Artykuł metodologiczny

Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

DOI:

10.3791/63981

⸱

24 stycznia 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry, Molecular Sciences Research Hub, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanożele są doskonałą i wszechstronną platformą nanocząsteczek do dostarczania leków biologicznych. Reagujące na bodźce polimerowe nanożele na bazie glikolu poli(etylenowego), zdolne do kapsułkowania ładunków opartych na białkach, zsyntetyzowano przy użyciu jednoetapowej strategii sieciowania ko-nanopolimeryzacji w warunkach wodnych. Przedstawiono tutaj optymalne wytwarzanie i charakterystykę tych nowych nanocząstek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanożele składające się z usieciowanych polimerowych nanocząstek zostały opracowane do dostarczania licznych chemicznych i biologicznych środków terapeutycznych, dzięki ich wszechstronnej syntezie oddolnej i biokompatybilności. Chociaż do tej pory do syntezy nanożeli stosowano różne metody, bardzo niewielu udało się to osiągnąć bez użycia ostrych rozpuszczalników organicznych lub wysokich temperatur, które mogą uszkodzić integralność ładunku biologicznego. W przeciwieństwie do tego, przedstawiona tutaj metodologia pozwala na syntezę nanożeli o wielkości poniżej 100 nm, obciążonych białkami w łagodnych warunkach reakcji. W tym miejscu przedstawiamy metodę niekowalencyjnej enkapsulacji ładunków opartych na białkach w nanożelach, które zostały zsyntetyzowane przy użyciu wodnej, jednoetapowej techniki kopolimeryzacji sieciowej. W tej technice początkowo elektrostatycznie wiążemy ładunek oparty na białku z kationowym czwartorzędowym monomerem amoniowym, a jednocześnie sieciujemy go i kopolimeryzujemy za pomocą nadsiarczanu amonu i N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiaminy, tworząc nanożele, które zatrzymują ładunek białka. Wielkość i wskaźnik polidyspersyjności nanożeli określa się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), natomiast morfologię powierzchni ocenia się za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Masę białka uwięzionego w nanożelach określa się poprzez obliczenie wydajności kapsułkowania. Co więcej, zdolność nanożeli do kontrolowanego uwalniania poprzez stopniową degradację elementów strukturalnych reagujących na redoks jest również oceniana w testach bioredukcji. Podajemy przykłady danych optymalizacyjnych dotyczących nanocząstek, aby zademonstrować wszystkie zastrzeżenia dotyczące syntezy i charakterystyki nanożeli przy użyciu tej techniki. Ogólnie rzecz biorąc, uzyskano nanożele o jednolitej wielkości i średniej wielkości 57 nm i wartości wskaźnika polidyspersyjności wynoszącej 0,093. Osiągnięto wysoką skuteczność enkapsulacji wynoszącą 76%. Co więcej, nanożele wykazywały kontrolowane uwalnianie do 86% kapsułkowanego białka poprzez stopniową degradację nowych składników reagujących na redoks w obecności glutationu przez 48 godzin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanożele to trójwymiarowe, submikronowe hydrożele z usieciowanymi strukturami sieci polimerowej, które mogą pomieścić duże ilości płynów w swojej powłoce rdzenia bez wpływu na ich integralność morfologiczną1. Ogólnie rzecz biorąc, nanożele są syntetyzowane przez polimeryzację funkcjonalnych monomerów poprzez fizyczne lub chemiczne sieciowanie w heterogenicznych układach koloidalnych, takich jak odwrotne mikroemulsje typu woda w oleju2,3. Kopolimery amfifilowe mogą samoorganizować się w struktury w skali nano w środowisku wodnym. Muszą być jednak ustabilizowane za pomocą chemicznych strategii sieciowania obejmujących dwusiarczki lub sprzężenie na bazie amidu, chemii kliknięć, lub mogą być fizycznie indukowane (strategie hydrofobowe, elektrostatyczne lub wiązania wodorowe) lub fotoindukowane4. Wśród tych strategii, fizyczna samoorganizacja polimerów, po której następuje chemiczne sieciowanie, została uznana za skuteczną technikę wytwarzania nanożeli5. Podczas gdy historycznie pierwszy nanożel został wprowadzony w latach 90. przez Vingradov et al.6, Akiyoshi et al.7 oraz Lemieux et al.8, ostatnio opracowano i zbadano różne inteligentne nanożele składające się zarówno z naturalnych, jak i syntetycznych polimerów pod kątem różnorodnych zastosowań biomedycznych9.

Nanożele mają dużą zdolność zatrzymywania ładunku, dużą powierzchnię, stabilność in vivo, a także konfigurowalne właściwości chemiczne i mechaniczne10. Synteza nanożeli jest również skalowalna i może być oparta na wodzie. Ponadto zwiększona zawartość wody w nanożelach sprawia, że są one skutecznymi nośnikami wrażliwych ładunków biologicznych11. Co więcej, duża powierzchnia może zaspokoić wiele potrzeb w zakresie biokoniugacji, umożliwiając w ten sposób dołączenie modalności celowania w celu umożliwienia aktywnego celowania. Warto zauważyć, że wszechstronność konstrukcji nanożeli pozwala na zastosowanie szerokiej gamy monomerów reagujących na bodźce, co pozwala na precyzyjną kontrolę ich właściwości fizykochemicznych9. Ta wyjątkowa zdolność inżynieryjna umożliwia racjonalne ulepszenie konstrukcji nanożelu, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnie stosowanych liposomów, miceli lub polimerosomów12,13. Poprzez włączenie ugrupowań reagujących na bodźce do specjalnie zaprojektowanych monomerów, nanożele mogą być zaprojektowane tak, aby wyzwalały kontrolowane uwalnianie ich ładunku w odpowiedzi na różne fizjologicznie istotne bodźce, takie jak pH, warunki redoks, enzymy itp.9,14. Takie inteligentne nanożele są bardziej użyteczne niż konwencjonalne nanożele, ponieważ mają doskonałą stabilność dla przedłużonego krążenia krwi i mogą wytrzymać warunki fizjologiczne, aby utrzymać integralność swojego ładunku i pośredniczyć w jego kontrolowanym uwalnianiu w pożądanych miejscach docelowych15. Rzeczywiście, ze względu na swoją wszechstronną naturę, nanożele zyskały popularność na arenie biomedycznej, ze znaczącymi postępami w rozwoju nanożeli reagujących na bodźce do licznych zastosowań teranotycznych i diagnostycznych2,16,17.

Biologics może reprezentować kategorię produktów farmaceutycznych składających się z białek, peptydów i/lub kwasów nukleinowych i zrewolucjonizowały krajobraz terapeutyczny dzięki swojej niezwykłej selektywności, stając się tym samym najszybciej rozwijającą się klasą terapii18. Rzeczywiście, rosnący rynek takich środków terapeutycznych jest widoczny w gwałtownym wzroście ich zatwierdzenia przez amerykańskie Federalne Stowarzyszenie Leków (FDA), gdzie leki biologiczne stanowiły ~40% wszystkich zatwierdzeń leków, w 2023 r. 19. Oprócz ich specyficzności i siły działania, szybkie odkrycia nowych celów leków, bardziej wydajne procesy bioinżynieryjne i większa wiedza na temat losu tych środków terapeutycznych in vivo doprowadziły do ich zwiększonego stosowania20. Tradycyjne leki biologiczne obejmują interferujące RNA, białka zastępcze, cytokiny i hormony, które są zwykle generowane przy użyciu technologii rekombinacji DNA21. Od czasu zatwierdzenia ludzkiej rekombinowanej insuliny w 1982 r. leki biologiczne zostały opracowane dla wielu schorzeń, w tym raka (np. trastuzumab, awelumab), nieswoistych zapaleń jelit (np. adalimumab, certolizumab) i rzadkich chorób genetycznych (np. mipomersan, miozym, aldurazyme, fabrazyme)21. Podczas gdy wysoka specyficzność interakcji leków biologicznych z ich celami powinna teoretycznie równoważyć wszelkie efekty niezamierzone, pojawiło się kilka problemów klinicznych związanych z ich stosowaniem związanych z niepożądanymi skutkami ubocznymi22. Te działania niepożądane można podzielić na dwie kategorie, w tym przesadną farmakologię (nadmierną stymulację celów) i immunogenność. Co więcej, ich krótkie okresy półtrwania, ograniczona biodostępność, uszkodzenia proteazy, krótki okres trwałości i kosztowne procesy produkcyjne ograniczają ich korzyści terapeutyczne21. Konwencjonalne metody łagodzenia tych problemów obejmują kowalencyjną modyfikację tych leków biologicznych, która może zagrozić ich funkcji, a tym samym skuteczności23. Alternatywnie, podejście nanomedyczne do hermetyzacji ładunków terapeutycznych może przynieść wiele korzyści właściwościom farmakologicznym, a przede wszystkim pasywne ukierunkowanie na miejsce objęte stanem zapalnym poprzez efekt wzmocnionego przenikania i zatrzymywania (EPR)24. Inne korzyści związane z nanocząstkami mogą obejmować wydłużony czas krążenia, zmniejszoną szybkość klirensu, większą elastyczność formuły, lepszą przepuszczalność naczyń krwionośnych i wychwyt komórkowy25. Podczas gdy obecnie badana jest ogromna różnorodność preparatów nanocząstek pod kątem dostarczania ładunków biologicznych, niewiele z nich jest w stanie naśladować wielofunkcyjność nanożeli. Rzeczywiście, nanożele przewyższają nośność osiąganą przez nanocząstki na bazie liposomalii i miceli i wykazują większą stabilność koloidalną niż większość nanocząstek nieorganicznych. W związku z tym nanożele stanowią cenną platformę do dostarczania różnych biologicznych środków terapeutycznych.

Wcześniej udało nam się dostarczyć enzym antyoksydacyjny w nowych nanożelach polimerowych reagujących na metaloproteinazę macierzy, gdzie zastosowano łagodną strategię enkapsulacji, która utrzymywała bioaktywność białka po uwolnieniu26. W tej pracy demonstrujemy zoptymalizowaną syntezę nanożeli reagujących na redoks w celu dostarczania ładunków opartych na białkach. Warto zauważyć, że metodologia syntezy umożliwia syntezę nanożeli w łagodnych warunkach w celu zamknięcia pożądanego ładunku, bez użycia agresywnych rozpuszczalników organicznych lub wysokich temperatur. Wykorzystaliśmy homeostazę redoks w środowisku wewnątrzkomórkowym, aby regulować uwalnianie zamkniętego ładunku27,28. Zazwyczaj naturalnie występujący w skutkach przeciwutleniacz glutation (GSH) kontroluje zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy potencjał redoks, gdzie jego stężenie waha się odpowiednio między 2-20 μM i 1-10 mM29,30. Do tej pory zgłoszono wiele nanocząstek wrażliwych na redoks, co sprawia, że jest to sprawdzona i niezawodna strategia umożliwiająca kontrolowane uwalnianie leków in vivo27,28. Rzeczywiście, wiązania dwusiarczkowe zostały zainstalowane w nanomateriałach polimerowych przy użyciu środków sieciujących zawierających dwusiarczek31,32, samoorganizacja biodegradowalnych polimerów z monomerów zawierających disiarczek33, oraz proleki polimerowe reagujące na redoks lub koniugaty lek/polimer34,35. W związku z tym w niniejszym badaniu zbadano włączenie unikalnego, wysoce wrażliwego na GSH środka sieciującego dwusiarczek w polimerowych nanocząstkach, umożliwiając w ten sposób kontrolowane uwalnianie zamkniętego w kapsułkach ładunku białkowego.

W tym badaniu, projekt nanożelu był skoncentrowany na następujących kryteriach, aby uwzględnić specyficzność i dostarczanie ładunku: mały rozmiar (~100 nm) i jednolity rozkład wielkości (wskaźnik polidyspersyjności (PI)<0.3) w celu zapewnienia efektywnej penetracji śródbłonka i stabilności in vivo27; efektywna enkapsulacja ładunku białkowego i kontrolowane uwalnianie ładunku w odpowiedzi na GSH. Przedstawiamy syntezę usieciowanych nanożeli reagujących na GSH, które wykazały jednorodne nanocząstki o wielkości poniżej 100 nm, z 76% skutecznością enkapsulacji pożądanego ładunku białkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza środka sieciującego reagującego na redoks

  1. Dodać chlorowodorek metakrylanu 2-aminoetylu (44,79 mg, 0,270 mmol) i 0,063 ml trietyloaminy do 3 ml bezwodnego dichlorometanu i pozostawić do mieszania przez 20 minut w obojętnym gazieN2 w kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml.
  2. Rozpuścić ester di-N-sukcynimidylowy kwasu 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-heksadekaoksa-28,29-ditiaheksapentanonodioowego estru di-N-sukcynimidylowego (100 mg, 0,045 mmol) w 1 ml bezwodnego dichlorometanu i dodać do kolby.
  3. Dodać 4 ml bezwodnego dichlorometanu do kolby. Zawinąć kolbę reakcyjną w folię aluminiową i pozostawić do wymieszania podN2 w temperaturze pokojowej.
  4. Potwierdzić tworzenie produktu za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Upewnij się, że materiały wyjściowe są prawidłowo odnoszące, jednocześnie potwierdzając tworzenie produktu tą metodą.
    1. Chromatografia cienkowarstwowa jest metodą opartą na powinowactwie stosowaną do oddzielania pożądanych związków od mieszaniny reakcyjnej. W tym przypadku należy użyć wysoce polarnej i adsorbcyjnej płytki krzemionkowej jako fazy stacjonarnej. Umieścić próbkę materiału wyjściowego i próbkę mieszaniny reakcyjnej na jednym końcu płytki krzemionkowej i umieścić pionowo w zamkniętej szklanej zlewce z eluentem (faza ruchoma: 5% metanol: dichlorometan).
    2. Poprzez działanie kapilarne faza ruchoma przemieszcza się w górę płytki krzemionkowej, a związki próbki migrują na różne odległości w zależności od ich powinowactwa do fazy stacjonarnej i ruchomej. Gdy czoło rozpuszczalnika przetnie 3/4 płytki, wyjmij płytkę i wysusz ją. Oddzielone związki pojawiają się jako plamy na płytce. Określić ilościowo współczynnik retencji (Rf) pożądanego związku jako odległość przebytą przez związek/odległość przebytą przez rozpuszczalnik. W tym przypadku Rf produktu wynosiło 0,35. Światło UV lub barwienie można wykorzystać do wizualizacji plam (nadmanganian potasu).
  5. Zagęścić mieszaninę w próżni i oczyścić za pomocą chromatografii kolumnowej flash (izokratyczna mieszanina 5% metanolu: dichlorometan)36. Wprowadzić mieszaninę reakcyjną na wierzch szklanej kolumny wypełnionej krzemionką (faza stacjonarna), a następnie eluować za pomocą systemu rozpuszczalnikowego (faza ruchoma)36. Zebrać wszystkie frakcje i oznaczyć za pomocą TLC w celu rozróżnienia frakcji produktu przy użyciu wcześniej określonej wartości Rf.
  6. Zagęścić oczyszczone frakcje poprzez odparowanie rozpuszczalnika za pomocą wyparki obrotowej (temperatura: 40 °C), ustawić podciśnienie na ciśnienie atmosferyczne, aby najpierw usunąć dichlorometan o niższym wrzeniu. Gdy poziom rozpuszczalnika przestanie spadać, ustaw podciśnienie na 337 mbar, aby usunąć metanol i uzyskać bladożółty olej, który następnie zostanie poddany dalszej charakterystyce w celu potwierdzenia tworzenia produktu37.
  7. Przeprowadź analizę w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR)38, 1H NMR (in deuterated dimethylsulfoxide (DMSO-d 6))39, 13C NMR39 i wspomaganą matrycowo desorpcją/jonizacją laserową time-of-flight (MALDI-ToF)40 analiza, aby potwierdzić tworzenie się produktu przed wykonaniem kolejnych kroków.
    1. W przypadku analizy FT-IR załaduj 1 mg oleju na instrument, aby uzyskać widma.
    2. W przypadku analiz NMR należy ponownie rozpuścić 10 mg produktu w 0,75 ml odpowiedniego rozpuszczalnika NMR, przenieść do probówki NMR i szczelnie zamknąć, aby zapobiec wyciekowi. Załaduj próbkę do instrumentu NMR, po czym uzyskuje się widma39.
    3. Do analizy metodą spektrometrii mas należy zamknąć 1 mg produktu w fiolce, rozpuścić w DMSO i załadować na urządzenie.
      UWAGA: Analiza w podczerwieni dostarcza informacji na temat kluczowych grup funkcyjnych w pożądanym produkcie, a mianowicie rozciągnięć karbonylowych (C = O) identyfikowanych przez ostry pik na 1650 cm-1 wskazuje na tworzenie się wiązania amidowego, podkreślając w ten sposób tworzenie się produktu. 1H NMR i 13C dostarczają informacji o środowisku chemicznym, a tym samym mogą być wykorzystane do określenia składu chemicznego pożądanego produktu poprzez identyfikację środowisk chemicznych obecnych w związku. Wreszcie, zastosowanie spektrometrii mas może zweryfikować dokładną masę pożądanego produktu.

2. Test rozszczepienia środka sieciującego dwusiarczek z glutationem

  1. Inkubować środek sieciujący dwusiarczek (do końcowego stężenia 4,55 mg/ml) ze środkiem redukującym glutation (końcowy [GSH]: 10 mM), do końcowej objętości 1 ml, przez 24 godziny w szklanej fiolce o pojemności 1,5 ml.
  2. Aby potwierdzić rozszczepienie łącznika dwusiarczku, prześlij fiolkę do analizy MALDI-ToF26,40.

3. Synteza nanożelu reagująca na redoks

  1. Upewnij się, że wszystkie naczynia szklane, które mają być używane do reakcji, są wolne od kurzu, myjąc je przefiltrowaną (0.20 μm) wodą dejonizowaną, a następnie susząc szkło za pomocą sprężonego powietrza, do którego można uzyskać dostęp za pośrednictwem narzędzia sprężonego powietrza z boku dygestorii. Przymocuj bezpieczną dyszę do wylotu sprężonego powietrza, aby ułatwić dostęp. Trzymać fiolkę mocno i umieścić w niej dyszę. Aktywować sprężone powietrze, uwalniając kontrolowany strumień do fiolki. Obserwuj proces, aby zapewnić skuteczne suszenie, sprawdzając, czy nie ma pozostałych zanieczyszczeń lub wilgoci.
  2. Przygotować szklaną fiolkę o pojemności 10 ml, napełniając ją wodą dejonizowaną i zamknąć kolbę gumową przegrodą. Odtlenić wodę, przepuszczając przez nią N2 przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem reakcji. Aby to zrobić, napełnij balon gazem N2 i przymocuj igłę do balonu; umieść go na przegrodzie nosowej i użyj igły, aby przebić gumową przegrodę i umożliwić przepływ N2. Przymocować igłę wyjściową do kolby, aby zapewnić stały przepływN2.
  3. Rozpuścić albuminę surowicy bydlęcej (BSA; 2 mg, 30 nmol) lub BSA znakowaną Cy7 (2 mg, 30 nmol) w 1 ml odtlenionej wody dejonizowanej i dodać do innej czystej szklanej fiolki o pojemności 10 ml.
  4. Dodać roztwór chlorku [2-(akryloyloksy)etylo]trimetyloamoniowego (AETC) (12,00 mg/10,86 μl, 0,060 mmol) do kolby i uszczelnić ją za pomocą innej gumowej przegrody. Upewnij się, że mieszanina reakcyjna jest utrzymywana pod stałym przepływem gazuN2 i mieszaj przez 30 minut.
  5. Rozpuścić akryloamid (9,21 mg, 0,13 mmol) w 1 ml odtlenionej wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny w fiolce.
  6. Rozpuścić środek sieciujący dwusiarczek (4,44 mg, 0,004 mmol) w 1 ml wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny w fiolce. Przepłukiwać mieszaninę gazemN2 przez 20 minut.
  7. Rozpuścić dodecylosiarczan sodu (2 mg, 0,007 mmol) w 1 ml odtlenionej wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny za pomocą strzykawki z przepłukiwanym gazemN2 i mieszać mieszaninę przez 30 min.
    UWAGA: Przepłukując strzykawkęN2 minimalizujemy narażenie mieszaniny reakcyjnej na działanie tlenu w atmosferze, co może zahamować reakcję polimeryzacji rodnikowej.
  8. Dodać N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminę (1,5 μl, 0,010 mmol) i pozostawić mieszaninę reakcyjną na odtlenienie przez 3 minuty w gazieN2.
  9. Rozpuścić nadsiarczan amonu (1 mg, 0,004 mmol) w 1 ml odtlenionej wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny reakcyjnej. Upewnij się, że gazN2 bulgocze przez mieszaninę reakcyjną przez 10 min.
    UWAGA: Jeżeli etap dodawaniaN2 zostanie pominięty, istnieje prawdopodobieństwo, że w kolbie reakcyjnej utworzą się białe cząstki. Są to cząstki i/lub agregaty o większych rozmiarach i mogą zakłócić dalszą charakterystykę.
  10. Zamknąć kolbę w atmosferzeN2 i pozostawić do mieszania przez 3 godziny i 30 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Aby zakończyć reakcję, zdjąć uszczelkę z kolby i pozostawić mieszaninę reakcyjną na mieszanie przez co najmniej 10 minut. To wystawiłoby mieszaninę reakcyjną na działanie atmosferycznych poziomów gazuO2, które następnie stłumiłyby wszelkie pozostałe rodniki w mieszaninie reakcyjnej. Reakcja kończy się, gdy mieszanina nabiera klarownego niebieskiego, opalizującego wyglądu.
  12. W celu oczyszczenia nanożeli należy dodać mieszaninę reakcyjną do 15 ml filtra odśrodkowego (100 kDa MWCO) i dodać wodę dejonizowaną w celu napełnienia jednostki odśrodkowej. Odwirować mieszaninę reakcyjną o sile 1000 x g przez 10 min. Spowoduje to usunięcie wszelkich nieprzereagowanych substancji chemicznych (lub niekapsułkowanego ładunku), które są mniejsze niż 100 kDa i zagęszczenie próbki nanożelu.
  13. Gdy poziom wody w jednostce odśrodkowej spadnie, dodaj 2 ml wody dejonizowanej, aby rozcieńczyć próbkę nanożelu i odwirować, aby zagęścić produkt. Powtórz ten krok 3 razy.
  14. Przechowywać próbkę w temperaturze 2–8 °C, aby zapobiec degradacji kapsułkowanego białka.
  15. Przeprowadź analizę FT-IR i 1H NMR (w deuterowanym sulfotlenku dimetylu (DMSO-d6)) w celu potwierdzenia polimeryzacji39,41. Aby przygotować próbkę, liofilizuj 1 ml roztworu nanożelu w fiolce o pojemności 1,5 ml. Proces liofilizacji polega na zamrożeniu próbki, a następnie zastosowaniu próżni w celu usunięcia zamrożonego rozpuszczalnika poprzez sublimację, pozostawiając sproszkowaną pozostałość. Po liofilizacji ponownie rozpuścić próbkę w odpowiednim rozpuszczalniku NMR, przenieść do probówki NMR i szczelnie ją zamknąć. Załaduj próbkę do maszyny NMR, jak opisano wcześniej39. W przypadku analizy FT-IR należy załadować 1 mg suchego proszku na przyrząd w celu uzyskania widm.

4. Charakterystyka morfologiczna nanożelu

  1. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
    UWAGA: Średnicę hydrodynamiczną (nm), wskaźnik polidyspersyjności (PI) i potencjał zeta mierzono w temperaturze 25 °C, długości fali lasera 632,8 nm i detektora sygnału 173° przy użyciu maszyny DLS. Każdy przebieg obejmował 25 cykli skanowania podrzędnego.
    1. Pomiar wielkości hydrodynamicznej (nm)
      1. Przygotuj kuwetę lub jednorazową składaną komórkę kapilarną, czyszcząc ją przefiltrowaną wodą dejonizowaną. Wdmuchnij sprężone powietrze do kuwety (odpowiednie zarówno do pomiarów potencjału DLS, jak i zeta), aby upewnić się, że jest ona wolna od dużych cząstek kurzu.
      2. Napełnij kuwetę co najmniej 50-100 μl próbki i rozcieńcz w 750-1000 μl przefiltrowanej wody dejonizowanej. Używając kuwety z potencjałem zeta, upewnij się, że kuweta została napełniona próbką bez tworzenia się pęcherzyków, które mogą zakłócić pomiary.
      3. Umieść kuwetę w instrumencie DLS, upewniając się, że została prawidłowo włożona. W tym celu otwórz pokrywę komory na próbki przyrządu DLS. Trzymaj kuwetę za jej górne krawędzie, aby uniknąć odcisków palców na okienkach optycznych. Upewnij się, że kuweta jest prawidłowo osadzona w uchwycie kuwety, upewniając się, że jest wypoziomowana i wyrównana ze ścieżką optyczną instrumentu. Zamknij komorę na próbki, aby zapobiec zakłóceniom światła otoczenia.
        UWAGA: Pożywka rozcieńczająca jest filtrowana za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,45 μm.
      4. Kliknij, aby rozpocząć pomiar wielkości cząstek w odpowiednim oprogramowaniu maszyny DLS.
      5. Wybierz wyniki odpowiadające próbce, aby uzyskać średnią z (średnia wielkość cząstek), średnią liczbę PI, liczbę kilo na sekundę (kcps), potencjał zeta i odpowiednią grafikę. Upewnij się, że funkcja korelacji wykazuje gładką krzywą sigmoidalną, ponieważ sugeruje to jednolitą próbkę.
      6. Po zakończeniu analizy wyjmij kuwetę z DLS.
  2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Przygotować próbki, umieszczając 10 μl roztworu nanocząstek (0,077 mg/ml) na siatkach miedzianych pokrytych węglem. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Umyj kratki przefiltrowaną wodą dejonizowaną i zacej 5 μl przefiltrowanego 1% octanu uranylu w wodzie przez 2 minuty.
    3. Po nasączeniu nadmiaru środka barwiącego bibułą filtracyjną należy wysuszyć kratki przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia uchwyć obrazy TEM w powiększeniu 45 000x za pomocą kamery w jasnym polu.
    4. Użyj dołączonego oprogramowania do przetwarzania obrazu (rozdzielczość: 2048 x 2048 pikseli).

5. Kwantyfikacja białka (BSA) zamkniętego w nanożelach przy użyciu testu kwasu mikro-bicinchoninowego (BCA)

  1. Zgodnie z protokołem testu microBCA (podanym na stronie producenta), wygeneruj krzywą wzorcową na podstawie predefiniowanego stężenia białka42.
  2. Po ich syntezie należy oczyścić nanożele kapsułkujące białka za pomocą 15 ml filtrów odśrodkowych o stężeniu 100 kDa MWCO (1000 x g, 10 min), jak opisano w krokach 3.12-3.14.
  3. Zebrać filtrat i przeanalizować za pomocą testu microBCA (protokół dostępny na stronie producenta). Zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm za pomocą czytnika płytek. Ponieważ pomiar ten koreluje ze stężeniem białka niekapsułkowanego, należy określić masę białka kapsułkowanego. Aby obliczyć sprawność hermetyzacji (EE) %, należy użyć następującego równania:
    figure-protocol-1

6. Kwantyfikacja uwalniania białek z nanożeli w obecności glutationu

  1. Inkubować 200 μl 5 mg/ml nanożeli obciążonych Cy7BSA z 200 μl 10 mM glutationu (GSH) w 0,5 ml filtrów odśrodkowych (100 kDa MWCO). Umieścić jednostki filtrujące w łaźni wodnej, aby utrzymać temperaturę na poziomie 37 °C.
  2. Wirować przy 1000 x g przez 3 minuty co 10 minut przez co najmniej 1 godzinę - następnie co 2-8 godzin.
  3. Zebrać filtrat i użyć do dalszej analizy. Utrzymać objętość filtratu w odśrodkowych jednostkach filtracyjnych na poziomie 500 μl, dodając więcej wody dejonizowanej lub PBS.
  4. Zmierzyć ilość białka w filtratach, odnosząc się do krzywej wzorcowej dla nanożeli obciążonych Cy7BSA, gdzie absorbancję białka fluorescencyjnego mierzono za pomocą przyrządu do nanokropli przy 750 nm.
    UWAGA: Tę krzywą wzorcową można obliczyć, przygotowując seryjne rozcieńczenia Cy7BSA w zakresie od 0 mg/ml do 2 mg/ml. Wartości uzyskane z nanokropli można interpolować w stosunku do tej krzywej kalibracyjnej w celu określenia skuteczności enkapsulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza i charakterystyka sieciowania dikrylanu dwusiarczku poli(glikolu etylenowego) (PEG) Sieciujący redoks został zsyntetyzowany przez nukleofilowe podstawienie estru N-hydroksysukcynimidu (NHS) przez metakrylan 2-aminoetylu poprzez utworzenie wiązania amidowego (Rysunek 1). Synteza wymaganego produktu została zwalidowana przede wszystkim za pomocą 1H NMR (rysunek uzupełniający 1), który przeprowadzono poprzez rozpuszczenie próbki produktu w deu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące zapotrzebowanie na leki biologiczne specyficzne dla celu w przemyśle biofarmaceutycznym spowodowało zapotrzebowanie na technologie, które mogą poprawić ich profile farmakologiczne in vivo, jednocześnie zapobiegając ich szybkiej degradacji fizjologicznej i kompensując wszelkie niepożądane skutki uboczne. Mając to na uwadze, opisano prostą procedurę syntezy nanożeli zawierających białka. Jak wskazano w protokole, środek sieciujący reagujący na redoks musi zostać zsyntetyzowany przed syntezą nanożelu. Nastę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić. Nie ma żadnych szczegółów finansowych do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Wydziałowi Chemii Imperial College London oraz Instytutowi Nauk Przyrodniczych Rady Badań Medycznych za ich wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
2-(
akryloyloksy)etylo]roztworu chlorku trimetyloamoniowego 		Sigma Aldrich496146
chlorowodorek 2-aminoetylu metakrylanu Sigma Aldrich516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,
44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanodioic kwas di-N-sukcynimidylowy 		Sigma Aldrich671630
AkrylamidSigma Aldrich23701
Nadsiarczan amonuSigma Aldrich248614
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichB6917
Cy7 albumina surowicy bydlęcej znakowanaNanocsBS1-S7-1
Deuterowany dimetylosulfotlenekSigmaAldrich 547239
DichlorometanSigma Aldrich270997 (bezwodny) i D65100
GlutationSigma AldrichG4251
MetanolSigma Aldrich34860
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina Sigma Aldrich411019
Solanka buforowana fosforanami ThermoFisher10010023
Dodecylosiarczan soduSigma Aldrich436143
TrietyloaminaSigma Aldrich471283
Agar z octanem uranyluScientific AGR1260A
Sprzęt niezbędny do syntezy i charakterystyki nanożeli
Amicon Ultra-15 Filtry odśrodkowe (100kDa MWCO) Merck MilliporeC7715
Olympus Veleta Kratki
miedziane powlekane węglemAgar Scientific AGS160
(100kDa MWCO)Spectrum labs11405949
Dynamiczne rozpraszanie światła Malvern Zetasizer Nano Ultra
LabconcoWZ-03336-01
Spektroskopia w podczerwieniAgilent Oprogramowanie Cary 630 FTIR
iTEMOlympus 
Spektrometria masWodyMikromasa MALDI microMX MALDI Q-ToF 
Filtr membranowy MF-MilliporeTM (0,45/0,2μ m rozmiar porów)Merck Millipore, Wielka BrytaniaHAWP04700, GSWP04700 
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermoFisher23235
Czytnik płytekBeckmanCoulter-PARADIGM
Dane magnetycznego rezonansu jądrowego protonów i węgla-13NMR Bruker 400 MHz AV-400
Parownik obrotowy Buchi R-114 Rotary Vap System
Igły jednorazowego użytku Sterican4665643
Suba-Seal  septaSigma AldrichZ124575
Transmisyjna mikroskopia elektronowaPhillips CM 100 TEM 
Spektrofotometr UV-visNanodropNanodrop One/One C mikroobjętość 
Aparat Rurki do dializy Liofilizator Spektrometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X., Malhotra, S., Molina, M., Haag, R. Micro- and nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chem Soc Rev. 44 (7), 1948-1973 (2015).
  2. Chacko, R. T., Ventura, J., Zhuang, J., Thayumanavan, S. Polymer nanogels: A versatile nanoscopic drug delivery platform. Adv Drug Del Rev. 64 (9), 836-851 (2012).
  3. Hajebi, S., et al. Stimulus-responsive polymeric nanogels as smart drug delivery systems. Acta Biomaterialia. 92, 1-18 (2019).
  4. Lee, V. Y., et al. Nanogel star polymer architectures: A nanoparticle platform for modular programmable macromolecular self-assembly, intercellular transport, and dual-mode cargo delivery. Adv Mat. 23 (39), 4509-4515 (2015).
  5. Ekkelenkamp, A., Rachèl Elzes, M., Engbersen, J. F., Paulusse, J. M. Responsive crosslinked polymer nanogels for imaging and therapeutics delivery. J Mat Chem B. 6 (2), 210-235 (2018).
  6. Vinogradov, S. V., Zeman, A. D., Batrakova, E. V., Kabanov, A. V. Polyplex nanogel formulations for drug delivery of cytotoxic nucleoside analogs. J Control Rel. 107 (1), 143-157 (2015).
  7. Akiyoshi, K., Deguchi, S., Moriguchi, N., Yamaguchi, S., Sunamoto, J. Self-aggregates of hydrophobized polysaccharides in water. Formation and characteristics of nanoparticles. Macromol. 26 (12), 3062-3068 (1993).
  8. Lemieux, P., et al. Block and graft copolymers and NanoGel copolymer networks for DNA delivery into cell. J Drug Target. 8 (2), 91-105 (2000).
  9. Preman, N. K., Barki, R. R., Vijayan, A., Sanjeeva, S. G., Johnson, R. P. Recent developments in stimuli-responsive polymer nanogels for drug delivery and diagnostics: A review. Euro J Pharma Biopharmac. 157, 121-153 (2020).
  10. Oh, J. K., Drumright, R., Siegwart, D. J., Matyjaszewski, K. The development of microgels/nanogels for drug delivery applications. Prog Poly Sci. 33 (4), 448-477 (2008).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Deng, C., Suuronen, E. J., Zhong, Z. Click hydrogels, microgels and nanogels: Emerging platforms for drug delivery and tissue engineering. Biomat. 35 (18), 4969-4985 (2014).
  12. Napier, M. E., DeSimone, J. M. Nanoparticle drug delivery platform. Poly Rev. 47 (3), 321-327 (2007).
  13. Malmsten, M. Soft drug delivery systems. Soft Matt. 2 (9), 760-769 (2006).
  14. Kamaly, N., Yameen, B., Wu, J., Farokhzad, O. C. Degradable controlled-release polymers and polymeric nanoparticles: Mechanisms of controlling drug release. Che Rev. 116 (4), 2602-2663 (2016).
  15. Molina, M., et al. Stimuli-responsive nanogel composites and their application in nanomedicine. Chem Soc Rev. 44 (17), 6161-6186 (2015).
  16. Ma, Y., Ge, Y., Li, L. Advancement of multifunctional hybrid nanogel systems: Construction and application in drug co-delivery and imaging technique. Mat Sci Eng: C. 71, 1281-1292 (2017).
  17. Wang, H., Qian, J., Ding, F. Recent advances in engineered chitosan-based nanogels for biomedical applications. J Mat Chem B. 5 (34), 6986-7007 (2017).
  18. Durán-Lobato, M., Niu, Z., Alonso, M. J. Oral delivery of biologics for precision medicine. Adv Mat. 32 (13), 1901935(2020).
  19. de la Torre, B. G., Albericio, F. The pharmaceutical industry in 2022: An analysis of FDA drug approvals from the perspective of molecules. Molecules. 28 (3), 1038(2023).
  20. Škalko-Basnet, N. Biologics: The role of delivery systems in improved therapy. Biologics. 8, 107-114 (2014).
  21. Andrews, L., Ralston, S., Blomme, E., Barnhart, K. A snapshot of biologic drug development: Challenges and opportunities. Human Exp Toxicol. 34 (12), 1279-1285 (2015).
  22. Sathish, J. G., et al. Challenges and approaches for the development of safer immunomodulatory biologics. Nat Rev Drug Disc. 12 (4), 306-324 (2013).
  23. Pfister, D., Morbidelli, M. Process for protein PEGylation. J Control Rel. 180, 134-149 (2014).
  24. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  25. Golombek, S. K., et al. Tumor targeting via EPR: Strategies to enhance patient responses. Adv Drug Del Rev. 130, 17-38 (2018).
  26. Basak, S., et al. Simultaneous cross-linking and cross-polymerization of enzyme responsive polyethylene glycol nanogels in confined aqueous droplets for reduction of low-density lipoprotein oxidation. Biomacromol. 22 (2), 386-398 (2021).
  27. Morgulchik, N., Kamaly, N. Meta-analysis of in vitro drug-release parameters reveals predictable and robust kinetics for redox-responsive drug-conjugated therapeutic nanogels. ACS Appl Nano Mat. 4 (5), 4256-4268 (2021).
  28. Ghorbani, M., Hamishehkar, H. Redox-responsive smart nanogels for intracellular targeting of therapeutic agents: Applications and recent advances. J Drug Target. 27 (4), 408-422 (2019).
  29. Bajic, V. P., et al. Glutathione "redox homeostasis" and its relation to cardiovascular disease. Oxi Med Cell Long. 2019, e5028181(2019).
  30. Forman, H. J., Zhang, H., Rinna, A. Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Mol Asp Med. 30 (1-2), 1-12 (2009).
  31. Wang, Y. C., et al. Core-shell-corona micelle stabilized by reversible cross-linkage for intracellular drug delivery. Macromol Rapid Comm. 31 (13), 1201-1206 (2010).
  32. Elkassih, S. A., Kos, P., Xiong, H., Siegwart, D. J. Degradable redox-responsive disulfide-based nanogel drug carriers via dithiol oxidation polymerization. Biomat Sci. 7 (2), 607-617 (2019).
  33. Hu, X., et al. Stimuli-responsive polymersomes for biomedical applications. Biomacromol. 18 (3), 649-673 (2017).
  34. Navath, R. S., Wang, B., Kannan, S., Romero, R., Kannan, R. M. Stimuli-responsive star poly(ethylene glycol) drug conjugates for improved intracellular delivery of the drug in neuroinflammation. J Control Release. 142 (3), 447-456 (2010).
  35. Ling, X., et al. Glutathione-responsive prodrug nanoparticles for effective drug delivery and cancer therapy. ACS Nano. 13 (1), 357-370 (2019).
  36. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. J Org Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
  37. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry. Rotary evaporation to remove solvent. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  38. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry II. Infrared spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  39. JoVE. science education database - Organic chemistry. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  40. Kim, J. Sample preparation for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Mass Spec Lett. 6, 27-30 (2015).
  41. Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353(2019).
  42. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  43. Yu, M., Wu, J., Shi, J., Farokhzad, O. C. Nanotechnology for protein delivery: Overview and perspectives. J Control Release. 240, 24-37 (2016).
  44. Zhang, Y., Zhang, D., Wang, J. T., Zhang, X., Yang, Y. Fabrication of stimuli-responsive nanogels for protein encapsulation and traceless release without introducing organic solvents, surfactants, or small-molecule cross-linkers. Poly Chem. 12 (4), 554-563 (2021).
  45. Kamaly, N., et al. Targeted interleukin-10 nanotherapeutics developed with a microfluidic chip enhance resolution of inflammation in advanced atherosclerosis. ACS Nano. 10 (5), 5280-5292 (2016).
  46. Lu, R., et al. Probing the secondary structure of bovine serum albumin during heat-induced denaturation using mid-infrared fiberoptic sensors. Analyst. 140 (3), 765-770 (2015).
  47. Abrosimova, K. V., Shulenina, O. V., Paston, S. V. FTIR study of secondary structure of bovine serum albumin and ovalbumin. J Phys: Conf Ser. 769, 012016(2016).
  48. Kabanov, A. V., Vinogradov, S. V. Nanogels as pharmaceutical carriers: Finite networks of infinite capabilities. Ang Chem Int Ed Eng. 48 (30), 5418-5429 (2009).
  49. Li, C., Obireddy, S. R., Lai, W. F. Preparation and use of nanogels as carriers of drugs. Drug Del. 28 (1), 1594-1602 (2021).
  50. Kulkarni, J. A., et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 16 (6), 630-643 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synteza nanogelisieciowanie w rodowisku wodnymenkapsulacja bia ekdynamiczne rozpraszanie wiat atransmisyjna mikroskopia elektronowananogele responsywne na utlenianie redukcjkontrolowane uwalnianiewydajno enkapsulacji

Powiązane artykuły