Artykuł metodologiczny

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63988

⸱

2 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Streszczenie

Macierz zewnątrzkomórkowa jest ważnym regulatorem funkcji komórki. Coraz częściej wykazano, że sygnały środowiskowe istniejące w mikrośrodowisku komórkowym, takie jak dystrybucja ligandów i geometria tkanek, odgrywają kluczową rolę w zarządzaniu fenotypem i zachowaniem komórki. Jednak te sygnały środowiskowe i ich wpływ na komórki są często badane oddzielnie przy użyciu platform in vitro, które izolują poszczególne sygnały, strategia, która znacznie upraszcza złożoną sytuację in vivo wielu wskazówek. Podejścia inżynieryjne mogą być szczególnie przydatne w wypełnianiu tej luki poprzez opracowywanie konfiguracji eksperymentalnych, które ujmują złożoność mikrośrodowiska in vivo, zachowując jednocześnie stopień precyzji i możliwości manipulacji systemów in vitro.

To badanie podkreśla podejście łączące wzorowanie białek na bazie ultrafioletu (UV) i mikrofabrykację substratów opartą na litografii, które razem umożliwiają wysokoprzepustowe badanie zachowań komórek w środowiskach wielokierunkowych. Za pomocą bezmaskowego fotomodelowania UV możliwe jest tworzenie złożonych, adhezyjnych rozkładów białek na trójwymiarowych (3D) podłożach hodowli komórkowych na chipach, które zawierają różnorodne, dobrze zdefiniowane wskazówki geometryczne. Proponowana technika może być stosowana do substratów hodowlanych wykonanych z różnych materiałów polimerowych i połączonych z adhezyjnymi wzorzystymi obszarami szerokiej gamy białek. Dzięki takiemu podejściu, pojedyncze komórki, jak również monowarstwy, mogą być poddawane kombinacjom wskazówek geometrycznych i wskazówek dotyczących kontaktu prezentowanych przez wzorzyste podłoża. Systematyczne badania wykorzystujące kombinacje materiałów chipowych, wzorców białkowych i typów komórek mogą zatem dostarczyć fundamentalnych informacji na temat reakcji komórkowych na środowiska wielorakie.

Wprowadzenie

In vivo, komórki są poddawane różnorodnym sygnałom środowiskowym, które mogą mieć charakter mechaniczny, fizyczny i biochemiczny, a które pochodzą z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zidentyfikowano liczne sygnały środowiskowe, które odgrywają istotną rolę w regulacji zachowania komórek, takich jak proliferacja, różnicowanie i migracja1,2,3,4,5. Jednym z najszerzej badanych zjawisk jest naprowadzanie kontaktowe, opisujące ułożenie komórek za pośrednictwem adhezji wzdłuż anizotropowych wzorców biochemicznych lub topograficznych obecnych na podłożu zewnątrzkomórkowym6,7,8,9,10,11. Wykazano, że poza kierowaniem ułożeniem komórek, wskazówki dotyczące kontaktu wpływają również na inne właściwości komórek, takie jak migracja komórek, organizacja białek wewnątrzkomórkowych, kształt komórki i los komórki12,13,14,15. Dodatkowo, geometryczna architektura środowiska komórkowego 3D została również uznana za jej regulacyjny wpływ na zachowanie komórek16,17. W ludzkim ciele komórki są wystawione na działanie szeregu zakrzywionych geometrii, począwszy od mikroskalowych włókien kolagenowych, naczyń włosowatych i kłębuszków nerkowych, aż po mezoskalowe pęcherzyki płucne i tętnice18,19. Co ciekawe, ostatnie badania in vitro wykazały, że komórki mogą wyczuwać i reagować na takie sygnały fizyczne, od nano- do mezoscale20,21,22,23.

Do tej pory, większość badań nad reakcją komórek na sygnały środowiskowe była w dużej mierze przeprowadzana przy użyciu eksperymentalnych konfiguracji, które izolują pojedyncze sygnały. Chociaż podejście to pozwoliło na ogromny postęp w zrozumieniu podstawowych mechanizmów stojących za komórkowym wykrywaniem sygnałów środowiskowych, słabo podsumowuje środowisko in vivo, które jednocześnie przedstawia wiele wskazówek. Aby wypełnić tę lukę, przydatne jest opracowanie platform kulturowych, za pomocą których wiele sygnałów środowiskowych może być niezależnie i jednocześnie kontrolowanych. Koncepcja ta zyskuje ostatnio coraz większą popularność24,25, z badaniami łączącymi sztywność matrycy i gęstość liganda26,27,28,29, sztywność i porowatość podłoża30, sztywność podłoża i objętość mikroniszy 3D31, topografia powierzchni i wskazówki dotyczące kontaktu32,33,34, oraz nanoskalowe wskazówki dotyczące naprowadzania na kontakt z mezoskalowymi wskazówkami dotyczącymi krzywizny23. Wyzwaniem pozostaje jednak połączenie wskazówek naprowadzania kontaktowego z różnymi geometriami 3D w kontrolowany i wysokowydajny sposób.

Ten protokół badawczy rozwiązuje to wyzwanie i wprowadza metodę tworzenia substratów do hodowli komórkowych z kontrolowaną kombinacją wzorzystych obszarów adhezyjnych białek ECM (wskazówki kontaktowe) i krzywizny substratu (wskazówki geometryczne). Takie podejście pozwala na analizę odpowiedzi komórek w biomimetycznym środowisku wielokierunkowym w sposób systematyczny i wysokoprzepustowy. Zdobyta wiedza może pomóc w lepszym zrozumieniu zachowania komórek w złożonych środowiskach i może być wykorzystana do projektowania materiałów instruktażowych o właściwościach, które kierują odpowiedziami komórek w kierunku pożądanego rezultatu.

3D fotowzorce białek
Tworzenie obszarów adhezyjnych białek ECM (wskazówki kontaktowe) na materiałach do hodowli komórkowych można osiągnąć przy użyciu różnych technik, na przykład poprzez wzory w głębokim ultrafiolecie (głębokim UV) lub druk mikrokontaktowy35,36. Modelowanie w głębokim promieniowaniu UV wykorzystuje światło UV, które jest emitowane przez maskę na materiał polimerowy w celu degradacji polimerów pasywacyjnych w określonych miejscach na podłożu hodowli komórkowej. Wzorzysty substrat jest następnie inkubowany z interesującym ligandem, w wyniku czego powstają obszary adhezyjne, które wspierają przyczepianie się komórek i hodowlę w predefiniowanych lokalizacjach12,37,38. Alternatywnym sposobem wprowadzania wzorów białkowych jest druk mikrokontaktowy, w którym stemple elastomerowe zawierające pożądany kształt są powlekane wybranym białkiem i prasowane na podłożu do hodowli komórkowej, przenosząc w ten sposób powłokę białkową, do której komórki mogą przylegać35,37,39,40. Niestety, ponieważ obie techniki opierają się na przygotowaniu masek i metodach miękkiej litografii, eksperymenty są czasochłonne i pracochłonne, a także ograniczone pod względem elastyczności wzorów. Ponadto zarówno modelowanie w głębokim promieniowaniu UV, jak i druk mikrokontaktowy są najbardziej odpowiednie dla materiałów płaskich i są technicznie trudne, jeśli nie niemożliwe, do modelowania ligandów w środowisku 3D.

Aby ulepszyć te konwencjonalne metody, Waterkotte et al. połączyli litografię bez maski, chemiczne osadzanie z fazy gazowej i termoformowanie, aby wygenerować mikrowzorcowe podłoża polimerowe 3D41. Jednak technika ta opiera się na wykorzystaniu termoformowalnych folii polimerowych i oferuje niską rozdzielczość wzoru białka (7,5 μm), podczas gdy doniesiono, że komórki reagują na geometryczne wzorce białek tak małe jak 0,1 μm2,42. Sevcik i in. opisali inną obiecującą metodę nanomodelowania ligandów ECM na podłożach zawierających topografie nano- i mikrometrowe43. Za pomocą druku mikrokontaktowego białka ECM przeniesiono ze stempli polidimetylosiloksanu (PDMS) na termoczułe podłoże z poli(N-izopropylacrylamidu) (pNIPAM). Następnie właściwości termoczułe sieci pNIPAM pozwoliły im przenieść dwuwymiarowy (2D) wzór białka na topograficzne podłoże PDMS (rowki o głębokości 10-100 μm), kontrolując w ten sposób lokalizację miejsc adhezji na cechach topograficznych. Jednak nie wszystkie możliwe mikrotopografie mogą być modelowane, ponieważ problemy ze zmniejszoną zwilżalnością utrudniają modelowanie głębszych podłoży topograficznych. Zgłoszono, że rowy o proporcjach głębokości do szerokości wynoszącym 2,4 stanowią ostateczną granicę pomyślnego przeniesienia wzoru na podłoże topograficzne43. Dodatkowo, elastyczność różnych wzorów i rozdzielczość generowanych wzorów są słabe ze względu na wymóg druku mikrokontaktowego.

Ten artykuł opisuje metodę, która pokonuje wyżej wymienione wąskie gardła i oferuje elastyczną i wysokoprzepustową metodę tworzenia wielokierunkowych substratów, które mogą być użyte do hodowli komórkowej (zobacz Rysunek 1). Fizjologicznie istotne geometrie (cylindry, kopuły, elipsy i powierzchnie siodeł) o krzywiznach w zakresie od ĸ = 1/2500 do ĸ = 1/125 μm-1 są wstępnie zaprojektowane i mikrofabrykowane w chipach PDMS. Następnie, na geometriach 3D tworzone są wskazówki kontaktowe przy użyciu różnych cyfrowych projektów wzorów, wykorzystując technikę fotowzorców o rozdzielczości tak małej jak 1,5 μm44. W tym celu chipy PDMS są początkowo pasywowane, aby zapobiec przyleganiu komórek i białek; ta warstwa pasywacyjna może być następnie usunięta przez połączenie chlorku 4-benzoilobenzylo-trimetyloamoniowego (PLPP) i ekspozycji na światło UV45. Maska cyfrowa ma za zadanie określić miejsca ekspozycji na promieniowanie UV, a tym samym obszar, z którego usuwana jest warstwa pasywacyjna. Białka mogą następnie przylegać do tych obszarów, umożliwiając przyłączanie się komórek. Ponieważ tworzenie wzorów odbywa się za pomocą maski cyfrowej (a nie fizycznej), można szybko tworzyć różnorodne wzory bez kłopotów i kosztów związanych z projektowaniem i wytwarzaniem dodatkowych fotomasek. Ponadto na podłożu można wzorować różnorodną gamę białek ECM (np. kolagen typu I, żelatynę i fibronektynę). Chociaż protokół ten jest wykonywany przy użyciu chipów do hodowli komórkowych wykonanych z PDMS, zasada ta może być zastosowana do każdego innego interesującego materiału46.

Protokół

W badaniach opisanych w tym protokole, użyto pierwotnych ludzkich keratocytów. Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej. Keratocyty pierwotne wyizolowano z resztek tkanek ludzkich zwłok korowo-twardówkowych z operacji keratoplastyki śródbłonka błony Descemeta, które uzyskano z Oddziału Rogówki Centrum Wielotkankowego ETB-BISLIFE (Beverwijk, Holandia) po uzyskaniu zgody najbliższych krewnych wszystkich zmarłych dawców.

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

1. Wytwarzanie substratów do hodowli komórkowych 3D

  1. Stwórz szklaną formę negatywową zawierającą wszystkie interesujące Cię cechy, w tym przypadku wykonaną ze szkła przy użyciu techniki bezpośredniego zapisu laserem femtosekundowym (patrz Rysunek 2).
  2. Ostrożnie umieść szklaną foremkę do negatywu (#1) na dnie szalki Petriego.
  3. Przygotuj prepolimer PDMS, umieszczając pustą stożkową probówkę o pojemności 50 ml na wadze, wytaruj wagę i wlej żądaną ilość bazy z elastomeru silikonowego do probówki.
  4. Dodać utwardzacz za pomocą pipety Pasteura tak, aby ostateczny stosunek bazy elastomerowej i utwardzacza wynosił 10:1 (w/w).
  5. Dokładnie wymieszaj składniki w stożkowej probówce za pomocą szpatułki.
  6. Wirować przy 2 000 × g przez 70 s, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
  7. Wlej prepolimer PDMS na wierzch formy ze szkła ujemnego (#1) na szalce Petriego, aby całkowicie ją przykryć.
  8. Umieścić szalkę Petriego z ujemną szklaną formą (#1) i prepolimerem PDMS w eksykatorze próżniowym i uruchomić pompę próżniową. Po osiągnięciu próżni odczekaj 5 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki obecne na granicy między powierzchnią formy a prepolimerem PDMS.
  9. Usunąć próżnię i wyjąć szalkę Petriego z eksykatora.
  10. Prepolimer PDMS utwardzić przez noc w piecu w temperaturze 65 °C.
  11. Ostrożnie wyjmij nowo utwardzony dodatni chip PDMS (#2) z formy ze szkła ujemnego (#1), podnosząc krawędzie PDMS za pomocą szpatułki. Jeśli dodatni chip PDMS ma tendencję do przyklejania się do ujemnej formy szklanej , dodaj etanol lub wodę do krawędzi odcisku podczas podnoszenia.
    UWAGA: Płyn będzie przepływał między dwiema warstwami i ułatwi oddzielenie ujemnej formy szklanej (#1) i dodatniego chipa PDMS (#2).
  12. Za pomocą ostrza odetnij boki dodatniego chipa PDMS (#2), tak aby pozostał prostokątny chip.
  13. Umieścić dodatni chip PDMS w eksykatorze obok małej fiolki z kroplą tridekafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilanu, środka silanizacyjnego, i pozostawić na noc w próżni.
    UWAGA: Silanizacja zapewni, że nadruk nie będzie wiązał się z innymi warstwami PDMS w dalszej części protokołu. Inne środki i/lub metody silanizacji mogą również działać, aby zapewnić, że powierzchnie chipów PDMS nie będą przyklejać się do innych warstw PDMS.
    UWAGA: Tridekafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilan jest łatwopalny (H226) i powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu (H314). Nosić środki ochrony osobistej, pracować pod wyciągiem i dokładnie umyć ręce po użyciu. Środek silanizacyjny należy trzymać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskier, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Przechowywać w temperaturze od 15 do 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
  14. Usuń próżnię i umieść dodatni chip PDMS (#2) na dnie szalki Petriego. Wlej prepolimer PDMS (10:1) na wierzch, aby wytworzyć wiele ujemnych form PDMS (#3).
  15. Umieścić szalkę Petriego pod próżnią w eksykatorze na 15 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki.
  16. Utwardzić prepolimer PDMS w temperaturze 65 °C przez noc, po czym ujemną formę PDMS (#3) można oderwać od dodatniego chipa PDMS (#2) za pomocą szpatułki.
  17. Sylizanizować końcową ujemną pleśń PDMS (#3) za pomocą środka silanizacyjnego w eksykatorze próżniowym przez noc.
  18. Wytworzyć wiele chipów do hodowli komórkowych (#4, patrz Rysunek 2) o grubości około 5 mm, wlewając prepolimer PDMS do ujemnej formy PDMS , usuwając pęcherzyki za pomocą eksykatora i utwardzając przez 3 godziny w temperaturze 65 °C. Za pomocą żyletki przytnij wiór do ostatecznego rozmiaru, jak pokazano na Rysunek 2. Przechowuj frytki w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Chropowatość powierzchni może wpływać na odpowiedź komórkową. W razie potrzeby dodatkowa cienka warstwa PDMS może być użyta jako powłoka na dodatnim chipie PDMS (#2) w celu wygładzenia powierzchni. W tym celu należy wlać niewielką kropelkę prepolimeru PDMS na chip i rozprowadzić ją po całym chipie za pomocą sprężonego powietrza. Utwardzić pokryty wiór w temperaturze 65 °C przez 3 godziny i kontynuować krok 1.12.

2. Wytwarzanie płaskich próbek PDMS (próbki kontrolne)

  1. Przygotować prepolimer PDMS (10:1) zgodnie z krokami 1.3-1.6.
  2. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na zaokrąglonym słupku próżniowym na środku powlekarki wirowej.
  3. Włącz podciśnienie, aby przymocować szklane szkiełko nakrywkowe do urządzenia i odpipetuj kroplę PDMS na środku szkiełka nakrywkowego za pomocą pipety Pasteura.
  4. Rozprowadzić prepolimer PDMS na podłożu szklanym zgodnie z następującym protokołem, aby uzyskać warstwę o grubości około 10 μm.
    1. Wirowanie przez 10 s przy 0,45 × g, przyspieszenie: 0,2 × g/s.
    2. Spincoat przez 50 s przy 44,8 × g, przyspieszenie: 0,54 × g/s.
  5. Wyłącz próżnię, usuń szkiełko nakrywkowe z wirówki za pomocą pęsety i umieść je na szalce Petriego. Utwardzić PDMS przez noc w piekarniku w temperaturze 65 °C, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej.

3. Pasywacja substratów 3D do hodowli komórkowych

  1. Aktywuj grupy hydroksylowe na powierzchni chipa PDMS (#4) za pomocą plazmyO2. Za pomocą pęsety umieść chip w koszu ashera plazmowego.
  2. Uruchom cykl spopielania z mocą 20 W przez 30 s. Odpowietrz komorę spopielania za pomocą N2.
  3. Wyjmij chip z koszyka i umieść go w małym pojemniku PDMS (patrz Rysunek 1).
  4. Za pomocą pipety Pasteura dodaj 500 μl poli-L-lizyny (PLL, 0,01%) na wierzch chipa, tak aby cała powierzchnia była zanurzona w roztworze PLL. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usunąć 450 μl PLL z chipa hodowli komórkowej za pomocą pipety i trzykrotnie przepłukać powierzchnię chipa 500 μl 0,1 M buforu HEPES (pH 8 < < 8,5). Zawsze pozostawiaj niewielką objętość płynu na chipie PDMS, aby uniknąć wyschnięcia próbki, co obniży końcową jakość wzoru.
  6. Przygotować 500 μl walerianianu glikolu metoksypolietylenowego i sukcynimidylu o stężeniu 50 mg/ml (mPEG-SVA; MW 5 000 Da) w 0,1 M buforze HEPES (8 < pH < 8,5) na chip do hodowli komórkowej i pozostawić do inkubacji na próbce przez 60 minut. Ponieważ okres półtrwania mPEG-SVA wynosi 15 minut, należy przygotować wymaganą ilość leku tuż przed użyciem.
    UWAGA: mPEG-SVA rozpuszcza się, gdy roztwór jest całkowicie przezroczysty.
  7. Usunąć 450 μl roztworu mPEG-SVA za pomocą mikropipety i przemyć powierzchnię chipa pięciokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Upewnij się, że pipetujesz w górę i w dół wiele razy podczas prania, aby upewnić się, że wszystkie niezwiązane mPEG-SVA zostały usunięte. Aby zapobiec wysychaniu próbki, należy zminimalizować czas między etapami mycia i upewnić się, że do mycia używa się nadmiaru (500 μl lub więcej) PBS.
  8. Przechowuj próbki, zanurzając je w PBS lub przejdź do etapu tworzenia wzoru protokołu.
    UWAGA: W razie potrzeby pasywację można przeprowadzić w sterylnych warunkach podczas pracy w komorze hodowlanej oraz pracy ze sterylnymi roztworami i sprzętem.

4. Przechowywanie wzorzystych substratów do hodowli komórkowych

UWAGA: Substraty 3D do hodowli komórkowych mogą być przechowywane na różnych etapach procesu.

  1. Utwardzone chipy hodowli komórkowych PDMS należy przechowywać w suchych warunkach w temperaturze pokojowej.
  2. Przechowuj pasywowane chipy hodowli komórkowej na jeden z tych dwóch sposobów:
    1. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 7 dni.
    2. Przechowywać w suchych warunkach do kilku miesięcy. Aby uzyskać suche próbki, należy usunąć PBS i kilkakrotnie przepłukać wodą podwójnie destylowaną (ddH2O). Wysuszyć suszarką za pomocą pistoletu do wydobycia azotu lub wiatrówki.

5. Projektowanie masek cyfrowych używanych do fotomodelingu

UWAGA: Wzorowanie podłoży 3D może być wykonywane przy użyciu jednej lub wielu płaszczyzn ogniskowych (zobacz Rysunek 3). Pojedyncza płaszczyzna ogniskowej może być używana na obiektach, które nie są większe niż jedno cyfrowe urządzenie lustrzane (DMD, około 300 μm x 500 μm) i które nie są zbyt wysokie (50-100 μm). W takim przypadku należy zaprojektować wzór cyfrowy w trybie TIFF. W przypadku elementów, które przekraczają wymiary jednego DMD i są stosunkowo wysokie, należy podzielić wzór podłoża na wiele etapów. W tym przypadku wiele wzorów jest projektowanych przy użyciu trybu PDF, w którym każdy indywidualnie skupia się na jednej płaszczyźnie ogniskowej.

  1. Zaprojektuj cyfrową maskę za pomocą narzędzi do projektowania.
    1. Wzorzec w trybie TIFF (piksele): Utwórz całkowicie obszar roboczy o wymiarach 1 140 x 1 824 pikseli (dokładny rozmiar 1 DMD, około 300 μm x 500 μm) i wypełnij obszar roboczy interesującymi Cię kształtami. Eksportuj obszar roboczy jako 8-bitowy plik TIFF.
      UWAGA: Różne poziomy szarości w projekcie wzoru określają stopień ekspozycji, który zostanie wykonany w tym miejscu.
    2. Wzorzec w trybie PDF (jednostki metryczne): Utwórz obszar roboczy o żądanym rozmiarze w mm i wypełnij obszar roboczy dowolnym kształtem, który Cię interesuje. Podziel wzór na wiele plików, jeśli podłoże 3D musi być wymodelowane przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych. Zapisz obszar roboczy jako plik PDF.
      UWAGA: Różne poziomy szarości w projekcie wzoru określają stopień ekspozycji, który zostanie wykonany w tym miejscu.

6. Fotowzorce UV substratów do hodowli komórkowych 3D

  1. Kalibracja
    UWAGA: Kalibracja lasera jest wykonywana w celu uzyskania właściwej ostrości na interesującym nas materiale. Ponieważ substraty do hodowli komórkowych PDMS są zbyt grube, aby można było przez nie przebić się, należy użyć szklanego szkiełka, na którym chip umieszcza się do góry nogami. Ponieważ laser najpierw styka się ze szkiełkiem, użyj szkła do kalibracji lasera.
    1. Nałóż fluorescencyjny zakreślacz na szklane szkiełko nakrywkowe i umieść szklane szkiełko nakrywkowe w stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Upewnij się, że podświetlona powierzchnia jest skierowana do góry.
    2. Włącz mikroskop i sprzęt PRIMO i otwórz Micro-manager, aby uzyskać dostęp do oprogramowania Leonardo w sekcji "wtyczki".
    3. Wybierz Kalibracja w menu początkowym, a następnie wybierz obiektyw 20x zarówno w mikroskopie, jak i w oprogramowaniu. Kliknij Dalej.
    4. Umieść szklane szkiełko z fluorescencyjnym zakreślaczem w torze optycznym mikroskopu. Przełącz się w tryb fluorescencyjny i ostrożnie ustaw ostrość na wyświetlonym obrazie PRIMO, upewniając się, że zarówno logo, jak i tekst są ostre. Kliknij przycisk Dalej, aby zakończyć procedurę kalibracji.
    5. Zapisz położenie Z stolika podczas kalibracji i użyj tego położenia jako odniesienia w dalszej części protokołu.
      UWAGA: Materiał kalibracyjny powinien być zgodny z materiałem, który jest używany do tworzenia wzorów w dalszej części protokołu. Powyższe kroki opisują kalibrację potrzebną dla substratów do hodowli komórkowych. W celu kalibracji płaskich próbek kontrolnych PDMS nałóż fluorescencyjny zakreślacz na dodatkową płaską próbkę PDMS i skalibruj, wykonując kroki 6.1.2-6.1.5.
  2. Tworzenie wzoru elementów 3D przy użyciu pojedynczej płaszczyzny ogniskowej
    UWAGA: Tworzenie wzoru przy użyciu pojedynczej płaszczyzny ogniskowej jest wykonywane na elementach 3D, które nie przekraczają wymiarów jednego DMD (około 300 μm x 500 μm). Schemat układu płaszczyzny ogniskowej jest zilustrowany na Rysunek 3.
    1. Zdjąć szkiełko kalibracyjne ze stolika i umieścić w nim szklane szkiełko zawierające kroplę (~50 μL) fotoinicjatora (PLPP).
      UWAGA: PLPP działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę (R36-38). Nosić środki ochrony osobistej, trzymać je z dala od materiałów wybuchowych, nigdy nie dolewać wody do tego produktu, podjąć środki ostrożności przeciwko wyładowaniom elektrostatycznym oraz unikać wstrząsów i tarcia (S26-36).
    2. Umieść substrat do hodowli komórkowej PDMS do góry nogami w kropli fotoinicjatora. Upewnij się, że cechy 3D na powierzchni podłoża do hodowli komórkowej są skierowane w stronę szkiełka i są całkowicie zanurzone w PLPP, aby zapewnić prawidłowe wzory.
    3. Wybierz Wzór w oprogramowaniu.
    4. Przełącz się w tryb jasnego pola w mikroskopie i przesuń stolik do interesującej Cię funkcji.
    5. Skoncentruj się odpowiednio na górze lub na dole wypukłych i wklęsłych struktur (Rysunek 3).
    6. Wybierz PRIMO, aby wstawić wybrany wzór. Obserwuj podgląd wzoru w kolorze pomarańczowym na górze obrazu w jasnym polu na żywo.
    7. Dostosuj ustawienia wzoru zgodnie z funkcją (lokalizacja, kąt, powtórzenia) i wybierz dawkę 1,000 mJ/mm2.
    8. Kliknij Zablokuj i przełącz mikroskop w tryb fluorescencyjny.
    9. Kliknij przycisk Odtwórz w prawym dolnym rogu ekranu, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Po zakończeniu obserwuj wzór wyświetlany na zielono.
    10. Po zakończeniu wszystkich funkcji na chipie do hodowli komórkowej wyjąć chip z szkiełka do modelowania i przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.
  3. Tworzenie wzoru elementów 3D przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych
    UWAGA: Tworzenie wzorów przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych jest wykonywane na elementach 3D, które są większe niż jeden DMD (około 300 μm x 500 μm) lub są stosunkowo wysokie. W takim przypadku cechy 3D muszą być narysowane w wielu krokach, co oznacza, że projekt wzoru powinien być dostosowany zgodnie z przykładem w Rysunek 3.
    1. Zdjąć szkiełko kalibracyjne ze stolika i umieścić w stoliku szklane szkiełko zawierające kroplę (~50 μl) fotoinicjatora (PLPP).
    2. Umieść chip do hodowli komórkowej PDMS do góry nogami w kropli fotoinicjatora za pomocą pęsety.
    3. Wybierz Wzór w oprogramowaniu. Przełącz się w tryb jasnego pola w mikroskopie i przesuń stolik do interesującej Cię funkcji.
    4. Skoncentruj się na obszarze chipa we właściwym miejscu. Ponieważ tworzenie wzoru odbywa się w jednej płaszczyźnie ogniskowej, a cechy są większe niż pojedynczy DMD, należy użyć wielu płaszczyzn ogniskowych, a tym samym wielu rund wzoru na podłoże 3D, aby zapewnić wystarczającą rozdzielczość wzoru na całej wysokości i szerokości elementu (patrz Rysunek 3). Na przykład w przypadku obiektu o wysokości 150 μm należy utworzyć wzór obiektu w trzech okrążeniach (± 1 płaszczyzna ogniskowej na 50 μm ruchu Z), skupiając się na około 25 μm, 75 μm i 125 μm od dołu obiektu. Upewnij się, że dolna krawędź obiektu znajduje się wokół wartości zapisanej w kroku 6.1.5.
    5. Wybierz PRIMO, aby wstawić wybrany wzór. Obserwuj podgląd wzoru pokazany na pomarańczowo na górze obrazu w jasnym polu na żywo.
    6. Dostosuj ustawienia wzoru zgodnie z funkcją (lokalizacja, kąt) i wybierz dawkę 1,000 mJ/mm2.
    7. Kliknij Zablokuj i przełącz mikroskop w tryb fluorescencyjny.
    8. Kliknij przycisk Odtwórz w prawym dolnym rogu ekranu, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Po zakończeniu obserwuj wzór wyświetlany na zielono.
    9. Powtórz kroki 6.3.4-6.3.8 dla interesującej cechy, gdy używanych jest wiele płaszczyzn ogniskowych.
    10. Po zakończeniu wszystkich funkcji na chipie do hodowli komórkowej, wyjmij chip ze szkiełka modelarskiego i przechowuj go w PBS w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W razie potrzeby zastosuj fotomodelowanie UV w sterylnych warunkach, korzystając z szalek Petriego ze szklanym dnem i przygotuj wszystkie podłoża w sterylnych szafkach hodowlanych. Wzorzyste próbki należy przechowywać w PBS przez okres do kilku tygodni. Po umyciu ddH2O i wysuszeniu przy użyciu sprężonego powietrza próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do kilku miesięcy.

7. Inkubacja białek

UWAGA: Zaleca się używanie świeżo inkubowanych białek substratów do hodowli komórek. Przejdź do tej części protokołu tylko wtedy, gdy wysiewanie komórek (krok 8) zostanie wykonane bezpośrednio po nim.

  1. Przenieś wzorzysty chip do hodowli komórkowej do sterylnych pojemników PDMS w komorze hodowlanej.
  2. Wzorzyste chipy hodowli komórkowej przemyć 3x nadmiarem sterylnego PBS, jeśli wzór nie został wykonany w sterylnych warunkach.
  3. Przygotuj świeży roztwór białka w PBS.
    1. Fibronektyna: dodać 2 ml PBS za pomocą mikropipety do fiolki zawierającej 20 μg fibronektyny znakowanej rodaminą, aby uzyskać stężenie 10 μg/ml. Delikatnie pipetować, aby uniknąć tworzenia się grudek białka i chronić przed światłem.
    2. Żelatyna: rozmrozić 200 μl podwielokrotności rozpuszczonej żelatyny fluoresceinowej. Chronić przed światłem.
  4. Dodać 200-500 μl roztworu białkowego do chipa do hodowli komórkowej za pomocą mikropipety. Dostosuj czas inkubacji i temperaturę w zależności od wybranego białka: Fibronektyna: 5 min w temperaturze pokojowej, Żelatyna: 15 min w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że próbka jest przykryta (np. folią aluminiową).
  5. Usunąć roztwór białkowy i przemyć 5x 500 μl sterylnego PBS. Upewnij się, że pipetujesz PBS w górę i w dół wiele razy powyżej wszystkich istotnych cech chipa do hodowli komórkowej, aby usunąć wszelkie niezwiązane białka.
    UWAGA: Podczas etapów mycia ważne jest, aby próbka nigdy nie wyschła. Podczas usuwania roztworu białka lub PBS podczas mycia, należy natychmiast dodać nowy PBS, aby zapobiec tworzeniu się grudek białka (patrz Rysunek 4). Elementy wypukłe są szczególnie wrażliwe na wysychanie, ponieważ są wyniesione ponad powierzchnię podłoża.
  6. Opcjonalnie: przejrzyj wzorce białek pod mikroskopem fluorescencyjnym. Próbki należy przechowywać w stanie sterylnym i zanurzonym w PBS.

8. Rozsiewanie komórek

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje ludzkie pierwotne keratocyty i ludzkie fibroblasty skórne. Keratocyty zostały pobrane z ludzkiej tkanki rogówki od pacjentów, zgodnie z holenderskimi wytycznymi dotyczącymi wtórnego wykorzystania materiałów, i wcześniej scharakteryzowane jako keratocyty47. Komórki te są hodowane w DMEM uzupełnionym 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną/streptomycyną (P / S) i 1 mM hydratem soli seskwimagnezowej kwasu L-askorbinowego 2-fosforanu (witamina C) w temperaturze 37 °C przez maksymalnie cztery pasaże. Ludzkie fibroblasty skóry zakupiono i hodowano w DMEM uzupełnionym o 10% FBS i 1% P/S w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 15 pasaży. Do wysiewu zarówno keratocytów, jak i fibroblastów skóry na chipie do hodowli komórkowej z fotowzorcem, użyto 20 000 komórek na chip.

  1. Odłącz interesujące komórki (np. za pomocą trypsyny) i przygotuj 1 ml zawiesiny komórek ± 10 000-50 000 komórek/ml w pożywce hodowlanej na chip. Dostosuj dokładną liczbę komórek dodawanych na podłoże w zależności od rozmiaru komórki i żądanego odczytu.
  2. Usunąć PBS z chipa do hodowli komórkowej i dodać 1 ml zawiesiny komórkowej.
  3. Delikatnie przetransportować chip do hodowli komórkowej wraz z komórkami do inkubatora i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Sprawdź przyczepność komórek na wzorzystym chipie do hodowli komórkowej pod mikroskopem jasnego pola. Szukaj wydłużonych morfologii komórek w przypadku wzorów linii (patrz Rysunek 5). Jeśli komórki zaczęły również przylegać poza wzorzystym obszarem, usuń je, pipetując pożywkę w górę i w dół bezpośrednio nad komórkami na podłożu.
    UWAGA: Komórki dołączone do obszaru z wzorem pozostaną dołączone, podczas gdy komórki poza obszarami z wzorem zostaną odłączone.
  5. Wyjmij chip do hodowli komórkowej z pojemnika PDMS i za pomocą sterylnej pęsety umieść go na 6-dołkowej płytce wypełnionej ~5 ml pożywki hodowlanej.
  6. Hoduj komórki przez żądany okres czasu. Pożywkę do hodowli komórkowych należy wymieniać co 2-3 dni. Aby zapewnić wizualizację wzoru białka po hodowli komórkowej, należy zmniejszyć ekspozycję próbki na światło podczas hodowli.

9. Barwienie, akwizycja i analiza obrazu

  1. Utrwalanie i barwienie
    1. Po pożądanej długości hodowli usuń prawie całe podłoże i trzykrotnie przemyj nadmiarem PBS. Następnie inkubuj z 3,7% formaliną przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy etapy mycia z PBS przez 5 minut na pranie w temperaturze pokojowej. Nigdy nie pozwól, aby próbka wyschła.
      UWAGA: Formalina jest szkodliwa w przypadku połknięcia lub wdychania (H302, H332), może powodować reakcję alergiczną skóry (H317), podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne (H341) i może powodować raka (H350). Nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.
    2. Wybarwić substrat do hodowli komórkowych pożądanymi środkami barwiącymi lub przeciwciałami. Aby zmniejszyć objętość środków barwiących, umieść chipy hodowli komórkowej do góry nogami w kropli roztworu barwiącego pipetowanej na szkiełku podstawowym.
    3. Próbki należy przechowywać w PBS (krótkoterminowo) lub przymocować do szkiełka nakrywkowego za pomocą podłoża montażowego (długotrwale) w temperaturze 4 °C.
  2. Akwizycja obrazu
    1. Umieść wybarwioną próbkę do góry nogami w kropli PBS na szkiełku podstawowym. Umieścić próbkę w stoliku mikroskopu konfokalnego.
    2. W zależności od wymaganego poziomu szczegółowości należy wykonać stosy Z z odpowiednim obiektywem (10x, 20x lub 40x) i odstępami Z, aby zapewnić prawidłową akwizycję obrazu.
  3. Analiza i wizualizacja obrazu
    1. Otwórz pliki obrazów RAW w oprogramowaniu do analizy obrazu i sprawdź, czy właściwości obrazu (np. wymiary, rozdzielczość) są poprawne.
    2. W razie potrzeby dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału.
    3. Przytnij obszar zainteresowania zawierający wzór i komórki.
    4. Opcjonalnie: w razie potrzeby wykonaj krok dekonwolucji.
    5. Utwórz render 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do renderowania 3D.
    6. Zoptymalizuj ustawienia kontrastu i wzmocnienia dla każdego kanału.
    7. Aby utworzyć obraz renderingu 3D, utwórz migawkę i wyeksportuj jako plik . Plik TIFF.
    8. Aby utworzyć film na podstawie renderingu 3D, ustaw klatkę początkową i końcową, a także ramkę czasową przed zarejestrowaniem filmu. Eksportuj jako .avi.

Wyniki

Zgodnie z opisanym protokołem, trójwymiarowe podłoża do hodowli komórkowych z PDMS mogą zostać poddane fotopat wzorowaniu UV w celu stworzenia precyzyjnych i wysokoprzepustowych obszarów adhezyjnych odpowiednich do przywierania komórek. W ten sposób komórki są jednocześnie poddane działaniu odpowiedniej geometrii podłoża oraz wzorów ligandów adhezyjnych. Właściwości komórek, takie jak orientacja, powierzchnia komórki i liczba adhezji ogniskowych, mogą być łatwo monitorowane i wykorzystywane do lepszego zrozumienia zachowania komórek w złożonych środowiskach przypominających warunki in vivo.

Aby zweryfikować procesy wzorcowania na trójwymiarowych podłożach PDMS, zmierzono atomowy skład powierzchni materiału na różnych etapach protokołu, wykorzystując rentgenowską spektroskopię fotoelektronów (XPS)48. Podsumowując, pomiary XPS wykazały obecność łańcuchów PEG ze zwiększonym sygnałem węgla w próbkach pasywowanych, który uległ zmniejszeniu po fotowzorcowaniu. Inkubacja z fibronektyną doprowadziła do wzrostu sygnału węgla, co ponownie wskazało na skuteczną adhezję białka na powierzchni chipa do hodowli komórek. Następnie rozdzielczość i dopasowanie wzorców na elementach 3D scharakteryzowano na różnych wklęsłych dołkach z wzorcem kolistym (ĸ = 1/250 µm-1, ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz ĸ = 1/3,750 µm-1, patrz Rysunek 6). Na podstawie projekcji maksymalnej intensywności można wywnioskować, że wzorzec białkowy został pomyślnie naniesiony na wszystkie trzy elementy 3D. Profil intensywności na Rysunku 6A wykazuje wysoką rozdzielczość wzorca z ostrymi przejściami między obszarami wzorcowanymi a niewzorcowanymi. Ponadto uzyskano spójną intensywność białka w obrębie całego wzorca w dołku.

Wklęsły dołek o ĸ = 1/250 µm-1 został uformowany przy użyciu metody jednej płaszczyzny ogniskowej (jeden wzór), natomiast dołki o ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz ĸ = 1/3,750 µm-1 zostały uformowane przy użyciu odpowiednio dwóch i trzech płaszczyzn ogniskowych (wzorów). Jak widać na projekcjach maksymalnej intensywności na Rysunku 6, obie metody zapewniają idealne dopasowanie wzorów do struktur. Nie zaobserwowano żadnych przesunięć w przejściach między dwiema różnymi płaszczyznami ogniskowymi i wzorami.

Stosując opisany protokół, szeroki zakres wzorów białkowych można nanieść na różnorodne geometrie (patrz Rycina 7 i Wideo 1). Aby zilustrować wszechstronność tej metody, półcylindry (wypukłe i wklęsłe), powierzchnię siodłową oraz wgłębienie wzorowano za pomocą linii i okręgów o różnych szerokościach. Fotowzorowane materiały mogą być następnie wykorzystywane do hodowli komórkowych (patrz Rycina 7, Rycina 8, Wideo 2, Wideo 3 oraz Wideo 4). Przykład fibroblastów skóry hodowanych na wzorowanym (linie fibronektyny, czerwone, szerokość 5 µm i przerwy 5 µm) wklęsłym półcylindrze przedstawiono na Rycynie 8, Rycynie 9 oraz w Wideo 4. Podczas eksperymentu komórki wyczuwają i przylegają do wielostymulującego podłoża hodowlanego, zachowując żywotność w czasie. Jak wynika z barwienia immunofluorescencyjnego na Rycynie 8, komórki tworzą adhezje ogniskowe (skupiska winkuliny) głównie na liniach fibronektyny.

Kolejne badanie z wykorzystaniem tych materiałów do hodowli komórkowych zostało niedawno opublikowane przez naszą grupę48. W tej pracy ludzkie miofibroblasty i komórki śródbłonka poddano kombinacji sygnałów kierowania kontaktowego (contact guidance) oraz topografii geometrycznej. In vivo oba typy komórek doświadczają sygnałów związanych z krzywizną i kierowaniem kontaktowym w tkankach natywnych, takich jak naczynia krwionośne człowieka. Poddając komórki in vitro środowisku łączącemu oba te sygnały środowiskowe, można odtworzyć sytuację in vivo, co pozwala na głębsze zrozumienie roli mikrośrodowiska w zachowaniu komórek. Wykazano, że ludzkie miofibroblasty ustawiają się zgodnie z sygnałami kierowania kontaktowego (równoległe linie fibronektyny) na wklęsłych podłożach cylindrycznych48. Jednak na strukturach wypukłych o zwiększającej się krzywiźnie sygnały geometryczne przeważyły nad sygnałami biochemicznymi, co sugeruje, że miofibroblasty potrafią wyczuwać zarówno stopień, jak i znak krzywizny. Co ciekawe, komórki śródbłonka mogły przylegać jedynie do wklęsłych podłoży wielosygnałowych, a nie do wypukłych podłoży z PDMS. Na wklęsłych podłożach z wzorami białkowymi komórki śródbłonka orientują się w kierunku sygnału kierowania kontaktowego. Ta podstawowa wiedza in vitro ma znaczenie fizjologiczne w dziedzinie inżynierii tkanki naczyniowej i może w przyszłości pomóc w projektowaniu inteligentnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Schemat wytwarzania hodowli komórkowej 3D; etapy: przygotowanie chipa PDMS, fotopatronowanie UV i barwienie.
Rycina 1: Harmonogram eksperymentalny stosowania sygnałów prowadzenia kontaktowego na podłożach do hodowli komórkowej 3D. W pierwszej kolejności pozytywne chipy do hodowli komórkowej są wytwarzane z negatywowej formy PDMS zawierającej zestaw geometrii. Nieutwardzony PDMS jest wlewany do formy i utwardzany przez 3 h w temperaturze 65 °C. Następnie PDMS jest poddawany działaniu plazmy O2 i inkubowany z PLL oraz mPEG-SVA (kolor niebieski, oznaczone), aby spasywować powierzchnię podłoża do hodowli komórkowej. Po przemyciu podłoże zostaje odwrócone do góry dnem w kropelce fotoinicjatora (PLPP, kolor zielony, oznaczone) i poddane fotopatronowaniu UV z wykorzystaniem podejścia LIMAP. W tym etapie używana jest maska cyfrowa z zdefiniowanym przez użytkownika wzorem, aby usunąć warstwę pasywacyjną w określonych miejscach. Następnie można przeprowadzić inkubację z roztworem białka (kolor czerwony, oznaczone), który przyłączy się tylko do miejsc, w których usunięto warstwę pasywacyjną. Komórki wysiane na podłożu są poddawane zarówno wzorom geometrycznym, jak i białkowym, co umożliwia badanie zachowania komórek w złożonych środowiskach naśladujących warunki in vivo. Skróty: PDMS = polidimetylosiloksan; mPEG-SVA = metoksypolietylenglikol-sukcynimidylowy walerianian; PLPP = chlorek 4-benzoilbenzylo-trimetyloamoniowy; LIMAP = indukowana światłem molekularna adsorpcja białek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu mikrowytwarzania; forma szklana, chip PDMS, chip do hodowli komórkowej do użytku laboratoryjnego.
Rysunek 2: Różne etapy produkcji i pasywacji podłoża do 3D hodowli komórkowej. Negatywowa forma szklana (#1) została zaprojektowana w programie wspomaganego projektowania komputerowego (CAD) i wykonana przy użyciu techniki bezpośredniego zapisu laserem femtosekundowym. Forma ta służy do wytworzenia pośredniego pozytywowego chipa PDMS (#2) oraz negatywowej formy PDMS (#3), które są następnie wykorzystywane do produkcji końcowego chipa do hodowli komórkowej (#4). Skrót: PDMS = polidimetylosiloksan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat fotolitografii UV: podłoże, laser UV, płaszczyzny ogniskowania, wyniki wzorowania, tworzenie struktury 3D.
Rycina 3: Schematyczny rysunek dwóch metod wzorowania. Po lewej: fotolitografia UV jest wykonywana dla mniejszych elementów (około jednego DMD) przy użyciu pojedynczej płaszczyzny ogniskowania i wzoru. W rezultacie cały element zostaje ukształtowany w jednym kroku. Po prawej: w przypadku zastosowania większych elementów (większych niż jeden DMD), proces wzorowania jest podzielony na wiele płaszczyzn ogniskowania i wzorów. Skrót: DMD = cyfrowe urządzenie lustrzane (digital mirror device). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza wzoru koncentrycznego w mikroskopii; porównanie stanów normalnego i wysuszonego; widoki XY, XZ.
Rycina 4: Typowy przykład normalnego i wysuszonego podłoża inkubowanego z białkiem. Projekcje maksymalnej intensywności (XY) oraz widoki ortogonalne (XZ) normalnego i wysuszonego podłoża inkubowanego z białkiem. Podczas płukania wzorowanego podłoża do hodowli komórek po inkubacji z roztworem białka kluczowe jest, aby próbka zawsze pozostała mokra. Chociaż wzór na elementach jest identyczny na wszystkich obrazach (ĸ = 1/1,000 µm-1), żelatyna-flurorescyna (zielona) zagregowała się, tworząc dużą grudkę, gdy próbka została pozostawiona do wyschnięcia na kilka sekund. Jeśli próbka pozostaje stale mokra, można zaobserwować prawidłowe wzory białkowe. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat kanałów mikroprzepływowych; strzałki wskazują analizę wzorców przepływu cieczy w mikroskopii z czerwonym filtrem.
Rycina 5: Obrazy w polu jasnym po wysianiu. Pierwotne keratocyty (lewo) i fibroblasty skóry właściwej (prawo) 4 h po wysianiu na trójwymiarowe struktury geometryczne (wklęsłe zagłębienie o ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz półcylindry o ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 i 1/125 µm-1). Wstawki w lewym górnym rogu przedstawiają wzór liniowy użyty do formowania geometrii. Białe strzałki wskazują rozprzestrzeniające się komórki, które wykazują już orientację. Paski skali = 250 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzory koncentrycznych pierścieni w mikroskopii fluorescencyjnej; wykres intensywności; wartości κ: 1/250, 1/1,000, 1/3,750 μm⁻¹.
Rycina 6: Charakterystyka wzorów kolistych na wklęsłych wgłębieniach. (A) Projekcja maksymalnej intensywności (XY) oraz widok ortogonalny (XZ) wklęsłego wgłębienia (ĸ = 1/250 µm-1) ustrukturyzowanego za pomocą LIMAP (szerokość linii: 20 µm, szerokość przerwy: 20 µm) i inkubowanego z żelatyną-fluoresceiną (zielony). Profil intensywności wzdłuż białej linii przedstawiono w funkcji odległości, co wykazuje spójną jakość i rozdzielczość wzoru. (B) Dodatkowe ustrukturyzowanie wykonane na wklęsłych wgłębieniach z ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz ĸ = 1/3750 µm-1, wykazujące elastyczność w zakresie cech geometrycznych, które mogą być wykorzystane do ustrukturyzowania. Ponownie zwizualizowano zarówno projekcje maksymalnej intensywności (XY), jak i widoki ortogonalne (XZ). Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna 3D fibronektyny i F-aktyny w macierzy komórkowej do analizy strukturalnej.
Rycina 7: Dane z mikroskopii 3D struktur wzorcowanych. Typowe przykłady materiałów do hodowli komórkowej z wzorowaniem 3D po fotowzorcowaniu i hodowli komórek, wizualizowane za pomocą oprogramowania do renderowania 3D. (A) Wypukły półcylinder z naniesionymi liniami o szerokości 10 µm (rodamina-fibronektyna, czerwony) i przerwami o szerokości 10 µm. Pasek skali = 5 µm. (B) Fibroblasty skóry właściwej barwione na F-aktynę (zielony), hodowane na wklęsłym półcylindrze z naniesionymi liniami o szerokości 20 µm (rodamina-fibronektyna, czerwony) i przerwami o szerokości 20 µm. Pasek skali = 5 µm. (C) Powierzchnia siodłowata z naniesionymi liniami o szerokości 20 µm (rodamina-fibronektyna, czerwony) i przerwami o szerokości 20 µm. Pasek skali = 5 µm. (D) Wklęsły dołek z naniesionymi koncentrycznymi okręgami linii o szerokości 20 µm (żelatyna-fluoresceina, zielony) i przerwami o szerokości 20 µm. Cytoszkielet F-aktynowy ludzkich keratocytów został zabarwiony faloidyną i zwizualizowany na czerwono. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia konfokalna adhezji komórek do fibronektyny; nałożenie kanałów dla F-aktyny, jądra i winkuliny.
Rycina 8: Barwienie immunofluorescencyjne ludzkich fibroblastów skórnych na fotowzorowanym, wklęsłym półcylindrze. (A) Projekcja maksymalnej intensywności (XY) i przekroje ortogonalne (XZ i YZ) ludzkich fibroblastów skórnych hodowanych przez 24 h na wzorowanym (linie fibronektyny, czerwone, szerokość 5 µm i przerwy 5 µm) wklęsłym półcylindrze. Komórki zostały zabarwione na F-aktynę (magenta), winkulinę (zielony) i jądra (niebieski). Pasek skali = 100 µm. (B) Powiększenie komórki przylegającej do środowiska wielostymulującego. Paski skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia poklatkowa przedstawiająca migrację komórek w biofilmie w ciągu 3180 min, seria mikrografii.
Rycina 9: Obrazy poklatkowe w polu jasnym ludzkich fibroblastów skóry na wzorowanym, wklęsłym cylindrze. Wklęsły półcylinder (ĸ = 1/250 µm-1) został wzorowany równoległymi liniami (szerokość 5 µm i odstępy 5 µm) i inkubowany z rodaminą-fibronektyną przed wysianiem komórek. Obrazowanie poklatkowe rozpoczęto 1 h po wstępnym wysianiu komórek (lewo, 0 min), gdy komórki były jeszcze zaokrąglone i nieprzylegały (strzałki). Po około 24 h (środek, 1 420 min) komórki przyległy do podłoża wielostymulującego i wykazują reakcję ustawienia zgodnie ze wzorem prowadzenia kontaktowego. Zarówno reakcja ustawienia, jak i żywotność komórek są utrzymywane przez cały czas trwania hodowli (prawo, 3 180 min). Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wideo 1: Przykład wzoru na cylindrycznym podłożu 3D. Reprezentacja 3D wypukłego cylindra z naniesionym wzorem z rodaminy-fibronektyny (czerwony). Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 2: Reprezentacja 3D fibroblastów skórnych hodowanych na wzorcowanym, cylindrycznym podłożu 3D (ĸ = 1/500 µm-1). Fibroblasty skórne hodowane przez 24 h na wypukłym półcylindrze z naniesionym wzorem (linie z fibronektyny, czerwone, szerokość 10 µm, przerwy 10 µm). Komórki barwione na F-aktynę (magenta), winukulinę (zielony) oraz jądra komórkowe (niebieski). Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 3: Reprezentacja 3D ludzkich keratocytów hodowanych w ustrukturyzowanym zagłębieniu 3D (ĸ = 1/3,750 µm-1). Reprezentacja 3D ludzkich keratocytów hodowanych przez 24 h w wklęsłym, ustrukturyzowanym zagłębieniu (kółka żelatynowe, zielone, o szerokości 20 µm, oraz przerwy 20 µm). Komórki zabarwiono na F-aktynę (czerwony). Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 4: Obrazowanie timelapse w świetle białym ludzkich fibroblastów skóry na wzorcowanym, wklęsłym cylindrze. Wklęsły półcylinder (ĸ = 1/250 µm-1) został wzorcowany równoległymi liniami (szerokość 5 µm i przerwy 5 µm) i inkubowany z rodaminą-fibronektyną przed wysianiem komórek. Obrazowanie timelapse rozpoczęto 1 h po wstępnym wysianiu komórek, gdy wykazały one początkową adhezję do środowiska wielostymulującego. Podczas całego procesu timelapse komórki orientowały się głównie wzdłuż wskazówek przewodnictwa kontaktowego, przy zachowaniu żywotności komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Obecnie zachowanie komórek jest często badane na płaskich podłożach hodowlanych, które nie są tak złożone jak natywne mikrośrodowisko komórki. Jako alternatywę stosuje się środowiska 3D, takie jak rusztowania i hydrożele. Chociaż te środowiska hodowli komórkowych poprawiają przydatność in vivo, zarówno systematyczne badania zachowania komórek, jak i wykonalność metod odczytu pozostają wyzwaniem. Aby systematycznie badać zachowanie komórek na reprezentatywnych podłożach hodowlanych, potrzebne są spójne substraty wielokierunkowe, które pozwalają na odczyt mikroskopowy. Dlatego w tym protokole opisujemy metodę tworzenia wielokierunkowych substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych geometriach i wzorzystych białkach ECM. Głównym wyzwaniem związanym z łączeniem sygnałów środowiskowych, takich jak geometria tkanek i wskazówki kontaktowe, na platformach in vitro, jest w dużej mierze charakter technologiczny. Konwencjonalne metody stosowania wskazówek kontaktowych (np. miękka litografia, wzory w głębokim UV i druk mikrokontaktowy35,36) do materiałów do hodowli komórkowych zostały zoptymalizowane pod kątem podłoży płaskich. Zapotrzebowanie na materiały do hodowli komórkowych 3D w połączeniu ze wskazówkami dotyczącymi kontaktu uwypukliło kilka wyzwań technologicznych, takich jak słabe wyrównanie wzoru, rozdzielczość i elastyczność. Aby sprostać tym wyzwaniom, można zastosować wysokoprzepustową, bezmaskową, opartą na świetle metodę modelowania45,49. W tym przypadku mikroskop optyczny umożliwia precyzyjne wyrównanie wzoru i rozdzielczość rzędu mikrometrów (patrz rysunek 6). Co więcej, zastosowanie maski cyfrowej umożliwia naukowcom badanie zachowania komórek w szerokim zakresie wzorców bez konieczności wytwarzania pracochłonnych masek fizycznych.

Podejście oparte na fotowzorcach UV może być stosowane w połączeniu z różnymi geometriami 3D (np. cylindrami, siodłami, kopułami, dołami) wykonanymi z różnych materiałów48. Substraty do hodowli komórkowych 3D użyte w tym badaniu są wykonane z PDMS; Można jednak użyć również innych materiałów. Może to wymagać różnych etapów w celu wytworzenia końcowego substratu do hodowli komórkowej zawierającego interesujące cechy. Ponieważ wykazano, że komórki są wrażliwe na chropowatość powierzchni materiałów do hodowli komórkowych, ważne jest, aby tworzyć chipy do hodowli komórkowych o gładkiej powierzchni, tak aby odpowiedź obserwowanych komórek można było w pełni przypisać geometrii 3D i wskazówkom naprowadzania kontaktowego50,51. Do pomiaru chropowatości powierzchni można wykorzystać metody pomiarowe, takie jak profilometria optyczna, skaningowa mikroskopia elektronowa lub mikroskopia sił atomowych. Po wytworzeniu materiału do hodowli komórkowej można wybrać metodę modelowania w oparciu o jedną lub wiele płaszczyzn ogniskowych w zależności od konkretnych wymiarów cechy będącej przedmiotem zainteresowania (patrz rysunek 3). Zazwyczaj pojedyncza płaszczyzna ogniskowej jest używana do modelowania obszaru w zakresie Z około 50 μm. Wykazano, że rozdzielczość wzorca jest spójna przy użyciu tej praktycznej reguły (patrz rysunek 6). Jednak wadą tej metody jest wydłużony czas tworzenia wzoru wraz z wprowadzeniem wielu płaszczyzn ogniskowych i wzorów. W naszej dłoni, przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych, cechy geometryczne 3D do 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) zostały z powodzeniem wymodelowane z wysoką jakością wzoru.

Dodatkowo należy wspomnieć, że wysokość (oś Z) elementów geometrycznych, które można wykorzystać w połączeniu z tym protokołem, jest ograniczona. Ponieważ zarówno fotowzorzec UV, jak i wiele odczytów komórkowych opiera się na konfiguracji mikroskopowej, odległość robocza obiektywów określa maksymalną wysokość obiektu. W naszej dłoni geometrie przekraczające wysokość 300 μm mogą być nadal fotowzorcowane promieniami UV, a odczyty zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywami 40x. Dzięki temu możliwe są badania mechanobiologiczne w skali od wewnątrzkomórkowej po komórkową i tkankową przy użyciu opisanego protokołu.

Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest ryzyko wyschnięcia próbek w trakcie lub po fotowzorcowaniu UV49. Jest to szczególnie istotne w przypadku stosowania geometrii 3D, ponieważ wypukłości są często eksponowane poza materiałami do hodowli komórkowych. Jak pokazano na rysunku 4, może to skutkować nierównymi wzorcami z agregatami białkowymi tworzącymi się na szczycie interesującej cechy. Mycie chipów hodowli komórkowej po inkubacji białek i podczas hodowli komórkowej ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego powlekania geometrii 3D. Dlatego zaleca się, aby zawsze pozostawiać małe objętości roztworu roboczego (PBS, PLPP, roztwór białkowy, pożywka do hodowli komórkowych) na wierzchu chipa do hodowli komórkowej.

Do tej pory zastosowano kilka powłok białkowych (fibronektyna, kolagen typu I i IV, żelatyna, FNC) i typów komórek (ludzkie komórki zrębu szpiku kostnego, ludzkie miofibroblasty, ludzkie komórki śródbłonka, ludzkie keratocyty i fibroblasty skóry) w połączeniu z opisanym podejściem do fotowzorcowania na ustrukturyzowanych materiałach do hodowli komórkowych. Jak wykazano w poprzednim badaniu48, optymalizacja parametrów inkubacji białek ma kluczowe znaczenie dla systematycznych badań nad nowymi typami komórek. Dlatego przed wykonaniem nowego eksperymentu z nowymi białkami lub komórkami zaleca się przetestowanie zakresu stężeń białek, temperatur inkubacji i czasów inkubacji. Porównując morfologię komórek po początkowej adhezji na jednorodnych, płaskich obszarach o wzorzystych wzorcach z morfologią komórek w "normalnych" warunkach hodowli komórek, można uzyskać zoptymalizowany zestaw parametrów eksperymentalnych. Dodatkowo, każdy typ komórki może wymagać innej ilości czasu po wysiewie, aby pokazać rozpoznawalną morfologię adhezji w określonym środowisku wielokierunkowym (patrz Rysunek 5). W tym celu kluczowe znaczenie ma optymalizacja czasu wymaganego dla każdego typu ogniwa do przedstawienia zdarzeń kontaktowych na obszarze wzoru podczas prania w kroku 8.4. Na przykład zaobserwowaliśmy, że we wzorcach liniowych ludzkie keratocyty wykazują wydłużone morfologie w ciągu pierwszych 30 minut po wysiewie, podczas gdy komórki śródbłonka i fibroblasty skóry potrzebują wielu godzin, zanim wykażą zmianę morfologii adhezji. Parametry doświadczalne wymagane do inkubacji białek (etap 7) i wysiewu komórek (etap 8) mogą być zatem zależne od wybranego typu białka i komórki.

Przedstawione podejście do stosowania wskazówek dotyczących kontaktu z komputerem w geometriach 3D może pomóc w lepszym zrozumieniu zachowania komórek w złożonych środowiskach wielokierunkowych. Może to obejmować badania składników wewnątrzkomórkowych, takich jak zrosty ogniskowe i jądra, a także może obejmować eksperymenty przeprowadzane na większej, komórkowej lub tkankowej skali przy użyciu proponowanej metody. Ostatecznie oczekuje się, że zdobyta wiedza będzie mogła zostać wykorzystana w projektowaniu zastosowań inżynierii tkankowej, w których złożone środowiska komórkowe są projektowane tak, aby kierować zachowaniem komórek w kierunku pożądanego wyniku.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) za dostarczenie ludzkich pierwotnych keratocytów. Prace te były wspierane przez Chemelot InSciTe (projekt BM3.02); Europejska Rada ds. Badań Naukowych (grant 851960); oraz Ministerstwu Edukacji, Kultury i Nauki za Program Grawitacji 024.003.013 "Regeneracja Sterowana Materiałami". Autorzy chcieliby podziękować firmie Alvéole za korespondencję, pomoc i rozwiązywanie problemów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-winkulinowe, mysi monoklonalny IgG1SigmaV9131Rozcieńczenie: 1/600
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja VRoche10735086001
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianGibco41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)Gibco
DMi8Leica Microsystems
EtanolBiosolve0005250210BS
Płodowa surowica bydlęcaSerana758093
Fidżi/ImageJ, wersja v1.53kwww.imageJ.nih.gov
Fluorescencyjny rozświetlaczStabilo4006381333627
Żelatyna znakowana fluorescynąInvitrogenG13187Stężenie: 0,01%
Roztwór formaldehyduMerckF8775
Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 60 mm, #1VWR631-1575
Szkiełka nakrywkowe, ø = 32 mm, #1Menzel-Glä obiektyw mikroskopowy ser
HCX PL fluotar L 20X/0.40naLeica11506242
HEPESGibco15630080
Ludzkie fibroblasty skóryLonzaCC-2511
Ludzkie pierwotne keratocytyMERLN Instytut Medycyny
Illustrator, wersja 26.0.1Adobe
Piec laboratoryjnyKarbolit
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydratSigma-AldrichA8960
Oprogramowanie Leica Application Suite X, wersja 3.5.7.23225Oprogramowanie Leica Microsystems
Leonardo, wersja 4.16Alvé
Micro-manager, wersja 1.4.23Otwarte obrazowanie
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381medium montażowe
walerianian mPEG-sukcynimidyl MW 5,000 DaLaysan BioMPEG-SVA-5000Stężenie: 50 mg / ml
Negatywna forma szklanaFEMTOprint
Odczynnik NucBlue Live Readyprobes (Hoechst 33342)InvitrogenR376052 krople/ml
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140163
szalka Petriego (ø=100 mm)Greiner Bio-one664160
Phalloidin Atto 647NSigma65906Rozcieńczenie: 1/250
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigmaP4417
Plazma asherEmitechK1050X
PLPP (fotoinicjator)Alvé
Poli-L-lizyna, sterylnie filtrowanaSigma-AldrichP4707Stężenie: 0,01%
PRIMOAlvé
fibronektyna znakowana rodaminąCytoskeletn, Inc.FNR01Stężenie: 10 &mikro; g / ml
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa 488, kozie przeciwciało anty-mysie IgG1 (H)Sondy molekularneA21121Rozcieńczenie: 1/300
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa 555, kozie przeciwciało anty-mysie IgG1 (H)Sondy molekularneA21127Rozcieńczenie: 1/300
Powlekarka wirowaLeurell Technologies Corporationmodel WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDOW1673921
Mikroskop konfokalny TCS SP8XLeica Microsystems
tridekafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilanABCRAB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), bez czerwieni fenolowejGibco12604013
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300054
Mikroskop epifluorescencyjny 10565018 Regeneracyjnej Inspirowanej Technologiąoleoleole

Bibliografia

  1. Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
  2. Viswanathan, P., et al. 3D surface topology guides stem cell adhesion and differentiation. Biomaterials. 52, 140-147 (2015).
  3. Peyton, S. R., et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. Biotechnology and Bioengineering. 108 (5), 1181-1193 (2011).
  4. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  5. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584, 535-546 (2020).
  6. Guido, S., Tranquillo, R. T. A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels. Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence. Journal of Cell Science. 105 (2), 317-331 (1993).
  7. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, 1881-1892 (2003).
  8. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS Nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  9. Buskermolen, A. B. C., et al. Cellular contact guidance emerges from gap avoidance. Cell Reports Physical Science. 1 (5), 100055(2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Cell contact guidance via sensing anisotropy of network mechanical resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (29), 1-11 (2021).
  11. Buskermolen, A. B. C., et al. Entropic forces drive cellular contact guidance. Biophysical Journal. 116 (10), 1994-2008 (2019).
  12. Vignaud, T., et al. Reprogramming cell shape with laser nano-patterning. Journal of Cell Science. 125 (9), 2134-2140 (2012).
  13. Pouthas, F., et al. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. Journal of Cell Science. 121 (14), 2406-2414 (2008).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Théry, M., et al. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19771-19776 (2006).
  16. Huang, G., et al. Functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensional cell microenvironment. Chemical Reviews. 117 (20), 12764-12850 (2017).
  17. Callens, S. J. P., Uyttendaele, R. J. C., Fratila-Apachitei, L. E., Zadpoor, A. A. Substrate curvature as a cue to guide spatiotemporal cell and tissue organization. Biomaterials. 232, 119739(2020).
  18. Yilmaz, C. O., Xu, Z. S., Gracias, D. H. Curved and Folded Micropatterns in 3D Cell Culture and Tissue Engineering. Methods in Cell Biology. 121, Elsevier Inc (2014).
  19. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. Journal of Biomechanics. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  20. Werner, M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Cellular geometry sensing at different length scales and its implications for scaffold design. Materials. 13 (4), 963(2020).
  21. Di Cio, S., Bøggild, T. M. L., Connelly, J., Sutherland, D. S., Gautrot, J. E. Differential integrin expression regulates cell sensing of the matrix nanoscale geometry. Acta Biomaterialia. 50, 280-292 (2017).
  22. Fioretta, E. S., Simonet, M., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Differential response of endothelial and endothelial colony forming cells on electrospun scaffolds with distinct microfiber diameters. Biomacromolecules. 15 (3), 821-829 (2014).
  23. Werner, M., Kurniawan, N. A., Korus, G., Bouten, C. V. C., Petersen, A. Mesoscale substrate curvature overrules nanoscale contact guidance to direct bone marrow stromal cell migration. Journal of The Royal Society Interface. 15 (145), 20180162(2018).
  24. Ruprecht, V., et al. How cells respond to environmental cues - insights from bio-functionalized substrates. Journal of Cell Science. 130 (1), 51-61 (2017).
  25. Bao, M., Xie, J., Huck, W. T. S. Recent advances in engineering the stem cell microniche in 3D. Advanced Science. 5 (1800448), 1-16 (2018).
  26. Zhan, X. Effect of matrix stiffness and adhesion ligand density on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (3), 675-683 (2020).
  27. Jiang, T., et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. 188, 130-143 (2019).
  28. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33, 4460-4468 (2012).
  29. Rape, A. D., Zibinsky, M., Murthy, N., Kumar, S. A synthetic hydrogel for the high-throughput study of cell-ECM interactions. Nature Communications. 6 (8129), 1-9 (2015).
  30. Camarero-Espinosa, S., et al. 3D printed dual-porosity scaffolds: the combined effect of stiffness and porosity in the modulation of macrophage polarization. Advanced Healthcare Materials. 11 (2101415), 1-16 (2022).
  31. Bao, M., et al. Cellular volume and matrix stiffness direct stem cell behavior in a 3D microniche. ACS Applied Materials and Interfaces. 11 (2), 1754-1759 (2019).
  32. Charest, J. L., Eliason, M. T., García, A. J., King, W. P. Combined microscale mechanical topography and chemical patterns on polymer cell culture substrates. Biomaterials. 27, 2487-2494 (2006).
  33. Bilem, I., et al. Interplay of Geometric Cues and RGD/BMP-2 crosstalk in directing stem cell fate. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (10), 2514-2523 (2017).
  34. Nam, K. -H., et al. Multiscale cues drive collective cell migration. Scientific Reports. 6, 29749(2016).
  35. Alom Ruiz, S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  36. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein Micropatterns. A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, Academic Press. (2010).
  37. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  38. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640(2009).
  39. Offenhäusser, A., et al. Microcontact printing of proteins for neuronal cell guidance. Soft Matter. 3 (3), 290-298 (2007).
  40. Ricoult, S. G., Sanati Nezhad, A., Knapp-Mohammady, M., Kennedy, T. E., Juncker, D. Humidified microcontact printing of proteins: universal patterning of proteins on both low and high energy surfaces. Langmuir. 30 (40), 12002-12010 (2014).
  41. Waterkotte, B., et al. Biofunctional Micropatterning of Thermoformed 3D Substrates. Advanced Functional Materials. 24 (4), 442-450 (2014).
  42. Lehnert, D., et al. Cell behaviour on micropatterned substrata: Limits of extracellular matrix geometry for spreading and adhesion. Journal of Cell Science. 117 (1), 41-52 (2004).
  43. Sevcik, E. N., Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. Patterning on topography for generation of cell culture substrates with independent nanoscale control of chemical and topographical extracellular matrix cues. Current Protocols in Cell Biology. 75, 1-25 (2017).
  44. Micropatterning: Surface functionalization. Alvéole. , Available from: https://www.alveolelab.com/technology/micropatterning-surface-functionalization/ (2022).
  45. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  46. van Gaal, R. C., Miltenburg, R. P. R. S., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C., Dankers, P. Y. W. Renal epithelial cell responses to supramolecular thermoplastic elastomeric concave and convex structures. Advanced Materials Interfaces. 8 (1), 2001490(2021).
  47. Foster, J. W., Gouveia, R. M., Connon, C. J. Low-glucose enhances keratocyte-characteristic phenotype from corneal stromal cells in serum-free conditions. Scientific Reports. 5, 1-16 (2015).
  48. Van Der Putten, C., et al. Protein micropatterning in 2.5D: an approach to investigate cellular responses in multi-cue environments. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (22), 25589-25598 (2021).
  49. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).
  50. Hou, Y., et al. Surface roughness gradients reveal topography-specific mechanosensitive responses in human mesenchymal stem cells. Small. 16 (10), 1905422(2020).
  51. Bourkoula, A., et al. Roughness threshold for cell attachment and proliferation on plasma micro-nanotextured polymeric surfaces: The case of primary human skin fibroblasts and mouse immortalized 3T3 fibroblasts. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (30), 304002(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wieloskładnikowe mikrootoczeniamacierz zewnątrzkomórkowawzorowanie białekmikrowytwarzanie podłożyprowadzenie kontaktoweadhezja komórekwzorowanie fibronektynyludzkie fibroblasty skóry właściwej
Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.