Artykuł metodologiczny

Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną

DOI:

10.3791/63974

⸱

20 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU, Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics, Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do pomiaru modułów sprężystości obszarów bogatych w kolagen w prawidłowej i chorej wątrobie za pomocą mikroskopii sił atomowych. Jednoczesne zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej zapewnia wysoką precyzję przestrzenną do lokalizacji obszarów bogatych w kolagen w wycinkach wątroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usztywnienie macierzy zostało uznane za jeden z kluczowych czynników postępu zwłóknienia wątroby. Ma głęboki wpływ na różne aspekty zachowania komórek, takie jak funkcja komórki, różnicowanie i ruchliwość. Ponieważ jednak procesy te nie są jednorodne w całym narządzie, coraz ważniejsze staje się zrozumienie zmian we właściwościach mechanicznych tkanek na poziomie komórkowym.

Aby móc monitorować usztywnienie obszarów bogatych w kolagen w płatach wątroby, ten artykuł przedstawia protokół pomiaru modułów sprężystości tkanki wątrobowej z wysoką precyzją przestrzenną za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). AFM jest czułą metodą, która może charakteryzować lokalne właściwości mechaniczne, obliczane jako moduł Younga (określany również jako moduł sprężystości). AFM w połączeniu z mikroskopią polaryzacyjną może być stosowany do specyficznego lokalizowania obszarów rozwoju zwłóknienia w oparciu o dwójłomność włókien kolagenowych w tkankach. Korzystając z przedstawionego protokołu, scharakteryzowaliśmy sztywność obszarów bogatych w kolagen ze zwłókniałych wątrob myszy i odpowiadających im obszarów w wątrobach myszy kontrolnych.

Wraz z rozwojem zwłóknienia zaobserwowano wyraźny wzrost sztywności obszarów kolagenowo-dodatnich. Przedstawiony protokół pozwala na wysoce powtarzalną metodę pomiaru AFM, dzięki zastosowaniu łagodnie utrwalonej tkanki wątroby, która może być wykorzystana do lepszego zrozumienia zainicjowanych przez chorobę zmian lokalnych właściwości mechanicznych tkanek i ich wpływu na los sąsiednich komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wątroba jest ważnym organem do utrzymania homeostazy organizmów1,2. Przewlekłe choroby wątroby są przyczyną ~2 milionów zgonów rocznie na całym świecie3. Powstają one najczęściej jako infekcje wirusowe, zaburzenia autoimmunologiczne, zespoły metaboliczne lub choroby związane z nadużywaniem alkoholu i towarzyszy im postępujące zwłóknienie wątroby. Uszkodzenie wątroby wywołuje reakcję zapalną, która prowadzi do aktywacji komórek odkładających macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w odpowiedzi gojenia się ran. Jednak w przypadku przewlekłego urazu, nadmiar ECM tworzy nierozwiązaną tkankę bliznowatą w wątrobie, prowadząc do rozwoju zwłóknienia wątroby, marskości wątroby, raka wątroby i ostatecznie do niewydolności wątroby4.

Uszkodzenie hepatocytów natychmiast powoduje zwiększoną sztywność wątroby5,6. Wpływa to bezpośrednio na funkcję hepatocytów, aktywuje komórki gwiaździste wątroby (HSC) i fibroblasty wrotne oraz powoduje ich transróżnicowanie do miofibroblastów odkładających kolagen7,8. Odkładanie się włóknistego ECM dodatkowo zwiększa sztywność wątroby, tworząc samowzmacniającą się pętlę sprzężenia zwrotnego usztywnienia wątroby i aktywacji komórek wytwarzających macierz

.

Sztywność wątroby stała się więc ważnym parametrem w prognozowaniu chorób wątroby. Zmiana właściwości biomechanicznych tkanki może być wykryta wcześniej niż zwłóknienie może być zdiagnozowane za pomocą analizy histologicznej. Dlatego opracowano różne techniki pomiaru sztywności wątroby zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych. W warunkach klinicznych elastografia przejściowa (TE)9,10,11,12,13 i elastografia rezonansu magnetycznego (MRE)14,15,16,17,18 zostały wykorzystane do nieinwazyjnego diagnozowania wczesnych stadiów uszkodzenia wątroby poprzez badanie dużej sztywności wątroby19.

W TE, fale ultradźwiękowe o łagodnej amplitudzie i niskiej częstotliwości (50 Hz) są rozchodzone przez wątrobę, a ich prędkość jest mierzona, co jest następnie wykorzystywane do obliczenia modułu sprężystości tkanki13. Jednak ta technika nie jest przydatna dla pacjentów z wodobrzuszem, otyłością lub niższymi przestrzeniami międzyżebrowymi z powodu niewłaściwego przekazywania fal ultradźwiękowych przez tkanki otaczające wątrobę9.

MRE opiera się na metodzie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i wykorzystuje mechaniczne fale ścinające o częstotliwości 20-200 Hz do celowania w wątrobę. Specyficzna sekwencja obrazowania metodą rezonansu magnetycznego jest następnie wykorzystywana do śledzenia fal wewnątrz tkanki i obliczania sztywności tkanki16. Wartości sztywności zgłoszone zarówno za pomocą technik TE, jak i MRE dobrze korelują ze stopniem zwłóknienia wątroby uzyskanym z biopsji próbek ludzkiej wątroby uszeregowanych za pomocą histologicznych wyników METAVIR 20 (Tabela 1). TE i MRE zostały również przystosowane do pomiaru sztywności wątroby w modelach gryzoni do celów badawczych21,22,23. Ponieważ jednak obie metody wyprowadzają wartości sztywności na podstawie odpowiedzi tkanki na rozchodzące się fale ścinające, uzyskane wartości mogą nie odzwierciedlać bezwzględnej sztywności mechanicznej tkanki.

Dla bezpośredniej mechanicznej charakterystyki wątroby gryzoni, Barnes et al. opracowali test modelowo-żelowo-tkankowy (test MGT) polegający na osadzeniu tkanki wątroby w żelu poliakrylamidowym24. Żel ten jest ściskany przez pulsacyjną jednostajną siłę, na podstawie której można obliczyć moduł Younga. Test MGT wykazuje dobrą korelację z testem wgłębień dostosowanym zarówno do prawidłowej, jak i zwłóknienia wątroby24 (Tabela 1).

Tabela 1: Wartości sztywności wątroby na poziomie masowym. TE i MRE porównane z bezpośrednimi pomiarami mechanicznymi ex vivo modułów sprężystości wątroby przy użyciu testów wgłębień i MGT dla wątroby z różnych źródeł. Zależność między E i G jest określona przez E = 2G (1 + v), gdzie v jest stosunkiem Poissona próbki; F0 do F4 reprezentują wynik zwłóknienia w systemie punktacji METAVIR, gdzie F0 oznacza niskie zwłóknienie lub jego brak, a F4 marskość wątroby. Skróty: TE = elastografia przejściowa; MRE = elastografia rezonansu magnetycznego; MGT = model-żel-tkanka; E = moduł sprężystości (Younga); G = moduł ścinania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Jedną z głównych wad ogólnych pomiarów sztywności wątroby jest to, że nie zapewniają one rozdzielczości heterogeniczności sztywności wątroby na poziomie komórkowym. Podczas progresji zwłóknienia obszary bogate w kolagen wykazują większą sztywność w porównaniu z otaczającymi je miąższami25,26. Ten gradient sztywności lokalnie wpływa na komórki rezydentne i odgrywa ważną rolę w napędzaniu niejednorodności HSC27. W związku z tym zmiany w lokalnych właściwościach mechanicznych podczas rozwoju choroby wątroby muszą być scharakteryzowane na poziomie mikroskopowym, aby lepiej zrozumieć postęp zwłóknienia.

AFM pozwala na pomiar właściwości mechanicznych tkanek z wysoką rozdzielczością i wysoką czułością na siłę. AFM wykorzystuje końcówkę wspornika do wgniatania powierzchni próbki siłami tak niskimi, jak kilka pikonewtonów, wywołując deformację na poziomie mikroskopowym lub nanoskopowym w oparciu o geometrię i rozmiar zastosowanej końcówki. Reakcja siły próbki na przyłożone odkształcenie jest następnie mierzona jako ugięcie w klasie cantilever28. Krzywe siła-przemieszczenie są zbierane na podstawie podejścia i cofania wspornika, który może być wyposażony w odpowiednie modele mechaniki kontaktowej w celu oceny lokalnej sztywności próbki29.

Oprócz pomiaru sztywności danego obszaru, AFM może również dostarczyć informacji topograficznych o konkretnych cechach próbki, takich jak struktura włókien kolagenowych30,31,32. Wiele badań opisało zastosowanie AFM do pomiaru sztywności różnych zdrowych i chorych tkanek, takich jak skin32,33, lung34,35, brain36, mammary37,38,39, chrząstka40, lub heart41,42,43,44 zarówno z próbek modelu pacjenta, jak i myszy. Co więcej, AFM został również wykorzystany in vitro do określenia sztywności komórek i zewnątrzkomórkowych rusztowań białkowych45,46,47.

Pomiar właściwości mechanicznych próbek biologicznych za pomocą AFM jest nietrywialny ze względu na ich miękkość i kruchość. W związku z tym różne badania ustandaryzowały różne warunki i ustawienia, które dają bardzo zmienne wartości modułów Younga (przejrzane przez Mckee et al.48). Podobnie jak w przypadku innych tkanek miękkich, wartości modułu Younga w wątrobie przy różnych stopniach zwłóknienia wątroby również wykazują dużą zmienność (Tabela 2). Różnice w wartościach modułu Younga wynikają z różnic w trybie pracy AFM, końcówce wspornika, metodzie przygotowania próbki, grubości próbki, głębokości i siłach wgłębienia, środowisku tkanki wątroby podczas pomiaru oraz metodzie analizy (tabela 2).

Tabela 2: Wartości sztywności wątroby na poziomie komórkowym. Wartości sztywności wątroby uzyskane za pomocą AFM opisują właściwości mechaniczne wątroby na poziomie komórkowym. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; E = moduł sprężystości (Younga); PFA = paraformaldehyd; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Ten artykuł opisuje protokół powtarzalnego pomiaru modułów Younga bogatych w kolagen obszarów zwłóknienia w tkance wątroby za pomocą AFM z precyzyjną lokalizacją zapewnioną przez użycie mikroskopii polaryzacyjnej. Podaliśmy czterochlorek węgla (CCl4) w celu wywołania odkładania się kolagenu w sposób odśrodkowy49 w modelu mysim, niezawodnie naśladując kluczowe aspekty zwłóknienia ludzkiej wątroby50. Spolaryzowane obrazy mikroskopowe umożliwiają wizualizację kolagenu w wątrobie ze względu na dwójłomność włókien kolagenowych51, co pozwala na dokładne ustawienie końcówki wspornika nad pożądanym obszarem zainteresowania w obrębie zrazika wątrobowego52.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytutu Genetyki Molekularnej oraz zgodnie z Dyrektywą UE 2010/63/UE dotyczącą eksperymentów na zwierzętach. Ogólny schemat ideowy prezentowanego protokołu jest pokazany na Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ogólny schemat oceny modułu Younga przez AFM z wątroby myszy. (A) Izolacja wątroby od myszy kontrolnych lub leczonych, a następnie sekcja i przechowywanie w temperaturze -80 °C (maksymalne przechowywanie, 2 tygodnie). (B) Przymocowanie kuli do wspornika, a następnie utwardzenie kleju przez noc (po lewej). Kalibracja wspornika, a następnie montaż próbki (po prawej). (C) Ustawienie polaryzatora i analizatora w celu wizualizacji jasnych struktur kolagenowych, a następnie nałożenie obrazu w kamerze na pole pomiarowe pod wspornikiem AFM. (D) Pozyskiwanie map i analiz sztywności. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; OCT = mieszanka o optymalnej temperaturze skrawania; CCl4 = czterochlorek węgla. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie próbki I

  1. Wyciąć wątrobę z otwartego brzucha myszy poddanej eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu. Odizoluj lewy płat boczny i osadź boczną połowę płata w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) poprzez szybkie zamrażanie na suchym lodzie. Tkankę osadzoną w KTT przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Wcześniejsze badania wykazały, że wartości sztywności są podobne między tkankami mrożonymi i świeżymi25,26.
  2. Wycinek wątroby o grubości 30 μm należy umieścić na dodatnio naładowanych szkiełkach za pomocą kriotomii i przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C do dnia pomiaru AFM nie dłużej niż 2 tygodnie później.

2. Konfiguracja instrumentu

  1. Mocowanie stopki 5,7 μm do końcówki wysięgnika AFM (rysunek uzupełniający S1, kroki 1-5)
    UWAGA: Mocowanie stopki do wspornika zostało również wcześniej opisane przez Normana i wsp.46.
    1. Rozprowadzić zawiesinę kulek żywicy melaminowej o średnicy 5,7 μm równomiernie na połowie powierzchni szkiełka podstawowego i wysuszyć na powietrzu w celu odparowania rozpuszczalnika (rysunek uzupełniający S1, krok 1).
    2. Na drugiej połowie szkiełka, używając końcówki o pojemności 10 μl, wykonaj cienką linię wstępnie zmieszanej żywicy epoksydowej o długim czasie pracy (rysunek uzupełniający S1, krok 1).
    3. Załaduj sondę wspornikową do głowicy AFM zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Zamontuj suwak i pokrywę z głowicą AFM wyposażoną w sondę wspornikową.
      UWAGA: W badaniu zastosowano wspornik SD-qp-BioT-TL-10.
    5. Przyłóż wstępnie zmieszany klej z żywicy epoksydowej do środka szkiełka i zbliż się do kleju za pomocą wspornika z niewielką siłą (ustaw wartość zadaną na 1 V, aby postępować zgodnie z tym protokołem; Rysunek uzupełniający S1, krok 2).
      UWAGA: Przed zbliżeniem się do powierzchni prowadnicy upewnij się, że laser jest wyrównany na środku końcówki wspornika, wskazywanej przez wysoką sumę voltage, wykonując kroki 6-8 w Sekcja 2, część 3, Kalibracja stałej sprężystości wspornika AFM.
    6. Po zetknięciu się końcówki sondy wspornikowej z klejem, przesuń ją tuż nad suwak, aby usunąć nadmiar kleju.
    7. Teraz wycofaj końcówkę wspornika ze zjeżdżalni i przesuń prowadnicę, aby umieścić pojedynczy koralik na środku (rysunek uzupełniający S1, krok 3). Ponownie zbliżyć się do stopki za pomocą sondy wspornikowej AFM z większą siłą (wartość zadana 2 V), aby przymocować stopkę w środku sondy wspornikowej i pozostawić ją na co najmniej 10 s (rysunek uzupełniający S1, krok 4).
    8. Wyjmij sondę wspornikową i trzymaj ją przez noc w temperaturze pokojowej, aby stwardniał klej lub postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi żywicy epoksydowej (rysunek uzupełniający S1, krok 5).
  2. Konfiguracja polaryzatora i analizatora
    1. Aby zlokalizować obszary zainteresowania w obrębie odcinków wątroby, ustaw mikroskop z polaryzatorem i analizatorem. Ustaw ich azymuty drgań pod kątem od 0° do 90° względem siebie, obracając jeden z nich względem drugiego ręcznie lub w sposób zautomatyzowany, aby zminimalizować przepuszczane światło i zmaksymalizować niezwykłe promienie przechodzące przez obiektyw. Upewnij się, że włókna kolagenu wydają się jasne na ciemnym tle na spolaryzowanym obrazie (Rysunek 2), co jest odzwierciedlone przez przesunięcie szczytu histogramu obrazu w kierunku jasnych pikseli.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy mikroskopowe pokazują wyraźną wizualizację włókien kolagenowych w mikroskopii spolaryzowanej w porównaniu z obrazami w jasnym polu. Wycinki wątroby myszy leczonychCCl 4 przez 3 tygodnie poddano (A) mikroskopii jasnego pola i (B) mikroskopii spolaryzowanej. Dwójłomne włókna kolagenowe są wyraźnie widoczne w kolorze białym na spolaryzowanych obrazach w porównaniu z obrazami w jasnym polu. Czerwone pole reprezentuje obszar bogaty w kolagen używany do pomiaru AFM. Wstawki pokazują powiększone widoki obszaru w czerwonym polu. Podziałka = 100 μm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 = czterochlorek węgla; CV = żyła centralna; PV = żyła wrotna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Dla tego protokołu, głowica AFM może być zainstalowana na dowolnym odpowiednim mikroskopie odwróconym z możliwością włożenia polaryzatora i analizatora. System musi być umieszczony w jednostce izolacyjnej, aby zredukować hałas tła.

  1. Kalibracja stałej sprężystości wspornika AFM
    1. Załaduj sondę wspornikową (przygotowaną zgodnie z krokami 1-8 w sekcji 2, część 1, Mocowanie koralika 5.7 μm do końcówki wspornika AFM) do głowicy AFM zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wyczyść wspornik 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu wspornika podczas pomiaru. Dokładnie umyj wodą destylowaną, aby usunąć resztki etanolu z końcówki.
    3. Włącz tryb kontaktowy i wybierz mapowanie siły jako metodę pomiaru.
    4. Otwórz wszystkie odpowiednie okna (Silniki krokowe Z, Zmotoryzowane sterowanie stopniem, Przeglądarka danych, Oscyloskop mapy Force Scan, Wyrównanie laserowe i okno Kamera) w zakładkach oprogramowania, klikając odpowiednie przyciski.
    5. Zamontuj czyste szklane szkiełko zawierające 1,2 ml 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) na obszarze o wymiarach około 2 cm x 4 cm, wyznaczonym markerem hydrofobowym. Zamontuj głowicę AFM na stoliku mikroskopu i upewnij się, że wspornik jest całkowicie zanurzony w PBS.
    6. Skoncentruj obiektyw na końcówce wspornika. Zmniejsz intensywność światła przepuszczanego przez mikroskop, aby uzyskać lepszy widok położenia lasera na monitorze.
    7. Skieruj laser na półprzezroczysty koniec wspornika (pod którym przymocowany jest kuliste koralik) i wyrównaj lustro za pomocą pokręteł na głowicy AFM, aby zmaksymalizować całkowitą intensywność wiązki laserowej na detektorze (przedstawioną przez sumę w oknie Wyrównanie lasera).
    8. Ustaw detektor fotodiody za pomocą pokręteł znajdujących się na głowicy AFM, aby ustawić laser w jego środku.
    9. Pozwól wspornikowi ustabilizować się przez 15 minut przed przystąpieniem do kalibracji.
    10. Otwórz Menedżera kalibracji i wprowadź typ wspornika, wymiary wspornika i warunki otoczenia. Skalibruj stałą sprężyny i czułość (znaną również jako odwrócona czułość dźwigni optycznej, InvOLS), klikając przycisk Kalibruj. Dokładność stałej sprężystości uzyskanej po kalibracji potwierdzić deklaracją producenta. Kalibracja wspornika w trybie bezkontaktowym (kalibracja jest wykonywana przez oprogramowanie przy użyciu twierdzenia termicznego wyprowadzonego przez Sader et al.58).
      UWAGA: Stała sprężystości wspornika reprezentuje sztywność wspornika i jest określona przez siłę oporu wspornika, gdy odkształca się na długość odkształcenia pod względem N / m. Czułość wspornika przedstawia wartość odpowiedzi fotodiody (w woltach) w odpowiedzi na ugięcie wspornika (w nanometrach) i jest zwykle przedstawiana w postaci nm/V59. W trybie bezkontaktowym widmo szumu termicznego jest automatycznie rejestrowane i wyposażane w funkcję hydrodynamiczną60 przez oprogramowanie sterujące AFM po kalibracji. Złączka podaje parametry kalibracyjne, a mianowicie stałą sprężystości i InvOLS. Stała sprężystości wspornika SD-qp-BioT-TL-10 użytego w tym badaniu wynosiła 0,09 N/m, zgodnie z deklaracją producenta.

3. Przygotowanie próbki II

  1. Rozmrażać zamrożone skrawki (przechowywane w temperaturze -80 °C, zgodnie z opisem w sekcji 1, Przygotowanie próbki I) w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  2. Utrwalić skrawki lodowatym 4% paraformaldehydem (PFA) w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie dokładnie umyć (5x) 1x PBS. Przetrzeć resztki PBS wokół odcinka chusteczką i zaznaczyć granicę o wymiarach około 2 cm x 4 cm wokół odcinka wątroby za pomocą hydrofobowego markera. Przykryj próbkę 1x PBS (upewnij się, że wyznaczony obszar zawiera ~1.2 ml 1x PBS). Użyj próbki do pomiarów AFM.
    UWAGA: Ponieważ PFA jest niebezpieczną substancją chemiczną, należy obchodzić się z nią ostrożnie, aby zapobiec kontaktowi ze skórą lub oczami. Aby uniknąć toksycznych oparów, wszystkie procedury związane z PFA muszą być przeprowadzane w certyfikowanym dygestoriach chemicznych lub innym zatwierdzonym wentylowanym pomieszczeniu.

4. Pomiar

  1. Włącz automatyczne zapisywanie, przechodząc do zakładki Ustawienia i zaznaczając opcję Autozapis. Określ nazwę pliku i katalog do zapisania plików pomiarowych, przechodząc do zakładki Konfiguracja, a następnie klikając Zapisywanie ustawień.
  2. Załadować próbkę (przygotowaną zgodnie z sekcją 3, Przygotowanie próbki II). Zbliż się do powierzchni tkanki za pomocą wspornika AFM, włączając laser i klikając Approach. Po zetknięciu się końcówki z powierzchnią tkanki, cofnij końcówkę wspornika tak, aby końcówka pozostała w ognisku obiektywu (klikając Wycofanie, który cofa wspornik do górnego końca zakresu piezoelektrycznego). Ponownie wyrównaj detektor, jeśli pozycja lasera zostanie odsunięta od jego środka w oknie Wyrównanie lasera.
  3. Wyłącz laser i nałóż pole optyczne mikroskopu na mapy pomiarowe AFM, klikając zakładkę Akcesoria, a następnie wybierając opcję Bezpośrednia kalibracja optyczna nakładki. W następnym oknie kliknij Dalej, aby zrobić serię zdjęć wspornika skanującego określony obszar. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby przejść do następnego okna.
  4. Na pierwszym obrazie kliknij ręcznie środek końcówki wspornika, aby przedstawić pozycję końcówki w oprogramowaniu. Rozmiarem okręgu przedstawiającego położenie końcówki można manipulować, wskazując jego promień, aby zwiększyć dokładność. Kliknij przycisk Kalibruj, aby automatycznie wykryć położenie końcówki wspornika na wszystkich obrazach. Potwierdź dokładność wykrywania końcówek, przeglądając obrazy.
  5. Kliknij przycisk Dalej, a następnie przycisk Zakończ, aby zakończyć nakładkę optyczną i zapisać serię obrazów zarejestrowanych podczas kalibracji optycznej.
  6. Cofnij wspornik jeszcze bardziej, aby uniknąć jego kolizji z wyższymi powierzchniami na suwaku. Przesuń stół montażowy, aby umieścić obszar bogaty w kolagen wewnątrz zielonego pola widocznego na karcie Przeglądarka danych przy użyciu obrazu spolaryzowanego. Wybierz obszar bogaty w kolagen, tworząc wokół niego prostokąt, naciskając i przytrzymując lewy przycisk myszy wewnątrz określonego zielonego pola. Zdefiniuj wymiary, orientację i rozdzielczość wybranego obszaru na karcie Siatka po lewej stronie. Kliknij Potwierdź nowy region skanowania, aby ustawić wybrany obszar jako obszar pomiaru.
  7. Zachowaj domyślne wartości IGain i PGain pętli sprzężenia zwrotnego, jeśli nie występują żadne poważne niestabilności w postaci nadmiernej wrażliwości systemu. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, ustaw IGain na 50 Hz i PGain na 0,001.
  8. Ustaw nastawę na 1 nN.
    UWAGA: Wartość zadana to siła oddziaływania końcówka-powierzchnia w stanie stacjonarnym. Dla większości próbek miękkich (komórek, żeli i tkanek) odpowiednie są wartości zadane w zakresie 0,5-2,0 nN.
  9. Wybierz względną wartość zadaną zgodnie z właściwościami mechanicznymi badanego materiału i sztywnością wspornika. Dla tego protokołu ustaw wartość na 5 nN.
    UWAGA: Względna wartość zadana reprezentuje maksymalną siłę oddziaływania, gdy osiągnięty zostanie szczyt krzywej siła-odległość, a ruch końcówki powróci do linii bazowej. W przypadku materiałów miękkich (1-50 kPa) parametr ten jest ustawiony w jednostkach nanoniutonów (nN). Ponadto w przypadku miękkiego wspornika (o stałej sprężystości od 0,05 N/m do 0,35 N/m) maksymalna siła, jaką można przyłożyć, wynosi około 50 nN. Dostosuj odpowiednio wartości zadane i względne wartości zadane.
    1. Upewnij się, że podana wartość zadana nie prowadzi do głębokości wcięcia większej niż promień wgłębnika sferycznego, w przeciwnym razie powierzchnia wcięcia nie może być prawidłowo zdefiniowana w obliczeniach modułu Younga. Obliczyć średnią wartość głębokości wgłębienia po pierwszym przebiegu wgłębień; patrz Rozdział 5, Analiza danych, aby dowiedzieć się, jak przetwarzać zarejestrowane dane. W razie potrzeby dostosuj wartość zadaną.
  10. Ustaw opcję Dostosuj linię bazową na 5,
    UWAGA: W tym przypadku linia bazowa odnosi się do stopnia wielomianu użytego do dopasowania krzywych podejścia i wycofania. Ustawienie linii bazowej na 5 dopasowuje krzywe do wysokiej rozdzielczości, a tym samym zapewnia uchwycenie szumu tła podczas pomiarów.
  11. Wybierz długość ruchu wspornika w osi Z (długość Z) zgodnie z topografią powierzchni próbki. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, ustaw długość Z na 15 μm.
    UWAGA: Wysoka wartość (np. 15 μm) zmniejsza czułość pomiaru, ale jest zwykle wymagana w przypadku próbek o bardzo nieregularnej powierzchni, takich jak zwłóknieniowa tkanka wątroby.
  12. Ustaw ruch Z na Stały czas trwania.
    UWAGA: Ruch Z można również ustawić na Stała prędkość, aby view dane odnoszące się do ruchu Z (Rozszerz prędkość i Wydłuż czas) w innym trybie.
  13. Ustaw opcję Extend Time (Wydłuż czas) na 1 s. Ustaw opóźnienie wysuwania i cofania na 0,
    UWAGA: Do bardzo miękkich materiałów należy stosować prędkości przedłużania >5,0 μm/s61, ponieważ niższe prędkości wgłębienia spowodują bardziej lepką i mniej elastyczną reakcję miękkich powierzchni. Opóźnienie wysuwu i opóźnienie wycofania to parametry, które można wykorzystać do badania specyficznej interakcji między końcówką wspornika a podłożem (np. oddziaływania białek unieruchomionych na powierzchni wspornika z białkami unieruchomionymi na powierzchni szkiełka).
  14. Ustaw częstotliwość próbkowania na 5000 Hz.
    UWAGA: Częstotliwość próbkowania odnosi się do częstotliwości punktów, które są rejestrowane na pełnej krzywej zbliżania-cofania. Ustaw tę wartość na wysoką (np. 5000 Hz), aby uniknąć pominięcia niektórych obszarów krzywych z powodu ich niezwykle szybkiego przejścia.
  15. Oznacz zamkniętą pętlę Z za pomocą znacznika, aby włączyć system pętli sprzężenia zwrotnego, który zapewnia stałą odległość między powierzchnią próbki a końcówką wspornika.
  16. Odłącz zmotoryzowany stolik, usuwając zaznaczenie opcji Włącz i kliknij Podejść, aby zbliżyć się do próbki za pomocą wspornika. Kliknij Rozpocznij skanowanie, aby rozpocząć zbieranie krzywych siła-odległość w obszarze ustawionym w kroku 6; Sekcja 4, Pomiar.

5. Analiza danych

  1. Analizuj pozyskane dane za pomocą oprogramowania typu open source "AtomicJ" (które można pobrać ze strony https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
    UWAGA: Obsługuje pliki zebrane z mikroskopów sił atomowych Agilent Technologies, JPK Instruments lub Bruker.
  2. Załaduj krzywe sił do programu, klikając ikonę krzywych i map sił procesowych w AtomicJ (rysunek uzupełniający S2A, x). W asystencie przetwarzania dodaj mapy do analizy, klikając przycisk Dodaj (rysunek uzupełniający S2A, y). Kliknij przycisk Next (Dalej) po załadowaniu map (Rysunek uzupełniający S2A, z).
  3. Określ ustawienia przetwarzania w następnym oknie zgodnie z krokami opisanymi poniżej (odpowiadającymi krokom na rysunku uzupełniającym S2B, kroki 1-11):
    1. Oszacuj punkt styku między próbką a wspornikiem ręcznie za pomocą obliczeń lub automatycznie, korzystając z zestawu parametrów krzywej dopasowania. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy skorzystać z automatycznego oszacowania punktu kontaktowego.
    2. Określić punkt styku między wspornikiem a próbką za pomocą klasycznej metody siatki skoncentrowanej.
    3. Wybierz metodę estymacji, aby uzyskać najlepsze określenie punktu kontaktowego na podstawie jakości zmierzonych krzywych siły, które należy empirycznie określić podczas optymalizacji analizy danych. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj metody niezależnej od modelu.
    4. Dopasuj krzywą wcięcia siły przy użyciu modelu klasycznego (użyj klasycznego L2, aby dopasować model do tego protokołu).
      UWAGA: Dopasowanie modelu i estymator kontaktu to parametry, które określają, odpowiednio, w jaki sposób krzywe są dopasowywane przez oprogramowanie i w jaki sposób punkt kontaktowy jest ustalany w dopasowanej krzywej. Do tych pomiarów użyto opcji Klasycznej, która wykorzystuje regresję metodą najmniejszych kwadratów. Przetwarza on każdy punkt o małej sile na krzywej jako próbny punkt kontaktowy i dopasowuje wielomian do obszaru przed punktem kontaktowym próby. Następnie dopasowuje odpowiedni model kontaktowy do zebranych danych o wcięciach siły. Przyjmuje się, że punkt, który daje najniższą sumę kwadratów, jest traktowany jako punkt kontaktowy. Inne metody mogą być stosowane w oparciu o jakość uzyskanych krzywych siły62,63.
    5. Ustaw dopasowanie modelu do krzywej wycofania.
    6. Ustaw współczynnik Poissona na 0,45, zgodnie z zaleceniami dla tkanek miękkich, takich jak liver24.
    7. Ustaw dopasowanie krzywej, używając stopnia linii bazowej 3 i stopnia kontaktu 1. Zmień stopień dopasowania wielomianu na podstawie skali odchyleń krzywych od modelu.
    8. Wybierz model używany do dopasowania krzywych wycofania. Użyj modelu Sneddona, który oblicza moduł Younga na podstawie równania (1) i równania (2):
      figure-protocol-3 (1)
      δ = figure-protocol-4 (2)
      gdzie F to siła, E to moduł Younga, v to współczynnik Poissona próbki, δ to głębokość wcięcia, a to promień kontaktu, a R to promień kuli62,63.
    9. Wypełnij promień kulistej końcówki w mikrometrach (2,9 μm w tym protokole).
    10. Załaduj stałą sprężystości i InvOLS z plików danych, włączając wczytywanie (zaznacz pola).
    11. Kliknij Finish.
      UWAGA: Analizowane dane są przedstawione w postaci map ugięcia pionowego, wysokości, przyczepności, siły nacisku, odkształcenia, siły przyczepności, wartości R2, nachylenia, modułu Younga, wgłębienia przejściowego, siły przejścia i pozycji kontaktu obliczonych dla każdej krzywej siły (rysunek uzupełniający S3, lewy górny róg). Dwa dodatkowe okna wyświetlają krzywe siły i wartości surowe (rysunek uzupełniający S3, odpowiednio prawy górny i dolny panel).
  4. Wyklucz krzywe siły, w których wspornik zbliżał się nieprawidłowo do powierzchni sekcji wątroby. Aby je zidentyfikować, poszukaj krzywych o wysokim poziomie szumu, nieprawidłowych kształtach i/lub niekompletnym podejściu, jak pokazano w Rysunek 3 i szczegółowo omówione w innym miejscu46.

figure-protocol-5
Rysunek 3: Przykłady reprezentatywnych krzywych siła-przemieszczenie. (A,B) Reprezentatywne interpretowalne krzywe siły dla sztywniejszych (A; E = 10,5 kPa) i bardziej miękkie (B; E = 1,78 kPa) obszary, które nadają się do analizy. (C-F) Reprezentatywne nieinterpretowalne wykresy, które muszą zostać wyłączone z analizy z powodu (C-E) nieprawidłowego podejścia lub (F) wyższego poziomu hałasu. Jak wskazano w legendzie zamieszczonej w (A), czerwone krzywe pokazują zbliżanie się wspornika, a zielone krzywe pokazują wycofanie wspornika. Czarne linie pokazują dopasowanie krzywej wycofania wspornika. Nachylenie czarnych linii odpowiada modułowi Younga. Punkty czerwony i niebieski odpowiadają odpowiednio punktowi styku i punktowi przejścia. Punkt styku jest ostatnim punktem styku między wspornikiem a podłożem podczas wciągania, podczas gdy punkt przejścia opisuje przejście wspornika od podejścia do wycofania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łagodnie utrwalone, 30 μm grube odcinki wątroby uzyskane od myszy kontrolnych oraz od myszy z łagodnym lub zaawansowanym zwłóknieniem (indukowanym przez wstrzyknięcie CCl4 przez odpowiednio 3 tygodnie lub 6 tygodni49) były badane za pomocą AFM, jak opisano w tym protokole. Do pomiaru map sztywności wybrano włókna kolagenowe w pobliżu żył centralnych. Obszary w pobliżu żył centralnych, które odpowiadają obszarom, w których zwykle tworzą się włókna kolagenowe u zwierząt traktowanychCCl 4, analizowano w wątrobach kontrolnych (Figura 4A). Rozkład modułów Younga był powtarzalny w różnych wątrobach kontrolnych i obszarach bogatych w kolagen w obrębie pojedynczego odcinka wątroby (Ryc. 4B: wykres lewych skrzypiec).

U zwierząt leczonych CCl4, mapy sztywności odpowiadające okołocentralnym obszarom złogów kolagenu wykazały znacznie wyższe wartości modułów Younga w porównaniu do równoważnych obszarów u myszy kontrolnych (Rysunek 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa mediana wartości modułu Younga dla kontroli vs. 3-tygodniowa mysz leczona CCl4; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa mediana wartości modułu Younga dla kontroli vs. 6 tygodni CCl4-leczona mysz; p = 0,02). Co więcej, nastąpił znaczny wzrost wartości modułów Younga przy dłuższym leczeniuCCl 4 (Rysunek 4B; 2,6 kPa w porównaniu z 5,1 kPa mediana wartości modułu Younga dla 3 tygodni w porównaniu z 6 tygodniami myszy leczonej CCl4; p = 0,04). Pokazuje to stopniowe usztywnienie złogów kolagenu wraz z progresją zwłóknienia i że pomiary AFM odzwierciedlają fibrogenezę.

Aby ocenić wpływ długotrwałego przechowywania skrawków wątroby z osadzonymi w OCT na właściwości mechaniczne włókien kolagenowych, zmierzyliśmy sztywność włókien kolagenowych w sekcjach myszy traktowanych CCl4, które były przechowywane w temperaturze -80 °C przez 2 tygodnie lub 3 miesiące na szkiełku po cięciu (Rysunek 5). Pomiary AFM wykazały istotnie niższe wartości modułów Younga w obszarach bogatych w kolagen dla skrawków przechowywanych przez 3 miesiące w porównaniu z tymi uzyskanymi z odcinków zmierzonych w ciągu 2 tygodni od przekroju próbki (Rysunek 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa mediana wartości modułu Younga przez 2 tygodnie w porównaniu z 3 miesiącami przechowywania; p < 0,001). Dlatego ważne jest, aby zmierzyć właściwości mechaniczne tkanki wątroby wkrótce po przygotowaniu skrawków z płatów wątrobowych osadzonych w OCT.

figure-results-1
Rysunek 4: Pomiary AFM ujawniają postępujące usztywnienie obszarów bogatych w kolagen, korelujące z przedłużonym leczeniemCCl 4. (A) Wycinki wątroby myszy kontrolnych i myszy leczonych CCl4 przez 3 tygodnie lub 6 tygodni zostały użyte do pomiaru właściwości mechanicznych obszarów bogatych w kolagen. Pudełkowe obszary skrawków wątroby pokazane na spolaryzowanych obrazach mikroskopowych (po lewej) to bogate w kolagen obszary skanowania (lub odpowiadające im obszary w wątrobie kontrolnej) wybrane do pomiarów AFM (30 μm x 100 μm, 10 pikseli x 36 pikseli). Mapy modułu Younga ze skalami kolorów odpowiadającymi tym obszarom ramkowym są pokazane po prawej stronie, w tym histogramy wartości modułu Younga z tych map; Wykresy punktowe pokazują wartości >10 kPa dla każdego warunku. Usztywnienie wątroby jest wizualizowane jako stopniowe przesunięcie w prawo rozkładu histogramu i wyższa częstotliwość punktów na wstawkowym wykresie punktowym. Podziałka liniowa = 20 μm. (B) Wykresy skrzypiec pokazują rozkład modułów sprężystości z trzech obszarów mierzonych dla każdego warunku (po lewej) i sumaryjne wartości modułów sprężystości ze wszystkich trzech map (po prawej). Wykresy skrzypiec pokazują medianę (czerwona linia), 25. percentyl i 75. percentyl (czarne linie); Kropki reprezentują średnie wartości poszczególnych map z obszarów 1-3. Prezentowane wartości p zostały obliczone za pomocą testu t Studenta wykonanego na średnich. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 = czterochlorek węgla. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 5: Przedłużone przechowywanie skrawków wątroby prowadzi do zmniejszenia sztywności obszarów bogatych w kolagen. Do pomiaru modułu Younga użyto skrawków wątroby (przygotowanych od myszy leczonychCCl 4 przez 2 tygodnie) przechowywanych w temperaturze -80 °C przez 2 tygodnie lub 3 miesiące. Obrazy z mikroskopii polaryzacyjnej (po lewej) z ramkami wskazującymi obszary bogate w kolagen używane do pomiaru AFM (30 μm x 100 μm, 10 pikseli x 36 pikseli). Odpowiadający mu moduł Younga jest odwzorowywany ze skalami kolorów (po prawej). Histogramy pokazują wartości modułu Younga zebrane z 4-6 obszarów w każdej próbce; Wbudowane wykresy punktowe pokazują wartości >10 kPa dla każdego warunku. Podziałka = 20 μm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; CCl4 = czterochlorek węgla. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Metoda modyfikacji wspornika za pomocą mikrokulki z żywicy melaminowej. (A) Narysowany schemat ilustruje przymocowanie kulistego koralika do końcówki wspornika. Aby zapoznać się z opisem krokowym, patrz Rozdział 2, Część 1, Mocowanie ściegu 5,7 μm do końcówki wspornika AFM. (B) Obraz mikroskopowy sferycznego koralika o średnicy 5,7 μm przymocowanego do końcówki wspornika, pokazany od góry (po lewej) i z boku view (po prawej). Podziałka = 20 μm. Skróty: AFM = mikroskopia sił atomowych; RT = temperatura pokojowa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Analiza danych w AtomicJ. (A) Sekwencja kroków, które należy wykonać, aby uzyskać mapy sztywności otworu w AtomicJ. Pojedyncze kliknięcie lewym przyciskiem myszy na krzywych i mapach siły procesowej (x) otwiera asystenta przetwarzania. Pliki można załadować do asystenta przetwarzania, klikając dodaj (y) i wybierając żądane pliki. Kliknij Dalej (z), aby przejść do następnego kroku. (B) Parametry dopasowania krzywej, odpowiedni model mechaniki kontaktu i ustawienia AFM używane podczas pomiaru. Kroki 1-11 odnoszą się do odpowiednich podpunktów wyszczególnionych w kroku 3 protokołu, sekcja 5, Analiza danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Zarys analizowanych danych w AtomicJ. Podgląd analizowanych danych pokazuje mapy sztywności (lewe górne okno), krzywe sił (prawe górne okno) i surowe dane (dolne okno). Skrót: AFM = mikroskopia sił atomowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół zapewnia krok po kroku powtarzalną metodę pomiaru AFM prawidłowej i zwłókniejącej tkanki wątroby myszy. Mikroskopia polaryzacyjna sprzężona zapewnia wysoką precyzję przestrzenną i umożliwia wizualizację włókien kolagenowych ze względu na ich dwójłomność. Ponadto przedstawiono szczegółowy opis analizy uzyskanych krzywych sił. Pomiar sztywności AFM można wykonać na poziomie komórkowym, co pozwala na monitorowanie miejscowych zmian właściwości mechanicznych tkanki wątroby spowodowanych rozwijającą się chorobą zwłóknieniową. Zwłóknienie wątroby nie jest jednorodnym procesem wpływającym na cały narząd. Wręcz przeciwnie, obszary bogatych w kolagen przegród zwłóknieniowych przeplatają się z obszarami o niskim lub zerowym poziomie złogów kolagenu. W związku z tym zmiany sztywności są specyficzne dla lokalnego mikrośrodowiska i wpływają na komórki tylko miejscowo stykające się z obszarami uszkodzonymi przez uraz. Ta mikroskala niejednorodności sztywności jest również widoczna w szczegółach map modułów AFM Younga, gdzie punkty o wysokiej sztywności graniczą z obszarami o prawie normalnej sztywności. Ta zmienność pokazuje, że nawet obszar tkanki bliznowatej kolagenu nie jest mechanicznie jednorodny i wymaga scharakteryzowania pomiaru AFM na poziomie komórkowym (ryc. 4).

Przedstawiony protokół pozwala na pomiar sztywności wątroby za pomocą AFM niezależnie od pobrania wątroby, ponieważ całe płaty wątroby osadzone w OCT mogą być przechowywane przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C. Jednak po przecięciu tkanki zalecamy zmierzenie próbek w ciągu ~2 tygodni, ponieważ zaobserwowaliśmy stopniowe zmiękczanie skrawków tkanek przechowywanych przez dłuższy czas (ryc. 5).

AFM wyposażony w mikroskopię polaryzacyjną pozwala na precyzyjne zlokalizowanie obszaru zainteresowania w obrębie struktury zrazika wątroby. Ma jednak również pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji wyników. Uzyskane tutaj wartości sztywności zostały zmierzone w temperaturze pokojowej. Zakładamy, że wpływ temperatury na właściwości mechaniczne tkanek miękkich będzie niewielki; Może to być jednak jedna z przyczyn różnic między podawanymi in vivo wartościami właściwości mechanicznych tkanek wątroby a wartościami w niniejszym badaniu.

Ponadto protokół ten pozwala na analizę AFM tkanki wątroby przez okres do 3 godzin, co wymaga łagodnego unieruchomienia tkanki. Łagodne utrwalenie skrawków tkanki, a także cykl zamrażania-rozmrażania, najprawdopodobniej wpłyną na bezwzględne wartości modułu Younga. W związku z tym podane wartości modułów Younga mogą różnić się od wartości in vivo . Potrzebne są dalsze badania w celu optymalizacji protokołu pomiaru bezwzględnych wartości modułu Younga z odcinków wątroby, co można osiągnąć inną metodą utrwalania tkanki wątroby64.

Niemniej jednak zaobserwowaliśmy rosnącą sztywność obszarów bogatych w kolagen w wątrobie myszy leczonychCCl 4 przez 3 tygodnie w porównaniu z 6 tygodniami. Zmiany te odpowiadają progresji zwłóknienia podczas długotrwałego urazu (ryc. 4) i pokazują, że za pomocą przedstawionego protokołu można badać względne różnice między różnymi terapiami. Jest to zgodne z obserwacjami Calò i wsp., którzy wykazali, że łagodnie unieruchomione skrawki wątroby wykazują podobne różnice w wartościach sztywności między obszarami bogatymi w kolagen i pozbawionymi kolagenu, jak w świeżej tkance25.

Zastosowaliśmy wspornik SD-qp-BioT-TL-10 (teoretyczna stała sprężystości ~0,09 N/m) zmodyfikowany kulistą końcówką o średnicy 5,7 μm w celu zminimalizowania mechanicznego uszkodzenia tkanki wątroby podczas pomiarów. Kulka o średnicy 5,7 μm umożliwiła wystarczające wgłębienie próbki, aby zbadać jej sztywność przy jednoczesnym zachowaniu jej integralności. Ścieg o mniejszej średnicy może być użyty, po kilku optymalizacjach, do uzyskania wyższej rozdzielczości w mapach sztywności, ale może prowadzić do dalszego przeszacowania wartości modułu Younga (więcej szczegółów można znaleźć w Crichton i wsp.65). Korzystając z określonego zestawu wspornika-stopki, byliśmy w stanie scharakteryzować sztywność próbki w szerokim zakresie, od kilkudziesięciu jednostek Pa do ~100 kPa.

Model Sneddona został wykorzystany do wyprowadzenia modułu Younga na podstawie krzywych sił, ponieważ umożliwia analizę głębokich wgłębień za pomocą sond koloidalnych62. Model Sneddona, w przeciwieństwie do modelu Hertza, nie cierpi z powodu ograniczenia, że promień kontaktu musi być znacznie mniejszy niż promień kuli. Zakłada się ponadto, że grubość próbki jest kilkakrotnie większa niż głębokość wgłębienia30,66. W niniejszym badaniu wgłębienie wynosiło ~2 μm przy wielkości kulki 5,7 μm i grubości próbki 30 μm w obszarach bogatych w kolagen; w związku z tym model Sneddona był odpowiedni. Inne modele63 biorąc pod uwagę siłę przylegania między końcówką a podłożem, mogą być stosowane do różnych typów tkanek.

Analiza w AtomicJ wprowadza poprawki na skończoną grubość próbek w celu zminimalizowania udziału substratu przy jednoczesnym wyprowadzeniu modułu Younga62,67. W analizie uzyskanych krzywych sił zastosowaliśmy pojedynczy współczynnik Poissona wynoszący 0,45, który był wcześniej zalecany dla narządów tkanek miękkich24. Przybliżenie to nie ma istotnego wpływu na obliczone wartości modułu Younga, gdyż zmiana wartości współczynnika Poissona z 0,4 na 0,5 powoduje jedynie 0,893-krotny spadek wartości modułu Younga obliczonych według równania Sneddona. Biorąc pod uwagę wielokrotne różnice w module Younga między różnymi czasami trwania zabiegówCCl 4, błędy wynikające z aproksymacji współczynnika Poissona są tylko marginalne.

Do obliczenia wartości sztywności użyliśmy krzywych wycofania, ponieważ interesowała nas sprężysta reakcja tkanki na obciążenie dostarczane przez wspornik, a nie reakcja plastyczna na wgłębienie68. Ze względu na lepkosprężystą reakcję tkanki miękkiej, dopasowanie krzywych wycofania może zawyżać moduł Younga, o czym należy pamiętać. Ponadto zaobserwowaliśmy, że analiza danych z krzywymi podejścia daje podobne trendy w wartościach sztywności między obszarami zwłóknienia i kontrolnymi, chociaż wartości bezwzględne są odpowiednio niższe (dane nie pokazane).

Optymalizując protokół, zidentyfikowaliśmy kilka kroków krytycznych dla odtwarzalności pomiarów. Po pierwsze, ważne jest, aby upewnić się, że koralik znajduje się mniej więcej pośrodku półprzezroczystej końcówki podczas mocowania do wspornika. Zapobiega to ewentualnemu niewyważeniu mechanicznemu podczas wgniatania. Po drugie, podczas wiązania wątroby z PFA konieczne jest ścisłe przestrzeganie limitów czasowych rozmrażania i utrwalania. Zmiana czasu tego etapu może poważnie wpłynąć na właściwości mechaniczne skrawków tkanek. Po trzecie, wspornik musi być wielokrotnie kalibrowany z ciągłym monitorowaniem i wprowadzaniem jednoczesnych wartości temperatury, aby uniknąć wystąpienia jakichkolwiek artefaktów w wartościach sztywności spowodowanych wahaniami temperatury. Wreszcie, pojedynczy wycinek wątroby nie powinien być mierzony dłużej niż 3 godziny od przygotowania, ponieważ nałożony PBS może parować przez dłuższy czas. Czytelnicy mogą zapoznać się z tabelą rozwiązywania problemów (Tabela 3) w celu rozwiązywania problemów napotkanych podczas pomiaru AFM, omówionej również szczegółowo w Norman et al.46.

Tabela 3: Przewodnik rozwiązywania problemów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Przedstawiony protokół pozwala na powtarzalne badanie tkanki wątroby za pomocą AFM. Ma ona potencjał, aby ujawnić informacje na temat rozwoju i ostatecznej regresji zwłóknieniowej choroby wątroby na poziomie mikroskopowym i może przyczynić się do opracowania terapii ukierunkowanych na zwłókniałe obszary blizn powstałe podczas progresji przewlekłej choroby wątroby.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Agencję Grantową Republiki Czeskiej (18-02699S), Instytucjonalny Projekt Badawczy Czeskiej Akademii Nauk (RVO 68378050) oraz projekt MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC konsorcjum UE, finansowane przez projekt infrastrukturalny MEYS CR LM2018127 i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego – projekt "UP CIISB" (nr CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) wsparł finansowo pomiary w CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Dziękujemy również Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Republika Czeska, wspierana przez MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) i RVO: 68378050-KAV-NPUI, za ich wsparcie w zakresie obrazowania mikroskopowego przedstawionego w niniejszym dokumencie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Głowica AFMBrukerJPK nanowizard 3
KameryAndorZyla 5.5 USB (sCMOS, chłodzone wodą)
Obrazowanieźródło S/N:12310015
CantileverSD-qp-BioT-TL-10, NanosensoryS/N:73750F05
CryotomeLeica CM1950
Klej na bazie żywicy epoksydowej (długi czas pracy)Bison epoksydowe uniwersalne
kulki melaminowe; średnica, 5,7 umMikrocząstki, GmbHMF-R-5.7
MikroskopOlympus  IX81
Hydrofobowy  marker do slajdówSuperHTPAP PEN
OprogramowanieJPK nanowizard  v6.1.151
Prowadnice AtomicJ v2.3.1
SuperfrostThermoscientificnr ref. J1800AMNZ
SystemUbuntu 14.04.5 LTS
Kontrola izolacji drgań jednostkaStajnia stołowaAVI-200-S

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
  2. Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
  3. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual Review of Pathology. 6, 425-456 (2011).
  5. Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
  6. Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
  8. Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
  9. Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
  10. Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
  11. Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
  12. Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
  13. Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
  14. Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
  15. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
  16. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
  17. Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
  18. Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
  19. Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
  20. Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
  21. Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
  22. Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
  23. Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
  24. Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
  25. Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664(2020).
  26. Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
  27. Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
  28. Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 56 (9), (1986).
  29. Johnson, K. L. Contact Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1985).
  30. Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159(2022).
  31. Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
  32. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  33. Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
  34. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911(2011).
  35. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  36. Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600(2019).
  37. del Mar Vivanco, M. Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
  38. Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597(2018).
  39. Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
  40. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
  41. Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
  42. Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
  43. Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
  44. Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
  45. Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
  46. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  47. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  48. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  49. Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
  50. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  51. Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724(2013).
  52. Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487(2020).
  53. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  54. Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
  55. Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
  56. Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
  57. Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
  58. Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705(2012).
  59. JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
  60. van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908(2015).
  61. Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
  62. Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703(2014).
  63. Hermanowicz, P. AtomicJ 2.3.1 User's Manual. , (2021).
  64. Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619(2020).
  65. Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
  66. Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705(2015).
  67. Hermanowicz, P. Determination of Young's modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138(2021).
  68. Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Liver StiffnessAtomic Force MicroscopyPolarization MicroscopyLiver FibrosisCollagen Rich AreasYoung s ModulusTissue ElasticityForce Distance CurvesFibrogenesisSoft Tissue Mechanics

Powiązane artykuły