rycina 4: Schemat przedstawiający sposób polimeryzacji aktyny z wykorzystaniem metody buforu docelowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-protocol-4
Rycina 5: Organizacja przestrzenna HYE po związaniu z F-aktyną. Migawki TIRF przedstawiające organizację przestrzenną HYE przed i po dodaniu filamentów aktynowych (oznaczonych Atto-635 maleimide). Organizacja HYE jest homogenna przed dodaniem F-aktyny, a po jej dodaniu staje się kolokalizowana i współliniowa wzdłuż filamentów aktynowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Analiza danych

  1. Za pomocą oprogramowania Fiji (https://imagej.net) odjąć tło od obrazów białka łącznika (z kroku 2.4.). Zmierzyć średnie wartości intensywności z wybieczonego punktu oraz z obszaru referencyjnego.
  2. Znormalizować przebiegi czasowe z wybieczonego punktu i obszaru referencyjnego do intensywności ich odpowiednich wartości przed wybieczaniem. Podzielić każdą wartość czasową z znormalizowanego obszaru wybieczonego przez odpowiednie punkty czasowe w znormalizowanym przebiegu czasowym obszaru referencyjnego. Poprawić wynikowy znormalizowany przebieg czasowy o tło oraz wszelkie systematyczne fluktuacje intensywności podczas akwizycji (globalne fotowybieczanie, dryft z, itp.).
    1. Użyć metody ręcznej, bez dopasowywania (fitting-free)28, aby oszacować współczynnik dyfuzji białek przytwierdzonych do dwuwarstwy. W skrócie, czas połowy profilu regeneracji, τ1/2, można obliczyć, analizując czas, w którym znormalizowany profil regeneracji osiąga połowę swojego stanu stacjonarnego:
      figure-protocol-5
      Tutaj F0 to średnia intensywność w obszarze wybieczonym w pierwszej klatce po fotowybieczaniu, a F∞ to długoterminowa wartość stanu stacjonarnego regeneracji dwuwarstwy.
    2. Oszacować efektywny promień wybieczania, re, będący parametrem korygującym dyfuzję podczas fotowybieczania, na podstawie skanu liniowego profilu punktu po wybieczaniu29. Połowa szerokości przy połowie minimum tego skanu liniowego przechodzącego przez środek punktu wybieczania, r1/2, wiąże się z re w następujący sposób:
      figure-protocol-6
      Wartość τ1/2 obliczona w kroku 2.8.3., re obliczony w kroku 2.8.4. oraz pierwotnie ustalony promień wybieczania, rn, są wykorzystywane do obliczenia współczynnika dyfuzji (D) zgodnie z następującym wzorem:
      figure-protocol-7
  3. Analiza obrazów asterów akto-miozynowych
    1. Za pomocą Fiji odjąć tło od wszystkich zarejestrowanych obrazów we wszystkich kanałach. Skorygować obrazy pod kątem niejednorodnego oświetlenia lub wzorów interferencyjnych, stosując korekcję pola płaskiego (flat-field correction).
      UWAGA: Można użyć kolorowych szkiełek plastikowych, które stanowią dobre płaskie próbki do przeprowadzania takich korekcji. W przypadku białka łącznika i filamentów aktynowych na płaskiej dwuwarstwie można również użyć średniej projekcji wielu obrazów sprzed dodania miozyny, aby stworzyć mapy korekcji oświetlenia specyficzne dla każdego kanału.
      1. Dla kanału HYE, pokazanego tutaj, wykonać średnią projekcję intensywności z wielu obrazów HYE (zarejestrowanych z różnych obszarów dwuwarstwy lipidowej przed dodaniem miozyny). Zastosować odpowiedni filtr Gaussa (σ = 50 pikseli do 80 pikseli) do średniej projekcji (z obrazów sprzed dodania miozyny lub dowolnej standardowej płaskiej próbki).
      2. Konwertować przefiltrowany obraz na obraz 32-bitowy. Podzielić wszystkie wartości pikseli przez średnią z całego obrazu. Uzyskana zostanie znormalizowana mapa korekcyjna dla kanału HYE. Podzielić wszystkie obrazy w kanale HYE przez tę mapę w celu korekcji pola płaskiego. Stworzyć mapy korekcyjne dla pozostałych kanałów, stosując tę samą strategię.
    2. Skorygować fotowybieczanie w programie Fiji, stosując metodę wykładniczą lub prostą metodę stosunków (w zależności od profilu spadku intensywności).
      1. Aby skorygować ewentualne czasowe przesunięcia w osi x-y (ruch translacyjny), scalić wszystkie skorygowane pod kątem fotowybieczania kanały w jeden Hyperstack. Używając wtyczki Hyperstack-Reg w programie Fiji, zastosować transformację Rigid Body lub Translation.
      2. Na koniec rozdzielić wyrównany Hyperstack na poszczególne kanały i zapisać je oddzielnie jako 16-bitowe stosy TIFF do dalszej analizy.

Wyniki

W celach reprezentacyjnych przedstawiono typowy profil po wybielaniu z pierwszego obrazu po fotowybielaniu (obraz w t = 0 s na Rysunku 3A) oraz jego dopasowanie do następującej funkcji28 (patrz Rysunek 6A):

figure-results-1

Wartość re (23,94 µm) obliczona na podstawie dopasowania do tej krzywej jest bardzo zbliżona do wartości re obliczonej w kroku 2.8.4. (23,24 µm). Tutaj K jest parametrem głębokości wybielania, który można bezpośrednio oszacować z F0 (opisanego w kroku 2.8.4.). Podobnie, Rycina 6B przedstawia profil regeneracji oraz jego dopasowanie do następującej funkcji28:

figure-results-2

Ustaliliśmy, że dopasowana wartość współczynnika dyfuzji wynosi 1,34 µm2/s, co jest wartością bliską 1,39 µm2/s obliczonej zgodnie ze wzorem w kroku 2.8.4. Tutaj MF oznacza frakcję mobilną dwuwarstwy lipidowej, która reprezentuje ułamek wybielonej populacji ulegający powrotowi. Mobilność cząsteczek zakotwiczonych w lipidach zależy oczywiście od składu lipidów i ich stanu fizycznego (fazy ciekłej lub żelowej). W przypadku naszych eksperymentów z wykorzystaniem membran lipidowych opartych na DOPC, mobilność powinna wynosić >1 µm2/s, a frakcja mobilna nie powinna być mniejsza niż 0,9, co świadczy o dobrej jakości dwuwarstwy lipidowej. Do szybkiego sprawdzenia jakości i mobilności dwuwarstwy zalecamy zastosowanie ręcznej metody bez dopasowania. Metoda dopasowania może być przydatna podczas automatyzacji analizy wielu krzywych FRAP. Ponadto, jeśli chcemy przeprowadzić bardziej zaawansowany eksperyment FRAP w celu systematycznej charakterystyki dyfuzji w układzie, odsyłamy czytelnika do przeglądu Lorén i wsp.30 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat modeli dopasowania i potencjalnych pułapek w projekcie eksperymentalnym.

figure-results-3
Rysunek 6: Wyznaczanie współczynnika dyfuzji w dwuwarstwach lipidowych. (A) Profil liniowy pierwszego obrazu po fotowybielaniu (t = 0 s na Rysunku 3A) oraz jego dopasowanie do równania 4 w celu obliczenia efektywnego promienia wybielania. (B) Profil regeneracji wybielonego obszaru oraz jego dopasowanie do równania 5 w celu obliczenia współczynnika dyfuzji i frakcji mobilnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Typowy wynik opisanych powyżej eksperymentów, przedstawiający dynamiczny montaż i organizację sieci akto-miozynowej powiązanej z podłożną dwuwarstwą lipidową, obrazowany za pomocą mikroskopii TIRF, ukazano na Rysunku 7 oraz w filmie uzupełniającym S1.

Rysunek 7 przedstawia montaż obrazów białka łącznikowego, aktyny F oraz miozyny-II.

figure-results-4
Rycina 7: Kurczliwe przepływy akto-miozynowe napędzają lokalną klasteryzację białka łączącego błonę z aktyną HYE. Migawki TIRF dla HYE (oznaczonego YFP), filamentów aktynowych (oznaczonych maleimidem Atto-635) i filamentów miozyny II (oznaczonych maleimidem Atto-565) po dodaniu miozyny II do SLB zawierającej HYE i F-aktynę. Czas jest wskazany na górze: 0 min to moment bezpośrednio przed pojawieniem się fluorescencyjnych miofilamentów w polu TIRF. Przed dodaniem miozyny (0 min) HYE i F-aktyna są jednorodnie rozmieszczone w dwuwarstwie lipidowej. Aktywność miozyny indukuje kurczliwe przepływy akto-miozynowe, które w stanie stacjonarnym (15 min) przybierają formę struktur przypominających aster, napędzając lokalną klasteryzację sprzężonego komponentu błonowego (HYE). Najniższy rząd to nałożenie obrazów aktyny (żółty) i miozyny II (magenta), pokazujące organizację aktyny i miozyny w różnych punktach czasowych. Obrazy wykorzystane do stworzenia tych zestawień zostały skorygowane w programie Fiji pod kątem sygnału tła, nierównomiernych wzorców intensywności oraz ruchu translacyjnego. Pasek skali = 10 µm. Szczegóły znajdują się w Supplementary Video S1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nazwa buforuSkład
bufor do rehydratacji lipidów50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% sacharozy, pH 7,5
Bufor do tworzenia SLB50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6
Bufor do przechowywania SLB50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2
Bufor do rozcieńczania białek20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1 mM TCEP lub DTT, pH 7,2
Bufor do wymiany jonowej 1X ME lub aktyny 50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (przechowywać w 4°C)
1X bufor KMEH lub bufor do polimeryzacji aktyny 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2
roztwór zapasowy ATP 100 mM100 mM ATP dwuwodny sól sodowa, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (przechowywać w temperaturze -20°C) 
2x bufor docelowy2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2 mM ATP, 5 mM TCEP (przechowywane w 4°C)
bufor G2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04% NaN3, pH 8 (przechowywać w 4°C)
Bufor do miozyny II500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0
Bufor do chromatografii żelowej50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5
Bufor do przechowywania białka capping protein 10 mM Tris·Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glicerolu 

Tabela 1: Lista składów buforów wykorzystanych w tym protokole.

Typowe problemy i sposoby ich rozwiązywania  filmowanie ProblemPrzyczynaMożliwe rozwiązania
1Dwuwarstwa lipidowa nie wykazuje dyfuzjiNajbardziej prawdopodobną przyczyną tego problemu jest zanieczyszczone szkiełko podstawowe, co może wystąpić w przypadku przedawnienia roztworu czyszczącego lub braku podgrzewania podczas sonikacji w kąpieli. Bilayery te mają wygląd „pęcherzykowy”, ponieważ pęknięte pęcherzyki przylegają do szkiełka podstawowego, lecz nie łączą się ze sobą. Użycie MLV starszych niż 6 tygodni lub SUV starszych niż 6 dni, a także dodanie niewielkich ilości SUV, może również prowadzić do powstania pęcherzykowych bilayerów.Należy użyć świeżego roztworu czyszczącego. Upewnij się, że grzałka jest włączona, a temperatura wynosi od 45-65°CNależy stosować świeże mieszaniny lipidów. (Zastosowanie fluorescencyjnej sondy lipidowej zamiast fluorescencyjnej sondy białkowej może czasami przynieść odmienne rezultaty. Na przykład, jeśli dwuwarstwa posiada defekty poniżej granicy dyfrakcji, a etap pasywacji powierzchni został pominięty (lub okazał się nieskuteczny), sonda lipidowa wykaże jednorodny rozkład intensywności, podczas gdy sonda białkowa może wykazywać jasne plamki fluorescencyjne).
2Dwuwarstwa lipidowa posiada jasne obszaryDługotrwała inkubacja SUV w celu formowania dwuwarstwy może prowadzić do powstania lipidowej dwuwarstwy, która wykazuje ogólną dyfuzję, lecz posiada sporadyczne jasne obszary. Obszary te mogą być dwuwarstwami wielowarstwowymi, które mogą przyciągać duże ilości sondy fluorescencyjnej.Inkubacja z SUV przez 15–20 min jest wystarczająca. Należy upewnić się, że sonda nie ulega agregacji: należy krótko i intensywnie odwirować białko łącznikowe (300 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C) może usunąć agregaty
3Dwuwarstwa lipidowa posiada ciemne otworyDzieje się tak, gdy dwuwarstwa jest tworzona ze starych SUV i obrazowana przez wiele godzin (> 4 godziny po utworzeniu), lub gdy pH roztworu drastycznie zmienia się z powodu przedłużonego obrazowania (np. w stanie wysokiego poziomu ATP i w obecności niektórych usuwaczy tlenu), lub gdy powierzchnia jest nadmiernie pasywowana beta-kazeiną (dodanie zbyt dużej ilości beta-kazeiny na ponad 10–15 min i/lub brak jej wypłukania).Należy użyć świeżych lipidów. Należy zmniejszyć częstotliwość klatek obrazowania lub efektywny czas naświetlania laserem. Należy stosować bufory o wyższej pojemności buforowej.
4Dwuwarstwa lipidowa wykazuje powolną dyfuzję Błon lipidowe o wysokim procencie cholesterolu, długich lipidach nasyconych lub lipidach naładowanych wykazują wolniejszą dyfuzję.W takich przypadkach należy przygotować próbkę w wysokiej temperaturze. Jako kontrolę, obok złożonych i nieprzebadanych składów lipidowych, można zastosować prosty, sprawdzony skład lipidowy. Należy upewnić się, że szkło jest czyste.
5Aktyna nie polimeryzuje Bufor docelowy jest przeterminowany, zapas G-aktyny jest zbyt stary, stara i nowa G-aktyna zostały poddane wspólnej polimeryzacji. Upewnij się, że Ca2+ zostaje zastąpiony przez Mg2+ przed polimeryzacją (używając buforu ME). Należy użyć świeżego ATP-Mg2+ roztwór zapasowy. Należy użyć świeżo recyklingowanej G-aktyny. Należy upewnić się, że stężenie F-aktyny (wyrażone jako G-aktyna) dodanej do dwuwarstwy jest wyższe niż 0.2 µMW przypadku niższych stężeń należy zastosować F-aktynę stabilizowaną falloidyną.
6Aktyna nie wiąże się z dwuwarstwąŁącznik błona-aktyna nie został dodany lub dodano go w bardzo niskim stężeniu — można to wywnioskować z fluorescencji białka łącznikowego. Jeśli fluorescencja jest wyraźna, oznacza to, że łącznik błona-aktyna utracił zdolność wiązania aktyny. Ponadto, jeśli białko łącznikowe wiąże się niespecyficznie z powierzchnią szkła (w przypadku wadliwej dwuwarstwy), może nie rekrutować filamentów aktynowych.Upewnij się, że warstwa dwuwarstwowa ulega dyfuzji. Użyj świeżego białka łączącego.
7Sygnał fluorescencyjny F-aktyny jest słabyStosunek aktyny znakowanej do nieznakowanej jest zbyt niski. Albo aktyna znakowana, albo nieznakowana jest zbyt stara, przez co nie ulegają one wspólnej polimeryzacji.Ponownie odzyskaj aktynę i powtórz polimeryzację, używając świeżo odzyskanej aktyny. Uszkodzenia fotochemiczne mogą niszczyć lub depolimeryzować F-aktynę; jeśli to możliwe, w przypadku aktyny (i miozyny) stosuj barwniki czerwone lub dalekie czerwone. 
8Miozyna nie wykazuje zdolności do kurczenia sięmożna zauważyć, że po dodaniu ATP do układu nasyconego miozyną, akto-miozyna nie wykazuje zdolności do kurczenia się. Należy sprawdzić, czy stężenie lub poziom czystości miozyny jest odpowiedni. Należy użyć świeżo odzyskanym miozyny (wykorzystać w ciągu 6 tygodni od odzyskania). Pomocne może być dodanie świeżego ATP do mieszaniny miozyny. Odgazowanie buforów oraz stosowanie pochłaniaczy tlenu itp. może ograniczyć fotouszkodzenia motorów molekularnych.  Dalsze informacje można znaleźć w protokołach opracowanych przez Plastino i wsp. lub Stam i wsp. z tego samego zbioru metod
9Łańcuszek szkiełka podstawowego nie jest hydrofilowyKapturek szkiełka nie został odpowiednio oczyszczony.Czyste hydrofilowe szkiełko nakrywkowe jest  kluczowe dla formowania dwuwarstwy lipidowej. Przydatnym, wizualnym wskaźnikiem hydrofilowości szkiełka podstawowego po zastosowaniu protokołu czyszczenia jest obserwacja zwilżalności szkła przez wodę. Należy dodać niewielką objętość wody na płasko leżące szkiełko. Jeśli szkiełko nie zostało odpowiednio oczyszczone, woda pozostanie w kształcie okrągłej kropli. Natomiast na potraktowanym hydrofilowym szkiełku ta sama objętość wody rozprzestrzeni się, tworząc cienką warstwę. Taka charakterystyka zwilżania powierzchni szkiełka przez wodę może służyć do potwierdzenia skuteczności etapów czyszczenia z użyciem roztworu czyszczącego/NaOH. .   

Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów podsumowujący typowe problemy i odpowiadające im rozwiązania.

Wideo uzupełniające S1: Kurczliwe przepływy akto-miozynowe napędzają lokalne skupianie białka łącznika błona-aktyna HYE.Timelapse TIRF białka HYE (oznaczonego YFP), filamentów aktyny (oznaczonych maleimidem Atto-635) oraz filamentów miozyny II (oznaczonych maleimidem Atto-565) po dodaniu miozyny II do SLB zawierającej HYE i F-aktynę. Czas jest wskazany u góry: 0 min to moment bezpośrednio przed pojawieniem się fluorescencyjnych miofilamentów w polu TIRF. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten stanowi wszechstronną platformę i punkt wyjścia do projektowania eksperymentów w celu zbadania interfejsu błona-kora komórkowa. Krytycznymi etapami są przygotowanie czystych szkiełek szkiełkowych, przy użyciu świeżych lipidów do wydajnego tworzenia SUV-ów (oba wpływają na jakość SLB) oraz wykorzystanie świeżo przetworzonych białek miozyny II do dynamicznej reorganizacji włókien aktynowych. Podczas obrazowania dynamiki w długim czasie bardzo ważne jest włączenie systemu pochłaniacza tlenu (np. kwasu protokatechowego i protokatechuianu 3 4-dioksygenazy 5,31).

Konstrukcja z otwartą komorą umożliwia sekwencyjne dodawanie komponentów do istniejącego systemu bez indukowania przepływu lipidów. Może to stanowić istotną przewagę nad powszechnie stosowanymi metodami z zamkniętą komorą lub pracą z wykorzystaniem zamkniętych białek w liposomach36. Przeciwstawne efekty, takie jak deformacja błony wywołana białkiem, nie mogą być badane za pomocą dwuwarstw lipidowych zaadsorbowanych przez szkło.

Dwuwarstwy lipidowe mogą być tworzone z szerokiej gamy kompozycji lipidowych. Rozpoczyna się od adsorpcji pęcherzyków lipidowych na powierzchni szkła hydrofilowego, po której następuje albo spontaniczne pęknięcie pęcherzyka w wyniku interakcji powierzchniowo-pęcherzykowych i bezpośrednich interakcji pęcherzyk-pęcherzyk, albo zaadsorbowane pęcherzyki osiągają krytyczne pokrycie, po czym niewielka część pęcherzyków pęka, tworząc aktywne krawędzie, co ostatecznie prowadzi do powstania dwuwarstwy32. Oprócz szkła, różne podłoża mogą być używane do tworzenia podpartych dwuwarstw lipidowych, takich jak mika (np. do mikroskopii sił atomowych), miękkie podłoża (np. poli-di-metylosiloksan), poduszki polimerowe 33,34,35, rozciągające się między otworami siatek mikroskopii elektronowej 14. Dwuwarstwy z interfejsem kropelkowym to kolejna interesująca metoda tworzenia stabilnych, wolnostojących dwuwarstw lipidowych36. Włączenie sieci aktoo-miozyny do pęcherzyków lub emulsji jest bardzo potężną metodą badania tego minimalnego systemu w geometrii podobnej do komórki37,38, która jest szczegółowo opisana w innym miejscu39.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusz badawczy AXA oraz Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) dla DVK, NCBS-TIFR dla AB i ST oraz stypendium Wellcome-DBT Margdarshi (IA/M/15/1/502018) dla SM. DVK pragnie również podziękować Towarzystwu Biofizycznemu za umożliwienie wirtualnego wydarzenia networkingowego "Wyzwania w zrozumieniu wieloskładnikowych sieci cytoszkieletowych od molekularnej do mezoskali", , które przyczyniły się do powstania tej kolekcji protokołów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2 dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N- (lisamina rodamina B sulfonyl)Avanti Polar Lipids81015816:0 RhoPE
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1 karboksypentylo)kwas iminodiacetowy) sukcynylo] (sól niklu)Avanti Polar Lipids790404DGS-NTA-Ni2+
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids850375DOPC
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinaDOPC Avanti Polar Lipids850355DPPC
Fiolki ze szkła bursztynowegoThermoFisherB7990-2A
ATP sól disodowaSigma AldrichA26209
Komora komórkowa AttofluorThermoFisherA7816
Sonikator do kąpieliGT Sonic1860QTS
beta-kazeinaSigma AldrichC6905
CaCl2ThermoFisher12135
chloroformSigma Aldrich650471alternatywnie z Electron Microscopy Sciences, 50980296
Szkiełka nakrywkowe, #1, średnica 25 mm, Gold SealHarvard Apparatus64-0705B
Szkiełka nakrywkowe, #1, 40x22 mm, Gold SealThermoFisher48404-031
EDTAThermoFisherG12635
EGTAHimediaMB130
Strzykawki ze szkła gazoszczelnego, z igłą removebla,, objętości 10 i mikro; L, 100 i mikro; L, 500 i mikro; LHammilton1700 series
Hellmanex IIIRoztwór czyszczącyZ805939Hellma Analytics
HEPESHimediaRM380
KaH2PO4ThermoFisherG13405
KClThermoFisherG13305
KOHThermoFisherG26708
Wytłaczarka do lipidówAvanti Polar Lipids61000-1EA
MgCl2ThermoFisherG15535
Mikrokońcówka SonicsVC7503 mm Średnica końcówki
Na2CO3ThermoFisherG15955
NaClHimediaGRM853
NaH2PO4ThermoFisherG15825
NaOHThermoFisherG27815
Mikroskop Nikon Ti Eclipse TIRFNikonZ jednostką TIRF podłączoną światłowodem oszczędzającym polaryzację do monolitycznego sumatora laserowego Agilent MLC400 z wieloma liniami laserowymi z obiektywem olejowym 100X, 1,45 NA z dwoma aparatami EMCCD o rozdzielczości 512 x 512 pikseli (Photometrics Evolve 512) z obiektywem olejowym Nikon 100x, 1,45 NA z dwoma aparatami EMCCD o rozdzielczości 512 x 512 pikseli (Photometrics Evolve 512)
NOA88Norland Products8801
Pęseta z powłoką PTFE #2Asonda strukturalna0S2AT-XD
Mikrowirówka z chłodzeniemEppendorf5424R
SacharozaThermoFisherG15925
Oświetlacz UVNovascanPSD PRO-UVwymaga próżni i zasilania O2
do

Bibliografia

  1. Köster, D. V., Mayor, S. Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined. Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).
  2. Rao, M., Mayor, S. Active organization of membrane constituents in living cells. Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).
  3. Honigmann, A., et al. A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes. eLife. 3, 01671(2014).
  4. Das, A., et al. Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex. Science Advances. 6 (11), (2020).
  5. Köster, D. V., et al. Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).
  6. Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. The design of MACs (minimal actin cortices). Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).
  7. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Reconstitution of contractile actomyosin arrays. Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).
  8. Mosby, L. S., et al. Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy. Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).
  9. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).
  10. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7, 12615(2016).
  11. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, 00116(2013).
  12. Ditlev, J. A., et al. A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin. eLife. 8, 42695(2019).
  13. Banjade, S., Rosen, M. K. Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors. eLife. 3, 04123(2014).
  14. Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex. Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).
  15. Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex. eLife. 6, 24350(2017).
  16. Block, S. Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers. Biomolecules. 8 (2), 30(2018).
  17. JoVE, JoVE. JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
  18. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).
  19. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  20. Pollard, T. D. Myosin purification and characterization. Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).
  21. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
  22. Bieling, P., et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).
  23. Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro. PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).
  24. Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
  25. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, 5412(2014).
  26. Selden, N. S., et al. Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).
  27. Seu, K. J., et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  28. Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data. Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).
  29. Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes. Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).
  30. Lorén, N., et al. Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).
  31. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).
  32. Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).
  33. Lin, W. -C., et al. Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology. Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).
  34. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  35. Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing. Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).
  36. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  37. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236(2022).
  38. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).
  39. Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekonstrukcja kory aktynowejaktyna związana z błonąsieci akto-miozynowecałkowite wewnętrzne odbiciemikroskopia fluorescencyjnapolimeryzacja filamentów aktynowychbiałka związane z błonątest FRAPmotory miozynowe
Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.