Artykuł metodologiczny

Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63974

⸱

20 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU, Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics, Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do pomiaru modułów sprężystości obszarów bogatych w kolagen w prawidłowej i chorej wątrobie za pomocą mikroskopii sił atomowych. Jednoczesne zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej zapewnia wysoką precyzję przestrzenną do lokalizacji obszarów bogatych w kolagen w wycinkach wątroby.

Streszczenie

Usztywnienie macierzy zostało uznane za jeden z kluczowych czynników postępu zwłóknienia wątroby. Ma głęboki wpływ na różne aspekty zachowania komórek, takie jak funkcja komórki, różnicowanie i ruchliwość. Ponieważ jednak procesy te nie są jednorodne w całym narządzie, coraz ważniejsze staje się zrozumienie zmian we właściwościach mechanicznych tkanek na poziomie komórkowym.

Aby móc monitorować usztywnienie obszarów bogatych w kolagen w płatach wątroby, ten artykuł przedstawia protokół pomiaru modułów sprężystości tkanki wątrobowej z wysoką precyzją przestrzenną za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). AFM jest czułą metodą, która może charakteryzować lokalne właściwości mechaniczne, obliczane jako moduł Younga (określany również jako moduł sprężystości). AFM w połączeniu z mikroskopią polaryzacyjną może być stosowany do specyficznego lokalizowania obszarów rozwoju zwłóknienia w oparciu o dwójłomność włókien kolagenowych w tkankach. Korzystając z przedstawionego protokołu, scharakteryzowaliśmy sztywność obszarów bogatych w kolagen ze zwłókniałych wątrob myszy i odpowiadających im obszarów w wątrobach myszy kontrolnych.

Wraz z rozwojem zwłóknienia zaobserwowano wyraźny wzrost sztywności obszarów kolagenowo-dodatnich. Przedstawiony protokół pozwala na wysoce powtarzalną metodę pomiaru AFM, dzięki zastosowaniu łagodnie utrwalonej tkanki wątroby, która może być wykorzystana do lepszego zrozumienia zainicjowanych przez chorobę zmian lokalnych właściwości mechanicznych tkanek i ich wpływu na los sąsiednich komórek.

Wprowadzenie

Wątroba jest ważnym organem do utrzymania homeostazy organizmów1,2. Przewlekłe choroby wątroby są przyczyną ~2 milionów zgonów rocznie na całym świecie3. Powstają one najczęściej jako infekcje wirusowe, zaburzenia autoimmunologiczne, zespoły metaboliczne lub choroby związane z nadużywaniem alkoholu i towarzyszy im postępujące zwłóknienie wątroby. Uszkodzenie wątroby wywołuje reakcję zapalną, która prowadzi do aktywacji komórek odkładających macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w odpowiedzi gojenia się ran. Jednak w przypadku przewlekłego urazu, nadmiar ECM tworzy nierozwiązaną tkankę bliznowatą w wątrobie, prowadząc do rozwoju zwłóknienia wątroby, marskości wątroby, raka wątroby i ostatecznie do niewydolności wątroby4.

Uszkodzenie hepatocytów natychmiast powoduje zwiększoną sztywność wątroby5,6. Wpływa to bezpośrednio na funkcję hepatocytów, aktywuje komórki gwiaździste wątroby (HSC) i fibroblasty wrotne oraz powoduje ich transróżnicowanie do miofibroblastów odkładających kolagen7,8. Odkładanie się włóknistego ECM dodatkowo zwiększa sztywność wątroby, tworząc samowzmacniającą się pętlę sprzężenia zwrotnego usztywnienia wątroby i aktywacji komórek wytwarzających macierz

.

Sztywność wątroby stała się więc ważnym parametrem w prognozowaniu chorób wątroby. Zmiana właściwości biomechanicznych tkanki może być wykryta wcześniej niż zwłóknienie może być zdiagnozowane za pomocą analizy histologicznej. Dlatego opracowano różne techniki pomiaru sztywności wątroby zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych. W warunkach klinicznych elastografia przejściowa (TE)9,10,11,12,13 i elastografia rezonansu magnetycznego (MRE)14,15,16,17,18 zostały wykorzystane do nieinwazyjnego diagnozowania wczesnych stadiów uszkodzenia wątroby poprzez badanie dużej sztywności wątroby19.

W TE, fale ultradźwiękowe o łagodnej amplitudzie i niskiej częstotliwości (50 Hz) są rozchodzone przez wątrobę, a ich prędkość jest mierzona, co jest następnie wykorzystywane do obliczenia modułu sprężystości tkanki13. Jednak ta technika nie jest przydatna dla pacjentów z wodobrzuszem, otyłością lub niższymi przestrzeniami międzyżebrowymi z powodu niewłaściwego przekazywania fal ultradźwiękowych przez tkanki otaczające wątrobę9.

MRE opiera się na metodzie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i wykorzystuje mechaniczne fale ścinające o częstotliwości 20-200 Hz do celowania w wątrobę. Specyficzna sekwencja obrazowania metodą rezonansu magnetycznego jest następnie wykorzystywana do śledzenia fal wewnątrz tkanki i obliczania sztywności tkanki16. Wartości sztywności zgłoszone zarówno za pomocą technik TE, jak i MRE dobrze korelują ze stopniem zwłóknienia wątroby uzyskanym z biopsji próbek ludzkiej wątroby uszeregowanych za pomocą histologicznych wyników METAVIR 20 (Tabela 1). TE i MRE zostały również przystosowane do pomiaru sztywności wątroby w modelach gryzoni do celów badawczych21,22,23. Ponieważ jednak obie metody wyprowadzają wartości sztywności na podstawie odpowiedzi tkanki na rozchodzące się fale ścinające, uzyskane wartości mogą nie odzwierciedlać bezwzględnej sztywności mechanicznej tkanki.

Dla bezpośredniej mechanicznej charakterystyki wątroby gryzoni, Barnes et al. opracowali test modelowo-żelowo-tkankowy (test MGT) polegający na osadzeniu tkanki wątroby w żelu poliakrylamidowym24. Żel ten jest ściskany przez pulsacyjną jednostajną siłę, na podstawie której można obliczyć moduł Younga. Test MGT wykazuje dobrą korelację z testem wgłębień dostosowanym zarówno do prawidłowej, jak i zwłóknienia wątroby24 (Tabela 1).

Tabela 1: Wartości sztywności wątroby na poziomie masowym. TE i MRE porównane z bezpośrednimi pomiarami mechanicznymi ex vivo modułów sprężystości wątroby przy użyciu testów wgłębień i MGT dla wątroby z różnych źródeł. Zależność między E i G jest określona przez E = 2G (1 + v), gdzie v jest stosunkiem Poissona próbki; F0 do F4 reprezentują wynik zwłóknienia w systemie punktacji METAVIR, gdzie F0 oznacza niskie zwłóknienie lub jego brak, a F4 marskość wątroby. Skróty: TE = elastografia przejściowa; MRE = elastografia rezonansu magnetycznego; MGT = model-żel-tkanka; E = moduł sprężystości (Younga); G = moduł ścinania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Jedną z głównych wad ogólnych pomiarów sztywności wątroby jest to, że nie zapewniają one rozdzielczości heterogeniczności sztywności wątroby na poziomie komórkowym. Podczas progresji zwłóknienia obszary bogate w kolagen wykazują większą sztywność w porównaniu z otaczającymi je miąższami25,26. Ten gradient sztywności lokalnie wpływa na komórki rezydentne i odgrywa ważną rolę w napędzaniu niejednorodności HSC27. W związku z tym zmiany w lokalnych właściwościach mechanicznych podczas rozwoju choroby wątroby muszą być scharakteryzowane na poziomie mikroskopowym, aby lepiej zrozumieć postęp zwłóknienia.

AFM pozwala na pomiar właściwości mechanicznych tkanek z wysoką rozdzielczością i wysoką czułością na siłę. AFM wykorzystuje końcówkę wspornika do wgniatania powierzchni próbki siłami tak niskimi, jak kilka pikonewtonów, wywołując deformację na poziomie mikroskopowym lub nanoskopowym w oparciu o geometrię i rozmiar zastosowanej końcówki. Reakcja siły próbki na przyłożone odkształcenie jest następnie mierzona jako ugięcie w klasie cantilever28. Krzywe siła-przemieszczenie są zbierane na podstawie podejścia i cofania wspornika, który może być wyposażony w odpowiednie modele mechaniki kontaktowej w celu oceny lokalnej sztywności próbki29.

Oprócz pomiaru sztywności danego obszaru, AFM może również dostarczyć informacji topograficznych o konkretnych cechach próbki, takich jak struktura włókien kolagenowych30,31,32. Wiele badań opisało zastosowanie AFM do pomiaru sztywności różnych zdrowych i chorych tkanek, takich jak skin32,33, lung34,35, brain36, mammary37,38,39, chrząstka40, lub heart41,42,43,44 zarówno z próbek modelu pacjenta, jak i myszy. Co więcej, AFM został również wykorzystany in vitro do określenia sztywności komórek i zewnątrzkomórkowych rusztowań białkowych45,46,47.

Pomiar właściwości mechanicznych próbek biologicznych za pomocą AFM jest nietrywialny ze względu na ich miękkość i kruchość. W związku z tym różne badania ustandaryzowały różne warunki i ustawienia, które dają bardzo zmienne wartości modułów Younga (przejrzane przez Mckee et al.48). Podobnie jak w przypadku innych tkanek miękkich, wartości modułu Younga w wątrobie przy różnych stopniach zwłóknienia wątroby również wykazują dużą zmienność (Tabela 2). Różnice w wartościach modułu Younga wynikają z różnic w trybie pracy AFM, końcówce wspornika, metodzie przygotowania próbki, grubości próbki, głębokości i siłach wgłębienia, środowisku tkanki wątroby podczas pomiaru oraz metodzie analizy (tabela 2).

Tabela 2: Wartości sztywności wątroby na poziomie komórkowym. Wartości sztywności wątroby uzyskane za pomocą AFM opisują właściwości mechaniczne wątroby na poziomie komórkowym. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; E = moduł sprężystości (Younga); PFA = paraformaldehyd; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Ten artykuł opisuje protokół powtarzalnego pomiaru modułów Younga bogatych w kolagen obszarów zwłóknienia w tkance wątroby za pomocą AFM z precyzyjną lokalizacją zapewnioną przez użycie mikroskopii polaryzacyjnej. Podaliśmy czterochlorek węgla (CCl4) w celu wywołania odkładania się kolagenu w sposób odśrodkowy49 w modelu mysim, niezawodnie naśladując kluczowe aspekty zwłóknienia ludzkiej wątroby50. Spolaryzowane obrazy mikroskopowe umożliwiają wizualizację kolagenu w wątrobie ze względu na dwójłomność włókien kolagenowych51, co pozwala na dokładne ustawienie końcówki wspornika nad pożądanym obszarem zainteresowania w obrębie zrazika wątrobowego52.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytutu Genetyki Molekularnej oraz zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/EU dotyczącą eksperymentów na zwierzętach. Ogólny schemat przedstawionego protokołu znajduje się na Rysunku 1.

Metoda mikroskopowa przekroju wątroby: konfiguracja wspornika, polaryzacja, analiza mapy sztywności, krzywe siły.
Rysunek 1: Ogólny schemat oceny modułu Younga w wątrobach myszy za pomocą AFM. (A) Izolacja wątroby od myszy kontrolnych lub traktowanych, a następnie krojenie i przechowywanie w −80 °C (maksymalny czas przechowywania: 2 tygodnie). (B) Przymocowanie sferycznej kulki do wspornika z późniejszym utwardzaniem kleju przez noc (lewa strona). Kalibracja wspornika, a następnie montaż próbki (prawa strona). (C) Ustawienie polaryzatora i analizatora w celu wizualizacji jasnych struktur kolagenu, a następnie nałożenie obrazu z kamery na pole pomiarowe pod wspornikiem AFM. (D) Pozyskiwanie map sztywności i analiza. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; PBS = roztwór soli fosforanowej; OCT = optymalny związek do cięcia w niskiej temperaturze; CCl4 = tetrachlorek węgla. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie próbek I

  1. Wyciąć wątrobę z otwartego brzucha myszy poddanej eutanazji poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych w znieczuleniu. Wyizolować lewy płat boczny i zamrozić jego boczną połowę w związku OCT (optimal cutting temperature), szybko schładzając go na suchym lodzie. Tkankę zatopioną w OCT przechowywać w temperaturze −80 °C.
    UWAGA: Wcześniejsze badania wykazały, że wartości sztywności są podobne dla tkanek mrożonych i świeżych25,26.
  2. Przygotować skrawki wątroby o grubości 30 µm na szkiełkach dodatnio naładowanych przy użyciu kriostatu i przechowywać szkiełka w temperaturze −80 °C do dnia pomiaru AFM, nie dłużej niż przez 2 tygodnie.

2. Konfiguracja urządzenia

  1. Mocowanie kuleczki o średnicy 5,7 µm do końcówki wspornika AFM (Rycina uzupełniająca S1, kroki 1-5)
    UWAGA: Mocowanie kuleczki do wspornika zostało wcześniej opisane przez Normana i współpracowników46.
    1. Równomiernie rozprowadzić zawiesinę kuleczek z żywicy melaminowej o średnicy 5,7 µm na połowie powierzchni szkiełka przedmiotowego i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w celu odparowania rozpuszczalnika (Rycina uzupełniająca S1, krok 1).
    2. Na drugiej połowie szkiełka, używając końcówki 10 µL, nanieść cienką linię wcześniej wymieszanej żywicy epoksydowej o długim czasie żelowania (Rycina uzupełniająca S1, krok 1).
    3. Załadować sondę ze wspornikiem do głowicy AFM zgodnie z instrukcją producenta.
    4. Zamontować szkiełko i przykryć go głowicą AFM z zainstalowaną sondą ze wspornikiem.
      UWAGA: W badaniu zastosowano wspornik SD-qp-BioT-TL-10.
    5. Przesunąć wymieszany klej epoksydowy na środek szkiełka i zbliżyć do niego wspornik z niewielką siłą (aby postępować zgodnie z tym protokołem, ustawić setpoint na 1 V ; Rycina uzupełniająca S1, krok 2).
      UWAGA: Przed zbliżeniem się do powierzchni szkiełka należy upewnić się, że laser jest wycentrowany na końcówce wspornika, co sygnalizuje wysokie napięcie sumaryczne, postępując zgodnie z krokami 6-8 w sekcji 2, część 3, Kalibracja stałej sprężystości wspornika AFM.
    6. Po zetknięciu się końcówki sondy z klejem, przesunąć ją tuż nad szkiełko, aby usunąć nadmiar kleju.
    7. Następnie wycofać końcówkę wspornika ze szkiełka i przesunąć szkiełko tak, aby pojedyncza kuleczka znalazła się w centrum (Rycina uzupełniająca S1, krok 3). Ponownie zbliżyć sondę AFM do kuleczki z większą siłą (setpoint 2 V), aby przymocować kuleczkę do środka sondy, i pozostawić ją w tej pozycji przez co najmniej 10 s (Rycina uzupełniająca S1, krok 4).
    8. Wyjąć sondę i pozostawić ją na noc w temperaturze pokojowej w celu utwardzenia kleju lub postępować zgodnie z instrukcją dożycia epoksydowej (Rycina uzupełniająca S1, krok 5).
  2. Ustawienie polaryzatora i analizatora
    1. Aby zlokalizować obszary zainteresowania w przekrojach wątroby, przygotować mikroskop z polaryzatorem i analizatorem. Ustawić ich azymuty drgań pod kątem od 0° do 90° względem siebie, obracając jeden z nich względem drugiego ręcznie lub automatycznie, aby zminimalizować światło przechodzące i zmaksymalizować liczbę promieni nadzwyczajnych przechodzących przez obiektyw. Upewnić się, że włókna kolagenowe są jasne na ciemnym tle w obrazie spolaryzowanym (Rycina 2), co objawia się przesunięciem szczytu histogramu obrazu w stronę jasnych pikseli.

Obraz mikroskopowy, analiza CV i PV, powiększony szczegół podkreślający porównanie struktury komórkowej.
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy mikroskopowe wykazują wyraźną wizualizację włókien kolagenowych w mikroskopii spolaryzowanej w porównaniu z obrazami w polu jasnym. Przekroje wątroby myszy leczonych CCl4 przez 3 tygodnie poddano mikroskopii (A) w polu jasnym oraz (B) spolaryzowanej. Dwójłomne włókna kolagenowe są wyraźnie widoczne na biało na obrazach spolaryzowanych w porównaniu z obrazami w polu jasnym. Czerwona ramka reprezentuje obszar bogaty w kolagen, wykorzystany do pomiaru AFM. Wstawki przedstawiają powiększone widoki obszaru w czerwonej ramce. Pasek skali = 100 µm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 = tetrachlorek węgla; CV = żyła główna wątroby; PV = żyła wrotna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: W tym protokole głowica AFM może zostać zainstalowana na dowolnym odpowiednim mikroskopie odwróconym z możliwością wstawienia polaryzatora i analizatora. System musi zostać umieszczony w jednostce izolacyjnej w celu redukcji szumu tła.

  1. Kalibracja stałej sprężystości wspornika AFM
    1. Zamontuj sondę z wspornikiem (przygotowaną zgodnie z krokami 1-8 w sekcji 2, część 1, Mocowanie kuleczki o rozmiarze 5,7 μm do końcówki wspornika AFM) w głowicy AFM zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Oczyść wspornik 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu wspornika podczas pomiaru. Przepłucz go obficie wodą destylowaną, aby usunąć resztki etanolu z końcówki.
    3. Włącz tryb kontaktowy (contact) i wybierz mapowanie sił (force mapping) jako metodę pomiaru.
    4. Otwórz wszystkie odpowiednie okna (Z Stepper Motors, Motorized Stage Control, Data Viewer, Force Scan Map Oscilloscope, Laser Alignment oraz okno Camera) w zakładkach oprogramowania, klikając odpowiednie przyciski.
    5. Umieść czyste szkiełko przedmiotowe zawierające 1,2 mL 1x solistrolu fosforanowego (PBS) na obszarze około 2 cm x 4 cm wyznaczonego hydrofobowym markerem. Zamontuj głowicę AFM na stoliku mikroskopu i upewnij się, że wspornik jest całkowicie zanurzony w PBS.
    6. Ustaw ostrość obiektywu na końcówce wspornika. Zmniejsz intensywność światła przechodzącego w mikroskopie, aby uzyskać lepszy widok pozycji lasera na monitorze.
    7. Skieruj laser na przezroczysty koniec wspornika (pod którym przymocowana jest sferyczna kuleczka) i ustaw lustro za pomocą pokręteł w głowicy AFM, aby zmaksymalizować całkowitą intensywność wiązki lasera na detektorze (wyświetlaną jako suma w oknie Laser Alignment).
    8. Ustaw detektor fotodiodowy za pomocą pokręteł znajdujących się w głowicy AFM, aby laser znajdował się w jego centrum.
    9. Pozostaw wspornik do stabilizacji na 15 min przed przystąpieniem do kalibracji.
    10. Otwórz Menedżera kalibracji (Calibration manager) i wprowadź typ wspornika, wymiary wspornika oraz warunki środowiskowe. Skalibruj stałą sprężystości i czułość (znaną również jako odwrotna czułość dźwigni optycznej, InvOLS), klikając Kalibruj (Calibrate). Potwierdź dokładność uzyskanej po kalibracji stałej sprężystości z deklaracją producenta. Skalibruj wspornik w trybie bezstykowym (contact-free) (kalibracja jest wykonywana przez oprogramowanie przy użyciu twierdzenia termicznego opracowanego przez Sader i wsp.58).
      UWAGA: Stała sprężystości wspornika reprezentuje jego sztywność i jest określana jako siła oporu wspornika podczas odkształcania w stosunku do długości odkształcenia w N/m. Czułość wspornika określa wartość odpowiedzi fotodiody (w woltach) w odpowiedzi na ugięcie wspornika (w nanometrach) i jest zwykle podawana w nm/V59. W trybie bezstykowym widmo szumu termicznego jest rejestrowane i dopasowywane do funkcji hydrodynamicznej60 automatycznie przez oprogramowanie sterujące AFM po kalibracji. Dopasowanie dostarcza parametry kalibracyjne, mianowicie stałą sprężystości i InvOLS. Stała sprężystości wspornika SD-qp-BioT-TL-10 użytego w tej badaniu wynosiła 0,09 N/m, zgodnie z deklaracją producenta.

3. Przygotowanie próbek II

  1. Odprzeżyć zamrożone sekcje (przechowywane w −80 °C, zgodnie z opisem w sekcji 1, Przygotowanie próbek I) w temperaturze pokojowej przez 2 min.
  2. Utrwalić sekcje w lodowatej 4% paraformaldehydzie (PFA) w 1x PBS przez 10 min w 4 °C, a następnie dokładnie przemyć (5x) w 1x PBS. Osuszyć resztki PBS wokół sekcji za pomocą chusteczki i wyznaczyć obszar o wymiarach około 2 cm x 4 cm wokół sekcji wątroby za pomocą hydrofobowego markera. Przykryć próbkę 1x PBS (upewniając się, że wyznaczony obszar zawiera ~1.2 mL 1x PBS). Próbkę wykorzystać do pomiarów AFM.
    UWAGA: Ze względu na to, że PFA jest substancją niebezpieczną, należy obchodzić się z nią ostrożnie, aby zapobiec kontaktowi ze skórą lub oczami. Aby uniknąć wdychania toksycznych oparów, wszystkie procedury z użyciem PFA muszą być przeprowadzane w certyfikowanym dygestorium chemicznym lub innym zatwierdzonym obszarze wentylowanym.

4. Pomiar

  1. Włącz funkcję autozapisu, przechodząc do Konfiguracja zakładka i zaznaczenie znakiem wyboru AutozapisOkreśl nazwę pliku i katalog do zapisu plików pomiarowych, przechodząc do Konfiguracja zakładka, a następnie kliknięcie w Zapisywanie ustawień.
  2. Należy załadować próbkę (przygotowaną zgodnie z rozdziałem 3, Przygotowanie próbki II). Należy zbliżyć zwezglę AFM do powierzchni tkanki, włączając Laser i klikając w Metoda klucz. Po zetknięciu końcówki z powierzchnią tkanki, wycofaj końcówkę wspornika w taki sposób, aby pozostała ona w ognisku obiektywu (klikając w Wycofanie publikacji klawisz, który cofa belkę do górnego zakresu pozycjonowania piezoelektryka). Ponownie ustaw detektor, jeśli wiązka lasera przesunie się z jego centrum na Wyrównanie laserowe okno
  3. Wyłącz Laser i nałóż mapy pomiarowe AFM na pole optyczne mikroskopu, klikając w Akcesoria zakładkę, a następnie wybór Bezpośrednia kalibracja optyczna nakładania warstwW następnym oknie kliknij Następny aby wykonać serię obrazów z pomiaru określonego obszaru za pomocą belki dwuwpisowej. Kliknij Następny ponownie, aby przejść do następnego okna.
  4. Na pierwszym obrazie kliknij ręcznie w środek końcówki wspornika, aby zaznaczyć położenie końcówki w oprogramowaniu. Rozmiar okręgu przedstawiającego położenie końcówki można zmieniać poprzez wskazanie jego Promień aby zwiększyć dokładność. Kliknij Kalibrować aby automatycznie wykryć pozycję końcówki wspornika na wszystkich obrazach. Potwierdź dokładność detekcji końcówki, przeglądając obrazy.
  5. Kliknij Dalej a następnie Zakończ aby zakończyć nakładanie obrazów optycznych i zapisać serię obrazów zarejestrowanych podczas kalibracji optycznej.
  6. Wycofać belkę w celu uniknięcia jej kolizji z wyższymi powierzchniami na szkiełku. Przesuń stolik, aby obszar bogaty w kolagen znalazł się wewnątrz zielonej ramki widocznej w Przeglądarka danych zakładka przy użyciu obrazu spolaryzowanego. Wybierz obszar bogaty w kolagen, tworząc wokół niego prostokąt poprzez długie naciśnięcie lewego przycisku myszy wewnątrz wskazanego zielonego pola. Zdefiniuj wymiary, orientację i rozdzielczość wybranego obszaru w sekcji Siatka zakładka po lewej stronie. Kliknij w Potwierdzenie nowego obszaru skanowania aby ustawić zaznaczony obszar jako obszar pomiaru.
  7. Przechowywać Wzmocnienie sygnału (IGain) i Wzmocnienie PGain-parametry pętli sprzężenia zwrotnego-przy wartościach domyślnych, o ile nie wystąpią poważne niestabilności w postaci nadwrażliwości układu. Aby postępować zgodnie z niniejszym protokołem, należy ustawić IGain w 50 Hz i Wzmocnienie P w 0.001.
  8. Ustawić Wartość zadana w 1 nN.
    UWAGA: Wartość zadana jest siłą oddziaływania między końcówką a powierzchnią w stanie stacjonarnym. W przypadku większości próbek miękkich (komórek, żeli i tkanek), Wartość zadana wartości w zakresie 0,5-2,0 nN są odpowiednie.
  9. Wybierz Względna wartość punktu nastawy zależnie od właściwości mechanicznych badanego materiału oraz sztywności wspornika. W niniejszym protokole wartość tę należy ustawić na 5 nN.
    UWAGA: Względna wartość zadana (setpoint) reprezentuje maksymalną siłę oddziaływania w momencie osiągnięcia szczytu krzywej siła-odległość i powrotu ruchu końcówki do poziomu bazowego. W przypadku materiałów miękkich (1–50 kPa) parametr ten ustawia się w nanoniutonach (nN). Ponadto, dla miękkiego wspornika (o stałej sprężystości od 0,05 N/m do 0,35 N/m) maksymalna siła, jaką można przyłożyć, wynosi około 50 nN. Dostosuj Wartość zadana i Względne wartości nastaw odpowiednio.
    1. Należy upewnić się, że podana wartość zadana nie prowadzi do uzyskania głębokości wgłębienia większej niż promień wkluwacza sferycznego, w przeciwnym razie powierzchnia wgniecenia nie będzie mogła zostać prawidłowo zdefiniowana podczas obliczania modułu Younga. Oblicz średnią wartość głębokości wgłębienia po pierwszym cyklu wgnieceń; sposób przetwarzania zarejestrowanych danych opisano w sekcji 5, Analiza danych. Dostosuj Wartość zadana jeżeli jest to konieczne.
  10. Zestaw Korekta linii bazowej jako 5.
    UWAGA: Tutaj Poziom wyjściowy odnosi się do stopnia wielomianu użytego do dopasowania krzywych zbliżania i oddalania. Ustawienie wartości bazowej na 5 pozwala na dopasowanie krzywych z wysoką rozdzielczością, co zapewnia uchwycenie szumu tła podczas pomiarów.
  11. Wybierz zakres ruchu ramienia w osi Z (długość strefy Z) zgodnie z topografią powierzchni próbki. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy ustawić długość strefy Z w 15 µm.
    UWAGA: Wysoka wartość (np. 15 μm) zmniejsza czułość pomiaru, ale jest zazwyczaj wymagane w przypadku próbek o bardzo nieregularnej powierzchni, takich jak włóknista tkanka wątroby.
  12. Zestaw ruch w osi Z Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Stały czas trwania.
    UWAGA: Ruch w osi Z może być również ustawione na Stała prędkość aby wyświetlić dane dotyczące ruch w osi Z (Zwiększenie prędkości i Wydłużenie czasu) w innym trybie.
  13. Ustawić Wydłużenie czasu do 1 sUstawienie Opóźnienie wydłużenia i Opóźnienie retrakcji Jako 0.
    UWAGA: Należy stosować prędkości wysuwu wynoszące >5.0 µm/s dla materiałów bardzo miękkich61ponieważ niższe prędkości wgłębiania spowodują bardziej lepką i mniej sprężystą odpowiedź miękkich powierzchni. Opóźnienie wydłużenia i Opóźnienie retrakcji są parametrami, które można wykorzystać do badania specyficznych oddziaływań między końcówką wspornika a podłożem (np. oddziaływań białek unieruchomionych na powierzchni wspornika z białkami unieruchomionymi na powierzchni szkiełka).
  14. Zestaw Częstotliwość próbkowania jako 5000 Hz.
    UWAGA: Częstotliwość próbkowania (Sample Rate) odnosi się do częstotliwości rejestrowania punktów na pełnej krzywej zbliżenia i cofania. Należy ustawić tę wartość na wysoką (np. 5000 Hz) aby uniknąć pominięcia niektórych obszarów krzywych ze względu na ich niezwykle szybkie przejścia.
  15. Oznacz Zamknięta pętla z a Kleszcz aby umożliwić działanie systemu pętli sprzężenia zwrotnego, który zapewnia stałą odległość między powierzchnią próbki a końcówką wspornika.
  16. Odłącz stolik motorowy, odznaczając Zaangażować i kliknij w Metoda zbliżyć ramie do próbki. Kliknij w Rozpocznij skanowanie aby rozpocząć zbieranie krzywych siła-odległość w obszarze ustawionym w kroku 6; Sekcja 4, Pomiar.

5. Analiza danych

  1. Przeanalizuj uzyskane dane przy użyciu oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym „AtomicJ” (które można pobrać ze strony https://sourceforge.net/projects/jrobust/). 
    UWAGA: Program obsługuje pliki zebrane za pomocą mikroskopów sił atomowych firm Agilent Technologies, JPK Instruments lub Bruker.
  2. Wczytaj krzywe sił do programu, klikając w przetwarzanie krzywych i map sił ikona w AtomicJ (Rycina dodatkowa S2A, x). W w ramach asystent przetwarzaniadodaj mapy do analizy, klikając w Dodaj przycisk (Rycina dodatkowa S2A, y). Kliknij Następny po załadowaniu map (Rysunek dodatkowy S2A, z).
  3. W następnym oknie określ ustawienia przetwarzania zgodnie z poniższymi krokami (odpowiadającymi krokom w Rycina dodatkowa S2B, kroki 1-11):
    1. Oszacuj punkt styku między próbką a belką wspornikową ręcznie za pomocą obliczeń lub automatycznie, wykorzystując zestaw parametrów dopasowania krzywej. Aby postępować zgodnie z niniejszym protokołem, użyj automatyczny oszacowanie punktu styku.
    2. Wyznaczamy punkt kontaktowy między belką wspornikową a próbką przez Klasyczna metoda siatki ogniskowej.
    3. Wybierz metoda szacowania aby uzyskać najlepsze wyznaczenie punktu kontaktu na podstawie jakości zmierzonych krzywych sił, co musi zostać określone empirycznie podczas optymalizacji analizy danych. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć Metoda niezależna od modelu.
    4. Dopasuj krzywą wciskania siłowego za pomocą Klasyczny model (użycie Klasyczne L2 dla dopasowanie modelu aby postępować zgodnie z tym protokołem).
      UWAGA: Dopasowanie modelu i Estymator kontaktów są parametrami, które określają odpowiednio sposób dopasowania krzywych przez oprogramowanie oraz sposób wyznaczania punktu styku na dopasowanej krzywej. W przypadku tych pomiarów Klasyczny zastosowano opcję wykorzystującą regresję najmniejszych kwadratów. Proces ten traktuje każdy punkt o niskiej sile na krzywej jako próbny punkt kontaktu i dopasowuje wielomian do obszaru przed tym punktem. Następnie do zebranych danych dotyczących siły wciskania dopasowywany jest odpowiedni model kontaktu. Punkt, dla którego suma kwadratów jest najniższa, przyjmuje się za punkt kontaktu. W zależności od jakości uzyskanych krzywych siły można zastosować inne metody.62,63.
    5. Ustaw odpowiednią dopasowanie modelu do Wycofać krzywa
    6. Zestaw Współczynnik Poissona jako 0.45, zgodnie z zaleceniami dla tkanek miękkich, takich jak wątroba24.
    7. Ustaw dopasowanie krzywej za pomocą a stopień wyjściowy z 3 oraz i stopień kontaktu z 1Zmień stopień dopasowania wielomianowego w zależności od skali odchyleń krzywych od modelu.
    8. Wybierz model wykorzystany do dopasowania krzywych wycofywania. Użyj Sneddon model, który oblicza moduł Younga na podstawie równania (1) i równanie (2):
      Wzór na równanie sprężystości przedstawiający zależność między naprężeniem a odkształceniem, kluczowy w analizie inżynierii materiałowej.   (1)
      δ = Równanie logarytmiczne, \( \frac{a}{2} \ln\left(\frac{R+a}{R-a}\right) \); wzór matematyczny.    (2)
      gdzie F jest siłą, E jest modułem Younga, v współczynnik Poissona próbki, $\delta$ to głębokość wgniecenia, a jest promieniem kontaktu, a R jest promieniem sfery62,63.
    9. Wypełnij promień promienia końcówki sferycznej w mikrometrach (2.9 µm w niniejszym protokole).
    10. Załaduj Stała sprężystości i InvOLS z plików danych poprzez włączenie odczyt danych (zaznacz pola).
    11. Kliknij w Zakończ.
      UWAGA: Przeanalizowane dane przedstawiono w formie map ugięcia w pionie, wysokości, adhezji, siły kontaktu, deformacji, siły adhezji oraz Rq2 wartości, nachylenie, moduł Younga, wcięcie przejścia, siła przejścia oraz pozycja kontaktu obliczone dla każdej krzywej siły (Rycina uzupełniająca S3, góra w lewo). Dwa dodatkowe okna wyświetlają krzywe siły oraz wartości surowe (Rycina uzupełniająca S3, odpowiednio w panelach prawym górnym i dolnym).
  4. Należy odrzucić krzywe siły, w których działo (cantilever) w sposób nieprawidłowy zbliżyło się do powierzchni skrawka wątroby. W celu ich zidentyfikowania należy szukać krzywych charakteryzujących się dużym poziomem szumów, aberracyjnymi kształtami i/lub niepełnym zbliżeniem, co przedstawiono w Rysunek 3 or szczegółowo omówiono w innym opracowaniu46.

Krzywe siła-odległość AFM, analiza sztywności; moduły E (10,5, 1,78 kPa); fazy zbliżania i wycofywania.
Rysunek 3: Przykłady reprezentatywnych krzywych siła-przemieszczenie. (A,B) Reprezentatywne, interpretowalne krzywe siły dla obszarów sztywniejszych (A; E = 10,5 kPa) i miększych (B; E = 1,78 kPa), które nadają się do analizy. (C-F) Reprezentatywne wykresy nieinterpretowalne, które muszą zostać wykluczone z analizy z powodu (C-E) nieprawidłowego zbliżania lub (F) większego poziomu szumów. Zgodnie z legendą zamieszczoną na panelu (A), czerwone krzywe przedstawiają zbliżanie ramienia (cantilever), a zielone krzywe przedstawiają wycofywanie ramienia. Czarne linie pokazują dopasowanie krzywej wycofywania ramienia. Nachylenie czarnych linii odpowiada modułowi Younga. Czerwone i niebieskie punkty odpowiadają odpowiednio punktowi styku i punktowi przejścia. Punkt styku to ostatni punkt kontaktu między ramieniem a podłożem podczas wycofywania, natomiast punkt przejścia opisuje przejście ramienia z fazy zbliżania do fazy wycofywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Lekko utrwalone, 30 µm grube przekroje wątroby pobrane od myszy kontrolnych oraz od myszy z łagodną lub zaawansowaną włóknicą (indukowaną wtryskiwaniem CCl4 odpowiednio przez 3 tygodnie lub 6 tygodni49) poddano badaniu za pomocą AFM zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Do pomiaru map sztywności wybrano włókna kolagenowe znajdujące się w pobliżu żył centralnych. W wątrobach kontrolnych przeanalizowano obszary położone blisko żył centralnych, które odpowiadają miejscom, w których u zwierząt traktowanych CCl4 zazwyczaj tworzą się włókna kolagenowe (Rycina 4A). Rozkład modułów Younga był powtarzalny w różnych wątrobach kontrolnych oraz w obszarach bogatych w kolagen w obrębie jednego przekroju wątroby (Rycina 4B: lewy wykres skrzypcowy).

U zwierząt traktowanych CCl4 mapy sztywności odpowiadające obszarom okołoprzyśrodkowym złogów kolagenu wykazały znacznie wyższe wartości modułów Younga w porównaniu do analogicznych obszarów u myszy kontrolnych (Rycyna 4B: medianowe wartości modułu Younga 1,9 kPa vs. 2,6 kPa dla grupy kontrolnej i myszy traktowanej CCl4 przez 3 tygodnie; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa dla grupy kontrolnej i myszy traktowanej CCl4 przez 6 tygodni; p = 0,02). Co więcej, odnotowano istotny wzrost wartości modułów Younga przy dłuższym czasie traktowania CCl4 (Rycina 4B; medianowe wartości modułu Younga 2,6 kPa vs. 5,1 kPa dla myszy traktowanej CCl4 przez 3 tygodnie vs. 6 tygodni; p = 0,04). Wskazuje to na stopniowe utwardzanie się złogów kolagenu wraz z postępem włóknienia oraz na to, że pomiary AFM odzwierciedlają proces fibrogenezy.

Aby ocenić wpływ przedłużonego przechowywania przekrojów wątroby zatopionych w OCT na właściwości mechaniczne włókien kolagenowych, zmierzono sztywność włókien kolagenowych w przekrojach myszy traktowanych CCl4, które były przechowywane na szkiełkach po cięciu w temperaturze −80 °C przez 2 tygodnie lub 3 miesiące (Rysunek 5). Pomiary AFM wykazały znacznie niższe wartości modułów Younga w obszarach bogatych w kolagen dla przekrojów przechowywanych przez 3 miesiące w porównaniu do wyników uzyskanych z przekrojów mierzonych w ciągu 2 tygodni od wykonania cięcia (Rysunek 5; medianowe wartości modułu Younga 4,7 kPa vs. 3,6 kPa dla przechowywania przez 2 tygodnie vs. 3 miesiące; p < 0,001). Zatem istotne jest pomiar właściwości mechanicznych tkanki wątroby krótko po przygotowaniu przekrojów z płatów wątroby zatopionych w OCT.

Analiza modułu Younga, histogramy i wykresy skrzypcowe wykazują zmiany sztywności po traktowaniu CCl4.
Rysunek 4Pomiary AFM wykazują progresywne sztywnienie obszarów bogatych w kolagen, co koreluje z przedłużonym działaniem CCl44 leczenie (A) Przekroje wątroby myszy kontrolnych oraz myszy traktowanych $\text{CCl}_4$4 przez 3 tygodnie lub 6 tygodni wykorzystano do pomiaru właściwości mechanicznych obszarów bogatych w kolagen. Obramowane obszary przekrojów wątroby przedstawione na obrazach z mikroskopii w świetle spolaryzowanym (po lewej) to obszary skanowania bogate w kolagen (lub odpowiadające im regiony w wątrobie kontrolnej) wybrane do pomiarów AFM (30 µm Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 100 µm, 10 pikseli x 36 pikseli). Po prawej stronie przedstawiono mapy modułu Younga z Graduate skalami kolorystycznymi odpowiadającymi tym zaznaczonym obszarom, wraz z histogramami wartości modułu Younga z tych map; wstawione wykresy rozrzutu przedstawiają wartości >10 kPa dla każdego stanu. Usztywnienie wątroby jest widoczne jako stopniowe przesunięcie rozkładu histogramu w prawo oraz większa częstotliwość punktów na wstawce z wykresem rozrzutu. Pasek skali = 20 µm. (BWykresy skrzypcowe przedstawiają rozkład modułów sprężystości z trzech obszarów zmierzonych dla każdego stanu (po lewej) oraz podsumowane wartości modułów sprężystości ze wszystkich trzech map (po prawej). Wykresy skrzypcowe wskazują medianę (czerwona linia), 25th percentyl i 75. percentyl (linie czarne); kropki reprezentują wartości średnie poszczególnych map z obszarów 1-3. Przedstawione wartości p obliczono przy użyciu testu t Studenta t-test przeprowadzony na średnich. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 tetrachlorek węgla Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe i histogramy zmian modułu Younga, 2 tygodnie vs. 3 miesiące przechowywania.
Rycina 5: Przedłużone przechowywanie przekrojów wątroby prowadzi do spadku sztywności obszarów bogatych w kolagen. Do pomiaru modułu Younga wykorzystano przekroje wątroby (przygotowane z myszy traktowanych CCl4 przez 2 tygodnie) przechowywane w −80 °C przez 2 tygodnie lub 3 miesiące. Obrazy z mikroskopii polaryzacyjnej (po lewej) z ramkami wskazującymi obszary bogate w kolagen użyte do pomiarów AFM (30 µm x 100 µm, 10 pikseli x 36 pikseli). Odpowiadające im mapy modułu Younga ze skalami kolorystycznymi (po prawej). Histogramy przedstawiają wartości modułu Younga zebrane z 4-6 obszarów w każdej próbce; dołączone wykresy rozproszeniowe pokazują wartości >10 kPa dla każdego stanu. Pasek skali = 20 µm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 = tetrachlorek węgla. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca S1: Metoda modyfikacji wspornika za pomocą mikrokuleczki z żywicy melaminowej. (A) Schemat ilustruje mocowanie kulistej kuleczki do wierzchołka wspornika. W celu uzyskania opisu krok po kroku należy przejść do sekcji 2, część 1, Mocowanie kuleczki o średnicy 5,7 µm do wierzchołka wspornika AFM. (B) Obraz mikroskopowy kulistej kuleczki o średnicy 5,7 µm przymocowanej do wierzchołka wspornika, przedstawiony w widoku z góry (lewo) i widoku bocznym (prawo). Paski skali = 20 µm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; RT = temperatura pokojowa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy S2: Analiza danych w programie AtomicJ. (A) Sekwencja kroków niezbędnych do otwarcia map sztywności w programie AtomicJ. Pojedyncze lewe kliknięcie opcji process force curves and maps (x) otwiera processing assistant. Pliki można załadować do processing assistant, klikając add (y) i wybierając wymagane pliki. Kliknij next (z), aby przejść do następnego kroku. (B) Parametry dopasowania krzywych, odpowiedni model mechaniki kontaktu oraz ustawienia AFM zastosowane podczas pomiaru. Kroki 1-11 odnoszą się do odpowiadających im podpunktów szczegółowo opisanych w kroku 3 protokołu, sekcja 5, Analiza danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S3: Schemat analizowanych danych w programie AtomicJ. Podgląd analizowanych danych przedstawia mapy sztywności (okno w lewym górnym rogu), krzywe sił (okno w prawym górnym rogu) oraz surowe dane (dolne okno). Skrót: AFM = mikroskopia sił atomowych. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiony protokół zapewnia krok po kroku powtarzalną metodę pomiaru AFM prawidłowej i zwłókniejącej tkanki wątroby myszy. Mikroskopia polaryzacyjna sprzężona zapewnia wysoką precyzję przestrzenną i umożliwia wizualizację włókien kolagenowych ze względu na ich dwójłomność. Ponadto przedstawiono szczegółowy opis analizy uzyskanych krzywych sił. Pomiar sztywności AFM można wykonać na poziomie komórkowym, co pozwala na monitorowanie miejscowych zmian właściwości mechanicznych tkanki wątroby spowodowanych rozwijającą się chorobą zwłóknieniową. Zwłóknienie wątroby nie jest jednorodnym procesem wpływającym na cały narząd. Wręcz przeciwnie, obszary bogatych w kolagen przegród zwłóknieniowych przeplatają się z obszarami o niskim lub zerowym poziomie złogów kolagenu. W związku z tym zmiany sztywności są specyficzne dla lokalnego mikrośrodowiska i wpływają na komórki tylko miejscowo stykające się z obszarami uszkodzonymi przez uraz. Ta mikroskala niejednorodności sztywności jest również widoczna w szczegółach map modułów AFM Younga, gdzie punkty o wysokiej sztywności graniczą z obszarami o prawie normalnej sztywności. Ta zmienność pokazuje, że nawet obszar tkanki bliznowatej kolagenu nie jest mechanicznie jednorodny i wymaga scharakteryzowania pomiaru AFM na poziomie komórkowym (ryc. 4).

Przedstawiony protokół pozwala na pomiar sztywności wątroby za pomocą AFM niezależnie od pobrania wątroby, ponieważ całe płaty wątroby osadzone w OCT mogą być przechowywane przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C. Jednak po przecięciu tkanki zalecamy zmierzenie próbek w ciągu ~2 tygodni, ponieważ zaobserwowaliśmy stopniowe zmiękczanie skrawków tkanek przechowywanych przez dłuższy czas (ryc. 5).

AFM wyposażony w mikroskopię polaryzacyjną pozwala na precyzyjne zlokalizowanie obszaru zainteresowania w obrębie struktury zrazika wątroby. Ma jednak również pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji wyników. Uzyskane tutaj wartości sztywności zostały zmierzone w temperaturze pokojowej. Zakładamy, że wpływ temperatury na właściwości mechaniczne tkanek miękkich będzie niewielki; Może to być jednak jedna z przyczyn różnic między podawanymi in vivo wartościami właściwości mechanicznych tkanek wątroby a wartościami w niniejszym badaniu.

Ponadto protokół ten pozwala na analizę AFM tkanki wątroby przez okres do 3 godzin, co wymaga łagodnego unieruchomienia tkanki. Łagodne utrwalenie skrawków tkanki, a także cykl zamrażania-rozmrażania, najprawdopodobniej wpłyną na bezwzględne wartości modułu Younga. W związku z tym podane wartości modułów Younga mogą różnić się od wartości in vivo . Potrzebne są dalsze badania w celu optymalizacji protokołu pomiaru bezwzględnych wartości modułu Younga z odcinków wątroby, co można osiągnąć inną metodą utrwalania tkanki wątroby64.

Niemniej jednak zaobserwowaliśmy rosnącą sztywność obszarów bogatych w kolagen w wątrobie myszy leczonychCCl 4 przez 3 tygodnie w porównaniu z 6 tygodniami. Zmiany te odpowiadają progresji zwłóknienia podczas długotrwałego urazu (ryc. 4) i pokazują, że za pomocą przedstawionego protokołu można badać względne różnice między różnymi terapiami. Jest to zgodne z obserwacjami Calò i wsp., którzy wykazali, że łagodnie unieruchomione skrawki wątroby wykazują podobne różnice w wartościach sztywności między obszarami bogatymi w kolagen i pozbawionymi kolagenu, jak w świeżej tkance25.

Zastosowaliśmy wspornik SD-qp-BioT-TL-10 (teoretyczna stała sprężystości ~0,09 N/m) zmodyfikowany kulistą końcówką o średnicy 5,7 μm w celu zminimalizowania mechanicznego uszkodzenia tkanki wątroby podczas pomiarów. Kulka o średnicy 5,7 μm umożliwiła wystarczające wgłębienie próbki, aby zbadać jej sztywność przy jednoczesnym zachowaniu jej integralności. Ścieg o mniejszej średnicy może być użyty, po kilku optymalizacjach, do uzyskania wyższej rozdzielczości w mapach sztywności, ale może prowadzić do dalszego przeszacowania wartości modułu Younga (więcej szczegółów można znaleźć w Crichton i wsp.65). Korzystając z określonego zestawu wspornika-stopki, byliśmy w stanie scharakteryzować sztywność próbki w szerokim zakresie, od kilkudziesięciu jednostek Pa do ~100 kPa.

Model Sneddona został wykorzystany do wyprowadzenia modułu Younga na podstawie krzywych sił, ponieważ umożliwia analizę głębokich wgłębień za pomocą sond koloidalnych62. Model Sneddona, w przeciwieństwie do modelu Hertza, nie cierpi z powodu ograniczenia, że promień kontaktu musi być znacznie mniejszy niż promień kuli. Zakłada się ponadto, że grubość próbki jest kilkakrotnie większa niż głębokość wgłębienia30,66. W niniejszym badaniu wgłębienie wynosiło ~2 μm przy wielkości kulki 5,7 μm i grubości próbki 30 μm w obszarach bogatych w kolagen; w związku z tym model Sneddona był odpowiedni. Inne modele63 biorąc pod uwagę siłę przylegania między końcówką a podłożem, mogą być stosowane do różnych typów tkanek.

Analiza w AtomicJ wprowadza poprawki na skończoną grubość próbek w celu zminimalizowania udziału substratu przy jednoczesnym wyprowadzeniu modułu Younga62,67. W analizie uzyskanych krzywych sił zastosowaliśmy pojedynczy współczynnik Poissona wynoszący 0,45, który był wcześniej zalecany dla narządów tkanek miękkich24. Przybliżenie to nie ma istotnego wpływu na obliczone wartości modułu Younga, gdyż zmiana wartości współczynnika Poissona z 0,4 na 0,5 powoduje jedynie 0,893-krotny spadek wartości modułu Younga obliczonych według równania Sneddona. Biorąc pod uwagę wielokrotne różnice w module Younga między różnymi czasami trwania zabiegówCCl 4, błędy wynikające z aproksymacji współczynnika Poissona są tylko marginalne.

Do obliczenia wartości sztywności użyliśmy krzywych wycofania, ponieważ interesowała nas sprężysta reakcja tkanki na obciążenie dostarczane przez wspornik, a nie reakcja plastyczna na wgłębienie68. Ze względu na lepkosprężystą reakcję tkanki miękkiej, dopasowanie krzywych wycofania może zawyżać moduł Younga, o czym należy pamiętać. Ponadto zaobserwowaliśmy, że analiza danych z krzywymi podejścia daje podobne trendy w wartościach sztywności między obszarami zwłóknienia i kontrolnymi, chociaż wartości bezwzględne są odpowiednio niższe (dane nie pokazane).

Optymalizując protokół, zidentyfikowaliśmy kilka kroków krytycznych dla odtwarzalności pomiarów. Po pierwsze, ważne jest, aby upewnić się, że koralik znajduje się mniej więcej pośrodku półprzezroczystej końcówki podczas mocowania do wspornika. Zapobiega to ewentualnemu niewyważeniu mechanicznemu podczas wgniatania. Po drugie, podczas wiązania wątroby z PFA konieczne jest ścisłe przestrzeganie limitów czasowych rozmrażania i utrwalania. Zmiana czasu tego etapu może poważnie wpłynąć na właściwości mechaniczne skrawków tkanek. Po trzecie, wspornik musi być wielokrotnie kalibrowany z ciągłym monitorowaniem i wprowadzaniem jednoczesnych wartości temperatury, aby uniknąć wystąpienia jakichkolwiek artefaktów w wartościach sztywności spowodowanych wahaniami temperatury. Wreszcie, pojedynczy wycinek wątroby nie powinien być mierzony dłużej niż 3 godziny od przygotowania, ponieważ nałożony PBS może parować przez dłuższy czas. Czytelnicy mogą zapoznać się z tabelą rozwiązywania problemów (Tabela 3) w celu rozwiązywania problemów napotkanych podczas pomiaru AFM, omówionej również szczegółowo w Norman et al.46.

Tabela 3: Przewodnik rozwiązywania problemów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Przedstawiony protokół pozwala na powtarzalne badanie tkanki wątroby za pomocą AFM. Ma ona potencjał, aby ujawnić informacje na temat rozwoju i ostatecznej regresji zwłóknieniowej choroby wątroby na poziomie mikroskopowym i może przyczynić się do opracowania terapii ukierunkowanych na zwłókniałe obszary blizn powstałe podczas progresji przewlekłej choroby wątroby.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Agencję Grantową Republiki Czeskiej (18-02699S), Instytucjonalny Projekt Badawczy Czeskiej Akademii Nauk (RVO 68378050) oraz projekt MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC konsorcjum UE, finansowane przez projekt infrastrukturalny MEYS CR LM2018127 i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego – projekt "UP CIISB" (nr CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) wsparł finansowo pomiary w CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Dziękujemy również Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Republika Czeska, wspierana przez MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) i RVO: 68378050-KAV-NPUI, za ich wsparcie w zakresie obrazowania mikroskopowego przedstawionego w niniejszym dokumencie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Głowica AFMBrukerJPK nanowizard 3
KameryAndorZyla 5.5 USB (sCMOS, chłodzone wodą)
Obrazowanieźródło S/N:12310015
CantileverSD-qp-BioT-TL-10, NanosensoryS/N:73750F05
CryotomeLeica CM1950
Klej na bazie żywicy epoksydowej (długi czas pracy)Bison epoksydowe uniwersalne
kulki melaminowe; średnica, 5,7 umMikrocząstki, GmbHMF-R-5.7
MikroskopOlympus  IX81
Hydrofobowy  marker do slajdówSuperHTPAP PEN
OprogramowanieJPK nanowizard  v6.1.151
Prowadnice AtomicJ v2.3.1
SuperfrostThermoscientificnr ref. J1800AMNZ
SystemUbuntu 14.04.5 LTS
Kontrola izolacji drgań jednostkaStajnia stołowaAVI-200-S

Bibliografia

  1. vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
  2. Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
  3. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual Review of Pathology. 6, 425-456 (2011).
  5. Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
  6. Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
  8. Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
  9. Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
  10. Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
  11. Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
  12. Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
  13. Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
  14. Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
  15. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
  16. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
  17. Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
  18. Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
  19. Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
  20. Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
  21. Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
  22. Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
  23. Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
  24. Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
  25. Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664(2020).
  26. Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
  27. Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
  28. Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 56 (9), (1986).
  29. Johnson, K. L. Contact Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1985).
  30. Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159(2022).
  31. Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
  32. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  33. Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
  34. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911(2011).
  35. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  36. Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600(2019).
  37. del Mar Vivanco, M. Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
  38. Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597(2018).
  39. Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
  40. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
  41. Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
  42. Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
  43. Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
  44. Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
  45. Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
  46. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  47. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  48. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  49. Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
  50. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  51. Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724(2013).
  52. Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487(2020).
  53. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  54. Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
  55. Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
  56. Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
  57. Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
  58. Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705(2012).
  59. JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
  60. van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908(2015).
  61. Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
  62. Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703(2014).
  63. Hermanowicz, P. AtomicJ 2.3.1 User's Manual. , (2021).
  64. Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619(2020).
  65. Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
  66. Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705(2015).
  67. Hermanowicz, P. Determination of Young's modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138(2021).
  68. Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Włóknienie wątrobyobszary bogate w kolagenmoduł Youngaelastyczność tkanekkrzywe siła-przemieszczeniefibrogenezamechanika tkanek miękkich
Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.