Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) zostały zaproponowane do zdefiniowania dwuwarstwowych struktur zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez komórki¹, które odgrywają ważną rolę w różnych zdarzeniach fizjologicznych i patologicznych². EV uwalniane przez zdrowe komórki można ogólnie podzielić na dwie główne kategorie, a mianowicie egzosomy (lub małe EV) utworzone przez wewnątrzkomórkowy szlak transportu endocytarnego³ i mikropęcherzyki (lub duże EV) powstałe przez zewnętrzne pączkowanie błony plazmatycznej komórki⁴. Podczas gdy wiele badań koncentruje się na funkcji EV pobranych z komórek hodowanych in vitro⁵, EV pochodzące z krążenia lub tkanek są bardziej złożone i niejednorodne, co ma tę zaletę, że odzwierciedla prawdziwy stan organizmu in vivo⁶. Co więcej, prawie wszystkie rodzaje tkanek mogą wytwarzać EV in vivo, a te EV mogą działać jako posłańcy w tkance lub być przenoszone przez różne płyny ustrojowe, zwłaszcza krew obwodową, aby ułatwić komunikację ogólnoustrojową⁷. EV w krążeniu i tkankach są również celami w diagnostyce i leczeniu chorób⁸.

Podczas gdy egzosomy były intensywnie badane w ostatnich latach, mikropęcherzyki pełnią również ważne funkcje biologiczne, które można łatwo wydobyć bez ultrawirowania, co sprzyja badaniom podstawowym i klinicznym⁹. Warto zauważyć, że kluczową kwestią dotyczącą EV wyizolowanych z krążenia i tkanek jest to, że pochodzą one z różnych typów komórek¹⁰. Ponieważ mikropęcherzyki są usuwane z błony komórkowej i charakteryzują się dużą ilością cząsteczek na powierzchni komórki⁹, możliwe jest użycie markerów macierzystej błony komórkowej do identyfikacji pochodzenia komórkowego tych EV. W szczególności technika cytometrii przepływowej (FC) może być stosowana do wykrywania markerów błonowych. Co więcej, naukowcy mogą wyizolować pojazdy elektryczne i przeprowadzić dalsze analizy w oparciu o funkcjonalne ładunki.

Obecny protokół zapewnia dokładną procedurę ekstrakcji i charakteryzowania EV z próbek in vivo. EV są izolowane za pomocą wirowania różnicowego, a charakterystyka EV obejmuje identyfikację morfologiczną za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizę pochodzenia za pomocą FC oraz analizę ładunku białka za pomocą western blot. Jako przedstawiciele stosuje się osocze krwi i kość szczęki myszy. Badacze mogą odwołać się do tego protokołu dla pojazdów elektrycznych z innych źródeł i wprowadzić odpowiednie modyfikacje.

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego oraz wytycznymi ARRIVE. W niniejszym badaniu wykorzystano 8-tygodniowe myszy C57Bl/6 (bez preferencji ani dla samic, ani samców). Etapy związane z izolacją EV osocza i tkanek są zilustrowane na Rysunek 1. Osocze jest traktowane jako przedstawiciel opisujący procedurę izolacji EV z płynów ustrojowych. Kość szczęki jest traktowana jako reprezentatywna w celu wyjaśnienia procedury izolacji EV z tkanek litych.

1. Przygotowanie próbek osocza i kości szczęki

1. Przygotuj próbki osocza, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Określ masę ciała myszy za pomocą standardowej wagi laboratoryjnej.
   2. Dodać 20 μl, 2 mg/ml heparyny do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i użyć mieszalnika (patrz tabela materiałów), aby heparyna przyczepiła się do ścianki probówki.
      UWAGA: Probówki przeciwzakrzepowe mogą być również używane bezpośrednio do pobierania krwi.
   3. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 50 mg/kg pentobarbitalu sodu (patrz tabela materiałów). Chwyć szyję myszy kciukiem i palcem wskazującym, a następnie przymocuj ogon i lewą tylną nogę małym palcem i wstrzyknij sód pentobarbitalu za pomocą strzykawki do wstrzykiwań o pojemności 1 ml po odsłonięciu brzucha.
   4. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona w oparciu o brak odruchu rogówkowego i reakcji kończyny, gdy podnóżek jest ściśnięty.
   5. Ogol włosy na twarzy i rzęsach oczu zakrzywionymi nożyczkami.
   6. Chwyć skórę szyi myszy i dociśnij skórę wokół oczu do tyłu szyi, tak aby gałka oczna wystawała. Użyj pęsety okulistycznej, aby szybko zacisnąć gałkę oczną i zebrać odpływ krwi za pomocą probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml przygotowanych w kroku 1.1.2. Poświęć mysz, zwichając kręg szyjny.
      UWAGA: Uważaj na włoski i rzęsy, ponieważ mogą one powodować hemolizę.
   7. Delikatnie obróć rurkę kilka razy do góry nogami, aby zapobiec krzepnięciu krwi.
      UWAGA: Jak najszybciej odwróć rurkę do góry nogami.
   8. Odwirować próbkę krwi przez 15 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C.
   9. Ostrożnie przenieść supernatant do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i natychmiast użyć próbki osocza lub przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.
   10. Rozcieńczyć supernatant równą objętością 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i dobrze wymieszać.
       UWAGA: Podany powyżej protokół pobierania osocza jest śmiertelny. Krew może być również pobrana przez nakłucie żyły podobojczykowej¹¹ bez poświęcania myszy.
2. Przygotuj próbki kości szczęki, wykonując poniższe czynności.
   1. Odizoluj kość szczęki za pomocą pęsety okulistycznej i nożyczek i umyj je PBS, aby pozbyć się tkanek miękkich za pomocą pęsety.
   2. Włóż kość szczęki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i pokrój kość na małe kawałki (rozmiar musi być mniejszy niż 1 mm średnicy) nożyczkami. Dodać pewną ilość liberazy (5 μg/ml, patrz tabela materiałów) w celu pokrycia tkanki (zwykle 1 ml w przypadku próbek kości od 8-tygodniowej myszy), a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Odwirować próbkę o masie 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.

2. Ekstrakcja EV

1. Odwirować próbki (przygotowane w krokach 1.1.10 i 1.2.4) przez 15 minut w temperaturze 2 500 x g (4 °C) w celu usunięcia dużych resztek komórek i pozostałych płytek krwi.
2. Ostrożnie przenieść supernatanty do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C).
   UWAGA: Prędkość wirowania można ustawić na ponad 10 000 x g, aby wyodrębnić EVs¹². Im wyższa prędkość wirówki, tym większą ilość EV można uzyskać. Ponieważ ograniczenie prędkości użytej przez nas wirówki wynosi 16 800 x g (patrz Tabela materiałów), wybraliśmy tę prędkość w tym protokole.
3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 1 ml PBS. Wirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C).
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 50 μl PBS. Próbki te należy przechowywać w temperaturze 4 °C krócej niż 24 godziny lub najlepiej natychmiast użyć do następujących analiz (etapy 3–5).
   UWAGA: Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest niedopuszczalne, ponieważ zmniejszy to stężenie EV i zwiększy rozmiary cząstek EVs¹³, wpływając w ten sposób na następującą analizę EVs.

3. Identyfikacja morfologiczna EV

1. Wykonaj analizę NTA.
   1. W zależności od ilości EV (w przybliżeniu ocenianej na podstawie wielkości granulek, cząstki osocza o objętości 50 μl są minimalne), przenieś 5-50 μl reprodukcji (krok 2.4), rozcieńcz w 10 ml roztworu buforowego (PBS przefiltrowany filtrem 0,22 μm) i wystarczająco wymieszaj z 1 ml końcówkami mikropipet. Użyj tej końcowej zawiesiny do pomiaru cząstek.
   2. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć co najmniej 5 ml wody destylowanej z umiarkowaną i stałą prędkością, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mniejsza niż pięć.
      UWAGA: Po wstrzyknięciu 1 ml wody destylowanej przez cały kanał, liczba cząstek jest bezpośrednio pokazywana na interfejsie wykrywania. Jeśli liczba nadal przekracza pięć, kontynuuj wstrzykiwanie 1 ml wody destylowanej, aż kryteria zostaną spełnione.
   3. Rozpuść 1 μl roztworu kalibracyjnego w 1 ml wody destylowanej w celu wytworzenia roztworu podstawowego, a następnie weź 100 μl roztworu podstawowego do 25 ml wody destylowanej w celu przygotowania wzorcowego roztworu podstawowego (1:250 000). Odczynnik roboczy należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
   4. Skalibrować przyrząd NTA z wzorcowym roztworem podstawowym (krok 3.1.3). Wstrzyknąć 1-5 ml roboczego roztworu kalibracyjnego za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml, aby przepłukać kanał maszyny, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mieścić się w zakresie 50-400 (najlepiej około 300). Uruchom program kalibracyjny.
   5. Powtórz krok 3.1.2, aby przepłukać kanał maszyny przed każdym pomiarem próbki.
   6. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć co najmniej 2 ml roztworu buforowego, przepłukać kanał urządzenia ze stałą prędkością, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mniejsza niż 10.
   7. Wstrzyknąć 1 ml próbki EV przygotowanej w kroku 3.1.1 z umiarkowaną i stałą prędkością (zalecana prędkość to 0,5-1 ml/s).
      UWAGA: Optymalne stężenie cząstek sprawia, że liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie detekcji mieści się w zakresie od 50-400, a najlepiej około 300. Jeśli liczba cząstek jest zbyt duża, powtórz krok 3.1.2, aby natychmiast przepłukać kanał maszyny, aby uniknąć zatrzymywania się cząstek na ściance kanału i dostosuj stężenie próbki EV zgodnie z krokiem 3.1.1, a następnie powtórz od kroku 3.1.5.
   8. Przeprowadź analizę cząstek i wygeneruj raporty z analizy zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
   9. Jeśli próbka jest cenna, odpompuj próbkę EV za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i zbierz ją do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 2.2, aby wyodrębnić EVs.
   10. Po wykryciu wszystkich próbek wstrzyknąć co najmniej 2 ml roztworu buforowego do kanału maszyny, a następnie wstrzyknąć co najmniej 5 ml wody destylowanej, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie detekcji będzie mniejsza niż pięć.
   11. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml, aby wstrzyknąć co najmniej 10 ml powietrza ze stałą prędkością (zalecana prędkość to 1 ml/s), aby usunąć wodę z kanału.
2. Wykonaj analizę TEM.
   UWAGA: Wykonaj następujące czynności w przypadku nowych zawieszeń EV. Siatka mikroskopu elektronowego pokryta węglem ma dwie strony, przy czym strona robocza jest świecąca w siatkach środkowych. Minimalna objętość osocza do ekstrakcji EV dla poniższej procedury wynosi 50 μl.
   1. Wymieszać próbkę EV (krok 2.4) z równą objętością 4% paraformaldehydu (PFA). Umieść 4 μl EV na jednej siatce i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   2. Umieść cztery krople PBS (jedna kropla jest równa 50 μl) na arkuszu folii polietylenowej (patrz tabela materiałów). Przenieś siatki za pomocą czystej, mikroskopijnej pęsety i umyj roboczą stronę siatki w PBS z jednej kropli na drugą.
   3. Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć dodatkowe PBS, które pozostały w siatkach.
   4. Inkubować roboczą stronę siatki w 1% kwasie fosfowolframowym (patrz tabela materiałów) przez 2 minuty, a następnie powtórzyć krok 3.2.2.
      UWAGA: Ponieważ kwas fosfowolframowy jest trujący, procedura ta musi być wykonywana w dygestorium, a nadmiarowy kwas fosfatungsowy należy specjalnie poddać recyklingowi, a nie bezpośrednio wyrzucać.
   5. Umieść kratki stroną zadrukowaną do góry w naczyniu o średnicy 10 cm pokrytym bibułą filtracyjną. Siatki mogą być przechowywane w RT przez kilka lat.
   6. Obserwować siatki pod mikroskopem elektronowym zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Aby zapewnić obserwację pojedynczych cząstek, należy dostosować stężenie EV, a zawiesina musi być klarowna, bez widocznego zmętnienia. Przed upuszczeniem próbka powinna być dobrze wymieszana. Reprezentatywne analizy TEM i NTA przedstawiono na rysunku Rysunek 2.

4. Analiza pochodzenia pojazdów elektrycznych

UWAGA: Identyfikacja komórkowego pochodzenia EV wymaga zastosowania przeciwciał dla typowych markerów błony komórkowej. Minimalna objętość osocza do ekstrakcji EV dla poniższej procedury wynosi 300 μL. W oparciu o dwuwarstwowe struktury lipidowe EV, do ich oznaczania można użyć barwnika membranowego. W przypadku próbek osocza krwi do reprezentacji wybiera się CD18 dla limfocytów¹⁴. W przypadku próbek kości szczęki jako przykład wybrano receptor związany z osteoklastami (OSCAR) dla osteoklastów¹⁵. Przed FC upewnij się, że cytometr przepływowy jest dostosowany do pomiaru EVs¹⁶, ponieważ dolna granica rozmiaru jest znacznie różna między różnymi cytometrami przepływowymi.

1. Ponownie zawiesić próbki (etap 2.4) za pomocą 500 μl PBS i przenieść 50 μl do nowej i czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml jako ślepej próby kontrolnej (probówka A), a kolejne 50 μl do nowej i czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml jako prostej probówki do barwienia dla FITC (probówka B). Dodaj 0,5 μl barwnika membranowego do pierwotnej probówki w celu barwienia membrany. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Odwirować probówkę pierwotną przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki za pomocą 200 μl PBS.
3. Podziel każdą próbkę o objętości 50 μl na cztery probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml do prostych probówek do barwienia PE (probówka C), barwienia markerem powierzchniowym (probówka D) i kontroli tylko wtórnych przeciwciał (probówka E).
4. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało OSCAR w próbkach EV kości, jak również przeciwciało CD18 w próbkach EV osocza (patrz tabela materiałów) do probówki B (krok 4.1) i probówki D (krok 4.3) oddzielnie (rozcieńczone w stosunku 1:100). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
5. Wirować probówki przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C). Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulki z 500 μl PBS, a następnie ponownie odwirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C) w celu usunięcia dodatkowych przeciwciał pierwszorzędowych.
6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki z 50 μl PBS, a następnie dodać odpowiednio przeciwciała drugorzędowe sprzężone z FITC (patrz Tabela materiałów) (rozcieńczone w stosunku 1:200) (probówka E). Dodać te same przeciwciała drugorzędowe do probówki B (krok 4.1) i probówki D (krok 4.3). Inkubować wszystkie probówki przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
   UWAGA: Przeciwciała znakowane bezpośrednio sprzężone z fluorescencją mogą być również używane do przetwarzania wykrywania FC za pomocą odpowiednich kontroli izotypów.
7. Rozcieńczyć jedną kroplę zawiesiny kulek o wielkości 0,2, 0,5 i 1 μm (patrz Tabela materiałów) odpowiednio w 1 ml PBS i najpierw uruchomić każdy rozmiar kulek, aby upewnić się, że bramka została wybrana dla pojazdów elektrycznych. Ustaw próg cytometru przepływowego, aby wyszukać kulki i populację EV za pomocą odpowiedniego rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC).
   1. Ustaw warunek końcowy jako obliczanie 100 000 cząstek barwionych membranowo. Analizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 3.
      UWAGA: Sprzęt NTA z kanałami fluorescencyjnymi może być również używany do analizy pochodzenia, a przygotowanie próbki jest takie samo jak FC.

5. Analiza zawartości białka w EV

UWAGA: Analiza zawartości białka w EVs jest przeprowadzana za pomocą western blot. Na przykład EV osocza i kości wybrano do analizy dehydrogenazy 6-fosfoglukonianu (PGD) i kinazy pirogronianowej M2 (PKM2) pod kątem stanu metabolicznego. Golgin84 (organelle Golgiego) zastosowano jako kontrolę negatywną, a flotylinę (białko błonowe), kaweolinę (integralne białko kaweoli) i β-aktynę (cytoszkielet) ¹⁷ zastosowano jako kontrolę pozytywną w EV w porównaniu z próbkami komórek. Mitofilina i α-aktynina-4 zostały wybrane jako duże markery EV, podczas gdy CD9 i CD81 zostały wybrane jako małe markery EV, aby zademonstrować subpopulacje EV¹⁸. Apoa1 został wybrany jako marker lipopcząstek osocza¹⁹. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Zawiesić granulki (krok 2.4) w 50 μl buforu do lizy RIPA i inkubować przez 30 minut na lodzie.
2. Określić ilościowo stężenia białka we wszystkich próbkach w 96-dołkowej mikropłytce za pomocą testu białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
   1. Rozcieńczyć 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 0,9% soli fizjologicznej (NS) (zawierającej 0,9% (w/v) chlorku sodu) w 0,5 mg/ml. Dodać 0,5 mg/ml BSA i 0,9% NS do trzech zduplikowanych studzienek o określonych objętościach, jak pokazano w Tabeli 1.
   2. Wrzucić 2 μl próbek (etap 5.1) i dodać 18 μl NS oddzielnie do trzech zduplikowanych studzienek.
   3. Przygotuj roztwór roboczy, mieszając odczynnik BCA A z odczynnikiem B (odczynnik A:B w proporcji 50:1). Dodaj 200 μl roztworu roboczego do każdej studzienki i delikatnie wstrząsaj przez 30 s.
   4. Inkubować 96-dołkową mikropłytkę przez 20-25 minut w temperaturze 37 °C.
   5. Zmierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali 596 nm za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów).
   6. Eksportuj dane.
   7. Narysuj krzywą wzorcową i oblicz stężenie białka w próbkach.
3. Zgodnie z wynikami rozcieńczyć próbki do 1 μg/μL z 0,9% NS i 5x buforem ładującym SDS-PAGE (250 mM Tris·HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy, patrz tabela materiałów). Szczelnie zamknąć probówki folią i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 100 °C.
4. Załaduj próbki i drabinkę białkową do gradientowego stężenia 4%-20% żelu Hepes-Tris (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Wybierz procent żelu zgodnie z masą cząsteczkową interesujących Cię białek.
5. Uruchom żel w buforze roboczym pod napięciem 80 V, aż białka utworzą linię, a następnie przełącz na 120 V na 1 godzinę, aż barwnik ładujący znajdzie się na dnie żelu.
   UWAGA: Czas pracy może się różnić w zależności od używanego sprzętu lub rodzaju i stężenia żelu.
6. Przenieść żel do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (patrz tabela materiałów), wstępnie inkubowanej w alkoholu metylowym przez 20 s. Użyć mokrego systemu transferowego do przenoszenia przez 1 godzinę przy 200 mA.
   UWAGA: Upewnij się, że wewnątrz systemu transferowego nie ma pęcherzyków powietrza i utrzymuj mokrą membranę PVDF.
   UWAGA: Czas transferu może się różnić w zależności od masy cząsteczkowej białka docelowego; 1 KD zwykle potrzebuje 1 min.
7. Przygotować 5% bufor blokujący BSA, dodając 2,5 g BSA (patrz Tabela Materiałów) do 50 ml Tris-buffered soli fizjologicznej (TBST) (2 ml Tween dodano w 2 l roztworu PBS) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Mieszać aż do rozpuszczenia proszku. Zablokować membrany w tym buforze na 2 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
8. Inkubować błony ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi TBST do odpowiedniego stężenia (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotylin-1, 1:1000; Kaweolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktyna, 1:3000) przez noc w temperaturze 4 °C.
9. Przemyć błony w buforze płuczącym (2 ml Tween dodane do 2 l roztworu PBS) cztery razy (za każdym razem 15 minut) i inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w stosunku 1:4000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
10. Umyj membrany w buforze myjącym cztery razy (za każdym razem 15 minut) i zobrazuj membrany za pomocą zestawu do chemiluminescencji i systemu obrazowania żelowego (patrz tabela materiałów).

Zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy, EVs mogą być ekstrahowane z krwi obwodowej i tkanek stałych (Rysunek 1). Kość szczęki myszy w wieku 8 tygodni wynosi około 0,1 ± 0,05 g, a od myszy można pobrać około 300 μl osocza. Postępując zgodnie z krokami protokołu, można zebrać odpowiednio 0,3 mg i 3 μg EV. Zgodnie z analizą TEM i NTA, typowymi cechami morfologicznymi EV są okrągłe pęcherzyki błonowe w kształcie miseczki o średnicy w zakresie od 50 do 300 nm (Rysunek 2). FC może wykrywać EV znakowane barwnikiem membranowym pod użyteczną kontrolą, a analiza FC pokazuje procentową ekspresję określonych markerów błonowych na EV, co sugeruje ich pochodzenie z komórek macierzystych (Rysunek 3). Analiza Western blot pokazuje ekspresję PGD i PKM2, odpowiednio, jako reprezentatywną zawartość białka w EV osocza i EV kości, wskazując na stan metaboliczny (Figura 4). Ujemna ekspresja Golgin84 w EV jest również wykrywana przy obecności Mitofiliny, α-aktyniny-4, flotyliny-1, kaweoliny-1 i β-aktyny, która jest powszechnie wzbogacana w duże EV (mikropęcherzyki) pochodzące z błony plazmatycznej. Można również wykryć mały marker EV CD9, podczas gdy ekspresja CD81 jest niska lub nieobecna, z brakiem obecności Apoa1 w plazmowych EV (Rysunek 4).

Rysunek 1: Ilustracja protokołu ekstrakcji EVs. (A) Etapy ekstrakcji EV z osocza krwi obwodowej za pomocą wirowania różnicowego. (B) Etapy ekstrakcji EV tkanek za pomocą wirowania różnicowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Identyfikacja morfologiczna EV. (A) Reprezentatywny obraz transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) przedstawiający morfologię EV. Podziałka = 200 nm. (B) Reprezentatywne obrazy analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wyniki kwantyfikacji pokazują rozkład wielkości i liczbę cząstek EV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza pochodzenia EVs. (A) Różne zestawy probówek z różnymi elementami sterującymi eksperymentu. (B) Rozkład koralików o rozmiarach 1 μm, 0,5 μm i 0,2 μm pokazany na wykresie scatted. (C) Reprezentatywne wykresy gęstości przedstawiające PBS (probówka A), proste barwienie EV (probówka B), proste barwienie barwnika membranowego (probówka C) i podwójne barwienie próbek EV (probówka D). (D) Analiza cytometrii przepływowej odsetka EV CD18 dodatnich w EV osocza krwi w kolorze czerwonym w porównaniu z kontrolą tylko przeciwciał drugorzędowych w kolorze czarnym. (E) Analiza cytometryczna przepływowa odsetka dodatnich EV OSCAR z próbek kości w kolorze czerwonym w porównaniu z kontrolą tylko przeciwciał drugorzędowych w kolorze czarnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza zawartości białka w EVs. (A) Reprezentatywne obrazy EV osocza western blot pokazujące obecność dehydrogenazy 6-fosfoglukanianu (PGD) i Mitofiliny, α-aktyniny-4, CD9, flotyliny-1, kaweoliny-1 i β-aktyny w EV osocza oraz ujemnej ekspresji CD81, Golgin84 i Apoa1. (B) Reprezentatywne obrazy EV kości western blot wykazujące obecność kinazy pirogronianowej M2 (PKM2) i Mitofiliny, α-aktyniny-4, CD9, CD81, flotyliny-1, kaweoliny-1 i β-aktyny w EV kości oraz ujemną ekspresję Golgin84. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Standardowe rozwiązanie robocze testu BCA. Dodaj 0,5 mg/ml BSA i 0,9% NS do trzech zduplikowanych studzienek, jak pokazano w tabeli.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.