Artykuł metodologiczny

Niespecyficzna strategia glikomiczna oparta na proteolizie dla glikoprotein bakteryjnych

763 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63977

⸱

30 czerwca 2022

 ,  , 
1Human Health Therapeutics Research Center, National Research Council Canada

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia metodę analizy glikoprotein za pomocą kombinacji trawienia pronazy E, permetylacji i analizy spektrometrii mas. Ta metoda jest w stanie analizować wszystkie typy glikanów sprzężonych z N, w tym N-glikany bakteryjne.

Streszczenie

Glikozylacja białek jest jedną z najczęstszych i najbardziej złożonych modyfikacji potranslacyjnych. Opracowano wiele technik mających na celu scharakteryzowanie specyficznych ról glikanów, zależności między ich strukturami oraz ich wpływu na funkcje białek. Powszechną metodą analizy glikanów jest zastosowanie rozszczepienia egzoglikozydazy w celu uwolnienia glikanów połączonych z N z glikoprotein lub glikopeptydów przy użyciu peptyd-N-glikozydazy F (PNGazy F). Jednak wiązania glikan-białko w bakteriach są różne i nie ma dostępnego enzymu, który uwalniałby glikany z glikoprotein bakteryjnych. Ponadto wolne glikany zostały również opisane w komórkach ssaków, bakteriach, drożdżach, roślinach i rybach. W tym artykule przedstawiamy metodę, która może scharakteryzować system glikozylacji sprzężonej z N w Campylobacter jejuni poprzez wykrywanie glikanów związanych z asparaginą (Asn) i wolnych glikanów, które nie są przyłączone do białek docelowych. W tej metodzie białka ogółem z C. jejuni były trawione przez Pronazę E o wyższym stosunku enzymu do białka (2:1−3:1) i dłuższym czasie inkubacji (48−72 h). Otrzymane Asn-glikany i wolne glikany zostały następnie oczyszczone za pomocą porowatych grafitowych wkładów węglowych, permetylowane i analizowane za pomocą spektrometrii mas.

Wprowadzenie

Białko N-glikozylacja jest jedną z najczęstszych i najbardziej złożonych modyfikacji potranslacyjnych u eukariontów1. N-glikany odgrywają istotną rolę w fałdowaniu białek, a także mają wpływ na sortowanie białek w ruchu biosyntetycznym2. Spektrometria mas jest szeroko stosowana w analizie glikanów uwalnianych przez rozszczepienie egzoglikozydazy (glikomy). Pozostałe deglikozylowane peptydy (glikoproteomika) były powszechnie stosowane do identyfikacji sekwencji glikozylowanych peptydów u eukariontów3. Identyfikacja glikanów sprzężonych z N w Campylobacter jejuni sugeruje, że N-glikozylacja nie jest ograniczona do eukariontów4,5,6,7,8. Jednak w przypadku bakterii brakuje skutecznych egzoglikozydaz lub endoglikozydaz uwalniających oligosacharydy do analizy glikanów.

Opracowano alternatywne podejście do charakteryzowania miejsc glikozylacji i struktur glikanów w glikoproteinach, które opiera się na użyciu niespecyficznej proteolizy do trawienia szkieletu większości peptydów i generowania pseudo-oligosacharydów, które zawierają tylko kilka aminokwasów. Do generowania pseudooligosacharydów użyto różnych niespecyficznych enzymów i stwierdzono, że Pronase E oferuje najbardziej efektywne i powtarzalne trawienie9. Opracowaliśmy strategię glikomiczną opartą na Pronase E do analizy N-glikanów C. jejuni<sup class="xref">10,11. Pseudooligosacharydy analizowano bezpośrednio za pomocą spektrometrii mas elektroforezy kapilarnej (CE-MS) i/lub spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS) po permetylacji.

Tutaj opisana jest uniwersalna metoda analizy glikomicznej, która wykorzystuje niespecyficzne trawienie i permetylację Pronase E do badania glikozylacji z patogenu błony śluzowej C. jejuni. Metoda ta jest w stanie scharakteryzować glikany sprzężone z N ulegające ekspresji zarówno przez systemy eukariotyczne, jak i bakteryjne, a także jest przydatna w identyfikacji nowych produktów pośrednich w szlakach glikozylacji sprzężonych z N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla C. jejuni 11168H i ekstrakcja białek ogółem

UWAGA: C. jejuni 11168H jest hiperruchliwą pochodną klonalną NCTC 1116812.

  1. Hodowlę komórkową należy rozpocząć od ponownego nawodnienia osadu komórkowego (około 0,15 g, NCTC) za pomocą około 5 ml pożywki Muellera-Hintona. Użyj kilku kropli pierwotnej probówki bulionowej, aby zaszczepić płytkę agarową Muellera-Hintona. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin w atmosferze mikroaerofilowej, tj. 5%O2, 10% CO2 i 85 % N2 .
  2. Zbierz trawniki bakteryjne za pomocą 1 ml bulionu Brain Heart Infusion (BHI). Rozcieńczyć zbiory, aby osiągnąć około 1 x 105 cfgu/ml bulionem BHI. Hodować komórki przez 18 godzin z wytrząsaniem (100 obr./min) w atmosferze mikroaerofilowej w temperaturze 37 °C.
  3. Schłodzić komórki, umieszczając płytki na lodzie na 10 minut, a następnie zebrać komórki przez odwirowanie (4 500 x g w temperaturze 4 °C). Odrzucić supernatant i umyć komórki 2x w 3 l lodowatego 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8).
  4. Zawieś komórki (108-10 11 C. komórek jejuni) w 8 ml lodowatego 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8) i poddaj lizie przez sonikację (tabela materiałów). Wykonaj sonikację w następujący sposób: 4 s impulsu, 1 s przerwy, 1 minuta za każdym razem i trzy razy razem.
  5. Wirować przy 9 500 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do innej probówki. Dializować białka w supernatancie 2x w stosunku do 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
  6. Określ stężenia białka za pomocą dostępnego na rynku testu białkowego13 (powinien mieścić się w zakresie od 4 do 6 μg/μL).
  7. Rozpuścić 1 mg białek w 1 ml 0,1 M buforu Tris-HCl (pH 7,5) i dodać 2,5 mg Pronazy E do roztworu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, a następnie gotować roztwór w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu dezaktywacji enzymu.
  8. Przechowywać roztwór do trawienia białka w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.

2. Oczyszczanie za pomocą porowatego węgla grafitowego (PGC)

  1. Aktywować wkłady PGC (100 mg, 5 ml), dodając 1 ml 80% (v/v) acetonitrylu (ACN) zawierającego 0,1% kwasu trifluooctowego (TFA) i powtórzyć 2x.
  2. Umyj wkład PGC 1 ml wody 3x.
  3. Załaduj trawienie Pronase E z 1 mg białka na PGC (objętość zależy od stężenia białka).
  4. Za każdym razem umyj wkład 1 ml wody, aby usunąć sole.
  5. Elute Asn-glikany z 1 ml 25% ACN w 0,1% TFA, a następnie 1 ml 50% ACN w 0,1% TFA.
  6. Zebrać obie frakcje i wysuszyć próbki za pomocą koncentratora próżniowego z chłodzeniem (tabela materiałów) w celu dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Do oczyszczania Asn-glikanu należy używać rozpuszczalników klasy MS.

3. Permetylacja Asn-glikanów

  1. Wysuszone Asn-glikany rozpuścić za pomocą 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) w probówce o pojemności 1,5 ml.
  2. Przygotować zawiesinę DMSO-NaOH, mieszając dwie granulki NaOH z 2 ml DMSO. Do próbki dodać 200 μl zawiesiny DMSO-NaOH i 100 μl jodku metylu.
  3. Szczelnie zamknij rurkę i mieszaj z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą miksera wirowego.
  4. Zgrozić permetylację, dodając 1 ml wody.
  5. Dodaj 1 ml chloroformu i wiruj przez 1 minutę, aby wyekstrahować permetylowane Asn-glikany.
  6. Wirować przy 9 000 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i zachować dolną fazę chloroformu z permetylowanymi Asn-glikanami.
  7. Przemyć warstwę organiczną, dodając 1 ml wody z wirowaniem przez 1 min. Wirować przy 9 000 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant. Powtórz 2 razy.
  8. Umieść fazę organiczną w dygestoriach i pozostaw do wyschnięcia strumieniem azotu w temperaturze pokojowej.
  9. Permetylowane Asn-glikany należy przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy spektrometrycznej mas.

4. Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylaną (ESI-MS) i analiza ESI-MS/MS

  1. Rozpuść permetylowane Asn-glikany w 20 μl 50% 2-propanolu w wodzie (v/v).
  2. Przeprowadzić analizę CE-ESI-MS przy użyciu 90 cm kapilary z gołej stopionej krzemionki o przepływie 50% 2-propanolu w wodzie o stężeniu 1 μl/min.
    UWAGA: CE-MS to system, który łączy w sobie elektroforezę kapilarną (CE) i spektrometrię mas. CE oddziela jony na podstawie ich ruchliwości jonów. W tym protokole system CE jest wykorzystywany do wprowadzania niewielkiej objętości próbek i przeprowadzania odsalania on-line.
  3. Ustawić napięcie ESI na 5 kV w trybie dodatnim.
  4. Załadować permetylowane próbki Asn-glikanu przy ciśnieniu 500 mbar przez 0,2 minuty, co odpowiada około 100 nL.
  5. Pozyskaj dane MS za pomocą spektrometru mas (tabela materiałów) przy użyciu następujących parametrów akwizycji.
    1. W przypadku pełnego MS ustaw czas przebywania na 2,0 ms na krok 0,1 m/z. W eksperymentach MS2 i MS3 z ulepszonym skanowaniem jonów produktu (EPI) ustaw prędkość skanowania na 4 000 Da/s z pułapkowaniem Q0. Ustaw czas wypełnienia pułapki jako dynamiczny, a rozdzielczość Q1 jako jednostkę. W przypadku eksperymentów MS3 należy ustawić współczynnik wzbudzenia, aby upewnić się, że dla pojedynczego naładowanego prekursora wybrany jest tylko pik monoizotopowy. Ustaw czasy wzbudzenia na 100 ms.

5. Analiza permetylowanych glikanów przez MALDI-TOF MS

  1. Rozpuścić permetylowane Asn-glikany w 10 μl 50% metanolu/wody (v/v).
  2. Zmieszać 1 μl rozpuszczonych Asn-glikanów z 2 μl roztworu kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (10 mg/ml w 50% acetonitrylu/wodzie (v/v)).
  3. Dodać 1 μl zmieszanej próbki do 384-dołkowej płytki MALDI i poczekać, aż próbka całkowicie wyschnie.
  4. Włożyć płytkę do spektrometru mas MALDI-TOF wyposażonego w impulsowy laser azotowy (337 nm). Ustawić napięcie przyspieszające na 20 kV w trybie dodatnim.
  5. Ustaw moc lasera na dowolną skalę 6 000 i pobierz dane w trybie dodatniego reflektoronu od m/z 1 000 do 5 000.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metodę opartą na połączeniu trawienia pronazą E i permetylacji zastosowano do analizy N-glikanów z ekstraktów białek całkowitych z *C. jejuni* 168H. Rycina 1 przedstawia schemat procedury eksperymentalnej. W typowym trawieniu stosunek enzymu do glikoproteiny ustalono w zakresie od 1:10 do 1:20. W tym przypadku stosunek Pronase E do białka zwiększono do 2:1–3:1 i zastosowano dłuższy czas trawienia, aby uzyskać całkowity rozkład poprzez inkubację w 37 °C przez 48 h. Glikany Asn z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole znajdują się dwa kluczowe kroki dla wdrożenia tej uniwersalnej strategii glikomicznej. Pierwszym krytycznym krokiem jest zakończenie trawienia spalin. Ta metoda silnie zależy od zakończenia trawienia pronazy E. Dlatego tak ważne jest, aby stosować długi czas trawienia i wysoki stosunek enzymów do białka. Zazwyczaj sugeruje się stosowanie stosunku 2:1-3:1 dla pronazy E / białka i czas inkubacji wynoszący 48 godzin. Wykazano, że proponowane trawienie spalin wytworzyło glikany z jednym aminokwasem jako głównym s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Kennethowi Chanowi, Davidowi J. McNally'emu, Haraldowi Nothaftowi, Christine M. Szymanski, Jeanowi-Robertowi Brissonowi i Eleonorze Altman za pomoc i pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB),Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)149357
2-PropanolFisher Scientific (Ottawa, Ontario, Kanada)AA22906K7
4000 Q-TrapAB Sciex (Concord, Kanada)Spektrometr masowy
4800 MALDI-TOF/TOFApplied Biosystems (Foster City, CA)Spektrometr masowy
acetonitryl ( ACN)Fisher Scientific ( Ottawa, Ontario, Kanada)A996-4
Napar z mózgu i serca (BHI) bulionSigma-Aldrich (St. Louis, MO)5121
C18 Sep-Pak wkładyWaters (Milford, MA).
chloroformSigma-Aldrich (St. Louis, MO)CX1054
DifcoFisher Science (Ottawa, Ontario, Kanada)DF0037-17-8Fisher Science
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)276855
Rurka EppendorfaDiamed (Missisauga, Ontario, Kanada)SPE155-N
octowy lodowcowy kwasSigma-Aldrich (St. Louis, MO)A6283
metanolFisher Scientific, Ottawa, Ontario, Kanada)A544-4
jodek metyluSigma-Aldrich (St. Louis, MO)289566
Wkład PGCThermo Scientific(Waltham,MA)60106-303Porowaty węgiel grafitowy
Pronase ESigma-Aldrich (St. Louis, MO)7433-2
Zestaw do oznaczania białekBio-rad (Mississauga, Ontario, Kanada)5000001
Koncentrator próżniowy z chłodzeniemThermo Scientific(Waltham,MA)SRF110P2-230
wodorotlenek soduSigma-Aldrich (St. Louis, MO)367176
Sonicator Procesor ultradźwiękowyMandel Scientific (Guelph, Ontario, Kanada)XL 2020
Kwas trifluooctowy (TFA)Fisher Scientific( Ottawa, Ontario, Kanada)A11650
Tris-HClSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T3253
WAT036945

Bibliografia

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: more functions for oligosaccharides. Science. 269 (5228), 1234-1235 (1995).
  2. Scheiffele, P., Peränen, J., Simons, K. N-glycans as apical sorting signals in epithelial cells. Nature. 378 (6552), 96-98 (1995).
  3. Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
  4. Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
  5. Young, N., et al. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42530-42539 (2002).
  6. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
  7. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  8. Linton, D., et al. Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Molecular Microbiology. 55 (6), 1695-1703 (2005).
  9. Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
  10. Liu, X., et al. Mass spectrometry-based glycomics strategy for exploring N-linked glycosylation in eukaryotes and bacteria. Analytical Chemistry. 78 (17), 6081-6087 (2006).
  11. Nothaft, H., Liu, X., McNally, D. J., Li, J., Szymanski, C. M. Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 15019-15024 (2009).
  12. Macdonald, S. E., et al. Draft genome sequence of Campylobacter jejuni 11168H. Genome Announcements. 5 (5), e01556(2017).
  13. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  14. Liu, X., Chan, K., Chu, I. K., Li, J. Microwave-assisted nonspecific proteolytic digestion and controlled methylation for glycomics applications. Carbohydrate Research. 343 (17), 2870-2877 (2008).
  15. Liu, X., et al. 34;One-pot" methylation in glycomics application: Esterification of sialic acids and permanent charge construction. Analytical Chemistry. 79 (10), 3894-3900 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

glikozylacja bia ekanaliza glikan wglikany typu Nci cie egzosydaztrawienie pronaz Eglikany wi zane z Asnwolne glikanyporowaty w giel grafitowyspektrometria masowa
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły