Demonstracja narzędzia do dopasowywania sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków w celu szybkiej oceny zachowania białek

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący najnowszą wersję narzędzia Agencji Ochrony Środowiska USA do przewidywania podatności gatunków (SeqAPASS). Protokół ten demonstruje zastosowanie narzędzia online do szybkiej analizy konserwacji białek i dostarczania konfigurowalnych i łatwych do interpretacji prognoz podatności chemicznej u różnych gatunków.

Streszczenie

Narzędzie SeqAPASS (Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) to szybka, bezpłatna aplikacja do badań przesiewowych online, która pozwala badaczom i regulatorom ekstrapolować informacje o toksyczności między gatunkami. W przypadku celów biologicznych w systemach modelowych, takich jak komórki ludzkie, myszy, szczury i danio pręgowany, dostępne są dane dotyczące toksyczności dla różnych substancji chemicznych. Dzięki ocenie ochrony docelowych białek, narzędzie to może być wykorzystane do ekstrapolacji danych wygenerowanych z takich systemów modelowych na tysiące innych gatunków, które nie mają danych o toksyczności, co pozwala przewidzieć względną wewnętrzną podatność chemiczną. Najnowsze wersje narzędzia (wersje 2.0-6.1) zawierają nowe funkcje, które pozwalają na szybką syntezę, interpretację i wykorzystanie danych do publikacji oraz grafiki o jakości prezentacyjnej.

Wśród tych funkcji znajdują się konfigurowalne wizualizacje danych oraz obszerny raport podsumowujący, przeznaczony do podsumowania danych SeqAPASS dla łatwej interpretacji. W tym artykule opisano protokół, który prowadzi użytkowników przez proces przesyłania zadań, poruszania się po różnych poziomach porównań sekwencji białek oraz interpretowania i wyświetlania uzyskanych danych. Podkreślono nowe funkcje SeqAPASS v2.0-6.0. Ponadto opisano dwa przypadki użycia skoncentrowane na zachowaniu białka transtyretyny i receptora opioidowego za pomocą tego narzędzia. Na koniec omówiono mocne strony i ograniczenia projektu SeqAPASS, aby określić zakres zastosowania tego narzędzia i podkreślić różne zastosowania ekstrapolacji międzygatunkowej.

Wprowadzenie

Tradycyjnie, dziedzina toksykologii polegała głównie na wykorzystaniu testów na całych zwierzętach, aby dostarczyć danych niezbędnych do oceny bezpieczeństwa chemicznego. Takie metody są zazwyczaj kosztowne i wymagają dużych zasobów. Jednak ze względu na dużą liczbę obecnie stosowanych substancji chemicznych i szybkie tempo, w jakim opracowywane są nowe substancje chemiczne, na całym świecie istnieje zapotrzebowanie na bardziej efektywne metody badań przesiewowych substancji chemicznych^1,2. Ta potrzeba i wynikająca z niej zmiana paradygmatu polegająca na odejściu od testów na zwierzętach doprowadziły do opracowania wielu nowych metod podejścia, w tym wysokoprzepustowych testów przesiewowych, transkryptomiki o wysokiej przepustowości, sekwencjonowania nowej generacji i modelowania obliczeniowego, które są obiecującymi alternatywnymi strategiami testowania^3,4.

Ocena bezpieczeństwa chemicznego wśród gatunków potencjalnie narażonych na działanie substancji chemicznych była nieustającym wyzwaniem, nie tylko przy tradycyjnych testach toksyczności, ale także przy nowych metodach podejścia. Postępy w toksykologii porównawczej i predykcyjnej stworzyły ramy dla zrozumienia względnej wrażliwości różnych gatunków, a postęp technologiczny w metodach obliczeniowych nadal zwiększa możliwości zastosowania tych metod. W ciągu ostatniej dekady omówiono kilka strategii, które wykorzystują istniejące bazy danych sekwencji genów i białek, wraz z wiedzą na temat konkretnych chemicznych celów molekularnych, w celu wspierania podejść predykcyjnych do ekstrapolacji międzygatunkowej i poprawy oceny bezpieczeństwa chemicznego poza typowymi organizmami modelowymi^5,6,7,8.

Aby posunąć naukę do działania, wykorzystać te fundamentalne badania w toksykologii predykcyjnej, nadać priorytet testom chemicznym i wesprzeć podejmowanie decyzji, stworzono narzędzie Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS). To narzędzie jest publiczną i ogólnodostępną aplikacją internetową, która wykorzystuje publiczne repozytoria stale rozszerzających się informacji o sekwencjach białek do przewidywania podatności chemicznej w całej różnorodności gatunków⁹. Opierając się na zasadzie, że względną wewnętrzną podatność gatunku na określoną substancję chemiczną można określić poprzez ocenę zachowania znanych celów białkowych tej substancji chemicznej, narzędzie to szybko porównuje sekwencje aminokwasów białkowych od gatunku o znanej wrażliwości do wszystkich gatunków z istniejącymi danymi dotyczącymi sekwencji białek. Ocena ta jest przeprowadzana na trzech poziomach analizy, w tym (1) sekwencji aminokwasów pierwszorzędowych, (2) domeny funkcjonalnej i (3) krytycznych porównań reszt aminokwasowych, z których każdy wymaga bardziej dogłębnej wiedzy na temat interakcji chemiczno-białkowej i zapewnia większą rozdzielczość taksonomiczną w przewidywaniu podatności. Główną zaletą SeqAPASS jest to, że użytkownicy mogą dostosowywać i udoskonalać swoją ocenę, dodając dodatkowe linie dowodowe w kierunku ochrony celu w oparciu o to, ile informacji jest dostępnych na temat interakcji chemiczno-białkowej lub białko-białko będącej przedmiotem zainteresowania.

Pierwsza wersja została wydana w 2016 roku, co pozwoliło użytkownikom na ocenę pierwotnych sekwencji aminokwasów i domen funkcjonalnych w uproszczony sposób w celu przewidywania podatności chemicznej i zawierało minimalne możliwości wizualizacji danych (Tabela 1). Wykazano, że różnice między poszczególnymi aminokwasami są ważnymi determinantami różnic międzygatunkowych w interakcjach chemiczno-białkowych, które mogą wpływać na podatność chemiczną gatunków^10,11,12. W związku z tym opracowano kolejne wersje, aby uwzględnić kluczowe aminokwasy, które są ważne dla bezpośredniej interakcji chemicznej¹³. W odpowiedzi na informacje zwrotne od interesariuszy i użytkowników, narzędzie to jest corocznie wydawane w wersji z dodatkowymi nowymi funkcjami zaprojektowanymi z myślą o potrzebach zarówno badaczy, jak i społeczności regulacyjnych w zakresie rozwiązywania problemów związanych z ekstrapolacją międzygatunkową (tabela 1). Wprowadzenie na rynek SeqAPASS w wersji 5.0 w 2020 roku przyniosło funkcje skoncentrowane na użytkowniku, które obejmują opcje wizualizacji i syntezy danych, linki zewnętrzne, opcje tabel podsumowujących i raportów oraz funkcje graficzne. Ogólnie rzecz biorąc, nowe atrybuty i możliwości tej wersji poprawiły syntezę danych, interoperacyjność między zewnętrznymi bazami danych oraz łatwość interpretacji danych w celu przewidywania podatności międzygatunkowej.

Protokół

1. Rozpoczęcie pracy

UWAGA: Prezentowany tutaj protokół skupia się na narzędziu użytkowym i kluczowych funkcjach. Szczegółowe opisy metod, funkcji i komponentów można znaleźć na stronie internetowej w obszernym Podręczniku użytkownika (Tabela 1).

Tabela 1: Ewolucja narzędzia SeqAPPASS. Lista funkcji i aktualizacji dodanych do narzędzia SeqAPASS od czasu jego początkowego wdrożenia. Skróty: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (dopasowanie sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków); ECOTOX = Baza wiedzy EKOTOKSOLOGICZNEJ. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

1. Przejdź do https://seqapass.epa.gov/seqapass za pomocą Chrome. Wybierz opcję Zaloguj się, aby użyć istniejącego konta lub postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć konto SeqAPEX, które umożliwi użytkownikom uruchamianie, przechowywanie, uzyskiwanie dostępu i dostosowywanie ukończonych zadań.
2. Przed przeprowadzeniem analizy należy najpierw zidentyfikować białko będące przedmiotem zainteresowania oraz gatunek docelowy lub wrażliwy, przeglądając istniejącą literaturę lub istniejące wcześniej dane (Rysunek 1). Ponieważ SeqAPASS zawiera łącza do zasobów zewnętrznych, które pomagają zidentyfikować białko zapytania, kliknij przyciski rozwijane w obszarze Zidentyfikuj białko docelowe, aby uzyskać dostęp do odpowiednich zasobów.

Rysunek 1: Formułowanie problemu SeqAPASS: schemat ideowy przedstawiający wstępne informacje niezbędne do udanej analizy. Skróty: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (dopasowanie sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków); LBD = domena wiążąca ligand. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Interoperacyjność SeqAPASS między bazami danych. Schemat ideowy zewnętrznych narzędzi, baz danych i zasobów zintegrowanych z SeqAPASS. Skróty: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (dopasowanie sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków); AOP = ścieżka niepożądanych wyników; NCBI = Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej; ECOTOX = Baza wiedzy EKOTOKSOLOGICZNEJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 2: Linki, zasoby i narzędzia zintegrowane z narzędziem SeqAPass. Lista różnych źródeł danych, linków i zasobów wykorzystywanych w narzędziu SeqAPPASS. Skrót: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (Wyrównanie sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Tworzenie i uruchamianie zapytania SeqAPEX: Poziom 1

UWAGA: W analizie poziomu 1 cała sekwencja aminokwasów pierwszorzędowych białka pytanego jest porównywana z sekwencjami aminokwasów pierwszorzędowych wszystkich gatunków z dostępnymi informacjami o sekwencji. To narzędzie wykorzystuje algorytmy do wydobywania, gromadzenia i kompilowania publicznie dostępnych danych w celu szybkiego dopasowania i porównania sekwencji aminokwasów u różnych gatunków. Backend przechowuje informacje z baz danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) i strategicznie wykorzystuje autonomiczne wersje narzędzia Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)⁵⁴ i narzędzia COBALT (Constraint-based Multiple Alignment Tool)⁵⁵.

1. W obszarze Porównaj sekwencje aminokwasów pierwszorzędowych kliknij opcję Według gatunku lub Według akcesji. Użyj opcji Według gatunku, aby wpisać lub wybrać z listy gatunków, aby wybrać docelowe białko.
2. Zgłoszenia dotyczące akcesji białek (tj. identyfikatora białka NCBI) należy przesłać bezpośrednio, wprowadzając akcesje w polu tekstowym Przez przystąpienie.
3. Wybierz pozycję Zażądaj uruchomienia , aby przesłać zapytanie. Po przesłaniu poczekaj, aż w prawym górnym rogu okna przeglądarki pojawi się powiadomienie wskazujące na pomyślne przesłanie.
4. Wybierz kartę Stan uruchomienia SeqAPASS w górnej części strony, aby wyświetlić listę wszystkich przebiegów SeqAPASS przeprowadzonych przy użyciu tego konta użytkownika i sprawdzić procent ukończenia.
   1. Kliknij przycisk Odśwież dane, gdy jest zaznaczony odpowiedni przycisk radiowy, aby sprawdzić stan uruchomień poziomu 2 i 3.
5. Wybierz kartę Wyświetl raporty SeqAPASS u góry strony, aby uzyskać dostęp do listy wszystkich raportów wykonanych w ramach tego konta.
6. Na karcie View SeqAPASS Reports (Wyświetl raporty SeqAPASS) wybierz interesujące Cię białko zapytania. Kliknij przycisk Żądaj wybranego raportu, aby otworzyć stronę Poziom 1 Zapytanie o białko i wyświetlić wyniki, opcje dostosowywania danych, wizualizacje i raporty podsumowujące.
7. Domyślnie wybierz opcję Wyświetl raport, aby wyświetlić dane w przeglądarce internetowej. Alternatywnie wybierz opcję Zapisz raport, aby pobrać nieprzetworzone dane jako plik .zip.
   UWAGA: Czas wymagany do przeprowadzenia analizy poziomu 1 będzie się różnić (średnio 23 minuty dla wersji 5.1) w zależności od globalnego zapotrzebowania użytkowników w tym momencie, liczby zadań przesłanych do kolejki oraz ilości informacji o białkach, które istnieją dla przesłanego zadania. Jeśli docelowy białko zostało wcześniej zrealizowane, dane będą dostępne w ciągu kilku sekund po przesłaniu.

3. Tworzenie i uruchamianie zapytania SeqAPEX: Poziom 2

UWAGA: Ponieważ cała sekwencja białka nie jest bezpośrednio zaangażowana w interakcję chemiczną, analiza poziomu 2 porównuje tylko sekwencję aminokwasów domeny funkcjonalnej, aby przewidzieć podatność na niższe rangi taksonomiczne (np. klasa, kolejność, rodzina).

1. Na stronie Informacje o białku zapytania poziomu 1 kliknij znak plus + obok nagłówka poziomu 2, aby wypełnić menu Zapytania poziomu 2.
2. Zidentyfikuj odpowiednią domenę (domeny) w białku będącym przedmiotem zainteresowania (białko zapytania).
   1. Jeśli domena nie została zidentyfikowana, kliknij zintegrowany link do bazy danych NCBI Conserved Domains Database (CDD) (Tabela 1), który może pomóc w identyfikacji odpowiedniego wyboru domeny.
      UWAGA: zazwyczaj tylko określone domeny działań są wybierane jako zapytania na poziomie 2.
3. Kliknij pole Wybierz domenę, aby automatycznie wypełnić listę domen funkcjonalnych dla białka zapytania.
4. Wybierz akcesje do domeny z listy rozwijanej i zainicjuj zapytanie poziomu 2, klikając przycisk Request Domain Run (Żądaj uruchomienia domeny). Po przesłaniu poczekaj, aż pojawi się powiadomienie wskazujące na pomyślne przesłanie.
5. Kliknij pozycję Odśwież przebiegi poziomu 2 i 3, aby wypełnić dane poziomu 2, które będą dostępne w ciągu kilku sekund od przesłania.
6. W obszarze Wyświetl dane poziomu 2 wybierz z listy rozwijanej zakończone akcesje do domeny i kliknij przycisk Wyświetl dane poziomu 2, aby otworzyć wyniki na nowej stronie.

4. Dostęp i zrozumienie danych: SeqAPASS Poziom 1 i Poziom 2

1. Przewiń do dołu strony Zapytanie o informacje o białku, aby wyświetlić raport z wynikami — domyślnie dostarczany jest raport podstawowy z analizami poziomu 1 i 2. Wybierz przycisk radiowy Pełny raport, aby wyświetlić bardziej szczegółowy raport zawierający wszystkie trafienia sekwencji i metryki wyrównania. Kliknij na odpowiednią akcesję/identyfikator/nazwę w obu raportach, aby uzyskać dostęp do przejrzystych informacji o dopasowaniu białek i taksonomii w bazie danych NCBI.
2. Przewiń w prawą stronę tabeli wyników, aby wyświetlić kolumnę ECOTOX. Kliknij linki do bazy wiedzy ECOTOXicology (ECOTOX), aby szybko zebrać odpowiednie dane dotyczące toksyczności dla gatunków z prognozami wrażliwości.
   UWAGA: ECOTOX to kompleksowa, publicznie dostępna baza wiedzy zawierająca pojedyncze dane dotyczące toksyczności chemicznej dla roślin wodnych i lądowych oraz dzikich zwierząt. SeqAPASS v6.0 zawiera widżet ECOTOX do szybszego łączenia się z odpowiednimi danymi ECOTOX według interesujących substancji chemicznych i gatunków.
3. Kliknij przycisk Pobierz tabelę, aby zapisać tabelę jako plik arkusza kalkulacyjnego. Kliknij przycisk Wyświetl raport podsumowujący, aby wyświetlić i pobrać tabelę raportu podsumowującego prezentującą dane posortowane według grupy taksonomicznej.
   UWAGA: Tabele podsumowań danych są dostępne zarówno dla raportów podstawowych, jak i pełnych i zawierają przegląd prognoz dla danego celu.

5. Manipulowanie ustawieniami danych: SeqAPASS Poziom 1 i Poziom 2

UWAGA: Zarówno w analizach Poziomu 1, jak i Poziomu 2 zakłada się, że im większe podobieństwo białka, tym większe prawdopodobieństwo, że substancja chemiczna będzie oddziaływać z białkiem w podobny sposób jak badany gatunek/białko, czyniąc je podatnymi na potencjalne wpływy substancji chemicznych z tym celem molekularnym. Ze względu na podobieństwo tych danych, kroki do zrozumienia danych poziomu 1 i 2 są opisane razem w jednym protokole.

1. Zapoznaj się z podmenu w górnej części okna Query Protein Information, aby uzyskać dostęp do ustawień raportu i manipulować nimi oraz używać ustawień domyślnych dla wszystkich opcji raportu dla większości analiz. Jeśli istnieje naukowe uzasadnienie zmiany ustawienia domyślnego, wykonaj następujące opcjonalne kroki:
   1. (OPCJONALNIE) Kliknij znak plus + obok opcji Odcięcie podatności, aby wyświetlić i dostosować ustawienia odcięcia podatności w nowej karcie. Wybierz nową wartość odcięcia z listy rozwijanej lub wprowadź wartość odcięcia zdefiniowaną przez użytkownika.
   2. (OPCJONALNIE) Zmień liczbę w polu E-Value (liczba różnych wyrównań, które mogą wystąpić przypadkowo), jeśli jest to wymagane inne niż domyślne.
      UWAGA: Każde białko o wartości E większej niż liczba w polu zostanie wyeliminowane z raportu pierwotnego.
   3. (OPCJONALNIE) Użyj opcji Sortuj według grupy taksonomicznej, aby wybrać poziom hierarchii taksonomicznej, który ma być wyświetlany w kolumnie Filtrowana grupa taksonomiczna w tabeli wyników.
      UWAGA: Zmiana hierarchii taksonomicznej zmieni również przewidywanie podatności na podstawie gatunków z każdej filtrowanej grupy, które znajdują się powyżej punktu odcięcia.
   4. (OPCJONALNIE) Zmień pole Common Domain (ile wspólnych domen musi współdzielić białko z białkiem zapytania, aby zostać uwzględnionym w wynikach), jeśli jest to wymagane inne niż domyślne.
      UWAGA: Ponieważ ustawieniem domyślnym jest 1, każda sekwencja, która nie ma co najmniej jednej wspólnej domeny z białkiem zapytania, zostanie wykluczona.
   5. (OPCJONALNIE) Wybierz opcję Nie w obszarze Gatunek czytany w poprzek, aby przywrócić przewidywania podatności Y tylko wtedy, gdy wartość procentu podobieństwa jest większa lub równa wartości odcięcia lub jeśli trafienie zostanie zidentyfikowane jako kandydat na ortologa.
      UWAGA: To ustawienie domyślne ma wartość Tak, co oznacza, że prognoza podatności Y zostanie zgłoszona dla wszystkich kandydatów na ortologów, wszystkich gatunków wymienionych powyżej wartości granicznej podatności i wszystkich gatunków poniżej granicy z tej samej grupy taksonomicznej z co najmniej jednym gatunkiem powyżej wartości odcięcia.
2. Kliknij przycisk Pobierz ustawienia bieżącego raportu, aby pobrać plik zawierający aktualnie zastosowane ustawienia.
   UWAGA: Wybrany konkretny poziom oceny (1, 2 lub 3) będzie dyktował ustawienia prezentowane w raporcie.

6. Wizualizacja danych: SeqAPASS Poziom 1 i Poziom 2

1. Kliknij znak plus + obok opcji Wizualizacja, a następnie kliknij przycisk Wizualizuj dane, aby otworzyć osobną kartę wyświetlającą informacje zdefiniowane przez użytkownika oraz opcję wyboru interaktywnego wykresu wyników.
2. Kliknij przycisk Wykres skrzynkowy, aby otworzyć interaktywny wykres skrzynkowy i formanty wykresu oraz zezwolić na aktywne aktualizowanie wizualizacji wykresu skrzynkowego w celu odzwierciedlenia zmian w tabeli danych i udostępnienia grafiki o jakości publikacji i prezentacji.
   UWAGA: Domyślny wykres skrzynkowy wyświetla grupy gatunków na osi x i procent podobieństwa na osi y. Wykresy pudełkowe wyświetlają punkt odcięcia podatności (linia przerywana), procentowe podobieństwo między gatunkami w porównaniu z gatunkiem pytanym oraz wartości średnie i mediany dla każdej grupy taksonomicznej wraz z 25. i 75. percentylem oraz zakresem międzykwartylowym. W zależności od celu analizy i potrzeb użytkownika wiele funkcji wykresu skrzynkowego można modyfikować za pomocą następujących opcjonalnych kroków.
   1. (OPCJONALNIE) Aby dostosować wyświetlane grupy taksonomiczne, zapoznaj się z polem Grupy taksonomiczne w sekcji Kontrole. Usuń grupy, przewijając nazwy i wybierając x lub korzystając z menu rozwijanego Grupy taksonomiczne.
   2. (OPCJONALNIE) Aby dodać legendę, która wskaże interesujący nas gatunek lub określone predefiniowane grupy (np. gatunki zagrożone lub zagrożone), najedź kursorem na nazwę grupy taksonomicznej na osi x, aby aktywować wyskakujące okienko z listą trzech pierwszych gatunków uporządkowanych według najwyższego procentowego podobieństwa. Najedź kursorem na gatunek w legendzie, aby wygenerować wyskakujące okienko z odpowiednimi informacjami o gatunkach. Kliknij pole obok określonej grupy taksonomicznej, aby wygenerować tabelę podsumowującą do pobrania z listą gatunków i prognoz.
3. Kliknij przycisk Pobierz wykres skrzynkowy, aby wybrać typ pliku, dostosować rozdzielczość szerokości/wysokości i zapisać wizualizację.

7. Opracowywanie i przeprowadzanie analizy SeqAPASS: Poziom 3

UWAGA: Analiza poziomu 3 ocenia zidentyfikowane przez użytkownika reszty aminokwasowe w pytanym białku i szybko porównuje zachowanie tych reszt między gatunkami. Zakłada się, że gatunki, u których te pozostałości są zachowane, z większym prawdopodobieństwem wchodzą w interakcje z substancją chemiczną w podobny sposób jak gatunki/białka wzorcowe. Ponieważ poziom 3 koncentruje się na poszczególnych aminokwasach, analizę można przeprowadzić tylko wtedy, gdy dostępna jest szczegółowa wiedza na temat reszt aminokwasowych krytycznych dla interakcji chemiczno-białkowej lub białko-białko.

1. Kliknij znak plus + obok nagłówka poziomu 3 na stronie Informacje o białku zapytania poziomu 1, aby wypełnić menu Zapytania poziomu 3.
2. Kliknij znak plus + obok Eksploratora odwołań, aby otworzyć narzędzie eksploratora odwołań, które generuje predefiniowany ciąg logiczny w celu przeszukania dostępnej literatury i pomaga użytkownikom w identyfikowaniu odpowiedniej literatury wspierającej identyfikację krytycznych aminokwasów, które mają być użyte w ocenie poziomu 3 (Tabela 2 i Rysunek 2).
   1. (OPCJONALNIE) Po automatycznym wypełnieniu zapytania białko użyj funkcji Dodaj nazwę białka, aby dodać dodatkowe białka.
3. Kliknij link Generuj Google Scholar, aby otworzyć wyskakujące okienko zawierające automatycznie wygenerowany ciąg wyszukiwania, który zawiera odpowiednie wyszukiwane hasła.
4. Kliknij Przeszukaj Google Scholar, aby przeszukać bazę danych literatury za pomocą szukanego ciągu.
   1. Możesz też kliknąć przycisk Kopiuj do schowka i dostosować ciąg wyszukiwania, dodając lub usuwając terminy za pomocą funkcji w Eksploratorze odwołań.

8. Zidentyfikuj krytyczne reszty aminokwasów za pomocą zidentyfikowanej literatury

1. Wybierz sekwencję szablonu, do której zostaną wyrównane gatunki wybrane przez użytkownika, w menu Zapytania poziomu 3.
   UWAGA: Ta sekwencja szablonowa jest powszechnie wybierana na podstawie literatury, dla której zidentyfikowano kluczowe aminokwasy i może być tego samego lub innego gatunku niż te badane na poziomie 1 i poziomie 2.
   1. (OPCJONALNIE) Użyj pola Dodatkowe porównania, aby porównać wszystkie akcesje/sekwencje, które nie pojawiają się w tabelach Główny/Pełny raport
   .
2. Wprowadź zdefiniowaną przez użytkownika nazwę przebiegu poziomu 3 w polu tekstowym Wprowadź nazwę uruchomienia poziomu 3, aby zidentyfikować ukończony przebieg poziomu 3. Wybierz unikatową nazwę dla każdej oceny.
3. Wybierz interesującą Cię grupę taksonomiczną w polu Wybierz grupy taksonomiczne. Wybierz grupę taksonomiczną, aby automatycznie filtrować tabelę według tej grupy taksonomicznej.
4. W tabeli wyników ręcznie kliknij pole wyboru obok dowolnego gatunku, który ma zostać wyrównany do sekwencji szablonu.
   UWAGA: Aby zapewnić odpowiednie dopasowanie, z szablonem należy porównywać jedną grupę taksonomiczną na raz. Wybieraj tylko podobnie oznaczone białka dla gatunków będących przedmiotem zainteresowania. Wybierając sekwencje do porównania, ważne jest, aby zwrócić uwagę na pewne sekwencje (np. hipotetyczne, NISKIEJ JAKOŚCI lub częściowe). O ile nie ma przejrzystego uzasadnienia dla włączenia, najlepiej jest wykluczyć te sekwencje, ponieważ mogą one zniekształcać przewidywania z powodu niekompletnych lub nieodpowiednich informacji o sekwencji.
5. Powtórz kroki, aby wyrównać wszystkie grupy taksonomiczne zainteresowania.
6. Kliknij opcję Odśwież przebiegi poziomu 2 i 3 po wyrównaniu wszystkich gatunków, aby wypełnić menu Wybierz nazwę uruchomienia poziomu 3 ukończonymi zadaniami poziomu 3 i natychmiast pobrać dane z wyrównania poziomu 3.
7. Kliknij opcję Połącz dane poziomu 3, aby połączyć wyrównania z wielu grup taksonomicznych.
   1. Alternatywnie, aby wyświetlić pojedynczy raport, wybierz nazwę zdefiniowaną przez użytkownika w obszarze Wybierz zapytanie do wyświetlenia i kliknij pozycję Wyświetl dane poziomu 3.
8. Wybierz szablon poziomu 3, który ma być używany jako podstawa do porównania reszt aminokwasowych w menu Połącz raporty poziomu 3 i kliknij przycisk Dalej.
9. W obszarze Zadania poziomu 3 wybierz ukończone zadania do porównania i kliknij przycisk Dalej. W razie potrzeby użyj funkcji Zadania poziomu 3, aby zmienić kolejność grup taksonomicznych. Kliknij opcję Wyświetl dane poziomu 3, aby utworzyć stronę raportu poziomu 3 z wyrównanymi połączonymi grupami taksonomicznymi.
10. Wybierz wcześniej zidentyfikowane pozycje aminokwasów dla gatunku szablonu, wpisując pozycje aminokwasów, oddzielone przecinkami, w polu Wprowadź pozycje reszt aminokwasowych, a następnie wybierając opcję Kopiuj do listy pozostałości. Bezpośrednio wybierz pozostałości w sekwencji szablonów z pudełka wahadłowego.
11. Kliknij przycisk Aktualizuj raport, aby odświeżyć stronę i wyświetlić prognozy podatności poziomu 3.
    UWAGA: Poziom 3 wykorzystuje prosty zestaw reguł wywodzących się z podstawowych deskryptorów właściwości funkcjonalnych łańcucha bocznego (np. alifatyczny, aromatyczny) i wymiarów molekularnych (różnice w masie cząsteczkowej >30 g/mol) w celu określenia, czy różnice w kluczowych pozycjach mogą wpływać na interakcje białek¹³.

9. Wizualizacja danych SeqAPASS poziomu 3

UWAGA: Podobnie jak w poprzednich poziomach, dostępne są raporty Podstawowe i Pełne. Oprócz danych identycznych z danymi na poziomie 1 i 2 raport podstawowy wyświetla pozycje aminokwasów, skróty i podatność tak/nie (T/N) podobną do przewidywania szablonu. Podobnie Pełny Raport zawiera informacje na temat klasyfikacji łańcucha bocznego aminokwasów i masy cząsteczkowej.

1. Na stronie raportu poziomu 3 przewiń w dół, aby wyświetlić raport z wynikami. Kliknij przycisk Pobierz tabelę u dołu raportu, aby zapisać tabelę.
2. Kliknij opcję Wyświetl raport podsumowujący poziomu 3, aby wyświetlić i pobrać tabelę raportu podsumowującego przedstawiającą dane posortowane według grup taksonomicznych. Kliknij znak plus + obok pozycji Wizualizacja na stronie Raport poziomu 3, aby otworzyć osobną kartę przeglądarki wyświetlającą informacje zdefiniowane przez użytkownika oraz opcję wyświetlania wyników w postaci interaktywnej mapy cieplnej.
3. Kliknij opcję Mapa skupień na stronie Informacje o wizualizacji, aby otworzyć interaktywną grafikę i formanty oraz zezwolić na aktywne aktualizowanie wizualizacji mapy skupień w celu odzwierciedlenia zmian w tabeli danych. Wykonaj następujące opcjonalne kroki, aby dostosować mapę cieplną.
   1. (OPCJONALNIE) Wybierz opcję Opcje raportu, aby przełączać się między prostym raportem, który wyświetla pozycję aminokwasu, jednoliterowy skrót i podobieństwo aminokwasów, a pełnym raportem, który wyświetla szczegółowe informacje o każdym wybranym aminokwasie.
   2. (OPCJONALNIE) Wybierz opcję Opcje raportu, aby zmienić sposób wyświetlania gatunków według nazwy zwyczajowej lub naukowej.
      UWAGA: W prostym raporcie aminokwasy są klasyfikowane jako Całkowite Dopasowanie (ciemnoniebieskie), Częściowe Dopasowanie (jasnoniebieskie, podstawienia spełniające tylko jedno kryterium) lub Niedopasowanie (żółte, podstawienia nie spełniające żadnego kryterium) do aminokwasu szablonowego. W pełnym raporcie porównania są wyświetlane jako Łączne dopasowanie (ciemnoniebieski) lub Niezgodne (żółte).
   3. (OPCJONALNIE) Wybierz opcję Opcjonalne wybory, aby wyróżnić przydatne informacje, takie jak kandydaci na ortologa, gatunki zagrożone, gatunki zagrożone lub pospolite organizmy modelowe.
   4. (OPCJONALNIE) Wybierz opcję Ustawienia mapy skupień, aby wybrać dodatkowe opcje dostosowywania, w tym dodawanie lub usuwanie kolumn, legend i tekstu.
4. Kliknij przycisk Pobierz wykres skrzynkowy, aby wybrać typ pliku i zapisać wizualizację.

10. Interpretacja wyników SeqAPASS: Dowody na zachowanie białka

UWAGA: Dla ułatwienia interpretacji, to narzędzie zawiera Raport Podsumowujący Decyzje (Raport DS) przeznaczony do integracji danych między poziomami. Raport DS zawiera wyniki (tj. tabele danych i/lub wizualizacje) wybrane przez użytkownika i pozwala na szybką ocenę przewidywań podatności na wielu poziomach dla wielu gatunków jednocześnie.

1. Kliknij opcję Wypchnij poziom # do raportu DS na stronach wyników lub wizualizacji danych i poczekaj, aż dane zostaną "wypchnięte", a karta Raport DS stanie się aktywna.
   UWAGA: Jeśli wyniki lub jakiekolwiek zmiany nie zostały przesłane do raportu DS, opcja Poziom wypychania # do raportu DS pozostanie aktywna do momentu wybrania. Jeśli ustawienie zostało zmienione, tekst Kliknij, aby wypchnąć nowe zmiany będzie wyświetlany do momentu wypchnięcia zmian do raportu. Wizualizacje można przesyłać do raportu DS w dowolnym momencie podczas oceny.
2. W dowolnym momencie wybierz kartę DS Report, aby uzyskać dostęp do strony DS.
   UWAGA: Dla wszystkich gatunków wyrównanych do poziomu 1 tabela Sprawozdanie podsumowujące ostateczną decyzję zawiera ważne dane i prognozy podatności dla każdej analizy. Jeśli gatunek w tabeli DS nie został uwzględniony w raporcie poziomu 3, ale został znaleziony w zadaniach poziomu 1 i/lub poziomu 2, komórka w tabeli otrzyma oznaczenie nie dotyczy (NA) dla przewidywania podatności na poziomie 3.

Wyniki

Aby zademonstrować zastosowanie narzędzia SeqAPASS i podkreślić nowe funkcje, opisano dwa studia przypadków reprezentujące przypadki, w których zachowanie białka przewiduje, że istnieją różnice w podatności chemicznej między gatunkami (ludzka transtyretyna) i że nie ma różnic (μ receptor opioidowy [MOR]). Pierwszy z tych przykładów dotyczy porównań sekwencji/struktury białek w celu przewidywania dziedziny przydatności dla szlaków niepożądanych wyników (AOP, definicja znajduje się w tabeli 2), podczas gdy...

Dyskusja

Istnieje powszechne przekonanie, że nie jest możliwe empiryczne przetestowanie wystarczającej liczby gatunków, aby uchwycić różnorodność genomiczną, fenotypową, fizjologiczną i behawioralną organizmów żywych, które mogą być narażone na działanie substancji chemicznych o znaczeniu toksykologicznym. Celem projektu SeqAPASS jest maksymalne wykorzystanie istniejących i stale rozszerzających się danych dotyczących sekwencji białek i danych strukturalnych, aby wspomóc i informować o ekstrapolacji danych/wiedzy o toksyczności c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Program do obsługi arkuszy kalkulacyjnych	Nie		Każdy program, którego można używać do przeglądania i pracy z plikami csv (np. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs), może być używany do uzyskiwania dostępu do plików eksportu danych.
Podstawowa konfiguracja komputerowa i dostęp do Internetu	Nie		SeqAPASS to bezpłatne narzędzie online, z którego można łatwo korzystać za pośrednictwem połączenia internetowego. Nie jest wymagane pobieranie oprogramowania.