Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

In vivo, komórki są poddawane różnorodnym sygnałom środowiskowym, które mogą mieć charakter mechaniczny, fizyczny i biochemiczny, a które pochodzą z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zidentyfikowano liczne sygnały środowiskowe, które odgrywają istotną rolę w regulacji zachowania komórek, takich jak proliferacja, różnicowanie i migracja^1,2,3,4,5. Jednym z najszerzej badanych zjawisk jest naprowadzanie kontaktowe, opisujące ułożenie komórek za pośrednictwem adhezji wzdłuż anizotropowych wzorców biochemicznych lub topograficznych obecnych na podłożu zewnątrzkomórkowym^{6,7,8,9,10,11}. Wykazano, że poza kierowaniem ułożeniem komórek, wskazówki dotyczące kontaktu wpływają również na inne właściwości komórek, takie jak migracja komórek, organizacja białek wewnątrzkomórkowych, kształt komórki i los komórki^12,13,14,15. Dodatkowo, geometryczna architektura środowiska komórkowego 3D została również uznana za jej regulacyjny wpływ na zachowanie komórek^16,17. W ludzkim ciele komórki są wystawione na działanie szeregu zakrzywionych geometrii, począwszy od mikroskalowych włókien kolagenowych, naczyń włosowatych i kłębuszków nerkowych, aż po mezoskalowe pęcherzyki płucne i tętnice^18,19. Co ciekawe, ostatnie badania in vitro wykazały, że komórki mogą wyczuwać i reagować na takie sygnały fizyczne, od nano- do mezoscale^20,21,22,23.

Do tej pory, większość badań nad reakcją komórek na sygnały środowiskowe była w dużej mierze przeprowadzana przy użyciu eksperymentalnych konfiguracji, które izolują pojedyncze sygnały. Chociaż podejście to pozwoliło na ogromny postęp w zrozumieniu podstawowych mechanizmów stojących za komórkowym wykrywaniem sygnałów środowiskowych, słabo podsumowuje środowisko in vivo, które jednocześnie przedstawia wiele wskazówek. Aby wypełnić tę lukę, przydatne jest opracowanie platform kulturowych, za pomocą których wiele sygnałów środowiskowych może być niezależnie i jednocześnie kontrolowanych. Koncepcja ta zyskuje ostatnio coraz większą popularność^24,25, z badaniami łączącymi sztywność matrycy i gęstość liganda^26,27,28,29, sztywność i porowatość podłoża³⁰, sztywność podłoża i objętość mikroniszy 3D³¹, topografia powierzchni i wskazówki dotyczące kontaktu^32,33,34, oraz nanoskalowe wskazówki dotyczące naprowadzania na kontakt z mezoskalowymi wskazówkami dotyczącymi krzywizny²³. Wyzwaniem pozostaje jednak połączenie wskazówek naprowadzania kontaktowego z różnymi geometriami 3D w kontrolowany i wysokowydajny sposób.

Ten protokół badawczy rozwiązuje to wyzwanie i wprowadza metodę tworzenia substratów do hodowli komórkowych z kontrolowaną kombinacją wzorzystych obszarów adhezyjnych białek ECM (wskazówki kontaktowe) i krzywizny substratu (wskazówki geometryczne). Takie podejście pozwala na analizę odpowiedzi komórek w biomimetycznym środowisku wielokierunkowym w sposób systematyczny i wysokoprzepustowy. Zdobyta wiedza może pomóc w lepszym zrozumieniu zachowania komórek w złożonych środowiskach i może być wykorzystana do projektowania materiałów instruktażowych o właściwościach, które kierują odpowiedziami komórek w kierunku pożądanego rezultatu.

3D fotowzorce białek
Tworzenie obszarów adhezyjnych białek ECM (wskazówki kontaktowe) na materiałach do hodowli komórkowych można osiągnąć przy użyciu różnych technik, na przykład poprzez wzory w głębokim ultrafiolecie (głębokim UV) lub druk mikrokontaktowy^35,36. Modelowanie w głębokim promieniowaniu UV wykorzystuje światło UV, które jest emitowane przez maskę na materiał polimerowy w celu degradacji polimerów pasywacyjnych w określonych miejscach na podłożu hodowli komórkowej. Wzorzysty substrat jest następnie inkubowany z interesującym ligandem, w wyniku czego powstają obszary adhezyjne, które wspierają przyczepianie się komórek i hodowlę w predefiniowanych lokalizacjach^12,37,38. Alternatywnym sposobem wprowadzania wzorów białkowych jest druk mikrokontaktowy, w którym stemple elastomerowe zawierające pożądany kształt są powlekane wybranym białkiem i prasowane na podłożu do hodowli komórkowej, przenosząc w ten sposób powłokę białkową, do której komórki mogą przylegać^35,37,39,40. Niestety, ponieważ obie techniki opierają się na przygotowaniu masek i metodach miękkiej litografii, eksperymenty są czasochłonne i pracochłonne, a także ograniczone pod względem elastyczności wzorów. Ponadto zarówno modelowanie w głębokim promieniowaniu UV, jak i druk mikrokontaktowy są najbardziej odpowiednie dla materiałów płaskich i są technicznie trudne, jeśli nie niemożliwe, do modelowania ligandów w środowisku 3D.

Aby ulepszyć te konwencjonalne metody, Waterkotte et al. połączyli litografię bez maski, chemiczne osadzanie z fazy gazowej i termoformowanie, aby wygenerować mikrowzorcowe podłoża polimerowe 3D⁴¹. Jednak technika ta opiera się na wykorzystaniu termoformowalnych folii polimerowych i oferuje niską rozdzielczość wzoru białka (7,5 μm), podczas gdy doniesiono, że komórki reagują na geometryczne wzorce białek tak małe jak 0,1 μm^2,42. Sevcik i in. opisali inną obiecującą metodę nanomodelowania ligandów ECM na podłożach zawierających topografie nano- i mikrometrowe⁴³. Za pomocą druku mikrokontaktowego białka ECM przeniesiono ze stempli polidimetylosiloksanu (PDMS) na termoczułe podłoże z poli(N-izopropylacrylamidu) (pNIPAM). Następnie właściwości termoczułe sieci pNIPAM pozwoliły im przenieść dwuwymiarowy (2D) wzór białka na topograficzne podłoże PDMS (rowki o głębokości 10-100 μm), kontrolując w ten sposób lokalizację miejsc adhezji na cechach topograficznych. Jednak nie wszystkie możliwe mikrotopografie mogą być modelowane, ponieważ problemy ze zmniejszoną zwilżalnością utrudniają modelowanie głębszych podłoży topograficznych. Zgłoszono, że rowy o proporcjach głębokości do szerokości wynoszącym 2,4 stanowią ostateczną granicę pomyślnego przeniesienia wzoru na podłoże topograficzne⁴³. Dodatkowo, elastyczność różnych wzorów i rozdzielczość generowanych wzorów są słabe ze względu na wymóg druku mikrokontaktowego.

Ten artykuł opisuje metodę, która pokonuje wyżej wymienione wąskie gardła i oferuje elastyczną i wysokoprzepustową metodę tworzenia wielokierunkowych substratów, które mogą być użyte do hodowli komórkowej (zobacz Rysunek 1). Fizjologicznie istotne geometrie (cylindry, kopuły, elipsy i powierzchnie siodeł) o krzywiznach w zakresie od ĸ = 1/2500 do ĸ = 1/125 ^μm-1 są wstępnie zaprojektowane i mikrofabrykowane w chipach PDMS. Następnie, na geometriach 3D tworzone są wskazówki kontaktowe przy użyciu różnych cyfrowych projektów wzorów, wykorzystując technikę fotowzorców o rozdzielczości tak małej jak 1,5 μm⁴⁴. W tym celu chipy PDMS są początkowo pasywowane, aby zapobiec przyleganiu komórek i białek; ta warstwa pasywacyjna może być następnie usunięta przez połączenie chlorku 4-benzoilobenzylo-trimetyloamoniowego (PLPP) i ekspozycji na światło UV⁴⁵. Maska cyfrowa ma za zadanie określić miejsca ekspozycji na promieniowanie UV, a tym samym obszar, z którego usuwana jest warstwa pasywacyjna. Białka mogą następnie przylegać do tych obszarów, umożliwiając przyłączanie się komórek. Ponieważ tworzenie wzorów odbywa się za pomocą maski cyfrowej (a nie fizycznej), można szybko tworzyć różnorodne wzory bez kłopotów i kosztów związanych z projektowaniem i wytwarzaniem dodatkowych fotomasek. Ponadto na podłożu można wzorować różnorodną gamę białek ECM (np. kolagen typu I, żelatynę i fibronektynę). Chociaż protokół ten jest wykonywany przy użyciu chipów do hodowli komórkowych wykonanych z PDMS, zasada ta może być zastosowana do każdego innego interesującego materiału⁴⁶.

W badaniach opisanych w tym protokole, użyto pierwotnych ludzkich keratocytów. Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej. Keratocyty pierwotne wyizolowano z resztek tkanek ludzkich zwłok korowo-twardówkowych z operacji keratoplastyki śródbłonka błony Descemeta, które uzyskano z Oddziału Rogówki Centrum Wielotkankowego ETB-BISLIFE (Beverwijk, Holandia) po uzyskaniu zgody najbliższych krewnych wszystkich zmarłych dawców.

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

1. Wytwarzanie substratów do hodowli komórkowych 3D

1. Stwórz szklaną formę negatywową zawierającą wszystkie interesujące Cię cechy, w tym przypadku wykonaną ze szkła przy użyciu techniki bezpośredniego zapisu laserem femtosekundowym (patrz Rysunek 2).
2. Ostrożnie umieść szklaną foremkę do negatywu (#1) na dnie szalki Petriego.
3. Przygotuj prepolimer PDMS, umieszczając pustą stożkową probówkę o pojemności 50 ml na wadze, wytaruj wagę i wlej żądaną ilość bazy z elastomeru silikonowego do probówki.
4. Dodać utwardzacz za pomocą pipety Pasteura tak, aby ostateczny stosunek bazy elastomerowej i utwardzacza wynosił 10:1 (w/w).
5. Dokładnie wymieszaj składniki w stożkowej probówce za pomocą szpatułki.
6. Wirować przy 2 000 × g przez 70 s, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
7. Wlej prepolimer PDMS na wierzch formy ze szkła ujemnego (#1) na szalce Petriego, aby całkowicie ją przykryć.
8. Umieścić szalkę Petriego z ujemną szklaną formą (#1) i prepolimerem PDMS w eksykatorze próżniowym i uruchomić pompę próżniową. Po osiągnięciu próżni odczekaj 5 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki obecne na granicy między powierzchnią formy a prepolimerem PDMS.
9. Usunąć próżnię i wyjąć szalkę Petriego z eksykatora.
10. Prepolimer PDMS utwardzić przez noc w piecu w temperaturze 65 °C.
11. Ostrożnie wyjmij nowo utwardzony dodatni chip PDMS (#2) z formy ze szkła ujemnego (#1), podnosząc krawędzie PDMS za pomocą szpatułki. Jeśli dodatni chip PDMS ma tendencję do przyklejania się do ujemnej formy szklanej , dodaj etanol lub wodę do krawędzi odcisku podczas podnoszenia.
    UWAGA: Płyn będzie przepływał między dwiema warstwami i ułatwi oddzielenie ujemnej formy szklanej (#1) i dodatniego chipa PDMS (#2).
12. Za pomocą ostrza odetnij boki dodatniego chipa PDMS (#2), tak aby pozostał prostokątny chip.
13. Umieścić dodatni chip PDMS w eksykatorze obok małej fiolki z kroplą tridekafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilanu, środka silanizacyjnego, i pozostawić na noc w próżni.
    UWAGA: Silanizacja zapewni, że nadruk nie będzie wiązał się z innymi warstwami PDMS w dalszej części protokołu. Inne środki i/lub metody silanizacji mogą również działać, aby zapewnić, że powierzchnie chipów PDMS nie będą przyklejać się do innych warstw PDMS.
    UWAGA: Tridekafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilan jest łatwopalny (H226) i powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu (H314). Nosić środki ochrony osobistej, pracować pod wyciągiem i dokładnie umyć ręce po użyciu. Środek silanizacyjny należy trzymać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskier, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Przechowywać w temperaturze od 15 do 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
14. Usuń próżnię i umieść dodatni chip PDMS (#2) na dnie szalki Petriego. Wlej prepolimer PDMS (10:1) na wierzch, aby wytworzyć wiele ujemnych form PDMS (#3).
15. Umieścić szalkę Petriego pod próżnią w eksykatorze na 15 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki.
16. Utwardzić prepolimer PDMS w temperaturze 65 °C przez noc, po czym ujemną formę PDMS (#3) można oderwać od dodatniego chipa PDMS (#2) za pomocą szpatułki.
17. Sylizanizować końcową ujemną pleśń PDMS (#3) za pomocą środka silanizacyjnego w eksykatorze próżniowym przez noc.
18. Wytworzyć wiele chipów do hodowli komórkowych (#4, patrz Rysunek 2) o grubości około 5 mm, wlewając prepolimer PDMS do ujemnej formy PDMS , usuwając pęcherzyki za pomocą eksykatora i utwardzając przez 3 godziny w temperaturze 65 °C. Za pomocą żyletki przytnij wiór do ostatecznego rozmiaru, jak pokazano na Rysunek 2. Przechowuj frytki w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Chropowatość powierzchni może wpływać na odpowiedź komórkową. W razie potrzeby dodatkowa cienka warstwa PDMS może być użyta jako powłoka na dodatnim chipie PDMS (#2) w celu wygładzenia powierzchni. W tym celu należy wlać niewielką kropelkę prepolimeru PDMS na chip i rozprowadzić ją po całym chipie za pomocą sprężonego powietrza. Utwardzić pokryty wiór w temperaturze 65 °C przez 3 godziny i kontynuować krok 1.12.

2. Wytwarzanie płaskich próbek PDMS (próbki kontrolne)

1. Przygotować prepolimer PDMS (10:1) zgodnie z krokami 1.3-1.6.
2. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na zaokrąglonym słupku próżniowym na środku powlekarki wirowej.
3. Włącz podciśnienie, aby przymocować szklane szkiełko nakrywkowe do urządzenia i odpipetuj kroplę PDMS na środku szkiełka nakrywkowego za pomocą pipety Pasteura.
4. Rozprowadzić prepolimer PDMS na podłożu szklanym zgodnie z następującym protokołem, aby uzyskać warstwę o grubości około 10 μm.
   1. Wirowanie przez 10 s przy 0,45 × g, przyspieszenie: 0,2 × g/s.
   2. Spincoat przez 50 s przy 44,8 × g, przyspieszenie: 0,54 × g/s.
5. Wyłącz próżnię, usuń szkiełko nakrywkowe z wirówki za pomocą pęsety i umieść je na szalce Petriego. Utwardzić PDMS przez noc w piekarniku w temperaturze 65 °C, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej.

3. Pasywacja substratów 3D do hodowli komórkowych

1. Aktywuj grupy hydroksylowe na powierzchni chipa PDMS (#4) za pomocą plazmy_O2. Za pomocą pęsety umieść chip w koszu ashera plazmowego.
2. Uruchom cykl spopielania z mocą 20 W przez 30 s. Odpowietrz komorę spopielania za pomocą N₂.
3. Wyjmij chip z koszyka i umieść go w małym pojemniku PDMS (patrz Rysunek 1).
4. Za pomocą pipety Pasteura dodaj 500 μl poli-L-lizyny (PLL, 0,01%) na wierzch chipa, tak aby cała powierzchnia była zanurzona w roztworze PLL. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć 450 μl PLL z chipa hodowli komórkowej za pomocą pipety i trzykrotnie przepłukać powierzchnię chipa 500 μl 0,1 M buforu HEPES (pH 8 < < 8,5). Zawsze pozostawiaj niewielką objętość płynu na chipie PDMS, aby uniknąć wyschnięcia próbki, co obniży końcową jakość wzoru.
6. Przygotować 500 μl walerianianu glikolu metoksypolietylenowego i sukcynimidylu o stężeniu 50 mg/ml (mPEG-SVA; MW 5 000 Da) w 0,1 M buforze HEPES (8 < pH < 8,5) na chip do hodowli komórkowej i pozostawić do inkubacji na próbce przez 60 minut. Ponieważ okres półtrwania mPEG-SVA wynosi 15 minut, należy przygotować wymaganą ilość leku tuż przed użyciem.
   UWAGA: mPEG-SVA rozpuszcza się, gdy roztwór jest całkowicie przezroczysty.
7. Usunąć 450 μl roztworu mPEG-SVA za pomocą mikropipety i przemyć powierzchnię chipa pięciokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Upewnij się, że pipetujesz w górę i w dół wiele razy podczas prania, aby upewnić się, że wszystkie niezwiązane mPEG-SVA zostały usunięte. Aby zapobiec wysychaniu próbki, należy zminimalizować czas między etapami mycia i upewnić się, że do mycia używa się nadmiaru (500 μl lub więcej) PBS.
8. Przechowuj próbki, zanurzając je w PBS lub przejdź do etapu tworzenia wzoru protokołu.
   UWAGA: W razie potrzeby pasywację można przeprowadzić w sterylnych warunkach podczas pracy w komorze hodowlanej oraz pracy ze sterylnymi roztworami i sprzętem.

4. Przechowywanie wzorzystych substratów do hodowli komórkowych

UWAGA: Substraty 3D do hodowli komórkowych mogą być przechowywane na różnych etapach procesu.

1. Utwardzone chipy hodowli komórkowych PDMS należy przechowywać w suchych warunkach w temperaturze pokojowej.
2. Przechowuj pasywowane chipy hodowli komórkowej na jeden z tych dwóch sposobów:
   1. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 7 dni.
   2. Przechowywać w suchych warunkach do kilku miesięcy. Aby uzyskać suche próbki, należy usunąć PBS i kilkakrotnie przepłukać wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O). Wysuszyć suszarką za pomocą pistoletu do wydobycia azotu lub wiatrówki.

5. Projektowanie masek cyfrowych używanych do fotomodelingu

UWAGA: Wzorowanie podłoży 3D może być wykonywane przy użyciu jednej lub wielu płaszczyzn ogniskowych (zobacz Rysunek 3). Pojedyncza płaszczyzna ogniskowej może być używana na obiektach, które nie są większe niż jedno cyfrowe urządzenie lustrzane (DMD, około 300 μm x 500 μm) i które nie są zbyt wysokie (50-100 μm). W takim przypadku należy zaprojektować wzór cyfrowy w trybie TIFF. W przypadku elementów, które przekraczają wymiary jednego DMD i są stosunkowo wysokie, należy podzielić wzór podłoża na wiele etapów. W tym przypadku wiele wzorów jest projektowanych przy użyciu trybu PDF, w którym każdy indywidualnie skupia się na jednej płaszczyźnie ogniskowej.

1. Zaprojektuj cyfrową maskę za pomocą narzędzi do projektowania.
   1. Wzorzec w trybie TIFF (piksele): Utwórz całkowicie obszar roboczy o wymiarach 1 140 x 1 824 pikseli (dokładny rozmiar 1 DMD, około 300 μm x 500 μm) i wypełnij obszar roboczy interesującymi Cię kształtami. Eksportuj obszar roboczy jako 8-bitowy plik TIFF.
      UWAGA: Różne poziomy szarości w projekcie wzoru określają stopień ekspozycji, który zostanie wykonany w tym miejscu.
   2. Wzorzec w trybie PDF (jednostki metryczne): Utwórz obszar roboczy o żądanym rozmiarze w mm i wypełnij obszar roboczy dowolnym kształtem, który Cię interesuje. Podziel wzór na wiele plików, jeśli podłoże 3D musi być wymodelowane przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych. Zapisz obszar roboczy jako plik PDF.
      UWAGA: Różne poziomy szarości w projekcie wzoru określają stopień ekspozycji, który zostanie wykonany w tym miejscu.

6. Fotowzorce UV substratów do hodowli komórkowych 3D

1. Kalibracja
   UWAGA: Kalibracja lasera jest wykonywana w celu uzyskania właściwej ostrości na interesującym nas materiale. Ponieważ substraty do hodowli komórkowych PDMS są zbyt grube, aby można było przez nie przebić się, należy użyć szklanego szkiełka, na którym chip umieszcza się do góry nogami. Ponieważ laser najpierw styka się ze szkiełkiem, użyj szkła do kalibracji lasera.
   1. Nałóż fluorescencyjny zakreślacz na szklane szkiełko nakrywkowe i umieść szklane szkiełko nakrywkowe w stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Upewnij się, że podświetlona powierzchnia jest skierowana do góry.
   2. Włącz mikroskop i sprzęt PRIMO i otwórz Micro-manager, aby uzyskać dostęp do oprogramowania Leonardo w sekcji "wtyczki".
   3. Wybierz Kalibracja w menu początkowym, a następnie wybierz obiektyw 20x zarówno w mikroskopie, jak i w oprogramowaniu. Kliknij Dalej.
   4. Umieść szklane szkiełko z fluorescencyjnym zakreślaczem w torze optycznym mikroskopu. Przełącz się w tryb fluorescencyjny i ostrożnie ustaw ostrość na wyświetlonym obrazie PRIMO, upewniając się, że zarówno logo, jak i tekst są ostre. Kliknij przycisk Dalej, aby zakończyć procedurę kalibracji.
   5. Zapisz położenie Z stolika podczas kalibracji i użyj tego położenia jako odniesienia w dalszej części protokołu.
      UWAGA: Materiał kalibracyjny powinien być zgodny z materiałem, który jest używany do tworzenia wzorów w dalszej części protokołu. Powyższe kroki opisują kalibrację potrzebną dla substratów do hodowli komórkowych. W celu kalibracji płaskich próbek kontrolnych PDMS nałóż fluorescencyjny zakreślacz na dodatkową płaską próbkę PDMS i skalibruj, wykonując kroki 6.1.2-6.1.5.
2. Tworzenie wzoru elementów 3D przy użyciu pojedynczej płaszczyzny ogniskowej
   UWAGA: Tworzenie wzoru przy użyciu pojedynczej płaszczyzny ogniskowej jest wykonywane na elementach 3D, które nie przekraczają wymiarów jednego DMD (około 300 μm x 500 μm). Schemat układu płaszczyzny ogniskowej jest zilustrowany na Rysunek 3.
   1. Zdjąć szkiełko kalibracyjne ze stolika i umieścić w nim szklane szkiełko zawierające kroplę (~50 μL) fotoinicjatora (PLPP).
      UWAGA: PLPP działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę (R36-38). Nosić środki ochrony osobistej, trzymać je z dala od materiałów wybuchowych, nigdy nie dolewać wody do tego produktu, podjąć środki ostrożności przeciwko wyładowaniom elektrostatycznym oraz unikać wstrząsów i tarcia (S26-36).
   2. Umieść substrat do hodowli komórkowej PDMS do góry nogami w kropli fotoinicjatora. Upewnij się, że cechy 3D na powierzchni podłoża do hodowli komórkowej są skierowane w stronę szkiełka i są całkowicie zanurzone w PLPP, aby zapewnić prawidłowe wzory.
   3. Wybierz Wzór w oprogramowaniu.
   4. Przełącz się w tryb jasnego pola w mikroskopie i przesuń stolik do interesującej Cię funkcji.
   5. Skoncentruj się odpowiednio na górze lub na dole wypukłych i wklęsłych struktur (Rysunek 3).
   6. Wybierz PRIMO, aby wstawić wybrany wzór. Obserwuj podgląd wzoru w kolorze pomarańczowym na górze obrazu w jasnym polu na żywo.
   7. Dostosuj ustawienia wzoru zgodnie z funkcją (lokalizacja, kąt, powtórzenia) i wybierz dawkę 1,000 mJ/mm².
   8. Kliknij Zablokuj i przełącz mikroskop w tryb fluorescencyjny.
   9. Kliknij przycisk Odtwórz w prawym dolnym rogu ekranu, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Po zakończeniu obserwuj wzór wyświetlany na zielono.
   10. Po zakończeniu wszystkich funkcji na chipie do hodowli komórkowej wyjąć chip z szkiełka do modelowania i przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.
3. Tworzenie wzoru elementów 3D przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych
   UWAGA: Tworzenie wzorów przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych jest wykonywane na elementach 3D, które są większe niż jeden DMD (około 300 μm x 500 μm) lub są stosunkowo wysokie. W takim przypadku cechy 3D muszą być narysowane w wielu krokach, co oznacza, że projekt wzoru powinien być dostosowany zgodnie z przykładem w Rysunek 3.
   1. Zdjąć szkiełko kalibracyjne ze stolika i umieścić w stoliku szklane szkiełko zawierające kroplę (~50 μl) fotoinicjatora (PLPP).
   2. Umieść chip do hodowli komórkowej PDMS do góry nogami w kropli fotoinicjatora za pomocą pęsety.
   3. Wybierz Wzór w oprogramowaniu. Przełącz się w tryb jasnego pola w mikroskopie i przesuń stolik do interesującej Cię funkcji.
   4. Skoncentruj się na obszarze chipa we właściwym miejscu. Ponieważ tworzenie wzoru odbywa się w jednej płaszczyźnie ogniskowej, a cechy są większe niż pojedynczy DMD, należy użyć wielu płaszczyzn ogniskowych, a tym samym wielu rund wzoru na podłoże 3D, aby zapewnić wystarczającą rozdzielczość wzoru na całej wysokości i szerokości elementu (patrz Rysunek 3). Na przykład w przypadku obiektu o wysokości 150 μm należy utworzyć wzór obiektu w trzech okrążeniach (± 1 płaszczyzna ogniskowej na 50 μm ruchu Z), skupiając się na około 25 μm, 75 μm i 125 μm od dołu obiektu. Upewnij się, że dolna krawędź obiektu znajduje się wokół wartości zapisanej w kroku 6.1.5.
   5. Wybierz PRIMO, aby wstawić wybrany wzór. Obserwuj podgląd wzoru pokazany na pomarańczowo na górze obrazu w jasnym polu na żywo.
   6. Dostosuj ustawienia wzoru zgodnie z funkcją (lokalizacja, kąt) i wybierz dawkę 1,000 mJ/mm².
   7. Kliknij Zablokuj i przełącz mikroskop w tryb fluorescencyjny.
   8. Kliknij przycisk Odtwórz w prawym dolnym rogu ekranu, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Po zakończeniu obserwuj wzór wyświetlany na zielono.
   9. Powtórz kroki 6.3.4-6.3.8 dla interesującej cechy, gdy używanych jest wiele płaszczyzn ogniskowych.
   10. Po zakończeniu wszystkich funkcji na chipie do hodowli komórkowej, wyjmij chip ze szkiełka modelarskiego i przechowuj go w PBS w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: W razie potrzeby zastosuj fotomodelowanie UV w sterylnych warunkach, korzystając z szalek Petriego ze szklanym dnem i przygotuj wszystkie podłoża w sterylnych szafkach hodowlanych. Wzorzyste próbki należy przechowywać w PBS przez okres do kilku tygodni. Po umyciu ddH₂O i wysuszeniu przy użyciu sprężonego powietrza próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do kilku miesięcy.

7. Inkubacja białek

UWAGA: Zaleca się używanie świeżo inkubowanych białek substratów do hodowli komórek. Przejdź do tej części protokołu tylko wtedy, gdy wysiewanie komórek (krok 8) zostanie wykonane bezpośrednio po nim.

1. Przenieś wzorzysty chip do hodowli komórkowej do sterylnych pojemników PDMS w komorze hodowlanej.
2. Wzorzyste chipy hodowli komórkowej przemyć 3x nadmiarem sterylnego PBS, jeśli wzór nie został wykonany w sterylnych warunkach.
3. Przygotuj świeży roztwór białka w PBS.
   1. Fibronektyna: dodać 2 ml PBS za pomocą mikropipety do fiolki zawierającej 20 μg fibronektyny znakowanej rodaminą, aby uzyskać stężenie 10 μg/ml. Delikatnie pipetować, aby uniknąć tworzenia się grudek białka i chronić przed światłem.
   2. Żelatyna: rozmrozić 200 μl podwielokrotności rozpuszczonej żelatyny fluoresceinowej. Chronić przed światłem.
4. Dodać 200-500 μl roztworu białkowego do chipa do hodowli komórkowej za pomocą mikropipety. Dostosuj czas inkubacji i temperaturę w zależności od wybranego białka: Fibronektyna: 5 min w temperaturze pokojowej, Żelatyna: 15 min w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że próbka jest przykryta (np. folią aluminiową).
5. Usunąć roztwór białkowy i przemyć 5x 500 μl sterylnego PBS. Upewnij się, że pipetujesz PBS w górę i w dół wiele razy powyżej wszystkich istotnych cech chipa do hodowli komórkowej, aby usunąć wszelkie niezwiązane białka.
   UWAGA: Podczas etapów mycia ważne jest, aby próbka nigdy nie wyschła. Podczas usuwania roztworu białka lub PBS podczas mycia, należy natychmiast dodać nowy PBS, aby zapobiec tworzeniu się grudek białka (patrz Rysunek 4). Elementy wypukłe są szczególnie wrażliwe na wysychanie, ponieważ są wyniesione ponad powierzchnię podłoża.
6. Opcjonalnie: przejrzyj wzorce białek pod mikroskopem fluorescencyjnym. Próbki należy przechowywać w stanie sterylnym i zanurzonym w PBS.

8. Rozsiewanie komórek

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje ludzkie pierwotne keratocyty i ludzkie fibroblasty skórne. Keratocyty zostały pobrane z ludzkiej tkanki rogówki od pacjentów, zgodnie z holenderskimi wytycznymi dotyczącymi wtórnego wykorzystania materiałów, i wcześniej scharakteryzowane jako keratocyty⁴⁷. Komórki te są hodowane w DMEM uzupełnionym 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną/streptomycyną (P / S) i 1 mM hydratem soli seskwimagnezowej kwasu L-askorbinowego 2-fosforanu (witamina C) w temperaturze 37 °C przez maksymalnie cztery pasaże. Ludzkie fibroblasty skóry zakupiono i hodowano w DMEM uzupełnionym o 10% FBS i 1% P/S w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 15 pasaży. Do wysiewu zarówno keratocytów, jak i fibroblastów skóry na chipie do hodowli komórkowej z fotowzorcem, użyto 20 000 komórek na chip.

1. Odłącz interesujące komórki (np. za pomocą trypsyny) i przygotuj 1 ml zawiesiny komórek ± 10 000-50 000 komórek/ml w pożywce hodowlanej na chip. Dostosuj dokładną liczbę komórek dodawanych na podłoże w zależności od rozmiaru komórki i żądanego odczytu.
2. Usunąć PBS z chipa do hodowli komórkowej i dodać 1 ml zawiesiny komórkowej.
3. Delikatnie przetransportować chip do hodowli komórkowej wraz z komórkami do inkubatora i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
4. Sprawdź przyczepność komórek na wzorzystym chipie do hodowli komórkowej pod mikroskopem jasnego pola. Szukaj wydłużonych morfologii komórek w przypadku wzorów linii (patrz Rysunek 5). Jeśli komórki zaczęły również przylegać poza wzorzystym obszarem, usuń je, pipetując pożywkę w górę i w dół bezpośrednio nad komórkami na podłożu.
   UWAGA: Komórki dołączone do obszaru z wzorem pozostaną dołączone, podczas gdy komórki poza obszarami z wzorem zostaną odłączone.
5. Wyjmij chip do hodowli komórkowej z pojemnika PDMS i za pomocą sterylnej pęsety umieść go na 6-dołkowej płytce wypełnionej ~5 ml pożywki hodowlanej.
6. Hoduj komórki przez żądany okres czasu. Pożywkę do hodowli komórkowych należy wymieniać co 2-3 dni. Aby zapewnić wizualizację wzoru białka po hodowli komórkowej, należy zmniejszyć ekspozycję próbki na światło podczas hodowli.

9. Barwienie, akwizycja i analiza obrazu

1. Utrwalanie i barwienie
   1. Po pożądanej długości hodowli usuń prawie całe podłoże i trzykrotnie przemyj nadmiarem PBS. Następnie inkubuj z 3,7% formaliną przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy etapy mycia z PBS przez 5 minut na pranie w temperaturze pokojowej. Nigdy nie pozwól, aby próbka wyschła.
      UWAGA: Formalina jest szkodliwa w przypadku połknięcia lub wdychania (H302, H332), może powodować reakcję alergiczną skóry (H317), podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne (H341) i może powodować raka (H350). Nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.
   2. Wybarwić substrat do hodowli komórkowych pożądanymi środkami barwiącymi lub przeciwciałami. Aby zmniejszyć objętość środków barwiących, umieść chipy hodowli komórkowej do góry nogami w kropli roztworu barwiącego pipetowanej na szkiełku podstawowym.
   3. Próbki należy przechowywać w PBS (krótkoterminowo) lub przymocować do szkiełka nakrywkowego za pomocą podłoża montażowego (długotrwale) w temperaturze 4 °C.
2. Akwizycja obrazu
   1. Umieść wybarwioną próbkę do góry nogami w kropli PBS na szkiełku podstawowym. Umieścić próbkę w stoliku mikroskopu konfokalnego.
   2. W zależności od wymaganego poziomu szczegółowości należy wykonać stosy Z z odpowiednim obiektywem (10x, 20x lub 40x) i odstępami Z, aby zapewnić prawidłową akwizycję obrazu.
3. Analiza i wizualizacja obrazu
   1. Otwórz pliki obrazów RAW w oprogramowaniu do analizy obrazu i sprawdź, czy właściwości obrazu (np. wymiary, rozdzielczość) są poprawne.
   2. W razie potrzeby dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału.
   3. Przytnij obszar zainteresowania zawierający wzór i komórki.
   4. Opcjonalnie: w razie potrzeby wykonaj krok dekonwolucji.
   5. Utwórz render 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do renderowania 3D.
   6. Zoptymalizuj ustawienia kontrastu i wzmocnienia dla każdego kanału.
   7. Aby utworzyć obraz renderingu 3D, utwórz migawkę i wyeksportuj jako plik . Plik TIFF.
   8. Aby utworzyć film na podstawie renderingu 3D, ustaw klatkę początkową i końcową, a także ramkę czasową przed zarejestrowaniem filmu. Eksportuj jako .avi.

Za pomocą opisanego protokołu, substraty do hodowli komórkowych 3D PDMS mogą być fotomodelowane UV, aby stworzyć precyzyjne i wysokoprzepustowe obszary kleju odpowiednie do przyłączenia komórek. W ten sposób komórki są poddawane jednocześnie działaniu zarówno odpowiednich geometrii substratów, jak i adhezyjnych wzorów ligandów. Właściwości komórek, takie jak orientacja, obszar komórki i liczba zrostów ogniskowych, można łatwo monitorować i wykorzystywać do lepszego zrozumienia zachowania komórek w złożonych środowiskach podobnych do vivo.

Aby zweryfikować zdarzenia wzorcowe na podłożach 3D PDMS, skład powierzchni atomowej materiału na różnych etapach protokołu został zmierzony za pomocą atomowej spektroskopii fotoelektronów rentgenowskich (XPS)48. Podsumowując, pomiary XPS wykazały obecność łańcuchów PEG o zwiększonym sygnale węglowym na pasywowanych próbkach, który został zmniejszony po fotowzorcowaniu. Inkubacja z fibronektyną spowodowała wzrost sygnału węglowego, co ponownie wskazuje na udaną adhezję białka na powierzchni chipa hodowli komórkowej. Następnie, rozdzielczość wzoru i wyrównanie na elementach 3D zostały scharakteryzowane na różnych wklęsłych wgłębieniach w kształcie okręgu (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1,000 μm-1 i ĸ = 1/3,750 μm-1, patrz Rysunek 6). Z projekcji maksymalnej intensywności można wywnioskować, że wzór białka został z powodzeniem wzorowany na wszystkich trzech cechach 3D. Profil intensywności w Rysunek 6A pokazuje wysoką rozdzielczość wzoru z ostrymi przejściami między obszarami wzorzystymi i niewzorzystymi. Dodatkowo uzyskano stałą intensywność białka w całym schemacie w jamie.

Wklęsły dół z ĸ = 1/250 μm-1 został wykonany metodą pojedynczej płaszczyzny ogniskowej (jeden wzór), podczas gdy wgłębienia z ĸ = 1/1,000 μm-1 i ĸ = 1/3,750 μm-1 zostały utworzone przy użyciu odpowiednio dwóch i trzech płaszczyzn ogniskowych (wzorów). Jak widać w projekcjach maksymalnej intensywności w Rysunek 6, obie metody skutkują idealnym wyrównaniem wzorców na wierzchu cech. Nie można zaobserwować nierównych przejść między dwiema różnymi płaszczyznami ogniskowymi i wzorami.

Korzystając z opisanego protokołu, szeroki zakres wzorów białek może być stosowany do różnych geometrii (zobacz Rysunek 7 i Wideo 1). Aby zilustrować wszechstronność tej metody, półcylindry (wypukłe i wklęsłe), powierzchnia siodła i wgłębienie zostały ukształtowane za pomocą linii i okręgów o różnych szerokościach. Materiały fotowzorzyste mogą być następnie wykorzystane do hodowli komórkowej (patrz Rysunek 7, Rysunek 8, Wideo 2, Wideo 3 i Wideo 4). Przykład fibroblastów skórnych hodowanych na wklęsłym wklęsłym półcylindrze (linie fibronektyny, czerwone, 5 μm szerokości i 5 μm) szczelinach jest pokazany w Rysunek 8, Rysunek 9 i Wideo 4. Podczas eksperymentu komórki wyczuwają i przylegają do substratu z wielu kultur komórkowych i pozostają żywotne w czasie. Jak widać z barwienia immunofluorescencyjnego w Ryc. 8, komórki tworzą zrosty ogniskowe (klastry winkuliny) głównie na liniach fibronektyny.

Kolejny przykładowy badanie z wykorzystaniem tych materiałów do hodowli komórkowych zostało niedawno opublikowane przez naszą grupę48. W tym badaniu ludzkie miofibroblasty i komórki śródbłonka poddano kombinacji wskazówek kontaktowych i topografii geometrycznych. In vivo oba typy komórek doświadczają wskazówek dotyczących krzywizny i kontaktu w tkankach natywnych, takich jak ludzkie naczynia krwionośne. Poddając komórki in vitro środowisku, które łączy w sobie oba sygnały środowiskowe, można podsumować sytuację in vivo, zapewniając głębsze zrozumienie roli mikrośrodowiska w zachowaniu komórek. Wykazano, że ludzkie miofibroblasty są zgodne ze wskazówkami kontaktowymi (równoległe linie fibronektyny) na wklęsłych cylindrycznych podłożach48. Jednak w przypadku wypukłych struktur o rosnących krzywiznach wskazówki geometryczne przeważały nad wskazówkami biochemicznymi, co sugeruje, że miofibroblasty mogą wyczuwać zarówno stopień, jak i znak krzywizny. Co ciekawe, komórki śródbłonka mogły przylegać tylko do wklęsłych podłoży wielokierunkowych, a nie do wypukłych substratów PDMS. Na wklęsłych, białkowych podłożach komórki śródbłonka są zorientowane w kierunku sygnału naprowadzania kontaktowego. Ta podstawowa wiedza in vitro ma znaczenie fizjologiczne w dziedzinie inżynierii tkanki naczyniowej i może ostatecznie pomóc w projektowaniu inteligentnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Rysunek 1: Eksperymentalny harmonogram stosowania wskazówek kontaktowych na podłożach 3D do hodowli komórkowych. Po pierwsze, dodatnie chipy do hodowli komórkowych są wytwarzane z ujemnej formy PDMS zawierającej szereg geometrii. Nieutwardzony PDMS wlewa się do formy i utwardza przez 3 godziny w temperaturze 65 °C. Następnie PDMS poddaje się działaniu osoczaO2-C i inkubuje z PLL i mPEG-SVA (niebieskie, znakowane) w celu pasywacji powierzchni substratu do hodowli komórkowej. Po umyciu podłoże jest odwracane do góry nogami w kropli fotoinicjatora (PLPP, zielone, oznakowane) i fotowzorcowane UV przy użyciu podejścia LMAP. W tym przypadku maska cyfrowa ze wzorem zdefiniowanym przez użytkownika jest używana do rozszczepiania warstwy pasywacji w określonych miejscach. Następnie roztwór białkowy (czerwony, znakowany) może być inkubowany i będzie przylegał tylko do miejsc, w których usuwana jest warstwa pasywacyjna. Komórki wysiane na podłożu poddawane są zarówno geometrii, jak i wzorcom białkowym, co umożliwia badania nad zachowaniem komórek w złożonych, naśladujących in vivo środowiskach. Skróty: PDMS = polidimetylosiloksan; mPEG-SVA = walerianian glikolu metoksypolietylenowego i sukcynimidylu; PLPP = chlorek 4-benzoilobenzylotrimetyloamoniowy; LIMAP = indukowana światłem adsorpcja molekularna białek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Różne etapy produkcji i pasywacji substratu do hodowli komórkowych 3D. Forma ze szkła negatywowego (#1) została zaprojektowana za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo i wyprodukowana przy użyciu techniki bezpośredniego zapisu laserem femtosekundowym. Ta forma jest wykorzystywana do produkcji pośredniego dodatniego chipa PDMS (#2) i ujemnej formy PDMS (#3), które są następnie wykorzystywane do produkcji końcowego chipa do hodowli komórkowej (#4). Skrót: PDMS = polidimetylosiloksan. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematyczna ilustracja dwóch metod tworzenia wzorów. Po lewej: Fotomodelowanie UV jest wykonywane na mniejszych obiektach (około jednego DMD) przy użyciu pojedynczej płaszczyzny ogniskowej i wzoru. W rezultacie, cała funkcja jest wzorowana za jednym razem. Po prawej: Gdy używane są większe obiekty (większe niż jeden DMD), wzór jest podzielony na wiele płaszczyzn ogniskowych i wzorów. Skrót: DMD = cyfrowe urządzenie lustrzane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Typowy przykład normalnego i wysuszonego substratu inkubowanego przez białko. Projekcje o maksymalnej intensywności (XY) i widoki ortogonalne (XZ) normalnych i wysuszonych substratów inkubowanych z białkami. Podczas mycia wzorzystego podłoża do hodowli komórkowej po inkubacji roztworem białkowym, ważne jest, aby próbka była zawsze mokra. Chociaż wzór jest identyczny na wszystkich obrazach na cechach (ĸ = 1/1 000 μm-1), żelatyna-fluoresceina (zielona) agregowała się, tworząc dużą grudkę, gdy próbkę pozostawiono do wyschnięcia na kilka sekund. Jeśli próbka zawsze pozostaje mokra, można zaobserwować prawidłowe wzorce białek. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Obrazy jasnego pola po zasianiu. Keratocyty pierwotne (po lewej) i fibroblasty skóry (po prawej) 4 godziny po wysiewie na cechach geometrycznych 3D (wklęsły dół ĸ = 1/1,000 μm-1 i półcylindry ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 i 1/125 μm-1). Wkładki w lewym górnym rogu reprezentują wzór linii używany do tworzenia wzoru geometrii. Białe strzałki wskazują rozlewiska komórki, które są już wyrównane. Podziałka = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Charakterystyka kolistych wzorów na wklęsłych wgłębieniach. (A) Projekcja o maksymalnej intensywności (XY) i widok ortogonalny (XZ) wklęsłego dołu (ĸ = 1/250 μm-1) wzorowanego przy użyciu LIMAP (szerokość linii: 20 μm, szerokość szczeliny: 20 μm) i inkubowanego z żelatyną-fluoresceiną (zielony). Profil intensywności wzdłuż białej linii jest wykreślany w stosunku do odległości, co pokazuje spójną jakość i rozdzielczość wzoru. (B) Dodatkowe wzory wykonywane na wklęsłych wgłębieniach o ĸ = 1/1,000 μm-1 i ĸ = 1/3750 μm-1, wykazujące elastyczność pod względem cech geometrycznych, które można wykorzystać do tworzenia wzorów. Również w tym przypadku wizualizowane są zarówno rzuty o maksymalnej intensywności (XY), jak i widoki ortogonalne (XZ). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Dane z mikroskopii 3D struktur wzorcowych. Typowe przykłady materiałów do hodowli komórkowych z wzorami 3D po fotowzorcowaniu i hodowli komórkowych, wizualizowane za pomocą oprogramowania do renderowania 3D. (A) Wypukły półcylinder z liniami o szerokości 10 μm (rodamina-fibronektyna, czerwony) i przerwami o szerokości 10 μm. Pasek skali = 5 μm. (B) Fibroblasty skórne barwione na obecność F-aktyny (zielone) hodowane na wklęsłym półcylindrze z liniami o szerokości 20 μm (rodamina-fibronektyna, czerwona) i odstępami o szerokości 20 μm. Podziałka = 5 μm. (C) Powierzchnia siodła z liniami o szerokości 20 μm (rodamina-fibronektyna, czerwona) i odstępami o szerokości 20 μm. Podziałka liniowa = 5 μm. (D) Wklęsły dół z koncentrycznymi okręgami o szerokości 20 μm (żelatyna-fluoresceina, zielony) i przerwami o szerokości 20 μm. Cytoszkielet F-aktyny ludzkich keratocytów jest barwiony za pomocą falloidyny i wizualizowany na czerwono. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Barwienie immunofluorescencyjne ludzkich fibroblastów skórnych na wklęsłym półcylindrze z fotowzorzystym, wklęsłym półcylindrem. (A) Projekcja o maksymalnej intensywności (XY) i ortogonalne przekroje (XZ i YZ) ludzkich fibroblastów skórnych hodowanych przez 24 godziny na wklęsłym półcylindrze (linie fibronektyny, czerwone, 5 μm szerokości i 5 μm przerwy). Komórki są barwione na F-aktynę (magenta), winkulinę (na zielono) i jądra (na niebiesko). Podziałka liniowa = 100 μm. (B) Powiększenie komórki przylegającej do środowiska wielokierunkowego. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Obrazy poklatkowe w jasnym polu ludzkich fibroblastów skóry na wzorzystym, wklęsłym cylindrze. Wklęsły półcylinder (ĸ = 1/250 μm-1) uformowano w równoległe linie (5 μm szerokości i 5 μm przerwy) i inkubowano z rodaminą-fibronektyną przed wysiewem komórek. Obrazowanie poklatkowe rozpoczyna się 1 godzinę po początkowym wysiewie komórek (po lewej, 0 min), gdy komórki są jeszcze zaokrąglone i nie przylegają (strzałki). Po około 24 godzinach (środek, 1,420 min) komórki przylegały do podłoża wielokierunkowego i wykazywały reakcję wyrównania zgodnie ze wzorcem prowadzenia kontaktu. Zarówno odpowiedź na wyrównanie, jak i żywotność komórek są utrzymywane przez cały czas trwania hodowli (po prawej, 3,180 min). Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Przykład wzoru na cylindrycznym podłożu 3D. Przedstawienie 3D wypukłego cylindra z wzorem rodaminy-fibronektyny (czerwony). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Reprezentacja 3D fibroblastów skórnych hodowanych na wzorzystym, cylindrycznym podłożu 3D (ĸ = 1/500 μm-1). Fibroblasty skórne hodowane przez 24 godziny na wzorzystym (linie fibronektyny, czerwone, szczeliny o szerokości 10 μm i 10 μm) wypukłym półcylindrze. Komórki są barwione na F-aktynę (magenta), winkulinę (na zielono) i jądra (na niebiesko). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 3: Reprezentacja 3D ludzkich keratocytów hodowanych na wzorzystym, 3D dołku (ĸ = 1/3,750 μm-1). Reprezentacja 3D ludzkich keratocytów hodowanych przez 24 godziny we wklęsłym, wzorzystym jamie (koła żelatynowe, zielone, szerokości 20 μm i przerwy 20 μm). Komórki są barwione na obecność F-aktyny (na czerwono). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 4: Obrazowanie poklatkowe w jasnym polu ludzkich fibroblastów skóry na wzorzystym, wklęsłym cylindrze. Wklęsły półcylinder (ĸ = 1/250 μm-1) uformowano w równoległe linie (5 μm szerokości i 5 μm przerwy) i inkubowano z rodaminą-fibronektyną przed wysiewem komórek. Obrazowanie poklatkowe rozpoczyna się 1 godzinę po początkowym wysiewie komórek, kiedy komórki wykazują początkowe przyleganie do środowiska wielokierunkowego. Podczas całego timelapse'u komórki orientują się głównie wzdłuż wskazówek naprowadzania kontaktu, podczas gdy żywotność komórek jest zachowana. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.