Artykuł metodologiczny

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

DOI:

10.3791/63973

⸱

12 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leki chemioterapeutyczne mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia DNA w komórkach nowotworowych, prowadząc do apoptozy lub przedwczesnego starzenia. W przeciwieństwie do apoptotycznej śmierci komórki, starzenie się jest zasadniczo inną maszynerią hamującą rozprzestrzenianie się komórek rakowych. Dziesięciolecia badań naukowych ujawniły złożone patologiczne skutki starczych komórek rakowych w guzach i mikrośrodowiskach, które modulują komórki rakowe i komórki zrębu. Nowe dowody sugerują, że starzenie się jest silnym czynnikiem prognostycznym podczas leczenia raka, dlatego niezbędne jest szybkie i dokładne wykrywanie komórek starczych w próbkach raka. W pracy przedstawiono metodę wizualizacji i wykrywania starzenia się wywołanego terapią (TIS) w komórkach nowotworowych. Linie komórkowe chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL) potraktowano mafosfamidem (MAF) lub daunorubicyną (DN) i zbadano pod kątem markera starzenia, β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-gal), markera syntezy DNA 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU) i markera uszkodzenia DNA gamma-H2AX (γH2AX). Obrazowanie cytometrem przepływowym może pomóc w generowaniu obrazów pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości w krótkim czasie, aby jednocześnie wizualizować i określać ilościowo trzy markery w komórkach nowotworowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnorodność bodźców może wywołać starzenie się komórek, powodując wejście komórek w stan stabilnego zatrzymania cyklu komórkowego. Bodźce te obejmują wewnętrzne zmiany sygnalizacyjne lub stresy zewnętrzne. Sygnały wewnętrzne obejmują postępujące skracanie telomerów, zmiany w strukturze telomerów, modyfikację epigenetyczną, zaburzenia proteostazy, dysfunkcję mitochondriów i aktywację onkogenów. Stresy zewnętrzne obejmują sygnały stanu zapalnego i/lub uszkodzenia tkanek, promieniowanie lub leczenie chemiczne oraz deprywację żywieniową1,2,3,4. Wśród różnych typów starzenia najczęściej obserwowane i dobrze zbadane to starzenie replikacyjne, starzenie się wywołane onkogenem (OIS), starzenie się wywołane promieniowaniem i starzenie się wywołane terapią (TIS). OIS jest ostrą odpowiedzią komórkową na uszkodzenia genotoksyczne spowodowane stresem replikacyjnym generowanym przez nieprawidłową aktywację onkogenu i może do pewnego stopnia zapobiec patologicznemu postępowi od zmiany przednowotworowej do pełnoobjawowego guza. TIS występuje, gdy komórki nowotworowe są zestresowane przez chemioterapeutyki lub promieniowanie jonizujące5,6.

Starzenie się jest uważane za miecz obosieczny w patologii ze względu na jego wysoce dynamiczną naturę. Początkowo został opisany jako korzystny mechanizm hamujący nowotwór, który usuwa uszkodzone komórki z krążącej puli dzielących się komórek, chroniąc normalne funkcjonowanie narządów i hamując wzrost guza7,8,9. Jednak pojawiające się dowody sugerują ciemną stronę starzenia się. Starzejące się komórki wydzielają cytokiny prozapalne, znane jako fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem się (SASP), co prowadzi do zwłóknienia i nieprawidłowego funkcjonowania narządów oraz sprzyja inicjacji i progresji nowotworu10. Co więcej, starzejące się komórki nowotworowe przechodzą przeprogramowanie epigenetyczne i ekspresję genów równolegle z przebudową chromatyny i aktywacją trwałej odpowiedzi uszkodzenia DNA (DDR)11,12, nowo uzyskując nowe właściwości komórek macierzystych raka3. Chociaż nowotwory zdolne do starzenia się lepiej reagują na interwencję terapeutyczną w porównaniu z nowotworami niezdolnymi do starzenia się13, utrzymywanie się komórek starczych może prowadzić do złego rokowania długoterminowego, jeśli nie zostaną one skutecznie zidentyfikowane i wyeliminowane przez leki senolityczne5. Tak czy inaczej, wiarygodna metoda oceny starzenia ma duże znaczenie kliniczne, nie tylko ze względu na rokowanie w leczeniu, ale także ze względu na rozwój nowych strategii ukierunkowanych na komórki starcze.

Niezależnie od różnych wyzwalaczy, komórki starcze wykazują pewne cechy wspólne, w tym powiększoną, spłaszczoną, wielojądrową morfologię z dużymi wakuolami, znacznie rozszerzone jądra, tworzenie bogatej w H3K9me3 heterochromatyny związanej ze starzeniem (SAHF) w jądrze, uporczywe gromadzenie markera uszkodzenia DNA γH2AX ogniska, aktywowane p53-p21CIP1 i Rb-p16INK4a mechanizmy regulacyjne cyklu komórkowego, stabilne zatrzymanie cyklu komórkowego G1, masowa indukcja SASP i podwyższona aktywność β-galaktozydazy (SA-β-gal) związana ze starzeniem14. Ponieważ żaden pojedynczy marker nie jest wystarczający do zdefiniowania starzenia, barwienie enzymatyczne aktywności SA-β-gal, które jest uważane za złoty standard wykrywania starzenia, jest zwykle łączone z barwieniem immunohistochemicznym dla H3K9me3 i Ki67 w celu wykrycia TIS15. Jednak chemiczny SA-β-gal na bazie chromogenów jest trudny do określenia ilościowego. W tym przypadku połączyliśmy wykrywanie 5-dodekanoilaminofluoresceiny-di-β-D-galaktopyranozydu (C12FDG) opartego na fluorescencji SA-β-gal (fSA-β-gal) z barwieniem immunofluorescencyjnym dla γH2AX i DNA włączonego do EdU w celu identyfikacji komórek starczych C12FDG+EdU-γH2AX+ za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania cytometru przepływowego, który łączy szybkość, czułość i szczegółowe obrazy pojedynczych komórek z informacjami przestrzennymi, których nie może dostarczyć cytometria przepływowa i mikroskopia. Metoda ta umożliwia szybkie generowanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na pozycjonowanie i kwantyfikację sygnałów fluorescencyjnych w komórkach, przy jednoczesnym licencjonowaniu szybkiej analizy wielu próbek poprzez budowę standardowych rurociągów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Linie komórkowe DLBCL z leczeniem mafosfamidem lub daunorubicyną w celu wywołania starzenia się komórek

UWAGA: Protokół działa również w przypadku przylegających komórek rakowych. W zależności od wielkości komórki, wysiewa się 1-2 × 105 komórek do jednego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubuje płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez noc przed zabiegiem. Kroki protokołu są takie same jak w przypadku ogniw zawiesinowych, ale z dwoma wyjątkami. Najpierw komórki muszą zostać wytrypsynizowane z płytki po kroku 3.4. Po drugie, etapy mycia są wykonywane bez wirowania przed trypsynizacją.

  1. Policz komórki DLBCL i nasiona 1 × 106 komórek/ml w 4 ml pożywki na dołek do 6-dołkowej płytki hodowlanej. Hoduj komórki DLBCL w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.
  2. Dodaj MAF (5 μg/ml) lub DN (20 ng/ml) do hodowli komórkowej i delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać.
    UWAGA: MAF i DN nie są stabilne. Po rozpuszczeniu w DMSO, roztwór podstawowy należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy unikać cykli zamrażania/rozmrażania.
  3. Inkubować płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 3 dni.
  4. Po 3-dniowej inkubacji zebrać komórki DLBCL w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 100 × g, 4 °C przez 5 minut.
  5. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulki komórek z 4 ml świeżej pożywki i dodać zawiesiny z powrotem do płytki 6-dołkowej.
  6. Hodować płytkę komórkową w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez kolejne 2 dni przed zbiorem w celu analizy.

2. Przygotuj roztwory do barwienia (Tabela 1)

3. Barwienie komórek DLBCL różnymi markerami starzenia

UWAGA: Próbki komórek barwione indywidualnymi markerami (np. pacific blue-EdU, C12FDG, lub Alexa Fluor 647-γH2AX) są przygotowane do wygenerowania matrycy kompensacyjnej w celu skorygowania rozlewu fluorescencji podczas pomiaru. Chociaż jest to wysoce zalecane, krok ten może zostać zawieszony, gdy występuje pomijalne nakładanie się (wartość współczynnika kompensacji ≤ 0,1) widm emisyjnych między różnymi fluoroforami. Jednak użytkownicy muszą określić ustandaryzowane kroki kompensacji w przypadku korzystania z różnych przyrządów i paneli fluorescencyjnych.

  1. Dodać 10 mM roztworu EdU w stosunku 1:1,000 do hodowli komórkowej DLBCL wygenerowanej z kroku 1.6 (końcowe stężenie EdU wynosi 10 μM). Delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  2. Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 100 mM roztworu chlorochiny do końcowego stężenia 75 μM (patrz dyskusja). Delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 20 mM roztworu C12FDG w stosunku 1:1,000 do końcowego stężenia C12FDG wynoszącego 20 μM. Delikatnie kołysać płytką, aby wymieszać i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 100 mM roztworu 2-fenyloetylo-β-D-tiogalaktozydu (PETG) w stosunku 1:50, aby zatrzymać barwienie fSA-β-gal (końcowe stężenie PETG 2 mM). Delikatnie obróć płytkę, aby wymieszać.
  5. Przenieść komórki do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 100 × g, 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  6. Powtórz krok prania PBS. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 500 μl 4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd.
  7. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze pokojowej 250 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 4 ml PBS.
  8. Powtórz krok prania PBS. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do przepuszczalności saponin i przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze 250 × g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osady komórkowe w 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało 1:500 γH2AX w roztworze do inkubacji przeciwciał). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w ciemności.
  10. Odwirować probówki o stężeniu 250 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć 100 μl roztworu saponinowego.
  11. Powtórz krok prania dodatkowo dwa razy. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 500 μl koktajlu detekcyjnego EdU.
  12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Wirować przy 250 × g, w temperaturze pokojowej przez 5 min. Odrzucić sklarowany osad i przemyć 1 ml roztworu saponinowego.
  13. Powtórz krok prania dwa razy. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 20-50 μl PBS. Przejdź do sekcji 4, aby uzyskać sample pomiar.

4. Obrazowanie markerów starzenia za pomocą systemu obrazowania cytometru przepływowego

  1. Opróżnij butelkę na zużyty płyn. Sprawdź poziomy koralików prędkości, sterylizatora, środka czyszczącego, odbąbelkowca, osłony i odczynników do płukania (woda dejonizowana), aby zapewnić wystarczającą ilość płynów przed włączeniem przyrządu (patrz Tabela materiałów).
  2. Włącz instrument i oprogramowanie do obrazowania (patrz interfejs oprogramowania w Rysunek 1A).
  3. Kliknij przycisk Start, aby zainicjować fluidykę i kalibrację systemu.
    UWAGA: Ta procedura trwa około 45 minut.
  4. Ustaw powiększenie na 40x, ustaw prędkość fluidyki na niską i włącz lasery potrzebne w eksperymencie. Włącz lasery 405 nm, 488 nm i 642 nm, aby zmierzyć odpowiednio błękit EdU-pacific, C12FDG i Alexa Fluor 647-γH2AX (lub Alexa Fluor 647-Ki67). Ustaw Ch6 dla kanału rozproszonego oraz Ch1 i Ch9 dla jasnego pola.
  5. Zacznij od próbki, która ma mieć najwyższą fluorescencję, aby ustawić intensywność laserów. Delikatnie odwróć probówkę z próbką, aby wymieszać. Otwórz pokrywę probówki i włóż probówkę z próbką do stacji dokującej. Kliknij Załaduj, aby rozpocząć.
  6. Otwórz diagram punktowy i wybierz elementy Area_M01 i Aspekt Ratio_M01 odpowiednio dla osi X i Y. Ustaw bramkę powyżej współczynnika proporcji 0,5, aby wykluczyć dublety i agregacje komórek poniżej i po prawej stronie, a populację koralików prędkości po lewej stronie (Rysunek 1B).
  7. Otwórz wykres histogramu i wybierz element Gradient RMS_M01_Ch01 dla osi X. Wybierz populację singletów i ustaw bramkę, aby wybrać dla skoncentrowanych komórek (Rysunek 1C).
    UWAGA: System obrazowania automatycznie użyje koralików prędkości do dostosowania ostrości do obrazowania. Zaleca się jednak wybranie prawej połowy piku histogramu dla najlepiej ukierunkowanej populacji.
  8. Otwórz wykres histogramu i wybierz opcję Raw Max Pixel Intensities (Maksymalne intensywności pikseli RAW dla osi X) dla każdego kanału koloru (Ch2, 7 i 11). Dostosuj moce lasera (tj. 488 nm, 405 nm i 642 nm odpowiednio dla Ch2, 7 i 11), tak aby każdy fluorochrom miał wartość Raw Max Pixel między 100 a 4,000, aby uniknąć przesycenia.
    UWAGA: W tym eksperymencie ustawienie mocy lasera wynosi 50 mW, 200 mW i 50 mW dla laserów odpowiednio 488 nm, 405 nm i 642 nm.
  9. Wybierz skoncentrowaną populację do zarejestrowania i kliknij przycisk Pobierz, aby zmierzyć próbki DLBCL ze spójnymi ustawieniami. Podczas zmiany próbek do pomiaru kliknij przycisk Return, aby odzyskać probówkę z próbką. Naciśnij przycisk Załaduj, aby wyrzucić próbkę.
  10. Po zmierzeniu wszystkich próbek wyłącz jasne pole i laser rozpraszający. Zmierz jednokolorowe próbki kontrolne, aby wygenerować macierz kompensacji.
  11. Kliknij przycisk Shutdown (Zamknij), aby zamknąć system obrazowania.
  12. Przeanalizuj dane w oprogramowaniu do analizy obrazu.
    1. Użyj narzędzia Spot Wizard w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby automatycznie zliczyć i określić ilościowo ogniska jądrowe γH2AX w obrazach żywych komórek. Wybierz dwie populacje komórek (jedną z wysoką i jedną z niską liczbą komórek), aby przeszkolić kreatora lokalizacji w celu dalszej automatycznej analizy zliczania plamek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz kompensacyjna została wygenerowana za pomocą oprogramowania do analizy obrazu poprzez wczytanie zarejestrowanych danych jednokolorowych próbek kontrolnych. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym S1, wykryto istotne (wartość współczynnika ≥ 0,1) rozlanie się światła z EdU do C12FDG o wartości współczynnika przesłuchu 0,248, podczas gdy przesłuch wśród innych kanałów nie był istotny. Cztery różne linie komórkowe DLBCL potraktowano 5 μg / ml MAF lub 20 ng / ml DN w celu wywołania starzeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ramach tej metody zbadano zdolność czterech różnych linii komórkowych DLBCL do wchodzenia w starzenie się po leczeniu chemioterapią, z obrazowaniem w jasnym polu i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej. Na poziomie pojedynczych komórek z powodzeniem wykryliśmy główne populacje starcze C12FDG+EdU-Ki67+ w leczonych komórkach KARPAS422 i WSU-DLCL2 oraz w mniejszym stopniu w komórkach OCI-LY1, podczas gdy linia komórkowa SU-DHL6 była oporna na leczenie. Różnica w zdolno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem dla Yong Yu z Uniwersytetu Johannesa Keplera w Linzu (BERM16108001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-H2A.X Phospho (Ser139) Przeciwciało anty-H2A.XBiolegend613407
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Ki-67 (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-dodekanylaminofluoresceina di-β-D-galaktopiranozyd)Fisher Scientific11590276
Chloroquin-difosforanSigma aldrichC6628
Cleanser (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Zestaw do analizy obrazu Click-iT EdU Pacific Blue FlowScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)Millipore1.3704
Oprogramowanie do analizy obrazu (Amnis  POMYSŁY  6.3)LuminexCN-SW69-12
Instrument i oprogramowanie do obrazowania (Amnis  ImageStreamX  System obrazowania cytometru przepływowego Mk II i oprogramowanie INSPIRE)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
cykloheksyloamina mafosfamidowaNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydFisher Scientific11473704
PETG (2-fenyloetylo-β-D-tiogalaktozyd) Sigma aldrichP4902
saponinaSigma aldrich47036
OsłonaMilliporeBSS-1006-B
Zestaw SpeedBead doLuminex 400041
(0,4-0,7% podchlorynu)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575
Thermo sterylizatora ImageStream

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
  3. Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
  4. Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347(2010).
  5. Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
  6. Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
  7. Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
  8. Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
  9. Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
  10. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
  11. Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
  12. Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
  13. Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651(2020).
  14. Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
  15. Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
  16. Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
  17. Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
  18. Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
  19. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  20. Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
  21. Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740(2021).
  22. Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

Powiązane artykuły