Method Article

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

DOI:

10.3791/63973

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leki chemioterapeutyczne mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia DNA w komórkach nowotworowych, prowadząc do apoptozy lub przedwczesnego starzenia. W przeciwieństwie do apoptotycznej śmierci komórki, starzenie się jest zasadniczo inną maszynerią hamującą rozprzestrzenianie się komórek rakowych. Dziesięciolecia badań naukowych ujawniły złożone patologiczne skutki starczych komórek rakowych w guzach i mikrośrodowiskach, które modulują komórki rakowe i komórki zrębu. Nowe dowody sugerują, że starzenie się jest silnym czynnikiem prognostycznym podczas leczenia raka, dlatego niezbędne jest szybkie i dokładne wykrywanie komórek starczych w próbkach raka. W pracy przedstawiono metodę wizualizacji i wykrywania starzenia się wywołanego terapią (TIS) w komórkach nowotworowych. Linie komórkowe chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL) potraktowano mafosfamidem (MAF) lub daunorubicyną (DN) i zbadano pod kątem markera starzenia, β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-gal), markera syntezy DNA 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU) i markera uszkodzenia DNA gamma-H2AX (γH2AX). Obrazowanie cytometrem przepływowym może pomóc w generowaniu obrazów pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości w krótkim czasie, aby jednocześnie wizualizować i określać ilościowo trzy markery w komórkach nowotworowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnorodność bodźców może wywołać starzenie się komórek, powodując wejście komórek w stan stabilnego zatrzymania cyklu komórkowego. Bodźce te obejmują wewnętrzne zmiany sygnalizacyjne lub stresy zewnętrzne. Sygnały wewnętrzne obejmują postępujące skracanie telomerów, zmiany w strukturze telomerów, modyfikację epigenetyczną, zaburzenia proteostazy, dysfunkcję mitochondriów i aktywację onkogenów. Stresy zewnętrzne obejmują sygnały stanu zapalnego i/lub uszkodzenia tkanek, promieniowanie lub leczenie chemiczne oraz deprywację żywieniową1,2,3,4.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Linie komórkowe DLBCL z leczeniem mafosfamidem lub daunorubicyną w celu wywołania starzenia się komórek

UWAGA: Protokół działa również w przypadku przylegających komórek rakowych. W zależności od wielkości komórki, wysiewa się 1-2 × 105 komórek do jednego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubuje płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez noc przed zabiegiem. Kroki protokołu są takie same jak w przypadku ogniw zawiesinowych, ale z dwoma wyjątkami. Najpierw komórki muszą zostać wytrypsynizowane z płytki po kroku 3.4. Po drugie, etapy mycia są wykonywane bez wirowania przed trypsyniza....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz kompensacyjna została wygenerowana za pomocą oprogramowania do analizy obrazu poprzez wczytanie zarejestrowanych danych jednokolorowych próbek kontrolnych. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym S1, wykryto istotne (wartość współczynnika ≥ 0,1) rozlanie się światła z EdU do C12FDG o wartości współczynnika przesłuchu 0,248, podczas gdy przesłuch wśród innych kanałów nie był istotny. Cztery różne linie komórkowe DLBCL potraktowano 5 μg / ml MAF lub 20 ng / ml DN w celu wywołania starzeni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ramach tej metody zbadano zdolność czterech różnych linii komórkowych DLBCL do wchodzenia w starzenie się po leczeniu chemioterapią, z obrazowaniem w jasnym polu i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej. Na poziomie pojedynczych komórek z powodzeniem wykryliśmy główne populacje starcze C12FDG+EdU-Ki67+ w leczonych komórkach KARPAS422 i WSU-DLCL2 oraz w mniejszym stopniu w komórkach OCI-LY1, podczas gdy linia komórkowa SU-DHL6 była oporna na leczenie. Różnica w zdolno.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem dla Yong Yu z Uniwersytetu Johannesa Keplera w Linzu (BERM16108001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciało anty-H2A.X Phospho (Ser139) Przeciwciało anty-H2A.XBiolegend613407
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Ki-67 (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-dodekanylaminofluoresceina di-β-D-galaktopiranozyd)Fisher Scientific11590276
Chloroquin-difosforanSigma aldrichC6628
Cleanser (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Zestaw do analizy obrazu Click-iT EdU Pacific Blue FlowScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)Millipore1.3704
Oprogramowanie do analizy obrazu (Amnis  POMYSŁY  6.3)LuminexCN-SW69-12
Instrument i oprogramowanie do obrazowania (Amnis  ImageStreamX  System obrazowania cytometru przepływowego Mk II i oprogramowanie INSPIRE)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
cykloheksyloamina mafosfamidowaNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydFisher Scientific11473704
PETG (2-fenyloetylo-β-D-tiogalaktozyd) Sigma aldrichP4902
saponinaSigma aldrich47036
OsłonaMilliporeBSS-1006-B
Zestaw SpeedBead doLuminex 400041
(0,4-0,7% podchlorynu)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575
Thermo sterylizatora ImageStream

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

Related Articles