Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

DOI:

10.3791/63990

⸱

17 października 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krążące i rezydujące w tkankach pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) stanowią obiecujące cele jako nowe biomarkery teranostyczne i wyłaniają się jako ważni gracze w utrzymaniu homeostazy organizmu i postępie szerokiego spektrum chorób. Podczas gdy obecne badania koncentrują się na charakterystyce endogennych egzosomów o pochodzeniu endosomalnym, mikropęcherzyki pęcherzykowe pęcherzyki pęcherzykowe z błony plazmatycznej zyskują coraz większą uwagę w zdrowiu i chorobie, które charakteryzują się obfitością cząsteczek powierzchniowych rekapitulujących sygnaturę błonową komórek macierzystych. W tym miejscu przedstawiono powtarzalną procedurę opartą na wirowaniu różnicowym w celu ekstrakcji i scharakteryzowania EV z osocza i tkanek stałych, takich jak kości. Protokół opisuje ponadto późniejsze profilowanie antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych pojazdów elektrycznych, które są w ten sposób identyfikowalne dla ich pochodzenia i identyfikowane ze składnikami związanymi z potencjalną funkcją. Metoda ta będzie przydatna do korelacyjnej, funkcjonalnej i mechanistycznej analizy EV w badaniach biologicznych, fizjologicznych i patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) zostały zaproponowane do zdefiniowania dwuwarstwowych struktur zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez komórki1, które odgrywają ważną rolę w różnych zdarzeniach fizjologicznych i patologicznych2. EV uwalniane przez zdrowe komórki można ogólnie podzielić na dwie główne kategorie, a mianowicie egzosomy (lub małe EV) utworzone przez wewnątrzkomórkowy szlak transportu endocytarnego3 i mikropęcherzyki (lub duże EV) powstałe przez zewnętrzne pączkowanie błony plazmatycznej komórki4. Podczas gdy wiele badań koncentruje się na funkcji EV pobranych z komórek hodowanych in vitro5, EV pochodzące z krążenia lub tkanek są bardziej złożone i niejednorodne, co ma tę zaletę, że odzwierciedla prawdziwy stan organizmu in vivo6. Co więcej, prawie wszystkie rodzaje tkanek mogą wytwarzać EV in vivo, a te EV mogą działać jako posłańcy w tkance lub być przenoszone przez różne płyny ustrojowe, zwłaszcza krew obwodową, aby ułatwić komunikację ogólnoustrojową7. EV w krążeniu i tkankach są również celami w diagnostyce i leczeniu chorób8.

Podczas gdy egzosomy były intensywnie badane w ostatnich latach, mikropęcherzyki pełnią również ważne funkcje biologiczne, które można łatwo wydobyć bez ultrawirowania, co sprzyja badaniom podstawowym i klinicznym9. Warto zauważyć, że kluczową kwestią dotyczącą EV wyizolowanych z krążenia i tkanek jest to, że pochodzą one z różnych typów komórek10. Ponieważ mikropęcherzyki są usuwane z błony komórkowej i charakteryzują się dużą ilością cząsteczek na powierzchni komórki9, możliwe jest użycie markerów macierzystej błony komórkowej do identyfikacji pochodzenia komórkowego tych EV. W szczególności technika cytometrii przepływowej (FC) może być stosowana do wykrywania markerów błonowych. Co więcej, naukowcy mogą wyizolować pojazdy elektryczne i przeprowadzić dalsze analizy w oparciu o funkcjonalne ładunki.

Obecny protokół zapewnia dokładną procedurę ekstrakcji i charakteryzowania EV z próbek in vivo. EV są izolowane za pomocą wirowania różnicowego, a charakterystyka EV obejmuje identyfikację morfologiczną za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizę pochodzenia za pomocą FC oraz analizę ładunku białka za pomocą western blot. Jako przedstawiciele stosuje się osocze krwi i kość szczęki myszy. Badacze mogą odwołać się do tego protokołu dla pojazdów elektrycznych z innych źródeł i wprowadzić odpowiednie modyfikacje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego oraz wytycznymi ARRIVE. W niniejszym badaniu wykorzystano 8-tygodniowe myszy C57Bl/6 (bez preferencji ani dla samic, ani samców). Etapy związane z izolacją EV osocza i tkanek są zilustrowane na Rysunek 1. Osocze jest traktowane jako przedstawiciel opisujący procedurę izolacji EV z płynów ustrojowych. Kość szczęki jest traktowana jako reprezentatywna w celu wyjaśnienia procedury izolacji EV z tkanek litych.

1. Przygotowanie próbek osocza i kości szczęki

  1. Przygotuj próbki osocza, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Określ masę ciała myszy za pomocą standardowej wagi laboratoryjnej.
    2. Dodać 20 μl, 2 mg/ml heparyny do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i użyć mieszalnika (patrz tabela materiałów), aby heparyna przyczepiła się do ścianki probówki.
      UWAGA: Probówki przeciwzakrzepowe mogą być również używane bezpośrednio do pobierania krwi.
    3. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 50 mg/kg pentobarbitalu sodu (patrz tabela materiałów). Chwyć szyję myszy kciukiem i palcem wskazującym, a następnie przymocuj ogon i lewą tylną nogę małym palcem i wstrzyknij sód pentobarbitalu za pomocą strzykawki do wstrzykiwań o pojemności 1 ml po odsłonięciu brzucha.
    4. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona w oparciu o brak odruchu rogówkowego i reakcji kończyny, gdy podnóżek jest ściśnięty.
    5. Ogol włosy na twarzy i rzęsach oczu zakrzywionymi nożyczkami.
    6. Chwyć skórę szyi myszy i dociśnij skórę wokół oczu do tyłu szyi, tak aby gałka oczna wystawała. Użyj pęsety okulistycznej, aby szybko zacisnąć gałkę oczną i zebrać odpływ krwi za pomocą probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml przygotowanych w kroku 1.1.2. Poświęć mysz, zwichając kręg szyjny.
      UWAGA: Uważaj na włoski i rzęsy, ponieważ mogą one powodować hemolizę.
    7. Delikatnie obróć rurkę kilka razy do góry nogami, aby zapobiec krzepnięciu krwi.
      UWAGA: Jak najszybciej odwróć rurkę do góry nogami.
    8. Odwirować próbkę krwi przez 15 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C.
    9. Ostrożnie przenieść supernatant do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i natychmiast użyć próbki osocza lub przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.
    10. Rozcieńczyć supernatant równą objętością 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i dobrze wymieszać.
      UWAGA: Podany powyżej protokół pobierania osocza jest śmiertelny. Krew może być również pobrana przez nakłucie żyły podobojczykowej11 bez poświęcania myszy.
  2. Przygotuj próbki kości szczęki, wykonując poniższe czynności.
    1. Odizoluj kość szczęki za pomocą pęsety okulistycznej i nożyczek i umyj je PBS, aby pozbyć się tkanek miękkich za pomocą pęsety.
    2. Włóż kość szczęki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i pokrój kość na małe kawałki (rozmiar musi być mniejszy niż 1 mm średnicy) nożyczkami. Dodać pewną ilość liberazy (5 μg/ml, patrz tabela materiałów) w celu pokrycia tkanki (zwykle 1 ml w przypadku próbek kości od 8-tygodniowej myszy), a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Odwirować próbkę o masie 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.

2. Ekstrakcja EV

  1. Odwirować próbki (przygotowane w krokach 1.1.10 i 1.2.4) przez 15 minut w temperaturze 2 500 x g (4 °C) w celu usunięcia dużych resztek komórek i pozostałych płytek krwi.
  2. Ostrożnie przenieść supernatanty do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C).
    UWAGA: Prędkość wirowania można ustawić na ponad 10 000 x g, aby wyodrębnić EVs12. Im wyższa prędkość wirówki, tym większą ilość EV można uzyskać. Ponieważ ograniczenie prędkości użytej przez nas wirówki wynosi 16 800 x g (patrz Tabela materiałów), wybraliśmy tę prędkość w tym protokole.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 1 ml PBS. Wirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C).
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 50 μl PBS. Próbki te należy przechowywać w temperaturze 4 °C krócej niż 24 godziny lub najlepiej natychmiast użyć do następujących analiz (etapy 3–5).
    UWAGA: Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest niedopuszczalne, ponieważ zmniejszy to stężenie EV i zwiększy rozmiary cząstek EVs13, wpływając w ten sposób na następującą analizę EVs.

3. Identyfikacja morfologiczna EV

  1. Wykonaj analizę NTA.
    1. W zależności od ilości EV (w przybliżeniu ocenianej na podstawie wielkości granulek, cząstki osocza o objętości 50 μl są minimalne), przenieś 5-50 μl reprodukcji (krok 2.4), rozcieńcz w 10 ml roztworu buforowego (PBS przefiltrowany filtrem 0,22 μm) i wystarczająco wymieszaj z 1 ml końcówkami mikropipet. Użyj tej końcowej zawiesiny do pomiaru cząstek.
    2. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć co najmniej 5 ml wody destylowanej z umiarkowaną i stałą prędkością, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mniejsza niż pięć.
      UWAGA: Po wstrzyknięciu 1 ml wody destylowanej przez cały kanał, liczba cząstek jest bezpośrednio pokazywana na interfejsie wykrywania. Jeśli liczba nadal przekracza pięć, kontynuuj wstrzykiwanie 1 ml wody destylowanej, aż kryteria zostaną spełnione.
    3. Rozpuść 1 μl roztworu kalibracyjnego w 1 ml wody destylowanej w celu wytworzenia roztworu podstawowego, a następnie weź 100 μl roztworu podstawowego do 25 ml wody destylowanej w celu przygotowania wzorcowego roztworu podstawowego (1:250 000). Odczynnik roboczy należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
    4. Skalibrować przyrząd NTA z wzorcowym roztworem podstawowym (krok 3.1.3). Wstrzyknąć 1-5 ml roboczego roztworu kalibracyjnego za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml, aby przepłukać kanał maszyny, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mieścić się w zakresie 50-400 (najlepiej około 300). Uruchom program kalibracyjny.
    5. Powtórz krok 3.1.2, aby przepłukać kanał maszyny przed każdym pomiarem próbki.
    6. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć co najmniej 2 ml roztworu buforowego, przepłukać kanał urządzenia ze stałą prędkością, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mniejsza niż 10.
    7. Wstrzyknąć 1 ml próbki EV przygotowanej w kroku 3.1.1 z umiarkowaną i stałą prędkością (zalecana prędkość to 0,5-1 ml/s).
      UWAGA: Optymalne stężenie cząstek sprawia, że liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie detekcji mieści się w zakresie od 50-400, a najlepiej około 300. Jeśli liczba cząstek jest zbyt duża, powtórz krok 3.1.2, aby natychmiast przepłukać kanał maszyny, aby uniknąć zatrzymywania się cząstek na ściance kanału i dostosuj stężenie próbki EV zgodnie z krokiem 3.1.1, a następnie powtórz od kroku 3.1.5.
    8. Przeprowadź analizę cząstek i wygeneruj raporty z analizy zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    9. Jeśli próbka jest cenna, odpompuj próbkę EV za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i zbierz ją do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 2.2, aby wyodrębnić EVs.
    10. Po wykryciu wszystkich próbek wstrzyknąć co najmniej 2 ml roztworu buforowego do kanału maszyny, a następnie wstrzyknąć co najmniej 5 ml wody destylowanej, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie detekcji będzie mniejsza niż pięć.
    11. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml, aby wstrzyknąć co najmniej 10 ml powietrza ze stałą prędkością (zalecana prędkość to 1 ml/s), aby usunąć wodę z kanału.
  2. Wykonaj analizę TEM.
    UWAGA: Wykonaj następujące czynności w przypadku nowych zawieszeń EV. Siatka mikroskopu elektronowego pokryta węglem ma dwie strony, przy czym strona robocza jest świecąca w siatkach środkowych. Minimalna objętość osocza do ekstrakcji EV dla poniższej procedury wynosi 50 μl.
    1. Wymieszać próbkę EV (krok 2.4) z równą objętością 4% paraformaldehydu (PFA). Umieść 4 μl EV na jednej siatce i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Umieść cztery krople PBS (jedna kropla jest równa 50 μl) na arkuszu folii polietylenowej (patrz tabela materiałów). Przenieś siatki za pomocą czystej, mikroskopijnej pęsety i umyj roboczą stronę siatki w PBS z jednej kropli na drugą.
    3. Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć dodatkowe PBS, które pozostały w siatkach.
    4. Inkubować roboczą stronę siatki w 1% kwasie fosfowolframowym (patrz tabela materiałów) przez 2 minuty, a następnie powtórzyć krok 3.2.2.
      UWAGA: Ponieważ kwas fosfowolframowy jest trujący, procedura ta musi być wykonywana w dygestorium, a nadmiarowy kwas fosfatungsowy należy specjalnie poddać recyklingowi, a nie bezpośrednio wyrzucać.
    5. Umieść kratki stroną zadrukowaną do góry w naczyniu o średnicy 10 cm pokrytym bibułą filtracyjną. Siatki mogą być przechowywane w RT przez kilka lat.
    6. Obserwować siatki pod mikroskopem elektronowym zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Aby zapewnić obserwację pojedynczych cząstek, należy dostosować stężenie EV, a zawiesina musi być klarowna, bez widocznego zmętnienia. Przed upuszczeniem próbka powinna być dobrze wymieszana. Reprezentatywne analizy TEM i NTA przedstawiono na rysunku Rysunek 2.

4. Analiza pochodzenia pojazdów elektrycznych

UWAGA: Identyfikacja komórkowego pochodzenia EV wymaga zastosowania przeciwciał dla typowych markerów błony komórkowej. Minimalna objętość osocza do ekstrakcji EV dla poniższej procedury wynosi 300 μL. W oparciu o dwuwarstwowe struktury lipidowe EV, do ich oznaczania można użyć barwnika membranowego. W przypadku próbek osocza krwi do reprezentacji wybiera się CD18 dla limfocytów14. W przypadku próbek kości szczęki jako przykład wybrano receptor związany z osteoklastami (OSCAR) dla osteoklastów15. Przed FC upewnij się, że cytometr przepływowy jest dostosowany do pomiaru EVs16, ponieważ dolna granica rozmiaru jest znacznie różna między różnymi cytometrami przepływowymi.

  1. Ponownie zawiesić próbki (etap 2.4) za pomocą 500 μl PBS i przenieść 50 μl do nowej i czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml jako ślepej próby kontrolnej (probówka A), a kolejne 50 μl do nowej i czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml jako prostej probówki do barwienia dla FITC (probówka B). Dodaj 0,5 μl barwnika membranowego do pierwotnej probówki w celu barwienia membrany. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odwirować probówkę pierwotną przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki za pomocą 200 μl PBS.
  3. Podziel każdą próbkę o objętości 50 μl na cztery probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml do prostych probówek do barwienia PE (probówka C), barwienia markerem powierzchniowym (probówka D) i kontroli tylko wtórnych przeciwciał (probówka E).
  4. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało OSCAR w próbkach EV kości, jak również przeciwciało CD18 w próbkach EV osocza (patrz tabela materiałów) do probówki B (krok 4.1) i probówki D (krok 4.3) oddzielnie (rozcieńczone w stosunku 1:100). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  5. Wirować probówki przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C). Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulki z 500 μl PBS, a następnie ponownie odwirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C) w celu usunięcia dodatkowych przeciwciał pierwszorzędowych.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki z 50 μl PBS, a następnie dodać odpowiednio przeciwciała drugorzędowe sprzężone z FITC (patrz Tabela materiałów) (rozcieńczone w stosunku 1:200) (probówka E). Dodać te same przeciwciała drugorzędowe do probówki B (krok 4.1) i probówki D (krok 4.3). Inkubować wszystkie probówki przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
    UWAGA: Przeciwciała znakowane bezpośrednio sprzężone z fluorescencją mogą być również używane do przetwarzania wykrywania FC za pomocą odpowiednich kontroli izotypów.
  7. Rozcieńczyć jedną kroplę zawiesiny kulek o wielkości 0,2, 0,5 i 1 μm (patrz Tabela materiałów) odpowiednio w 1 ml PBS i najpierw uruchomić każdy rozmiar kulek, aby upewnić się, że bramka została wybrana dla pojazdów elektrycznych. Ustaw próg cytometru przepływowego, aby wyszukać kulki i populację EV za pomocą odpowiedniego rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC).
    1. Ustaw warunek końcowy jako obliczanie 100 000 cząstek barwionych membranowo. Analizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 3.
      UWAGA: Sprzęt NTA z kanałami fluorescencyjnymi może być również używany do analizy pochodzenia, a przygotowanie próbki jest takie samo jak FC.

5. Analiza zawartości białka w EV

UWAGA: Analiza zawartości białka w EVs jest przeprowadzana za pomocą western blot. Na przykład EV osocza i kości wybrano do analizy dehydrogenazy 6-fosfoglukonianu (PGD) i kinazy pirogronianowej M2 (PKM2) pod kątem stanu metabolicznego. Golgin84 (organelle Golgiego) zastosowano jako kontrolę negatywną, a flotylinę (białko błonowe), kaweolinę (integralne białko kaweoli) i β-aktynę (cytoszkielet) 17 zastosowano jako kontrolę pozytywną w EV w porównaniu z próbkami komórek. Mitofilina i α-aktynina-4 zostały wybrane jako duże markery EV, podczas gdy CD9 i CD81 zostały wybrane jako małe markery EV, aby zademonstrować subpopulacje EV18. Apoa1 został wybrany jako marker lipopcząstek osocza19. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w Tabeli materiałów.

  1. Zawiesić granulki (krok 2.4) w 50 μl buforu do lizy RIPA i inkubować przez 30 minut na lodzie.
  2. Określić ilościowo stężenia białka we wszystkich próbkach w 96-dołkowej mikropłytce za pomocą testu białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    1. Rozcieńczyć 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 0,9% soli fizjologicznej (NS) (zawierającej 0,9% (w/v) chlorku sodu) w 0,5 mg/ml. Dodać 0,5 mg/ml BSA i 0,9% NS do trzech zduplikowanych studzienek o określonych objętościach, jak pokazano w Tabeli 1.
    2. Wrzucić 2 μl próbek (etap 5.1) i dodać 18 μl NS oddzielnie do trzech zduplikowanych studzienek.
    3. Przygotuj roztwór roboczy, mieszając odczynnik BCA A z odczynnikiem B (odczynnik A:B w proporcji 50:1). Dodaj 200 μl roztworu roboczego do każdej studzienki i delikatnie wstrząsaj przez 30 s.
    4. Inkubować 96-dołkową mikropłytkę przez 20-25 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Zmierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali 596 nm za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów).
    6. Eksportuj dane.
    7. Narysuj krzywą wzorcową i oblicz stężenie białka w próbkach.
  3. Zgodnie z wynikami rozcieńczyć próbki do 1 μg/μL z 0,9% NS i 5x buforem ładującym SDS-PAGE (250 mM Tris·HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy, patrz tabela materiałów). Szczelnie zamknąć probówki folią i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 100 °C.
  4. Załaduj próbki i drabinkę białkową do gradientowego stężenia 4%-20% żelu Hepes-Tris (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Wybierz procent żelu zgodnie z masą cząsteczkową interesujących Cię białek.
  5. Uruchom żel w buforze roboczym pod napięciem 80 V, aż białka utworzą linię, a następnie przełącz na 120 V na 1 godzinę, aż barwnik ładujący znajdzie się na dnie żelu.
    UWAGA: Czas pracy może się różnić w zależności od używanego sprzętu lub rodzaju i stężenia żelu.
  6. Przenieść żel do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (patrz tabela materiałów), wstępnie inkubowanej w alkoholu metylowym przez 20 s. Użyć mokrego systemu transferowego do przenoszenia przez 1 godzinę przy 200 mA.
    UWAGA: Upewnij się, że wewnątrz systemu transferowego nie ma pęcherzyków powietrza i utrzymuj mokrą membranę PVDF.
    UWAGA: Czas transferu może się różnić w zależności od masy cząsteczkowej białka docelowego; 1 KD zwykle potrzebuje 1 min.
  7. Przygotować 5% bufor blokujący BSA, dodając 2,5 g BSA (patrz Tabela Materiałów) do 50 ml Tris-buffered soli fizjologicznej (TBST) (2 ml Tween dodano w 2 l roztworu PBS) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Mieszać aż do rozpuszczenia proszku. Zablokować membrany w tym buforze na 2 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
  8. Inkubować błony ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi TBST do odpowiedniego stężenia (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotylin-1, 1:1000; Kaweolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktyna, 1:3000) przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Przemyć błony w buforze płuczącym (2 ml Tween dodane do 2 l roztworu PBS) cztery razy (za każdym razem 15 minut) i inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w stosunku 1:4000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
  10. Umyj membrany w buforze myjącym cztery razy (za każdym razem 15 minut) i zobrazuj membrany za pomocą zestawu do chemiluminescencji i systemu obrazowania żelowego (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy, EVs mogą być ekstrahowane z krwi obwodowej i tkanek stałych (Rysunek 1). Kość szczęki myszy w wieku 8 tygodni wynosi około 0,1 ± 0,05 g, a od myszy można pobrać około 300 μl osocza. Postępując zgodnie z krokami protokołu, można zebrać odpowiednio 0,3 mg i 3 μg EV. Zgodnie z analizą TEM i NTA, typowymi cechami morfologicznymi EV są okrągłe pęcherzyki błonowe w kształcie miseczki o średnicy w zakresie od 50 do 300 nm (Rysunek 2). FC może w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas badania cech, losu i funkcji pojazdów elektrycznych kluczowe znaczenie ma izolacja pojazdów elektrycznych o wysokiej wydajności i niskim zanieczyszczeniu. Istnieją różne metody ekstrakcji EV, takie jak wirowanie w gradiencie gęstości (DGC), chromatografia wykluczania wielkości (SEC) i testy immunowychwytywania 4,20. Tutaj zastosowano jedną z najczęściej stosowanych metod, wirowanie różnicowe; Zaletą tego rozwiązania jest to, że nie jest czasochłonne, gene...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32000974, 81870796, 82170988 i 81930025) oraz Chińskiej Fundacji Nauk Podoktoranckich (2019M663986 i BX20190380). Jesteśmy wdzięczni za pomoc ze strony Narodowego Centrum Demonstracyjnego Nauczania Eksperymentalnego dla Medycyny Podstawowej (AMFU).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paraformaldehydu Transmisyjny mikroskop elektronowyBiosharp143174
Alexa fluor 488 przeciwciało wtórne przeciwko kozomYeason34306ES60Cytometria przepływowa
Alexa fluor 488 przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowiInvitrogenA11008Cytometria przepływowa
Przeciwciało anty-CD18Abcamab131044Cytometria przepływowa
Przeciwciało anty-CD81Abcamab109201Przeciwciało Western blot
anty-CD9HuabioET1601-9Przeciwciało Western blot
anty-mitofilinyAbcamab110329Western
blot APOA1 Rabbit pAbAbcloneA14211Western blot
Zestaw do oznaczania białka BCATIANGENPA115Western blot
BLUeye Prestained Protein LadderSigma-Aldrich94964-500ULWestern blot
Albumina surowicy bydlęcejMP Biomedical218072801Western blot
Przeciwciało kaweoliny-1Santa Cruz Biotechnologysc-53564Western blot
CellMask Pomarańczowa plama błony plazmatycznejInvitrogenC10045Cytometria przepływowa
ChemiluminescencjaAmersham BiosciencesN/AWestern blot
Zakrzywione nożyce operacyjneInstrument chirurgiczny JZ IzolacjaJ21040EV
Waga elektronicznaZhi KeIzolacja ZK-DSTEV
Spektrofotometr epokowyBioTekN/AWestern blot
Probówki EppendorfaIzolacja Eppendorf3810XEV
Przeciwciało flotyliny-1PTM BIOPTM-5369Western blot
System obrazowania żelowegoTanon4600Western blot
Golgin84Novusnbp1-83352Western blot
Siatki - Formvar/Carbon Coated - Miedź 200 meshPolysciences24915Transmisyjny mikroskop elektronowy
Roztwór heparynyStemCell Izolacja 7980EV
Liberase Research GradeSigma-Aldrich5401127001Izolacja EV
Mikroskopijna pęsetaInstrument chirurgiczny JZ IzolacjaJD1020EV
Cytometr przepływowy NovoCyteACEAN/ACytometria przepływowa
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4 ~ 20%, 10 dołkówEpizymeLK206Western blot
OSCAR( D-19)Santa Cruz BiotechnologySC-34235Cytometria przepływowa
PBS (2x)ZHHCPW013Western blot
Pentobarbital soduSigma-Aldrich57-33-0Znieczulenie
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L)Jacson115-035-003Peroksydaza Western blot
AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jacson111-035-003Western blot
Kwas fosfatungsowyRHAWN12501-23-4Transmisyjny mikroskop elektronowy
PKM2(D78a4) xp rabbit  mab Sygnalizacja komórkowa4053tWestern blot
Folia polietylenowa (PE)Xiang yi200150055Transmisyjny mikroskop elektronowy
Membrany z polifluorku winylidenu Roche3010040001Western blot
Inhibitory proteazyRoche4693132001Western blot
Rekombinowane przeciwciało anty-PGDAbcamab129199blot
Bufor do lizy RIPABeyotimeP0013blot
Bufor ładujący SDS-PAGE (5x)CwbioCW0027SWestern blot
Rozmiar koralikówInvitrogenF13839Cytometria przepływowa
Stołowe mikrowirówki szybkoobrotoweIzolacja HitachiCT15EEV
Transmisyjny mikroskop elektronowyHITACHIH-7650Transmisyjny mikroskop elektronowy
Tween-20MP Biomedicals19472Western blot
Vortex Mixer GenieScientific IndustriesSI0425Izolacja EV
ZetaView BASIC NTA - Mikroskop wideo do śledzenia nanocząstek PMX-120Particle MetrixN/AAnaliza śledzenia nanocząstek
α-Actinin-4 Rabbit mAbAbcloneA3379Western blot
i beta-aktynaCwbioCW0096MWestern blot
przeciwciało Western Western

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja EVr nicowe wirowanieEV z osoczaEV z tkanekprofilowanie antygen w powierzchniowychcytometria przep ywowaanaliza zawarto ci bia ekWestern blotledzenie nanocz stek

Powiązane artykuły