Wykrywanie i kwantyfikacja nanorurek tunelowych za pomocą obrazów 3D w widoku objętości

Summary

Nanorurki tunelowe (TNT) to przede wszystkim otwarte nanorurki z membraną F-aktyny, które łączą sąsiednie komórki, ułatwiając komunikację międzykomórkową. Godną uwagi cechą, która odróżnia TNT od innych wypukłości komórek, jest unosząca się natura nanorurek między komórkami. W tym miejscu scharakteryzujemy TNT, konstruując widok objętościowy 3D konfokalnych obrazów z-stack.

Abstract

Ostatnie odkrycia ujawniły, że komórki wykonują bezpośredni, daleki, międzykomórkowy transfer za pomocą nano-skalowych kanałów aktynowo-błonowych, a konkretnie "tunelujących nanorurek" (TNT). TNT definiuje się jako otwarte, dwuwarstwowe przedłużenia błony otoczone lipidami, które pośredniczą w ciągłości między sąsiednimi komórkami o średnicach od 50 nm do 1 μm. TNT wykazano początkowo w komórkach neuronalnych, ale kolejne badania wykazały istnienie TNT w kilku typach komórek i chorobach, takich jak choroby neurodegeneracyjne, infekcje wirusowe i nowotwory. Kilka badań odnosiło się do zamkniętych, elektrycznie sprzężonych nanostruktur błonowych między sąsiednimi komórkami jako TNT lub struktur podobnych do TNT.

Wyjaśnienie ultrastruktury w kategoriach ciągłości membrany na końcu jest technicznie trudne. Ponadto badania nad komunikacją komórka-komórka są trudne pod względem charakterystyki TNT przy użyciu konwencjonalnych metod ze względu na brak specyficznych markerów. TNT są przede wszystkim definiowane jako otwarte wypukłości błonowe na bazie F-aktyny. Jednak jednym z głównych ograniczeń jest to, że F-aktyna jest obecna we wszystkich rodzajach wypukłości, co utrudnia odróżnienie trotylu od innych występów. Jedną z godnych uwagi cech TNT opartych na F-aktynie jest to, że struktury te unoszą się między dwiema komórkami bez dotykania podłoża. Dlatego wyraźne TNT barwione F-aktyną można wygodnie odróżnić od innych występów, takich jak filopodia i neuryty, na podstawie ich unoszenia się między komórkami.

Ostatnio wykazaliśmy, że internalizacja oligomerycznego β amyloidu_1-42 (oAβ) poprzez endocytozę zależną od aktyny stymuluje aktywowaną kinazę p21-1 (PAK1), która pośredniczy w tworzeniu TNT zawierających F-aktynę koeksprymowanych z fosfo-PAK1 między komórkami neuronalnymi SH-SY5Y. Protokół ten przedstawia metodę analizy objętościowej 3D w celu identyfikacji i scharakteryzowania TNT na podstawie przechwyconych obrazów stosu z wypukłości błon barwników immunologicznych F-aktyny i fosfo-PAK1 w komórkach neuronalnych traktowanych oAβ. Ponadto TNT odróżnia się od rozwijających się neurytów i wyrostków neuronalnych opartych na przewodach błonowych barwionych immunologicznie tubuliną F-aktyną i β-III.

Introduction

Tunelujące nanorurki (TNT) są oparte na F-aktynie, głównie otwartymi kanałami błonowymi i odgrywają istotną rolę w międzykomórkowym transporcie ładunku i organelli¹. Unikalną cechą trotylu jest to, że łączą sąsiednie komórki bez kontaktu z podłożem; Mają ponad 10-300 μm długości, a ich średnice wahają się od 50 nm do 1 μm^2,3. TNT są strukturami przejściowymi, a ich żywotność trwa od kilku minut do kilku godzin. TNT po raz pierwszy zademonstrowano w komórkach neuronalnych PC12¹; Później liczne badania wykazały ich istnienie w kilku typach komórek in vitro i in vivo^4,5. Kilka badań ujawniło patologiczne znaczenie trotylu w różnych modelach chorób, takich jak choroby neurodegeneracyjne, nowotwory i infekcje wirusowe^6,7,8.

Strukturalne niejednorodności TNT zostały wykazane w kilku badaniach w różnych systemach komórkowych⁹. Różnice wynikają ze składu cytoszkieletu, mechanizmu powstawania i typów przenoszonych ładunków¹⁰. Przede wszystkim uważa się, że otwarta, F-aktynowo-dodatnia ciągłość błony, która unosi się między dwiema sąsiednimi komórkami i przenosi organelle, składa się z TNTs¹¹. Jednak brak jasności lub różnorodności obserwowany w tworzeniu TNT zwiększa trudności w opracowywaniu markerów specyficznych dla TNT. W związku z tym trudno jest zidentyfikować struktury TNT za pomocą konwencjonalnych metod wykrywania i rozróżnić nanorurki membranowe pod względem wypukłości otwartych i zamkniętych¹². Jednak cecha TNT polegająca na unoszeniu się jako wypukłości błony F-aktyny między dwiema komórkami jest stosunkowo łatwiejsza i bardziej wykonalna do zidentyfikowania przy użyciu konwencjonalnych technik obrazowania. Inne wypukłości komórkowe oparte na aktynie, takie jak filopodia i filopodia grzbietowe, nie mogą unosić się między dwiema odległymi komórkami, szczególnie gdy komórki są unieruchomione. Warto zauważyć, że zamknięte, elektrycznie sprzężone, rozwijające się neuryty są często określane jako struktury podobne do TNT¹³.

Wiadomo, że F-aktyna odgrywa ważną rolę w tworzeniu TNT, a kilka badań wykazało, że inhibitor F-aktyny cytochalazyna D hamuje powstawanie TNTs^14,15. W przeciwieństwie do tego, inhibitory mikrotubul nie mają żadnego wpływu na tworzenie TNT¹⁶. W ciągu ostatnich 2 dekad pojawiło się kilka doniesień na temat znaczącej roli, jaką TNT odgrywają w rozprzestrzenianiu się patologii i oporności nowotworów oraz terapii¹⁷. W związku z tym istnieje niekończące się zapotrzebowanie na lepsze techniki charakteryzacji trotylu.

Brak specyficznych markerów TNT oraz różnorodność morfologii i składu cytoszkieletu utrudniają opracowanie unikalnej metody charakterystyki. W niektórych badaniach wykorzystano techniki automatycznego wykrywania obrazów i kwantyfikacji TNT^18,19. Istnieje jednak kilka zalet obecnej metody ręcznej analizy objętości 3D w porównaniu z automatyczną analizą obrazu w celu wykrywania i kwantyfikacji trotylu. Często wyszkolone ludzkie oczy mogą dostrzec te unoszące się w powietrzu nanostruktury łatwiej niż automatyczna metoda wykrywania obrazu. Co więcej, metody automatycznego wykrywania mogą być trudne do wdrożenia w laboratoriach, w których brakuje wiedzy specjalistycznej w zakresie algorytmów. Obecna metoda może być szeroko stosowana przez naukowców ze względu na swoją precyzję i powtarzalność.

W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że oAβ promuje biogenezę TNT w komórkach neuronalnych poprzez zależny od aktu mechanizm endocytozy za pośrednictwem PAK1¹². TNT indukowane przez oAβ również wyrażają aktywowany PAK1 (lub phospho-PAK1). Opracowaliśmy metodę rekonstrukcji obrazu 3D w widoku objętościowym, aby odróżnić TNT indukowane oAβ, F-aktyną i fosfo-PAK1 immunostainowane. β-III tubulino-dodatnie, rozwijające się neuryty często przypominają unoszące się struktury podobne do TNT²⁰. W związku z tym dodatkowo odróżniliśmy TNT na bazie F-aktyny od neurytów β-III tubulinowo-dodatnich i innych wypukłości podobnych do TNT. Obrazy 3D w widoku objętościowym zostały wykorzystane do identyfikacji TNT na podstawie ich cech unoszenia się nad podłożem i pozostawania połączonym między dwiema sąsiednimi komórkami. W artykule opisano identyfikację i detekcję przewodów błonowych zawierających aktynę lub TNT za pomocą konfokalnych obrazów stosu Z i wreszcie ręczną kwantyfikację zidentyfikowanych struktur na podstawie obrazów rekonstrukcji 3D w widoku objętości. Przedstawiona metoda nie jest w stanie odróżnić otwartych właściwych TNT od zamkniętych struktur podobnych do TNT; metoda ta pomaga zidentyfikować TNT w hodowli komórkowej 2D in vitro na płaskim podłożu. Metoda ta jest jednak łatwa do wdrożenia i odtworzenia i może być szeroko stosowana do precyzyjnego oznaczania ilościowego tylko TNT na bazie aktyny oraz do odróżniania ich od neurytów i struktur podobnych do TNT dodatnich β-tubuliny.

Protocol

UWAGA: Komórki SH-SY5Y hodowane w pożywkach DMEM/F-12 różnicowano za pomocą 10 μM kwasu retinowego przez 7 dni i traktowano oligomerami 1 μM oAβ przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (5% CO₂). Po leczeniu komórki utrwalano roztworem utrwalającym Karnovsky'ego i podwójnie barwiono immunologicznie przeciwciałem fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) i falloidyną wiążącą F-aktynę. Później konfokalne obrazy stosu z użyciem konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. TNT określono ilościowo za pomocą ręcznego liczenia i odróżniono od innych neurytów/wypukłości komórkowych poprzez konstruowanie obrazów 3D widoku objętościowego i identyfikowanie struktur na podstawie ich charakterystyki unoszenia się między dwiema komórkami bez dotykania podłoża (Rysunek 1).

1. Hodowla komórkowa i różnicowanie

1. Hodowla komórek neuronalnych SH-SY5Y w pożywce DMEM/F12 (Hama) w stosunku 1:1 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% mieszaniną penicyliny, streptomycyny i neomycyny (PSN). Zasiej komórki w naczyniu do obrazowania o średnicy 35 mm z 14-milimetrowym dołkiem utworzonym z szkiełka nakrywkowego #1.5 pośrodku naczynia przymocowanego do dna. Zasiaj komórki na czaszy obrazowania w stężeniu 12 000 komórek/^cm2 i przeprowadź eksperymenty przy zbiegu 60%-70%.
2. Częściowo różnicować komórki za pomocą 10 μM kwasu retinowego (RA) ze 100 mM roztworu podstawowego (5 mg RA w 15 ml dimetylosulfotlenku [DMSO]). Następnie inkubować komórki przez 7 dni w temperaturze 37 °C (5% CO_{2 )} w celu różnicowania ze zmianą pożywki co 2 dni.
   UWAGA: Uważaj na utrzymanie zbiegu (60%-70%) komórek (zarówno komórek niezróżnicowanych, jak i częściowo zróżnicowanych). Gęstość komórek może wpływać na tworzenie się TNT między komórkami.

2. Przygotowanie oligomerów β amyloidu_1-42 (oAβ) do leczenia komórek nerwowych

1. Rozpuścić Aβ _1-42 (1 mg) w 200 μl 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu i podzielić roztwór na 20 podwielokrotności, z których każda zawiera 0,05 mg peptydów. Liofilizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
2. Przygotować roztwór podstawowy (5 mM) liofilizowanego Aβ _1-42 w DMSO, dodając 2,2 μl DMSO do 0,05 mg liofilizowanego peptydu. Aby ostrożnie rozpuścić peptydy, należy zwirować roztwór i sonikować przez 2 minuty w sonikatorze łaźni wodnej.
Rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia 100 μM w DMEM, pH 7,4 i zawirować w celu przekształcenia peptydów w monomery, a następnie przeprowadzić inkubację w temperaturze 4 °C przez 24 godziny w celu uzyskania oligomerów Aβ _1-42 (oAβ)12,21,22.
4. Scharakteryzuj oAβ przed eksperymentami, jak opisano wcześniej^21,22 za pomocą obrazowania w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
5. Częściowo zróżnicowane komórki SH-SY5Y należy potraktować 1 μM oAβ. Usuń pożywkę przed zabiegami i dodaj świeży DMEM wolny od FBS. Po zmianie pożywki dodać wcześniej przygotowane oAβ (100 μM) do pożywki do końcowego stężenia 1 μM. Inkubować komórki z 1 μM oAβ przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (5 % CO₂ ). Uwzględnij kontrolę negatywną w postaci nieleczonych komórek.

3. Barwienie immunologiczne F-aktyny i aktywowanego PAK1 w celu scharakteryzowania TNT

1. Wykonaj różnicowe barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciała fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) i falloidyny wiążącej fallotynę F-aktyny.
2. Przemyć komórki kontrolne i poddane działaniu oAβ 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) przez 2 x 2 minuty przed utrwaleniem. Przygotować roztwór utrwalający Karnovsky'ego, używając 2% utrwalacza formaliny i 2,5% aldehydu glutarowego rozpuszczonego w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,2. Następnie utrwal komórki w naczyniu do obrazowania, dodając roztwór utrwalający Karnovsky'ego (tylko tyle, aby pokryć komórki) przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przemyć utrwalone komórki 2 x 2 minuty przy użyciu buforu do inkubacji. Przygotować bufor inkubacyjny (20x) rozpuszczając 0,1 g saponiny w 5 ml FBS i rozcieńczyć do 1x, dodając 95 ml 1x PBS.
4. Po utrwaleniu dodać pierwsze przeciwciało przeciwko phopho-PAK1 w rozcieńczeniu 1:250 do buforu inkubacyjnego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemnej, wilgotnej komorze.
5. Następnego dnia, po 24 godzinach inkubacji, przemyć komórki 2 x 2 minuty buforem do inkubacji, a następnie dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1000) i falloidyną 555 (rozcieńczenie 1:1000). Inkubować komórki w ciemnej, wilgotnej komorze przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Po inkubacji przemyć komórki 2 x 2 minuty buforem do inkubacji. Wybarwić jądro, dodając 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) w rozcieńczeniu 1:2,000 i inkubować przez 5 minut do 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Przygotuj podłoże montażowe DABCO, używając 25 mg DABCO w 90% glicerolu i 10% 1x PBS. Aby prawidłowo się rozpuścić, dostosuj pH do 8,6 za pomocą klasy spektrofotometrycznej, rozcieńczyć HCl (rozcieńczony wodą w stosunku 1:20) i trzymaj roztwór na kołysce do wymieszania.
8. Jako środek przeciwwybielający dodaj podłoże montażowe DABCO bezpośrednio na naczynie obrazowe zawierające szkiełko nakrywkowe na dole. Odczekaj co najmniej 1-2 godziny i bezpośrednio przystąp do wykonywania obrazowania konfokalnego.
   UWAGA: Do mocowania szkiełek nakrywkowych nie są wymagane żadne kleje.

4. Barwienie immunologiczne F-aktyny i tubuliny β-III w celu odróżnienia TNT od neurytów

1. Wykonaj różnicowe barwienie immunologiczne za pomocą przeciwciała tubuliny β-III i falloidyny wiążącej F-aktynę fallotoksyny.
2. Przemyj komórki poddane działaniu oAβ 2x 1x PBS przed dodaniem roztworu utrwalającego Karnovsky'ego. Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze pokojowej i przemywać komórki 2 x 2 minuty buforem do inkubacji.
3. Po utrwaleniu dodać przeciwciało przeciwko tubulinie β-III (TUBb3) w rozcieńczeniu 1:250 w buforze inkubacyjnym i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w ciemnej, wilgotnej komorze.
4. Następnego dnia umyj komórki buforem do inkubacji (2 x 2 min) i dodaj do tego samego naczynia przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1,000) i Phalloidyną 555 (rozcieńczenie 1:1,000). Następnie inkubuj komórki przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemnej, wilgotnej komorze.
5. Przemyć komórki 2x buforem do inkubacji i dodać DAPI barwiące jądrowo w rozcieńczeniu 1:2,000 przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
6. Dodaj środek wybielający DABCO do podłoża montażowego, jak wspomniano powyżej, i odczekaj 2 godziny przed obrazowaniem.

5. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Aby zidentyfikować TNT, należy uchwycić obrazy stosu z komórek barwionych immunologicznie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Zdjęcia można wykonać przy użyciu obiektywu DIC 40x/1,40 Oil z zestawami filtrów DAPI, izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i tetrametylorodaminy (TRITC).
2. Najpierw wybierz kanały, klikając kolejno wymagane lasery w oknach Ścieżka 1, Ścieżka 2 i Ścieżka 3 w oprogramowaniu konfokalnym. Kliknij opcję T-PMT poniżej okna Ścieżka 1, aby wykonać obrazy kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) z kanałami fluorescencji.
   UWAGA: Obrazy DIC są rejestrowane przez inny detektor oznaczony jako T-PMT.
3. Wybierz zakładkę pobierania oprogramowania, kliknij kartę Z-stack i poczekaj, aż otworzy się okno. Następnie kliknij skanowanie na żywo, aby ustawić ostrość komórek na dole naczynia. Wybierz ten skoncentrowany obraz jako pierwszy stos. Następnie ustaw ostrość w górę, aby zobaczyć najwyższą część komórki i wybierz ją jako ostatni stos. Zatrzymaj skanowanie na żywo i kliknij liczbę obok optymalnej zakładki, aby ustalić rozmiar kroku stosów. Rozmiar kroku określa liczbę wycinków i interwały na podstawie grubości komórek.
   UWAGA: Rozmiar kroku zostanie wybrany na podstawie próbkowania Nyquist, aby pobrać wystarczającą liczbę wycinków i upewnić się, że nie ma przerw między dwoma stosami. Próbkowanie Nyquist jest określane na podstawie celu i długości fal lights²³.
4. Wykonaj sekwencyjne obrazy trzech kanałów DAPI, FITC i TRITC za pomocą laserów 405 nm, 488 nm i 561 nm i uchwyć z czasem przebywania piksela 1,02 μs. Przechwytuj obrazy w kanale DIC z kanałami fluorescencyjnymi, aby obserwować granicę komórki.
5. Uchwyć stos obrazów o wymiarach x: 224,92 μm i y: 224,92 μm, z każdym pikselem o rozmiarze 220 nm² i skalowaniem z 415 nm.
6. Zrób zdjęcia przedstawiające kilka stosów z (15-22 stosów) od dołu do góry komórek. Zdobądź co najmniej 10 obrazów z losowego pola naczynia hodowlanego, aby uzyskać w sumie ~200-300 komórek.
7. Analizuj przechwycone obrazy w trybie offline, aby zidentyfikować TNT za pomocą analizy widoku objętościowego 3D

6. Analiza obrazów konfokalnych stosów z w celu identyfikacji i ilościowego określenia TNT

1. Otwórz obrazy konfokalne zapisane w formacie danych .czi w oprogramowaniu Fiji w celu analizy.
2. Wybierz opcję Hyperstack, aby wyświetlić każdy stos z i kanał obrazu. Poszukaj hiperstosów z-stacków i kanałów, które otwierają się w jednym oknie, jak pokazano na Rysunek 2. Przewiń paski przewijania kanału (oznaczone czerwonymi i zielonymi strzałkami) i z-stack (oznaczone niebieskimi strzałkami), aby wybrać dokładny stos określonego interesującego Cię kanału.
   UWAGA: W komórkach stałych, ponieważ unoszące się TNT lub kanały membranowe pozostają nad powierzchnią, struktury nie są widoczne w dolnych częściach stosów z. Jednak w komórkach stałych neuryty leżą na powierzchni i są wykrywalne w dolnych częściach stosów z (z = 0 do 2). Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z krokami identyfikacji.
3. Jak pokazano w Rysunek 2, najpierw wybierz kanał zabarwiony F-aktyną (oznaczony czerwonymi strzałkami), przewijając pasek kanału. Następnie ręcznie przewiń stosy z (oznaczone niebieskimi strzałkami), aby zobaczyć każdy stos jeden po drugim. Zidentyfikuj struktury zabarwione F-aktyną, które wydają się łączyć komórki, są widoczne w dolnych częściach stosów z i znajdują się blisko powierzchni naczynia obrazowania (z = 2) jako neuryty (oznaczone białymi strzałkami).
   UWAGA: Większość neurytów jest łatwa do zidentyfikowania, ponieważ wyglądają jak wydłużone wypukłości (oznaczone różowymi strzałkami).
4. Zidentyfikuj TNT, F-aktyno-dodatnie, unoszące się kanały międzykomórkowe, przewijając stosy z w kierunku góry (od z = 4 w Rysunek 2; oznaczone żółtymi strzałkami). Szukaj neurytów w pobliżu dolnych części z-stosów w kierunku powierzchni i obserwuj, że zaczynają one znikać wraz z przewijaniem z-stosów w kierunku góry (przy z = 6 w Rysunek 2; neuryty nie są wyraźnie widoczne).
5. Zidentyfikuj fosfo-PAK1-dodatnie TNT, podobnie jak F-aktyno-dodatnie TNT, analizując unoszący się charakter przewodów od z-stosów. Ponieważ barwienie fosfo-PAK1 jest słabsze niż barwienie F-aktyną, należy szukać TNT barwionych fosfo-PAK1 przy z = 4 (słabo widoczne) i przy z = 6 (wyraźne).
6. Następnie obserwuj obrazy DIC, aby sprawdzić, czy struktury TNT barwione F-aktyną i fosfo-PAK1 są kanałami błonowymi między komórkami (Rysunek 3). Ponadto połącz kanały F-aktyny (czerwone) i fosfo-PAK1 (zielone), aby sprawdzić, czy zidentyfikowane TNT są współbarwionymi strukturami F-aktyny i fosfo-PAK1 (Rysunek 3).
7. Aby określić ilościowo TNT, należy ręcznie policzyć całkowitą liczbę komórek i zidentyfikowane TNT i przedstawić liczby w procentach.
8. Aby odróżnić F-aktynowo-dodatnie TNT i β-III tubuliny (TUBb3), podobne do TNT kanały unoszące się na tle TNT od obrazów stosu z, połącz kanały F-aktyny (czerwony) i TUBb3 (zielony) (Rysunek 4). Następnie przeanalizuj stosy z scalonych obrazów.
   1. Szukaj wyłącznie TNT barwionych F-aktyną, które są słabo widoczne przy z = 3 i widoczne przy z = 6 i z = 9 (żółte strzałki). Podobnie zidentyfikuj podwójnie dodatnie, przypominające TNT rurki F-aktyny i tubulinę β-III (TUBb3) przy z = 6 i z = 9 (cyjanowe strzałki). Zidentyfikuj inne barwione tubuliną F-aktyną i β-III, nie unoszące się wypukłości z dolnych części stosów z (białe strzałki).
9. Zmierz średnicę trotylu za pomocą narzędzia do linii na Fidżi. Sprawdź skalę pomiaru, klikając przycisk Analizuj | Ustaw skalę tak, aby "odległość w pikselach" była ustawiana automatycznie z obrazów .czi. Zmierz średnice trotylu w płaszczyźnie xy.
   UWAGA: Większość średnic mieści się w zakresie od 1 piksela do 4 pikseli (tj. 220-880 nm); Każdy piksel ma długość fali 220 nm. Zobacz Rysunek 5 zawiera podsumowanie protokołu analizy obrazów konfokalnych z-stack
.

7. 3D rekonstrukcja obrazów z-stack w celu scharakteryzowania TNT

1. Użyj wtyczki przeglądarki woluminów na Fidżi, która umożliwia ponowne cięcie 3D i wizualizację 3D z obsługą progów (Rysunek 6).
2. Podziel obrazy z-stack na poszczególne kanały. Następnie przytnij jednokanałowe (kanał F-aktyny) obrazy z-stack, aby użyć widoku rekonstrukcji 3D do podświetlenia jednego lub dwóch TNT lub neurytów na raz. Włącz wtyczkę widoku woluminu, aby wizualizować widoki xy, yz i xz.
3. Przypnij pojedynczy TNT lub neuryt w płaszczyźnie xy (białe strzałki reprezentują neuryty w Rysunek 6A; żółte strzałki reprezentują TNT w Rysunek 6B) i zaznacz przekroje osi xz (czerwony) i yz (zielony). Obserwuj neuryty na dole płaszczyzny xz w płaszczyznach xz i yz (białe strzałki, Rysunek 6A) i TNT w górnych stosach z (żółte strzałki, Rysunek 6B).
4. Wybierz pojedynczy TNT lub neuryt, aby zrekonstruować widok objętości 3D w płaszczyźnie xz (Rysunek 6C, D). W rekonstrukcji 3D obserwuj neuryty na dole płaszczyzny z (białe strzałki, Rysunek 6C) oraz TNT pojawiające się jako unoszące się struktury łączące dwie komórki bez dotykania dolnej płaszczyzny z (żółte strzałki, Rysunek 6D).

Results

Tutaj identyfikujemy i charakteryzujemy TNT indukowane przez oAβ w komórkach neuronalnych SH-SY5Y, konstruując widoki objętości 3D z konfokalnych obrazów stosu z (Rysunek 1). Komórki zostały podwójnie wybarwione immunologicznie F-aktyną i fosfo-PAK1. Konfokalne obrazy stosu Z komórek barwionych immunologicznie przeanalizowano w celu identyfikacji TNT (Ryc. 2). Ponadto przeanalizowano obrazy DIC w celu sprawdzenia, czy struktury TNT barwione F-aktyną i fosfo-PAK1 były kanałami błono...

Discussion

Kilku badaczy w ciągu ostatnich 2 dekad próbowało zrozumieć i scharakteryzować strukturę trotylu¹⁸. Brak specyficznych markerów hamuje postęp i rośnie zapotrzebowanie na wygodną, ustandaryzowaną metodę, którą można wykorzystać do identyfikacji, scharakteryzowania i ilościowego określenia TNT. TNT definiuje się jako przewody błonowe oparte na F-aktynie, które unoszą się między dwiema komórkami. Badania wykazały, że β-tubulino-dodatnie, zamknięte, rozwijające się neuryty unoszą się między dwiema odl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naczynie 35 mm z dołkiem 14 mm wykonane z #1,5 szkiełka nakrywkowego	Cellvis	D35-14-1,5-N	Naczynie do obrazowania używane do wysiewu komórek do eksperymentów barwiących
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomery beta amyloidu w leczeniu komórek
Mąka Alexa 488 Koza Anty-królicza IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Przeciwciało drugorzędowe dla phospho-PAK1
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Zapewnij odpowiednie warunki do hodowli komórkowej
CO2 Inkubator Thermo	Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	Do hodowli komórek w temperaturze ciała lub w jej pobliżu
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Potrafi generować trójwymiarowe obrazy dużych próbek w superrozdzielczości
DABCO [1,4-diazobicyclo-(2,2,2) oktan]	Merck	8034560100	Odczynnik przeciwwybielający
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM	media Gibco	11965092	Służy do przygotowania 100uM Aβ (1-42)
DMEM/F12 (mieszanina DMEM i szynki w stosunku 1:1) s F12)	Gibco	12500062	Pożywka hodowlana dla SH-SY5Y
DMSO (siarczek dimetylu) Klasa hodowli komórkowej	Cryopur	CP-100	Klasa hodowli komórkowej stosowana jako środek rozpuszczający kwas retinowy
DMSO (siarczek dimetylu) Klasa molekularna	Himedia	MB058	Stosowany jako jeden ze środków rozpuszczających liofilizowany A β (1-42)
Surowica bydlęca płodu	Gibco	16000044	Główny suplement do pożywek hodowlanych (pochodzenie z USA)
Utrwalacz formaliny (neutralny buforowany 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Składnik w roztworze utrwalającym Karnovsky'ego
Aldehyd glutarowy (stopień I, 25% w H2O)	Sigma	G5882	Składnik w roztworze utrwalającym Karnovsky'ego
HFIP (1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol) roztwór	TCI	H024	Służy do rozpuszczania Aβ (1-42) 1 mg
Oprogramowanie do przetwarzania/analizy obrazu: FIJI (ImageJ)	Narodowy Instytut Zdrowia (NIH)		Służy do przetwarzania/analizy obrazów i odróżniania TNT od neurytów za pomocą wtyczki o nazwie "przeglądarka woluminów".
Liofilizator	Chrystus, Alpha	2,4 LDplus	0,05 mg porcje Aβ (1-42) może być przechowywany w -20 ° C tylko po liofilizacji
Mieszanina penicyliny, streptomycyny i neomycyny	Thermo fisher Scientific	15640055	Mieszanina antybiotyków
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	Barwnik wiążący F-aktynę
Phospho-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) [Królik]	CST	#2601	Przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało poliklonalne przeciwko tubulinie Beta 3 (TUBb3)	Klon chmury	PAE711Hu01	Przeciwciało pierwszorzędowe
Kwas retinowy	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Odczynnik różnicujący
Saponina	Merck	8047-15-2	Detergent stosowany w buforze inkubacyjnym w barwieniu immunologicznym
Sonikator kąpieli wodnej (kwarta, grzałka zaworu spustowego)	Myjka ultradźwiękowa	3.0 L/3.2	Sonikator używany do rozpuszczania Aβ (1-42) bulion, po dodaniu do niego DMSO podczas przygotowywania 100 &mikro; M Aβ (1-42)
Oprogramowanie do mikroskopii ZEN	ZEISS (Carl Zeiss)		Oprogramowanie do obrazowania do pozyskiwania obrazów mikroskopii konfokalnej z inteligentną automatyzacją