Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63981

⸱

24 stycznia 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry, Molecular Sciences Research Hub, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

Nanożele są doskonałą i wszechstronną platformą nanocząsteczek do dostarczania leków biologicznych. Reagujące na bodźce polimerowe nanożele na bazie glikolu poli(etylenowego), zdolne do kapsułkowania ładunków opartych na białkach, zsyntetyzowano przy użyciu jednoetapowej strategii sieciowania ko-nanopolimeryzacji w warunkach wodnych. Przedstawiono tutaj optymalne wytwarzanie i charakterystykę tych nowych nanocząstek.

Streszczenie

Nanożele składające się z usieciowanych polimerowych nanocząstek zostały opracowane do dostarczania licznych chemicznych i biologicznych środków terapeutycznych, dzięki ich wszechstronnej syntezie oddolnej i biokompatybilności. Chociaż do tej pory do syntezy nanożeli stosowano różne metody, bardzo niewielu udało się to osiągnąć bez użycia ostrych rozpuszczalników organicznych lub wysokich temperatur, które mogą uszkodzić integralność ładunku biologicznego. W przeciwieństwie do tego, przedstawiona tutaj metodologia pozwala na syntezę nanożeli o wielkości poniżej 100 nm, obciążonych białkami w łagodnych warunkach reakcji. W tym miejscu przedstawiamy metodę niekowalencyjnej enkapsulacji ładunków opartych na białkach w nanożelach, które zostały zsyntetyzowane przy użyciu wodnej, jednoetapowej techniki kopolimeryzacji sieciowej. W tej technice początkowo elektrostatycznie wiążemy ładunek oparty na białku z kationowym czwartorzędowym monomerem amoniowym, a jednocześnie sieciujemy go i kopolimeryzujemy za pomocą nadsiarczanu amonu i N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiaminy, tworząc nanożele, które zatrzymują ładunek białka. Wielkość i wskaźnik polidyspersyjności nanożeli określa się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), natomiast morfologię powierzchni ocenia się za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Masę białka uwięzionego w nanożelach określa się poprzez obliczenie wydajności kapsułkowania. Co więcej, zdolność nanożeli do kontrolowanego uwalniania poprzez stopniową degradację elementów strukturalnych reagujących na redoks jest również oceniana w testach bioredukcji. Podajemy przykłady danych optymalizacyjnych dotyczących nanocząstek, aby zademonstrować wszystkie zastrzeżenia dotyczące syntezy i charakterystyki nanożeli przy użyciu tej techniki. Ogólnie rzecz biorąc, uzyskano nanożele o jednolitej wielkości i średniej wielkości 57 nm i wartości wskaźnika polidyspersyjności wynoszącej 0,093. Osiągnięto wysoką skuteczność enkapsulacji wynoszącą 76%. Co więcej, nanożele wykazywały kontrolowane uwalnianie do 86% kapsułkowanego białka poprzez stopniową degradację nowych składników reagujących na redoks w obecności glutationu przez 48 godzin.

Wprowadzenie

Nanożele to trójwymiarowe, submikronowe hydrożele z usieciowanymi strukturami sieci polimerowej, które mogą pomieścić duże ilości płynów w swojej powłoce rdzenia bez wpływu na ich integralność morfologiczną1. Ogólnie rzecz biorąc, nanożele są syntetyzowane przez polimeryzację funkcjonalnych monomerów poprzez fizyczne lub chemiczne sieciowanie w heterogenicznych układach koloidalnych, takich jak odwrotne mikroemulsje typu woda w oleju2,3. Kopolimery amfifilowe mogą samoorganizować się w struktury w skali nano w środowisku wodnym. Muszą być jednak ustabilizowane za pomocą chemicznych strategii sieciowania obejmujących dwusiarczki lub sprzężenie na bazie amidu, chemii kliknięć, lub mogą być fizycznie indukowane (strategie hydrofobowe, elektrostatyczne lub wiązania wodorowe) lub fotoindukowane4. Wśród tych strategii, fizyczna samoorganizacja polimerów, po której następuje chemiczne sieciowanie, została uznana za skuteczną technikę wytwarzania nanożeli5. Podczas gdy historycznie pierwszy nanożel został wprowadzony w latach 90. przez Vingradov et al.6, Akiyoshi et al.7 oraz Lemieux et al.8, ostatnio opracowano i zbadano różne inteligentne nanożele składające się zarówno z naturalnych, jak i syntetycznych polimerów pod kątem różnorodnych zastosowań biomedycznych9.

Nanożele mają dużą zdolność zatrzymywania ładunku, dużą powierzchnię, stabilność in vivo, a także konfigurowalne właściwości chemiczne i mechaniczne10. Synteza nanożeli jest również skalowalna i może być oparta na wodzie. Ponadto zwiększona zawartość wody w nanożelach sprawia, że są one skutecznymi nośnikami wrażliwych ładunków biologicznych11. Co więcej, duża powierzchnia może zaspokoić wiele potrzeb w zakresie biokoniugacji, umożliwiając w ten sposób dołączenie modalności celowania w celu umożliwienia aktywnego celowania. Warto zauważyć, że wszechstronność konstrukcji nanożeli pozwala na zastosowanie szerokiej gamy monomerów reagujących na bodźce, co pozwala na precyzyjną kontrolę ich właściwości fizykochemicznych9. Ta wyjątkowa zdolność inżynieryjna umożliwia racjonalne ulepszenie konstrukcji nanożelu, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnie stosowanych liposomów, miceli lub polimerosomów12,13. Poprzez włączenie ugrupowań reagujących na bodźce do specjalnie zaprojektowanych monomerów, nanożele mogą być zaprojektowane tak, aby wyzwalały kontrolowane uwalnianie ich ładunku w odpowiedzi na różne fizjologicznie istotne bodźce, takie jak pH, warunki redoks, enzymy itp.9,14. Takie inteligentne nanożele są bardziej użyteczne niż konwencjonalne nanożele, ponieważ mają doskonałą stabilność dla przedłużonego krążenia krwi i mogą wytrzymać warunki fizjologiczne, aby utrzymać integralność swojego ładunku i pośredniczyć w jego kontrolowanym uwalnianiu w pożądanych miejscach docelowych15. Rzeczywiście, ze względu na swoją wszechstronną naturę, nanożele zyskały popularność na arenie biomedycznej, ze znaczącymi postępami w rozwoju nanożeli reagujących na bodźce do licznych zastosowań teranotycznych i diagnostycznych2,16,17.

Biologics może reprezentować kategorię produktów farmaceutycznych składających się z białek, peptydów i/lub kwasów nukleinowych i zrewolucjonizowały krajobraz terapeutyczny dzięki swojej niezwykłej selektywności, stając się tym samym najszybciej rozwijającą się klasą terapii18. Rzeczywiście, rosnący rynek takich środków terapeutycznych jest widoczny w gwałtownym wzroście ich zatwierdzenia przez amerykańskie Federalne Stowarzyszenie Leków (FDA), gdzie leki biologiczne stanowiły ~40% wszystkich zatwierdzeń leków, w 2023 r. 19. Oprócz ich specyficzności i siły działania, szybkie odkrycia nowych celów leków, bardziej wydajne procesy bioinżynieryjne i większa wiedza na temat losu tych środków terapeutycznych in vivo doprowadziły do ich zwiększonego stosowania20. Tradycyjne leki biologiczne obejmują interferujące RNA, białka zastępcze, cytokiny i hormony, które są zwykle generowane przy użyciu technologii rekombinacji DNA21. Od czasu zatwierdzenia ludzkiej rekombinowanej insuliny w 1982 r. leki biologiczne zostały opracowane dla wielu schorzeń, w tym raka (np. trastuzumab, awelumab), nieswoistych zapaleń jelit (np. adalimumab, certolizumab) i rzadkich chorób genetycznych (np. mipomersan, miozym, aldurazyme, fabrazyme)21. Podczas gdy wysoka specyficzność interakcji leków biologicznych z ich celami powinna teoretycznie równoważyć wszelkie efekty niezamierzone, pojawiło się kilka problemów klinicznych związanych z ich stosowaniem związanych z niepożądanymi skutkami ubocznymi22. Te działania niepożądane można podzielić na dwie kategorie, w tym przesadną farmakologię (nadmierną stymulację celów) i immunogenność. Co więcej, ich krótkie okresy półtrwania, ograniczona biodostępność, uszkodzenia proteazy, krótki okres trwałości i kosztowne procesy produkcyjne ograniczają ich korzyści terapeutyczne21. Konwencjonalne metody łagodzenia tych problemów obejmują kowalencyjną modyfikację tych leków biologicznych, która może zagrozić ich funkcji, a tym samym skuteczności23. Alternatywnie, podejście nanomedyczne do hermetyzacji ładunków terapeutycznych może przynieść wiele korzyści właściwościom farmakologicznym, a przede wszystkim pasywne ukierunkowanie na miejsce objęte stanem zapalnym poprzez efekt wzmocnionego przenikania i zatrzymywania (EPR)24. Inne korzyści związane z nanocząstkami mogą obejmować wydłużony czas krążenia, zmniejszoną szybkość klirensu, większą elastyczność formuły, lepszą przepuszczalność naczyń krwionośnych i wychwyt komórkowy25. Podczas gdy obecnie badana jest ogromna różnorodność preparatów nanocząstek pod kątem dostarczania ładunków biologicznych, niewiele z nich jest w stanie naśladować wielofunkcyjność nanożeli. Rzeczywiście, nanożele przewyższają nośność osiąganą przez nanocząstki na bazie liposomalii i miceli i wykazują większą stabilność koloidalną niż większość nanocząstek nieorganicznych. W związku z tym nanożele stanowią cenną platformę do dostarczania różnych biologicznych środków terapeutycznych.

Wcześniej udało nam się dostarczyć enzym antyoksydacyjny w nowych nanożelach polimerowych reagujących na metaloproteinazę macierzy, gdzie zastosowano łagodną strategię enkapsulacji, która utrzymywała bioaktywność białka po uwolnieniu26. W tej pracy demonstrujemy zoptymalizowaną syntezę nanożeli reagujących na redoks w celu dostarczania ładunków opartych na białkach. Warto zauważyć, że metodologia syntezy umożliwia syntezę nanożeli w łagodnych warunkach w celu zamknięcia pożądanego ładunku, bez użycia agresywnych rozpuszczalników organicznych lub wysokich temperatur. Wykorzystaliśmy homeostazę redoks w środowisku wewnątrzkomórkowym, aby regulować uwalnianie zamkniętego ładunku27,28. Zazwyczaj naturalnie występujący w skutkach przeciwutleniacz glutation (GSH) kontroluje zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy potencjał redoks, gdzie jego stężenie waha się odpowiednio między 2-20 μM i 1-10 mM29,30. Do tej pory zgłoszono wiele nanocząstek wrażliwych na redoks, co sprawia, że jest to sprawdzona i niezawodna strategia umożliwiająca kontrolowane uwalnianie leków in vivo27,28. Rzeczywiście, wiązania dwusiarczkowe zostały zainstalowane w nanomateriałach polimerowych przy użyciu środków sieciujących zawierających dwusiarczek31,32, samoorganizacja biodegradowalnych polimerów z monomerów zawierających disiarczek33, oraz proleki polimerowe reagujące na redoks lub koniugaty lek/polimer34,35. W związku z tym w niniejszym badaniu zbadano włączenie unikalnego, wysoce wrażliwego na GSH środka sieciującego dwusiarczek w polimerowych nanocząstkach, umożliwiając w ten sposób kontrolowane uwalnianie zamkniętego w kapsułkach ładunku białkowego.

W tym badaniu, projekt nanożelu był skoncentrowany na następujących kryteriach, aby uwzględnić specyficzność i dostarczanie ładunku: mały rozmiar (~100 nm) i jednolity rozkład wielkości (wskaźnik polidyspersyjności (PI)<0.3) w celu zapewnienia efektywnej penetracji śródbłonka i stabilności in vivo27; efektywna enkapsulacja ładunku białkowego i kontrolowane uwalnianie ładunku w odpowiedzi na GSH. Przedstawiamy syntezę usieciowanych nanożeli reagujących na GSH, które wykazały jednorodne nanocząstki o wielkości poniżej 100 nm, z 76% skutecznością enkapsulacji pożądanego ładunku białkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza sieciowania responsywnego na utlenianie-redukcję

  1. Do 3 ml bezwodnego dichlorometanu dodać chlorowodorek 2-aminoetylometakrylanu (44,79 mg, 0,270 mmol) oraz 0,063 ml trietyloaminy i mieszać przez 20 min w obojętnej atmosferze N22 gaz w kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml.
  2. Rozpuścić kwas 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-heksadekaoksa-28,29-ditiapentakontanodioik di-Nestert sukkynimidylowy (100 mg, 0,045 mmol) w 1 ml bezwodnego dichlorometanu i dodać do kolby.
  3. Do kolby należy dodać 4 ml bezwodnego dichlorometanu. Kolbę reakcyjną należy owinąć folią aluminiową i pozostawić do mieszania w atmosferze N2.2 w temperaturze pokojowej.
  4. Potwierdzić powstanie produktu za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Upewnić się, że zastosowano prawidłowe wzorce dla materiału wyjściowego podczas potwierdzania powstania produktu tą metodą.
    1. Chromatografia cienkowarstwowa jest metodą opartą na powinowactwie, stosowaną do oddzielania pożądanych związków z mieszaniny poreakcyjnej. W tym przypadku w jakość fazy stacjonarnej należy wykorzystać silnie polarną i adsorpcyjną płytkę krzemionkową. Próbkę materiału wyjściowego oraz próbkę mieszaniny poreakcyjnej należy nanieść na jeden koniec płytki krzemionkowej, a następnie umieścić płytkę pionowo w zamkniętym szklanym zlewce z eluentem (faza ruchoma: 5% metanol: dichlorometan).
    2. Pod wpływem sił kapilarnych faza ruchoma przemieszcza się w górę płytki krzemionkowej, a związki z próbki migrują na różne odległości w zależności od ich powinowactwa do fazy stacjonarnej i ruchomej. Gdy czoło rozpuszczalnika przekroczy 3/4th płyty, wyjmij płytę i osusz ją. Rozdzielone związki widoczne są jako plamy na płycie. Wyznacz współczynnik retencji (Rf) pożądanego związku jako stosunek drogi przebytej przez związek do drogi przebytej przez rozpuszczalnik. Tutaj Rf produktu wynosił 0,35. Do wizualizacji plam można wykorzystać światło UV lub barwienie (nadmanganian potasu).
  5. Zagęść mieszaninę in vacuo i oczyścić za pomocą szybciej płynącej chromatografii kolumnowej (izokratyczna mieszanina 5% metanolu w dichlorometanie)36Nanieś mieszaninę reakcyjną na górę kolumny szklanej wypełnionej krzemionką (faza stacjonarna), a następnie eluuj układem rozpuszczalników (faza ruchoma).36Zbierz wszystkie frakcje i przeprowadź analizę metodą TLC, aby odróżnić frakcje produktu, korzystając z wcześniej wyznaczonej wartości Rf.f wartość
  6. Skoncentruj oczyszczone frakcje poprzez odparowanie rozpuszczalnika za pomocą rotacyjnego odparowacza (temperatura: 40 °C), ustawić ciśnienie próżni na ciśnienie atmosferyczne, aby w pierwszej kolejności usunąć dichlorometan o niższej temperaturze wrzenia. Gdy poziom rozpuszczalnika przestanie opadać, ustawić ciśnienie próżni na 337 mbar, aby usunąć metanol i otrzymać bladożółty olej, który zostanie następnie poddany dalszej charakterystyce w celu potwierdzenia powstania produktu37.
  7. Przeprowadzenie analizy w podczerwieni w przekształceniu Fouriera (FT-IR)38, 1H NMR (w zdeuteryzowanym dimetylosulfoksydzie (DMSO-d6))39, 13NMR węgla (13C NMR)39 or desorpcję/jonizację laserową wspomaganą matrycą z analizą czasu przelotu (MALDI-ToF)40 analiza w celu potwierdzenia powstania produktu przed wykonaniem kolejnych kroków.
    1. Do analizy FT-IR należy nanieść 1 mg oleju na urządzenie w celu uzyskania widm.
    2. Do analiz NMR należy ponownie rozpuścić 10 mg produktu w 0,75 ml odpowiedniego rozpuszczalnika do NMR, przenieść do probówki NMR i szczelnie zamknąć, aby zapobiec wyciekowi. Następnie próbkę wprowadza się do spektrometru NMR w celu zarejestrowania widm.39.
    3. Do analizy spektrometrycznej należy umieścić 1 mg produktu w fiolce, rozpuścić w DMSO i wprowadzić do urządzenia.
      UWAGA: Analiza w podczerwieni dostarcza informacji na temat kluczowych grup funkcyjnych w pożądanym produkcie, a mianowicie drgań rozciągających grupy karbonylowej (C=O), zidentyfikowanych poprzez ostry pik przy 1650 cm⁻¹-1 wskazuje na powstanie wiązania amidowego, podkreślając tym samym tworzenie się produktu. 1widmo 1H NMR i 13${}^{13}\text{C}$ dostarcza informacji o środowiskach chemicznych, dzięki czemu może być wykorzystywany do określenia składu chemicznego pożądanego produktu poprzez identyfikację środowisk chemicznych obecnych w związku. Na koniec zastosowanie spektrometrii mas pozwala zweryfikować dokładną masę pożądanego produktu.

2. Test rozszczepiania sieciującego dwusiarczkowego za pomocą glutationu

  1. Inkubować sieciujący czynnik dwusiarczkowy (do stężenia końcowego 4,55 mg/mL) z reduktorem glutationem (końcowe [GSH]: 10 mM), do końcowej objętości 1 mL, przez 24 h w szklanej fiolce o pojemności 1,5 mL.
  2. Aby potwierdzić rozszczepienie łącznika dwusiarczkowego, poddać zawartość fiolki analizie MALDI-ToF26,40.

3. Synteza nanogelu reagującego na utlenianie-redukcję

  1. Należy upewnić się, że całe szkło używane do reakcji jest wolne od kurzu, myjąc je filtrowaną (0,20 µm) wodą dejonizowaną, a następnie susząc sprężonym powietrzem dostępnym z przyłącza sprężonego powietrza z boku dygestorium. Do wylotu sprężonego powietrza należy przymocować bezpieczną dyszę w celu ułatwienia dostępu. Mocno trzymać fiolkę i umieścić w niej dyszę. Aktywować sprężone powietrze, wpuszczając kontrolowany strumień do fiolki. Obserwować proces, aby zapewnić skuteczne suszenie, sprawdzając, czy nie pozostały zanieczyszczenia lub wilgoć.
  2. Przygotować szklaną fiolkę o pojemności 10 mL, napełniając ją wodą dejonizowaną, a następnie zamknąć kolbę gumowym septem. Odgazować wodę poprzez przedmuchiwanie N2 przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem reakcji. W tym celu napełnić balon gazem N2 i przymocować do niego igłę; umieścić go na septum i użyć igły do przebicia gumowego septum, umożliwiając przepływ N2. Do kolby przymocować igłę wylotową, aby zapewnić stały przepływ N2.
  3. Rozpuścić albuminę surowicy bydlęcej (BSA; 2 mg, 30 nmol) lub BSA znakowaną Cy7 (2 mg, 30 nmol) w 1 mL odgazowanej wody dejonizowanej i dodać do kolejnej czystej szklanej fiolki o pojemności 10 mL.
  4. Do kolby dodać roztwór chlorku [2-(akryloyloxy)etylu]trimetyloamoniowego (AETC) (12,00 mg/10,86 µL, 0,060 mmol) i zamknąć ją innym gumowym septem. Należy zapewnić, aby mieszanina reakcyjna znajdowała się pod stałym przepływem gazu N2 i mieszać przez 30 min.
  5. Rozpuścić akryloamid (9,21 mg, 0,13 mmol) w 1 mL odgazowanej wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny w fiolce.
  6. Rozpuścić sieciujący czynnik disiarczkowy (4,44 mg, 0,004 mmol) w 1 mL wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny w fiolce. Przepłukać mieszaninę gazem N2 przez 20 min.
  7. Rozpuścić dodecylosiarczan sodu (2 mg, 0,007 mmol) w 1 mL odgazowanej wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny za pomocą strzykawki przepłukanej gazem N2, a następnie mieszać mieszaninę przez 30 min.
    UWAGA: Poprzez przepłukanie strzykawki N2 minimalizujemy ekspozycję mieszaniny reakcyjnej na tlen atmosferyczny, który może hamować reakcję polimeryzacji rodnikowej.
  8. Dodać N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminę (1,5 µL, 0,010 mmol) i pozostawić mieszaninę reakcyjną do odgazowania przez 3 min pod gazem N2.
  9. Rozpuścić persiarczan amonu (1 mg, 0,004 mmol) w 1 mL odgazowanej wody dejonizowanej i dodać do mieszaniny reakcyjnej. Należy zapewnić, aby gaz N2 bąblował przez mieszaninę reakcyjną przez 10 min.
    UWAGA: Jeśli etap dodawania N2 zostanie pominięty, prawdopodobnie w kolbie reakcyjnej utworzą się białe cząstki. Są to cząstki i/lub agregaty o większym rozmiarze, które mogą zakłócić dalszą charakterystykę.
  10. Zamknąć kolbę w atmosferze N2 i pozostawić do mieszania przez 3 h i 30 min w temperaturze pokojowej.
  11. Aby zakończyć reakcję, należy usunąć zamknięcie z kolby i mieszać mieszaninę reakcyjną przez co najmniej 10 min. Pozwoli to na ekspozycję mieszaniny reakcyjnej na atmosferyczny poziom gazu O2, co doprowadzi do wygaszenia wszelkich pozostałych rodników w mieszaninie. Reakcja kończy się, gdy mieszanina przyjmie przejrzysty, niebieski, opalescencyjny wygląd.
  12. W celu oczyszczenia nanogeli, dodać mieszaninę reakcyjną do centryfugalnej jednostki filtrującej o pojemności 15 mL (MWCO 100 kDa) i dopełnić jednostkę centryfugalną wodą dejonizowaną. Wirować mieszaninę reakcyjną przy 1000 x g przez 10 min. Usunie to wszelkie nieprzereagowane odczynniki (lub niezatrzaśnięty ładunek) o masie mniejszej niż 100 kDa i skoncentruje próbkę nanogelu.
  13. Po obniżeniu poziomu wody w jednostce centryfugalnej, dodać 2 mL wody dejonizowanej, aby rozcieńczyć próbkę nanogelu, a następnie wirować w celu skoncentrowania produktu. Powtórzyć ten krok 3x.
  14. Próbkę przechowywać w temperaturze 2-8 °C, aby zapobiec degradacji zamkniętego białka.
  15. Przeprowadzić analizę FT-IR oraz 1H NMR (w deuterowanym dimetylosulfoksydzie (DMSO-d6)), aby potwierdzić polimeryzację39,41. Aby przygotować próbkę, liofilizować 1 mL roztworu nanogelu w fiolce 1,5 mL. Proces liofilizacji polega na zamrożeniu próbki, a następnie zastosowaniu próżni w celu usunięcia zamrożonego rozpuszczalnika poprzez sublimację, co pozostawia proszkową pozostałość. Po liofilizacji ponownie rozpuścić próbkę w odpowiednim rozpuszczalniku do NMR, przenieść do probówki NMR i szczelnie zamknąć. Próbkę wprowadzić do urządzenia NMR zgodnie z wcześniejszym opisem39. Do analizy FT-IR na urządzenie należy nałożyć 1 mg suchego proszku w celu uzyskania widm.

4. Charakterystyka morfologiczna nanogelu

  1. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
    UWAGA: Średnicę hydrodynamiczną (nm), indeks polidyspersyjności (PI) oraz potencjał zeta mierzono w temperaturze 25 °C, przy długości fali lasera 632,8 nm i detektorze sygnału pod kątem 173° przy użyciu urządzenia DLS. Każdy pomiar obejmował 25 cykli podskanowania.
    1. Pomiar rozmiaru hydrodynamicznego (nm)
      1. Przygotować kuwetę lub jednorazową zwijaną komórkę kapilarną, oczyszczając ją filtrowaną wodą dejonizowaną. Przedmuchać kuwetę (odpowiednią zarówno do pomiarów DLS, jak i potencjału zeta) sprężonym powietrzem, aby upewnić się, że jest wolna od dużych cząstek kurzu.
      2. Napełnić kuwetę co najmniej 50-100 µL próbki i rozcieńczyć w 750-1000 µL filtrowanej wody dejonizowanej. W przypadku używania kuwety do pomiaru potencjału zeta należy upewnić się, że została ona napełniona próbką bez tworzenia pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócić pomiary.
      3. Włożyć kuwetę do instrumentu DLS, upewniając się, że została prawidłowo wstawiona. W tym celu należy otworzyć pokrywę komory na próbki instrumentu DLS. Trzymać kuwetę za górne krawędzie, aby uniknąć odcisków palców na oknach optycznych. Upewnić się, że kuweta jest prawidłowo osadzona w uchwycie, jest wypoziomowana i wyrównana z torem optycznym instrumentu. Zamknąć komorę na próbki, aby zapobiec zakłóceniom przez światło otoczenia.
        UWAGA: Medium do rozcieńczania jest filtrowane za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze porów 0,45 µm.
      4. Kliknąć, aby rozpocząć pomiar wielkości cząstek w odpowiednim oprogramowaniu urządzenia DLS.
      5. Wybrać wyniki odpowiadające próbce, aby uzyskać z-average (średnią wielkość cząstek), średni PI, liczbę tysięcy zliczeń na sekundę (kcps), potencjał zeta oraz odpowiednie wykresy. Upewnić się, że funkcja korelacji wykazuje gładką krzywą sigmoidalną, co wskazuje na jednorodność próbki.
      6. Po zakończeniu analizy wyjąć kuwetę z urządzenia DLS.
  2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Przygotować próbki, nanosząc 10 µL roztworu nanocząstek (0,077 mg/mL) na miedziane siatki pokryte węglem. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    2. Przemyć siatki filtrowaną wodą dejonizowaną i zbarwić 5 µL filtrowanego 1% octanu uranylu w wodzie przez 2 min.
    3. Po odsączeniu nadmiaru środka barwiącego papierem filtracyjnym, suszyć siatki przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia wykonać obrazy TEM przy powiększeniu 45 000x przy użyciu kamery w polu jasnym.
    4. Użyć dostarczonego oprogramowania do przetwarzania obrazów (rozdzielczość: 2048 x 2048 pikseli).

5. Ilościowe oznaczenie białka (BSA) zamkniętego w nanogelach przy użyciu mikroanalizy kwasem bicinchononowym (BCA)

  1. Zgodnie z protokołem analizy microBCA (dostępnym na stronie internetowej producenta), sporządź krzywą standardową na podstawie zdefiniowanego wcześniej stężenia białka42.
  2. Po syntezie oczyść nanogele enkapsulujące białko, używając filtrów wirówkowych 15 mL z MWCO 100 kDa (1000 x g, 10 min), zgodnie z opisem w krokach 3.12-3.14.
  3. Zebierz filtrat i przeanalizuj go za pomocą analizy microBCA (protokół dostępny na stronie producenta). Zmierz absorbancję przy 562 nm za pomocą czytnika płytek. Ponieważ pomiar ten koreluje ze stężeniem białka nieenkapsulowanego, wyznacz masę białka zamkniętego w nanogelach. Aby obliczyć procentową wydajność enkapsulacji (EE %), zastosuj następujące równanie:
    wzór na procentową wydajność enkapsulacji, %EE=(zmierzona masa białka/masa dodanego białka)×100, równanie

6. Ilościowe oznaczenie uwalniania białka z nanogeli w obecności glutationu

  1. Inkubować 200 µL nanogeli obciążonych Cy7BSA w stężeniu 5 mg/mL z 200 µL glutationu (GSH) o stężeniu 10 mM w jednostkach filtrów odwirku 0,5 mL (MWCO 100 kDa). Umieścić jednostki filtracyjne w kąpieli wodnej w celu utrzymania temperatury 37 °C.
  2. Wirować przy 1000 x g przez 3 min co 10 min przez co najmniej 1 h, a następnie co 2-8 h.
  3. Zebrać filtrat i wykorzystać go do dalszych analiz. Utrzymywać objętość filtratu w jednostkach filtrów odwirku na poziomie 500 µL poprzez dodawanie wody dejonizowanej lub PBS.
  4. Zmierzyć ilość białka w filtratach, korzystając z krzywej wzorcowej dla nanogeli obciążonych Cy7BSA, w której absorbancję białka fluorescencyjnego mierzono przy użyciu urządzenia nanodrop przy 750 nm.
    UWAGA: Krzywą wzorcową można wyznaczyć, przygotowując rozcieńczenia seryjne Cy7BSA w zakresie od 0 mg/mL do 2 mg/mL. Wartości uzyskane z nanodrop można interpolować względem tej krzywej kalibracyjnej w celu określenia wydajności enkapsulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Synteza i charakterystyka sieciującego czynnika na bazie diakrylanu disiarczku poli(glikolu etylenowego) (PEG) Redox-responsywny czynnik sieciujący został zsyntezowany poprzez substytucję nukleofilową estru N-hydroksysukcynimidu (NHS) przez metakrylan 2-aminoetylowy poprzez utworzenie wiązania amidowego (Rysunek 1). Syntezę wymaganego produktu potwierdzono przede wszystkim za pomocą 1H NMR (Rycina uzupełniająca 1); badanie przeprowadzono ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rosnące zapotrzebowanie na leki biologiczne specyficzne dla celu w przemyśle biofarmaceutycznym spowodowało zapotrzebowanie na technologie, które mogą poprawić ich profile farmakologiczne in vivo, jednocześnie zapobiegając ich szybkiej degradacji fizjologicznej i kompensując wszelkie niepożądane skutki uboczne. Mając to na uwadze, opisano prostą procedurę syntezy nanożeli zawierających białka. Jak wskazano w protokole, środek sieciujący reagujący na redoks musi zostać zsyntetyzowany przed syntezą nanożelu. Nastę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić. Nie ma żadnych szczegółów finansowych do zadeklarowania.

Podziękowania

Dziękujemy Wydziałowi Chemii Imperial College London oraz Instytutowi Nauk Przyrodniczych Rady Badań Medycznych za ich wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
2-(
akryloyloksy)etylo]roztworu chlorku trimetyloamoniowego 		Sigma Aldrich496146
chlorowodorek 2-aminoetylu metakrylanu Sigma Aldrich516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,
44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanodioic kwas di-N-sukcynimidylowy 		Sigma Aldrich671630
AkrylamidSigma Aldrich23701
Nadsiarczan amonuSigma Aldrich248614
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichB6917
Cy7 albumina surowicy bydlęcej znakowanaNanocsBS1-S7-1
Deuterowany dimetylosulfotlenekSigmaAldrich 547239
DichlorometanSigma Aldrich270997 (bezwodny) i D65100
GlutationSigma AldrichG4251
MetanolSigma Aldrich34860
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina Sigma Aldrich411019
Solanka buforowana fosforanami ThermoFisher10010023
Dodecylosiarczan soduSigma Aldrich436143
TrietyloaminaSigma Aldrich471283
Agar z octanem uranyluScientific AGR1260A
Sprzęt niezbędny do syntezy i charakterystyki nanożeli
Amicon Ultra-15 Filtry odśrodkowe (100kDa MWCO) Merck MilliporeC7715
Olympus Veleta Kratki
miedziane powlekane węglemAgar Scientific AGS160
(100kDa MWCO)Spectrum labs11405949
Dynamiczne rozpraszanie światła Malvern Zetasizer Nano Ultra
LabconcoWZ-03336-01
Spektroskopia w podczerwieniAgilent Oprogramowanie Cary 630 FTIR
iTEMOlympus 
Spektrometria masWodyMikromasa MALDI microMX MALDI Q-ToF 
Filtr membranowy MF-MilliporeTM (0,45/0,2μ m rozmiar porów)Merck Millipore, Wielka BrytaniaHAWP04700, GSWP04700 
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermoFisher23235
Czytnik płytekBeckmanCoulter-PARADIGM
Dane magnetycznego rezonansu jądrowego protonów i węgla-13NMR Bruker 400 MHz AV-400
Parownik obrotowy Buchi R-114 Rotary Vap System
Igły jednorazowego użytku Sterican4665643
Suba-Seal  septaSigma AldrichZ124575
Transmisyjna mikroskopia elektronowaPhillips CM 100 TEM 
Spektrofotometr UV-visNanodropNanodrop One/One C mikroobjętość 
Aparat Rurki do dializy Liofilizator Spektrometr

Bibliografia

  1. Zhang, X., Malhotra, S., Molina, M., Haag, R. Micro- and nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chem Soc Rev. 44 (7), 1948-1973 (2015).
  2. Chacko, R. T., Ventura, J., Zhuang, J., Thayumanavan, S. Polymer nanogels: A versatile nanoscopic drug delivery platform. Adv Drug Del Rev. 64 (9), 836-851 (2012).
  3. Hajebi, S., et al. Stimulus-responsive polymeric nanogels as smart drug delivery systems. Acta Biomaterialia. 92, 1-18 (2019).
  4. Lee, V. Y., et al. Nanogel star polymer architectures: A nanoparticle platform for modular programmable macromolecular self-assembly, intercellular transport, and dual-mode cargo delivery. Adv Mat. 23 (39), 4509-4515 (2015).
  5. Ekkelenkamp, A., Rachèl Elzes, M., Engbersen, J. F., Paulusse, J. M. Responsive crosslinked polymer nanogels for imaging and therapeutics delivery. J Mat Chem B. 6 (2), 210-235 (2018).
  6. Vinogradov, S. V., Zeman, A. D., Batrakova, E. V., Kabanov, A. V. Polyplex nanogel formulations for drug delivery of cytotoxic nucleoside analogs. J Control Rel. 107 (1), 143-157 (2015).
  7. Akiyoshi, K., Deguchi, S., Moriguchi, N., Yamaguchi, S., Sunamoto, J. Self-aggregates of hydrophobized polysaccharides in water. Formation and characteristics of nanoparticles. Macromol. 26 (12), 3062-3068 (1993).
  8. Lemieux, P., et al. Block and graft copolymers and NanoGel copolymer networks for DNA delivery into cell. J Drug Target. 8 (2), 91-105 (2000).
  9. Preman, N. K., Barki, R. R., Vijayan, A., Sanjeeva, S. G., Johnson, R. P. Recent developments in stimuli-responsive polymer nanogels for drug delivery and diagnostics: A review. Euro J Pharma Biopharmac. 157, 121-153 (2020).
  10. Oh, J. K., Drumright, R., Siegwart, D. J., Matyjaszewski, K. The development of microgels/nanogels for drug delivery applications. Prog Poly Sci. 33 (4), 448-477 (2008).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Deng, C., Suuronen, E. J., Zhong, Z. Click hydrogels, microgels and nanogels: Emerging platforms for drug delivery and tissue engineering. Biomat. 35 (18), 4969-4985 (2014).
  12. Napier, M. E., DeSimone, J. M. Nanoparticle drug delivery platform. Poly Rev. 47 (3), 321-327 (2007).
  13. Malmsten, M. Soft drug delivery systems. Soft Matt. 2 (9), 760-769 (2006).
  14. Kamaly, N., Yameen, B., Wu, J., Farokhzad, O. C. Degradable controlled-release polymers and polymeric nanoparticles: Mechanisms of controlling drug release. Che Rev. 116 (4), 2602-2663 (2016).
  15. Molina, M., et al. Stimuli-responsive nanogel composites and their application in nanomedicine. Chem Soc Rev. 44 (17), 6161-6186 (2015).
  16. Ma, Y., Ge, Y., Li, L. Advancement of multifunctional hybrid nanogel systems: Construction and application in drug co-delivery and imaging technique. Mat Sci Eng: C. 71, 1281-1292 (2017).
  17. Wang, H., Qian, J., Ding, F. Recent advances in engineered chitosan-based nanogels for biomedical applications. J Mat Chem B. 5 (34), 6986-7007 (2017).
  18. Durán-Lobato, M., Niu, Z., Alonso, M. J. Oral delivery of biologics for precision medicine. Adv Mat. 32 (13), 1901935(2020).
  19. de la Torre, B. G., Albericio, F. The pharmaceutical industry in 2022: An analysis of FDA drug approvals from the perspective of molecules. Molecules. 28 (3), 1038(2023).
  20. Škalko-Basnet, N. Biologics: The role of delivery systems in improved therapy. Biologics. 8, 107-114 (2014).
  21. Andrews, L., Ralston, S., Blomme, E., Barnhart, K. A snapshot of biologic drug development: Challenges and opportunities. Human Exp Toxicol. 34 (12), 1279-1285 (2015).
  22. Sathish, J. G., et al. Challenges and approaches for the development of safer immunomodulatory biologics. Nat Rev Drug Disc. 12 (4), 306-324 (2013).
  23. Pfister, D., Morbidelli, M. Process for protein PEGylation. J Control Rel. 180, 134-149 (2014).
  24. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  25. Golombek, S. K., et al. Tumor targeting via EPR: Strategies to enhance patient responses. Adv Drug Del Rev. 130, 17-38 (2018).
  26. Basak, S., et al. Simultaneous cross-linking and cross-polymerization of enzyme responsive polyethylene glycol nanogels in confined aqueous droplets for reduction of low-density lipoprotein oxidation. Biomacromol. 22 (2), 386-398 (2021).
  27. Morgulchik, N., Kamaly, N. Meta-analysis of in vitro drug-release parameters reveals predictable and robust kinetics for redox-responsive drug-conjugated therapeutic nanogels. ACS Appl Nano Mat. 4 (5), 4256-4268 (2021).
  28. Ghorbani, M., Hamishehkar, H. Redox-responsive smart nanogels for intracellular targeting of therapeutic agents: Applications and recent advances. J Drug Target. 27 (4), 408-422 (2019).
  29. Bajic, V. P., et al. Glutathione "redox homeostasis" and its relation to cardiovascular disease. Oxi Med Cell Long. 2019, e5028181(2019).
  30. Forman, H. J., Zhang, H., Rinna, A. Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Mol Asp Med. 30 (1-2), 1-12 (2009).
  31. Wang, Y. C., et al. Core-shell-corona micelle stabilized by reversible cross-linkage for intracellular drug delivery. Macromol Rapid Comm. 31 (13), 1201-1206 (2010).
  32. Elkassih, S. A., Kos, P., Xiong, H., Siegwart, D. J. Degradable redox-responsive disulfide-based nanogel drug carriers via dithiol oxidation polymerization. Biomat Sci. 7 (2), 607-617 (2019).
  33. Hu, X., et al. Stimuli-responsive polymersomes for biomedical applications. Biomacromol. 18 (3), 649-673 (2017).
  34. Navath, R. S., Wang, B., Kannan, S., Romero, R., Kannan, R. M. Stimuli-responsive star poly(ethylene glycol) drug conjugates for improved intracellular delivery of the drug in neuroinflammation. J Control Release. 142 (3), 447-456 (2010).
  35. Ling, X., et al. Glutathione-responsive prodrug nanoparticles for effective drug delivery and cancer therapy. ACS Nano. 13 (1), 357-370 (2019).
  36. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. J Org Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
  37. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry. Rotary evaporation to remove solvent. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  38. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry II. Infrared spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  39. JoVE. science education database - Organic chemistry. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  40. Kim, J. Sample preparation for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Mass Spec Lett. 6, 27-30 (2015).
  41. Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353(2019).
  42. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  43. Yu, M., Wu, J., Shi, J., Farokhzad, O. C. Nanotechnology for protein delivery: Overview and perspectives. J Control Release. 240, 24-37 (2016).
  44. Zhang, Y., Zhang, D., Wang, J. T., Zhang, X., Yang, Y. Fabrication of stimuli-responsive nanogels for protein encapsulation and traceless release without introducing organic solvents, surfactants, or small-molecule cross-linkers. Poly Chem. 12 (4), 554-563 (2021).
  45. Kamaly, N., et al. Targeted interleukin-10 nanotherapeutics developed with a microfluidic chip enhance resolution of inflammation in advanced atherosclerosis. ACS Nano. 10 (5), 5280-5292 (2016).
  46. Lu, R., et al. Probing the secondary structure of bovine serum albumin during heat-induced denaturation using mid-infrared fiberoptic sensors. Analyst. 140 (3), 765-770 (2015).
  47. Abrosimova, K. V., Shulenina, O. V., Paston, S. V. FTIR study of secondary structure of bovine serum albumin and ovalbumin. J Phys: Conf Ser. 769, 012016(2016).
  48. Kabanov, A. V., Vinogradov, S. V. Nanogels as pharmaceutical carriers: Finite networks of infinite capabilities. Ang Chem Int Ed Eng. 48 (30), 5418-5429 (2009).
  49. Li, C., Obireddy, S. R., Lai, W. F. Preparation and use of nanogels as carriers of drugs. Drug Del. 28 (1), 1594-1602 (2021).
  50. Kulkarni, J. A., et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 16 (6), 630-643 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza nanogelisieciowanie w środowisku wodnymenkapsulacja białekdynamiczne rozpraszanie światłatransmisyjna mikroskopia elektronowananogele responsywne na utlenianie-redukcjękontrolowane uwalnianiewydajność enkapsulacji
Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.