Artykuł metodologiczny

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63996

⸱

26 maja 2022

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Myology Institute, University of Florida College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Zastąpienie zdrowej tkanki mięśniowej tłuszczem śródmięśniowym jest charakterystyczną cechą ludzkich chorób i schorzeń. Protokół ten określa, jak wizualizować, obrazować i określać ilościowo śródmięśniową tkankę tłuszczową, umożliwiając rygorystyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw tworzenia się śródmięśniowej tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

Fibro-adipogenne komórki progenitorowe (FAP) to mezenchymalne komórki zrębowe, które odgrywają kluczową rolę podczas homeostazy i regeneracji mięśni szkieletowych. FAP budują i utrzymują macierz zewnątrzkomórkową, która działa jak molekularne rusztowanie z włókien mięśniowych. Ponadto FAP są niezbędne do regeneracji włókien mięśniowych, ponieważ wydzielają wiele korzystnych czynników wyczuwanych przez komórki macierzyste mięśni (MuSC). Jednak w stanach chorobowych FAP są komórkowym pochodzeniem śródmięśniowej tkanki tłuszczowej i zwłókniejącej tkanki bliznowatej. To zwłóknienie tłuszczowe jest cechą charakterystyczną sarkopenii i chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a. Jedną z istotnych barier w ustaleniu, dlaczego i w jaki sposób FAP różnicują się w tłuszcz śródmięśniowy, jest skuteczne zachowanie i późniejsza wizualizacja adipocytów, zwłaszcza w zamrożonych skrawkach tkanek. Konwencjonalne metody przetwarzania tkanki mięśni szkieletowych, takie jak szybkie zamrażanie, nie zachowują prawidłowo morfologii poszczególnych adipocytów, uniemożliwiając w ten sposób dokładną wizualizację i kwantyfikację. Aby pokonać tę przeszkodę, opracowano rygorystyczny protokół, który zachowuje morfologię adipocytów w sekcjach mięśni szkieletowych, umożliwiając wizualizację, obrazowanie i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Protokół określa również, w jaki sposób przetwarzać część tkanki mięśniowej do RT-qPCR, umożliwiając użytkownikom potwierdzenie zaobserwowanych zmian w tworzeniu tłuszczu poprzez oglądanie różnic w ekspresji genów adipogennych. Dodatkowo można go dostosować do wizualizacji adipocytów poprzez immunofluorescencję całych próbek mięśniowych. Wreszcie, protokół ten określa, w jaki sposób przeprowadzić genetyczne śledzenie linii FAP eksprymujących Pdgfrα w celu zbadania adipogennej konwersji FAP. Protokół ten konsekwentnie zapewnia wysokiej rozdzielczości i morfologicznie dokładne obrazy immunofluorescencyjne adipocytów, wraz z potwierdzeniem za pomocą RT-qPCR, co pozwala na solidną, rygorystyczną i powtarzalną wizualizację i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Opisany tutaj proces analizy jest pierwszym krokiem do lepszego zrozumienia, w jaki sposób FAP różnicują się w tłuszcz śródmięśniowy i zapewnia ramy do walidacji nowatorskich interwencji zapobiegających tworzeniu się tłuszczu.

Wprowadzenie

Infiltracja zdrowej tkanki mięśniowej przez włóknienie tłuszczowe jest charakterystyczną cechą dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) i innych chorób nerwowo-mięśniowych, a także sarkopenii, otyłości i cukrzycy1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Chociaż zwiększona infiltracja tłuszczowa w tych schorzeniach jest silnie powiązana ze spadkiem funkcji mięśni, nasza wiedza na temat przyczyn i mechanizmów powstawania tłuszczu wewnątrzmięśniowego jest wciąż ograniczona. FAPs stanowią multipotentną populację mezenchymalnych komórek stropowych obecną w większości narządów dorosłych, w tym w mięśniach szkieletowych11,12. Jednak wraz z wiekiem oraz w przebiegu chorób przewlekłych komórki FAPs wytwarzają włóknistą tkankę bliznowatą i różnicują się w adipocyty, które lokalizują się pomiędzy poszczególnymi włóknami mięśniowymi i tworzą tłuszcz wewnątrzmięśniowy13,14,15,16,17,18,19,20.

Aby rozpocząć walkę z tworzeniem się tłuszczu wewnątrzmięśniowego, należy zdefiniować mechanizmy, dzięki którym FAP przekształcają się w adypocyty. PDGFRα jest „złotym standardem” markerów stosowanych w tej dziedzinie do identyfikacji FAP w mięśniach wielu gatunków13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. W rezultacie opracowano kilka mysich linii Cre indukowalnych tamoksyfenem, znajdujących się pod kontrolą promotora Pdgfrα, co umożliwia genetyczną manipulację FAP in vivo z wykorzystaniem systemu Cre-LoxP27,28,29. Na przykład, poprzez połączenie tej indukowalnej linii Cre z reporterem genetycznym, można przeprowadzić śledzenie linii FAP – strategię, którą z sukcesem zastosowaliśmy do mapowania losów FAP w mięśniach i białej tkance tłuszczowej20,30. Poza śledzeniem linii, linie Cre te stanowią cenne narzędzia do badania konwersji FAP w tkankę tłuszczową.

Główną przeszkodą w zdefiniowaniu mechanizmu konwersji adipogennej FAP w tłuszcz wewnątrzmięśniowy jest możliwość rygorystycznego i powtarzalnego określenia ilości tłuszczu wewnątrzmięśniowego, który utworzył się w różnych warunkach. Kluczem jest zrównoważenie zachowania tkanki mięśniowej i tłuszczowej oraz dopasowanie tego do dostępnych metod barwienia w celu wizualizacji adipocytów. Na przykład mięśnie szkieletowe są często mrożone szokowo bez wcześniejszej fiksacji, co pozwala zachować włókna mięśniowe, ale zaburza morfologię adipocytów (Rysunek 1). Z kolei fiksacja z późniejszym zatopieniem w parafinie, mimo że zapewnia najlepszą histologię tkanki, w tym adipocytów, usuwa wszystkie lipidy, czyniąc tym samym większość barwników lipofilnych, takich jak powszechnie stosowany Oil Red O, bezużytecznymi.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy tkanki tłuszczowej wewnątrzmięśniowej w tkankach mięśniowych zamrożonych gwałtownie w porównaniu z utrwalonymi. (A) Schematyczny przegląd układu eksperymentalnego. Obrazy immunofluorescencyjne przedstawiające adipocyty (żółte), włókna mięśniowe (szare) i jądra (cyjan) w mięśniach TA (B) zamrożonych gwałtownie oraz (C) utrwalonych 21 dni po uszkodzeniu glicerolem. Paski skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Opisany tutaj protokół zachowuje morfologię włókien mięśniowych i adipocytów oraz umożliwia wizualizację i analizę wielu typów komórek. Podejście to opiera się na barwieniu immunofluorescencyjnym adipocytów w tkance mięśniowej utrwalonej w paraformaldehydzie (PFA), co pozwala na jednoczesne barwienie przy użyciu wielu przeciwciał. Można je również łatwo dostosować do przestrzennego obrazowania tłuszczu wewnątrzmięśniowego w nienaruszonej tkance przy użyciu obrazowania całych preparatów (whole-mount imaging), dostarczając tym samym informacji o mikrośrodowisku komórkowym tłuszczu w obrębie mięśnia. Ponadto protokół ten można połączyć z naszą niedawno opublikowaną metodą wyznaczania pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych w utrwalonych tkankach mięśniowych31, co jest istotnym pomiarem w ocenie stanu zdrowia mięśni. Przedstawiono tutaj również połączenie tego podejścia z genetycznym śledzeniem linii komórkowych (lineage tracing) w celu mapowania losów różnicowania się FAPs w adipocyty. Zatem opisany tutaj wszechstronny protokół umożliwia rygorystyczną i powtarzalną ocenę FAPs oraz ich różnicowania w tłuszcz wewnątrzmięśniowy w przekrojach tkankowych i nienaruszonych tkankach.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Schematyczny przegląd protokołu. Schematyczny przegląd obróbki tkanek, w której jedna trzecia TA zostaje usunięta, zamrożona w ciekłym azocie i homogenizowana w celu późniejszej izolacji RNA i analizy transkrypcji za pomocą RT-qPCR. Pozostałe dwie trzecie TA są utrwalane w PFA i poddawane obróbce w celu immunostainingu na skrawkach mrożonych lub całych włóknach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Florydy.

1. Śledzenie linii genetycznej FAPs

UWAGA: Jeśli śledzenie linii genetycznej FAP nie jest wymagane, można pominąć krok 1.

  1. Aby przeprowadzić śledzenie linii komórkowych FAP, należy pozyskać niezbędne allele mysie.
    UWAGA: W celu skutecznego celowania w FAP wygenerowano kilka linii Cre indukowalnych tamoksyfenem, znajdujących się pod kontrolą promotora Pdgfrα, w tym z laboratoriów Hogana29, Rando27 i Berglesa32. Jako genetyczne reportery aktywności Cre dostępne są liczne allele reporterowe Rosa26, takie jak Rosa26EYFP33. Choć sugeruje się, aby każde laboratorium samodzielnie określiło, która kombinacja Cre-Reporter jest najskuteczniejsza, to poprzez krzyżowanie myszy PdgfrαCreERT2 (29 oraz Jax# 032770) z reporterem Rosa26EYFP (33 oraz Jax# 006148), otrzymane myszy PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP mogą być wykorzystane do wydajnego i specyficznego znakowania FAP20. Aby śledzić losy dojrzałych FAP, zaleca się odczekać, aż myszy osiągną wiek co najmniej ~10 tygodni przed podaniem tamoksyfenu. Eksperymenty ze śledzeniem linii komórkowych można przeprowadzać zarówno na samcach, jak i samicach.
  2. Podawanie tamoksyfenu poprzez zgłębnik do żołądka (gavage)
    1. Przygotować tamoksyfen w stężeniu 40 mg/mL w oleju kukurydzianym i dobrze wymieszać na wirówce typu vortex na 1 dzień przed podaniem. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C w rotacyjnym inkubatorze do hybrydyzacji.
      OSTROŻNIE: Tamoksyfen jest substancją rakotwórczą i należy z nim obchodzić się ostrożnie. Podczas pracy z nim zawsze należy nosić rękawiczki, a podczas odważania w formie proszku maseczkę, ze względu na ryzyko inhalacji.
    2. Oczyścić obszar zgodnie z protokołem i przymocować igłę do zgłębnika do strzykawki 1 mL. Nabrać 200 µL tamoksyfenu do strzykawki.
    3. Utrzymać myszy PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP (w wieku 10 tygodni; użyte oba płcie) poprzez położenie ich na płaskiej powierzchni i mocne chwycenie za nasadę ogona. Wolną ręką chwycić środek ciała myszy kciukiem i palcem wskazującym, a następnie delikatnie, z lekkim naciskiem, przesunąć chwyt tuż za barki.
    4. Odciągnąć skórę kciukiem i palcem wskazującym, podnieść mysz i obrócić dłoń tak, aby mysz była zwrócona w stronę operatora, a ogon wsunąć między mały a serdeczny palec dłoni trzymającej mysz.
    5. W tym momencie należy upewnić się, że mysz jest dobrze unieruchomiona i nie może poruszać głową ani kończynami przednimi. Wprowadzić igłę do zgłębnika do pyska i za jej pomocą lekko odchylić głowę myszy do tyłu; ułatwia to dostęp do przełyku.
    6. Ostrożnie i powoli wprowadzić igłę do przełyku. Nie forsować igły w przypadku napotkania oporu; igła powinna gładko przesuwać się w dół. Powoli wstrzyknąć tamoksyfen. Monitorować myszy przez 15-20 min, aby upewnić się, że podczas podawania nie wystąpiły żadne problemy.
      UWAGA: Podawanie tamoksyfenu przez 2 kolejne dni zazwyczaj skutkuje wydajnością rekombinacji FAP na poziomie ~75%-85% bez wywoływania działań niepożądanych. Zaleca się, aby operator odczekał 1-2 tygodnie przed indukcją urazu, co pozwoli na usunięcie pozostałego tamoksyfenu z organizmu i obrót pozostałego białka.

2. Uszkodzenie mięśnia piszczelowego przedniego (TA)

UWAGA: W celu badania tłuszczu wewnątrzmięśniowego zaleca się zastosowanie modelu urazu opartego na glicerolu (50% glicerolu w soli fizjologicznej), który prowadzi do masowego tworzenia się tłuszczu wewnątrzmięśniowego34,35,36,37.

  1. Przygotować aparat do znieczulania, dodając izofluran i upewniając się, że przewody do komory dla myszy oraz stożka nosowego są otwarte. Oczyścić komorę i obszar roboczy 70% etanolem lub roztworem nadtlenku (zależnie od protokołu).
  2. Ustawić przepływ tlenu na 2.5 L/min, a stężenie izofluranu na 2.5%. Umieścić mysz w komorze anestezjologicznej i odczekać ok. 5 min do momentu znieczulenia.
  3. Położyć mysz na plecach na czystej podkładce grzewczej i wprowadzić nos do stożka nosowego. Delikatnie nałożyć weterynaryjną maść oftalmiczną na oczy za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia. stale monitorować stan znieczulenia i przed wykonaniem urazu przeprowadzić test uszczypnięcia palca u myszy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.
  4. Oczyścić nogę przeznaczoną do zastrzyku świeżą chusteczką nasączoną alkoholem w celu dezynfekcji.
  5. Nabrać do strzykawki insulinowej 30-50 µL 50% glicerolu (zależnie od wielkości myszy). Delikatnie odsunąć sierść na piszczeli, aby odsłonić miejsce położenia m. TA.
    UWAGA: Przesunięcie sierści i uzyskanie lepszej widoczności jest łatwiejsze, gdy jest ona jeszcze wilgotna po przetarciu chusteczką z alkoholem.
  6. Po zlokalizowaniu m. TA (znajduje się on bocznie względem kości piszczelowej, lekko wystaje przez skórę i jest wyczuwalny przy delikatnej palpacji), wprowadzić igłę do m. TA w części dystalnej, w pobliżu kostki. Wprowadzić igłę całkowicie do mięśnia i powoli wstrzyknąć glicerol, stopniowo wycofując igłę, co pozwala na uszkodzenie większości mięśnia.
    UWAGA: Najlepiej wprowadzać igłę równolegle do nogi, pod niewielkim kątem. Prawidłowo wykonany uraz zazwyczaj powoduje zgięcie grzbietowe, gdy m. TA kurczy się po wycofaniu igły. Jeśli palce myszy rozszerzają się, prawdopodobnie doszło do wstrzyknięcia preparatu do mięśnia prostownika długiego palców (EDL).
  7. Umieścić mysz z powrotem w klatce i monitorować przez około 15-20 min do momentu wybudzenia z narkozy.
  8. Wyrzucić igłę do pojemnika na odpady ostre. Nigdy nie nakładać nasadki na używaną igłę.
    UWAGA: Analgezja po wstrzyknięciu glicerolu powinna być zapewniona zgodnie z zatwierdzeniem przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Adipocyty można obserwować już 5 dni po urazie (dpi). Do 7 dpi formują się wszystkie adipocyty, a do 21 dpi osiągają pełną dojrzałość.

3. Pobieranie tkanek

  1. Przygotować 4% PFA w 1x PBS i umieścić na lodzie przed rozpoczęciem pobierania tkanek.
  2. Umieścić płytki (12- lub 24-dołkowe) używane do fiksacji mięśni na lodzie i dodać 4% PFA do każdego dołka, upewniając się, że objętość PFA w każdym dołku jest 10-20 razy większa niż objętość fiksowanej tkanki.
  3. Od 7 do 21 dni po uszkodzeniu glicerolem eutanazować mysz zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (np. przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyi).
  4. Rozpocząć pobieranie tkanek przeznaczonych do badań histologicznych lub izolacji RNA.
    UWAGA: Tkanki należy zamrozić szokowo lub umieścić w PFA w ciągu 10-15 min od uśmiercenia (Rysunek 2).
  5. Obficie spryskać 70% etanolem obszary myszy, w których będą wykonywane nacięcia, aby zapobiec przedostawaniu się sierści do pola preparowania i na instrumenty.
  6. Za pomocą nożyczek naciąć skórę wokół górnej części nogi, w pobliżu miednicy (Rysunek 3A).
  7. Ostrożnie odsunąć skórę nogi od góry w stronę kostki (Rysunek 3B).
    UWAGA: Mięsień piszczelowy przedni (TA) jest mięśniem w kształcie łzy z wyraźnie zdefiniowanym ścięgnem dystalnym przyczepiającym się do kości klinowatej przyśrodkowej i pierwszej kości śródstopia. Znajduje się on bocznie względem piszczeli i sięga do dolnej części kolana.
  8. Przed pobraniem mięśnia TA usunąć ostro zakończoną pęsetą zewnętrzną warstwę tkanki łącznej (powięź zewnętrzną) (Rysunek 3C). W celu lepszej wizualizacji powięzi zewnętrznej należy użyć mikroskopu stereoskopowego.
  9. Wsunąć pęsetę pod mięsień TA od dołu, zaczynając od ścięgna dystalnego, i delikatnie pociągnąć w górę w kierunku kolana (Rysunek 3D). Przerwać czynność na końcu mięśnia; nie forsować ruchu poza oporem wyczuwalnym w dolnej części kolana.
  10. Jeśli przed dotarciem do dolnej części kolana wystąpi znaczny opór, należy przerwać czynność i kontynuować usuwanie pozostałych warstw tkanki łącznej.
    UWAGA: Tuż bocznie od ścięgna TA znajduje się inne ścięgno dystalne przyczepione do mięśnia prostownika długiego palców (EDL), który jest smukłym mięśniem położonym bocznie względem TA. Zachowanie ostrożności przy wsuwaniu pęsety wyłącznie pod ścięgno TA zapobiega przypadkowemu pobraniu EDL, który można jednak łatwo usunąć po fiksacji.
  11. Gdy mięsień TA zostanie częściowo uniesiony z nogi za pomocą pęsety, wykonać ten sam ruch skalpelem, aby przeciąć połączenie TA z dolną częścią kolana (Rysunek 3E). Przeciąć ścięgno przy kostce nożyczkami, aby całkowicie usunąć TA. Mięsień należy trzymać wyłącznie za ścięgno, aby uniknąć uszkodzenia włókien.
  12. Odciąć 1/3 mięśnia TA na końcu przeciwległym do ścięgna (Rysunek 3F), umieścić go w probówce do mikrocentryfugi i zamrozić szokowo, wrzucając do ciekłego azotu (Rysunek 3H).
  13. Zanurzyć pozostałe 2/3 tkanki w opisanym dołku z 4% PFA do badań histologicznych (Rysunek 3I). Należy dokładnie odnotować czas umieszczenia pierwszej i ostatniej tkanki w fiksatorze. Inkubować na wytrząsarce przez 2-2,5 h w temperaturze 4 °C.
  14. Czas fiksacji zależy od rodzaju i wielkości tkanki. Należy określić czas wymagany do utrwalenia tkanek. Fiksacja mięśni TA przez 2-2,5 h w 4 °C zazwyczaj pozwala na dobrą konserwację morfologii adipocytów bez powodowania nadmiernej fiksacji tkanki.
    UWAGA: W przypadku planowania barwienia immunofluorescencyjnego całych preparatów (whole-mount) mięśnia TA, należy pominąć pozostałą część tego protokołu aż do sekcji 7: „Barwienie immunofluorescencyjne całych preparatów”.
  15. Po fiksacji usunąć PFA z dołków, wypłukać tkanki zimnym 1x PBS 2-3 razy, a następnie przemyć 2-3 razy zimnym 1x PBS przez 5 min na każde przemywanie.
  16. Usunąć PBS z dołków i dodać wystarczającą ilość 30% sacharozy w 1x PBS, aby tkanka unosiła się na powierzchni. Inkubować na wytrząsarce w 4 °C przez noc.

figure-protocol-1
Rysunek 3: Podsumowanie pobierania tkanek. (A) Skórę nacinamy u podstawy nogi i (B) odsłaniamy mięśnie kończyny tylnej. (C) Po usunięciu epimysium z mięśnia TA, (D) za pomocą pęsety częściowo rozdzielamy mięsień, aby upewnić się, że epimysium zostało całkowicie usunięte. (E) Mięsień TA odcinamy od nogi skalpelem i wyjmujemy po przecięciu ścięgna. (G) Po podziale mięśnia TA na fragmenty w proporcji jednej trzeciej do dwóch trzecich, (H) jedną trzecią zamrażamy błyskawicznie w ciekłym azocie do analizy RT-qPCR, a (I) pozostałe dwie trzecie utrwalamy w 4% PFA do badań histologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Osadzanie

  1. Przygotować formy do zatapiania próbek, odpowiednio je opisując i wypełniając wystarczającą ilością medium do zatapiania, aby całkowicie zanurzyć tkanki.
  2. Wyjąć tkanki z dołków, osuszyć nadmiar sacharozy za pomocą ręcznika papierowego i przenieść je do wypełnionych medium mrożącym form do próbek.
    UWAGA: Warto wiedzieć, w jakiej orientacji forma zostanie poddana sekcjonowaniu w kriotomie. Dzięki temu użytkownik może ustawić tkanki w formie w taki sposób, aby obszar zainteresowania był łatwo dostępny. W przypadku mięśnia TA (m. piszczelowy przedni) osiąga się to poprzez skierowanie najgrubszej części (przeciwległej do strony ścięgna) w stronę powierzchni, która będzie sekcjonowana. Pozwala to na łatwe cięcie mięśnia TA w jego najgrubszym fragmencie (brzuścu) oraz umożliwia cięcie poprzeczne włókien mięśniowych.
  3. Przygotować zawiesinę izopentanu, częściowo zanurzając pojemnik z izopentanem w ciekłym azocie. Należy upewnić się, że w pojemniku znajduje się wystarczająca ilość ciekłego izopentanu, aby zanurzyć około połowy formy do próbek używanej do zatapiania tkanek.
  4. Rozpocząć mrożenie form, ostrożnie umieszczając je w zawiesinie izopentanu i upewniając się, że około połowa formy jest zanurzona. Należy również dopilnować, aby forma zamarzała równomiernie z każdej z czterech stron.
  5. Wyjąć formę z izopentanu tuż przed całkowitym, widocznym zamarznięciem jej górnej części. Czas trwania tego procesu zależy od rodzaju używanych form.
  6. Przechowywać zamrożone formy w pojemniku z suchym lodem podczas mrożenia pozostałych bloków, a następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Izopentan użyty do mrożenia może być wykorzystany ponownie. Należy przelać go do szklanej butelki, ale nie dokręcać szczelnie nakrętki, dopóki izopentan nie osiągnie temperatury pokojowej (RT). W przeciwnym razie zmiana ciśnienia mogłaby doprowadzić do rozbicia butelki.

5. Krojenie na skrawki

  1. Ustaw kriostat na -22 do -24 °C, umieść w nim formy zawierające TAs i odczekaj co najmniej 30 min w celu aklimatyzacji termicznej. W międzyczasie opisz serię dodatnio naładowanych szkiełek mikroskopowych.
  2. Włóż płytkę antyrolującą i wyrównaj ją względem kriostatu w taki sposób, aby w miejscu kontaktu z blokiem preparatu występowały minimalne nacięcia w płytce. Zabezpiecz ją w tej pozycji.
  3. Włóż nowe ostrze do uchwytu noża kriostatu i zabezpiecz je na miejscu.
    UWAGA: Ostrze jest ostre. Przykrywaj ostrze podczas manipulowania innymi częściami kriostatu lub zamrożonymi formami.
  4. Wyjmij zamrożony blok z formy. Nałóż równą warstwę medium zatopieniowego na uchwyt kriostatu i umieść blok w medium. Pozostaw na 1-3 min, aż medium zatopieniowe całkowicie zamarznie (stanie się nieprzezroczyste, białe).
    UWAGA: W przypadku TAs, najgrubszy obszar (brzusiec) powinien być widoczny po umieszczeniu na uchwycie.
  5. Umieść uchwyt kriostatu z blokiem tkankowym w kriostacie. Odsłoń ostrze i przesuń kriostat do przodu, aż do momentu zetknięcia się z ostrzem. Wykonuj skrawki z bloku o grubości 25 µm, dopóki tkanka nie przestanie być przesłonięta przez medium zatopieniowe.
    UWAGA: Podczas skrawania dostosuj kąt kriostatu i/lub pozycję stolika tak, aby skrawki miały jednolitą grubość. Pomocne może być zebranie kilku skrawków w celu upewnienia się co do jednolitości ich grubości. Zaleca się, aby użytkownik ustalił właściwą pozycję płytki antyrolującej przed rozpoczęciem skrawania w obszarze zainteresowania w obrębie TA (brzusiec), co pozwala na przetestowanie kilku pozycji płytki antyrolującej, aż skrawki będą odchodzić prosto, bez marnowania tkanki.
  6. Zmień grubość skrawka na 10-12 µm i zbieraj skrawki na opisanych szkiełkach mikroskopowych. Zaleca się skrawanie seryjne poprzez zbieranie sąsiednich skrawków na 6-10 szkiełkach (opisanych od 1-x), co umożliwia barwienie na wiele markerów. W razie potrzeby użyj cienkiego pędzla, aby rozprostować skrawki przed ich naniesieniem na szkiełko.
    UWAGA: Jeśli skrawki zwijają się, sprawdź, czy temperatura utrzymuje się stabilnie w zakresie -22 do -24 °C. Jeśli w skrawkach występują pionowe prążki, może to być spowodowane nacięciem w płytce antyrolującej lub ostrzu; można to naprawić poprzez regulację pozycji płytki antyrolującej i/lub wymianę ostrza na nowe.
  7. Po zebraniu sąsiednich skrawków z tej samej płaszczyzny skrawania na każde szkiełko, przywróć grubość do 25 µm, aby przejść o 150-200 µm w głąb bloku, następnie ponownie ustaw grubość na 10-12 µm i rozpocznij skrawanie.
    UWAGA: Takie skrawanie seryjne pozwala użytkownikowi na wizualizację, obrazowanie i kwantyfikację na różnych głębokościach w obrębie TA; wystarczające jest wykonanie trzech do czterech skrawków seryjnych na szkiełko.
  8. Przechowuj szkiełka i bloki tkankowe w temperaturze -80 °C.

6. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) przekrojów tkankowych

UWAGA: Ponieważ stężenia przeciwciał mogą różnić się w zależności od serii i producenta, zaleca się optymalizację poprzez ocenę kilku różnych stężeń przeciwciał na slajdach testowych przed barwieniem slajdów właściwych.

  1. Rozmrozić/wysuszyć preparaty w temperaturze pokojowej (RT) lub na płytce grzejnej w 37 °C przez 10-20 min.
  2. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysować linię na krawędzi papierowej powierzchni szkiełka, w miejscu jej styku ze szkłem.
  3. Umieścić szkiełka w naczyniu Coplina i przemyć 3-5x roztworem 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) na wytrząsarce przez co najmniej 5 min na każde przemycie, aby rehydratować skrawki tkanek.
    UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby nie pozostawiać szkiełek bez zanurzenia w PBST (do linii hydrofobowej), w przeciwnym razie skrawki tkanek wyschną.
  4. Umieścić szkiełka na statywie w komorze nawilżającej i pokryć je 310-350 µL roztworu blokującego (5% surowicy osła i 0,3% Triton X-100 w 1x PBS) na 1-2 h w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Dodatkowy etap permeabilizacji nie jest konieczny, ponieważ roztwór blokujący zawiera 0,3% Triton X-100, co zapewnia wystarczającą permeabilizację skrawków tkanek. Przy stosowaniu przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od myszy (np. PAX7 i MYOD1 wymienionych poniżej) zaleca się zastosowanie etapu blokowania typu „mouse-on-mouse” z użyciem fragmentów Fab (1:50) w roztworze blokującym. Pomoże to zredukować tło wynikające z niespecyficznego wiązania mysiego przeciwciała wtórnego do przeciwciał innych niż pierwszorzędowe.
  5. Tuż przed przejściem do następnego kroku rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym w następujący sposób:
    1. Przeciwciała pierwszorzędowe do barwienia adipocytów i obrazowania całych skrawków: rozcieńczyć króliki przeciwko Perilipinie w stosunku 1:1000.
    2. Przeciwciała pierwszorzędowe do śledzenia linii adipocytów: rozcieńczyć kurze przeciwko GFP w stosunku 1:1000 oraz króliki przeciwko Perilipinie w stosunku 1:1000.
    3. Przeciwciała pierwszorzędowe do śledzenia linii FAP: rozcieńczyć kurze przeciwko GFP w stosunku 1:1000 oraz kozie przeciwko PDGFRα w stosunku 1:250.
    4. Przeciwciała pierwszorzędowe dla markerów miogennych: rozcieńczyć mysie przeciwko PAX7 w stosunku 1:25 lub mysie przeciwko MYOD1 w stosunku 1:250 oraz króliki przeciwko LAMININIE w stosunku 1:1000.
      UWAGA: Choć powyższe przeciwciała zostały pomyślnie zweryfikowane w tym protokole, prawdopodobne jest, że inne markery i przeciwciała do znakowania FAP, adipocytów i/lub innych typów komórek są również kompatybilne z tą metodą. Przy pierwszym zastosowaniu przeciwciał pierwszorzędowych zdecydowanie zaleca się dołączenie szkiełka kontrolnego negatywnego, z którego pomija się przeciwciała pierwszorzędowe. Pozwoli to skontrolować specyficzność przeciwciał. Należy wykonać wszystkie pozostałe kroki protokołu, w tym dodanie przeciwciał wtórnych, jednak w następnym kroku zamiast przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym stosuje się sam roztwór blokujący.
  6. Zlać roztwór blokujący ze szkiełek i pokryć je 310-350 µL roztworu blokującego z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie inkubować przez noc w 4 °C w komorze nawilżającej.
  7. Następnego dnia zlać roztwór blokujący/przeciwciała pierwszorzędowe ze szkiełek i umieścić je w naczyniu Coplina. Przepłukać szkiełka 2-3 razy PBST i przemyć 3-5x PBST na wytrząsarce przez co najmniej 5 min na każde przemycie.
  8. Podczas ostatniego przemycia przygotować przeciwciała wtórne lub jakiekolwiek koniugaty bezpośrednie do użycia w roztworze blokującym. Zminimalizować czas ekspozycji tych przeciwciał na światło, aby uniknąć fotoblaknięcia.
    1. Rozcieńczyć przeciwciała wtórne/koniugaty bezpośrednie: osie przeciwko kurzym 488 nm (1:1000) lub przeciwko króliczym (1:1000) lub przeciwko mysim (1:1000), osie przeciwko kozim 568 nm (1:1000) lub przeciwko króliczym (1:1000) lub Faloidynę (włókna mięśniowe; 1:100), barwnik DAPI (jądra komórkowe; 1:500).
  9. Pokryć szkiełka 310-350 µL roztworu blokującego z przeciwciałami wtórnymi i/lub koniugatami bezpośrednimi w komorze nawilżającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 h. Od tego momentu chronić próbki przed światłem.
  10. Zlać roztwór blokujący/przeciwciała wtórne i umieścić szkiełka w naczyniu Coplina. Przepłukać raz PBST i przemyć 3-5x PBST na wytrząsarce przez co najmniej 5 min na każde przemycie. Przykryć naczynie Coplina, aby zapobiec ekspozycji na światło.
  11. Jak najlepiej osuszyć szkiełka, delikatnie stukając w krawędzie i wycierając spód ręcznikiem papierowym, dbając jednocześnie, aby skrawki tkanek nie wyschły.
  12. Nanieść trzy lub cztery krople wodnego medium montażowego na górną poziomą krawędź szkiełka i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkę. Nie dociskać i nie przesuwać nakrywki w przypadku powstania pęcherzyków powietrza; jakikolwiek nacisk lub ruch może zniekształcić delikatną architekturę komórkową adipocytów.
  13. Pozostawić medium montażowe do utwardzenia w ciemności przez noc przed obrazowaniem.

7. Barwienie immunofluorescencyjne całych preparatów

  1. Po około 1 h fiksacji (patrz krok 3.14), za pomocą pęsety z ostrym czubkiem oddziel włókna mięśniowe od utrwalonego mięśnia TA.
  2. Umieść odseparowane włókna na płytce 24-dołkowej i przemyj 3x przez 3 min każdorazowo roztworem PBST. Podczas wszystkich kolejnych inkubacji pamiętaj o nałożeniu pokrywy, aby zapobiec parowaniu.
  3. Inkubuj przez 1 h w 1% Triton X-100 w 1x PBS w RT (200-300 µL) na wytrząsarce, aby umożliwić lepszą penetrację przeciwciał.
  4. Po kilkukrotnym wypłukaniu PBST, pokryj próbki roztworem blokującym (200-300 µL) i inkubuj na nutatorze lub wytrząsarce przez noc w 4 °C.
  5. Rozcieńcz przeciwciała pierwszorzędowe do pożądanego stężenia (dobrym punktem wyjścia jest zazwyczaj podwojenie stężenia) w roztworze blokującym. Inkubuj próbki (200-300 µL) na nutatorze lub wytrząsarce przez noc w 4 °C.
  6. Dokładnie przemywaj próbki PBST w ciągu dnia, często wymieniając roztwór, w RT na wytrząsarce, około 4-6x przez 30-60 min każdego mycia.
  7. Rozcieńcz przeciwciała drugorzędowe w roztworze blokującym do pożądanego stężenia (zazwyczaj dobrze sprawdza się 1:500) wraz z barwnikiem do jąder komórkowych i inkubuj próbki (200-300 µL) na nutatorze lub wytrząsarce przez noc w 4 °C.
  8. Dokładnie przemywaj próbki PBST w ciągu dnia, często wymieniając roztwór, w RT na wytrząsarce, około 4-6x przez 30-60 min każdego mycia lub przemywaj przez noc w 4 °C.
  9. Aby zamontować preparat, delikatnie osusz nadmiar PBST, a następnie umieść włókna w jednej lub dwóch kroplach medium montażowego na szkiełku przedmiotowym (Rysunek 4A). Aby unieść szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm), dodaj małe nóżki z glinki; zapobiegnie to zmiażdżeniu włókien i unieruchomi nakrywkę na szkiełku. W tym celu dobrze sprawdzają się masy plastyczne. Po zabezpieczeniu nakrywki dodaj więcej medium do krawędzi, aż obszar pod nakrywką zostanie całkowicie wypełniony.
    UWAGA: Zamiast stosowania medium montażowego z dodatkiem środków przeciwblaknięciu, tkankę można również prowadzić przez rosnące stężenia glicerolu (od 30% do 80% glicerolu w PBS).
  10. Odczekaj 1-2 dni przed obrazowaniem, aby pozwolić na utwardzenie medium montażowego.

8. Obrazowanie tłuszczu wewnątrzmięśniowego

  1. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Przymocuj preparat do stolika.
    UWAGA: Do obrazowania adypocytów w przekrojach mięśni często wystarczający jest obiektyw 5x lub 10x w połączeniu z mikroskopią szerokopolową. Do wizualizacji WM-IF wymagany jest mikroskop konfokalny.
  2. Użyj dowolnego kanału, aby zidentyfikować obszar do obrazowania.
  3. W oprogramowaniu do obrazowania dostosuj wzmocnienie (gain) i czas ekspozycji dla każdego kanału.
  4. Wykonaj zdjęcia całej tkanki w każdym kanale (automatycznie lub ręcznie, zależnie od użytego mikroskopu i oprogramowania), a następnie połącz poszczególne kafelki, aby utworzyć kompozyt pełnego przekroju poprzecznego TA.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie zdjęć dwóch lub trzech różnych przekrojów tego samego TA na różnych głębokościach. Poprzez ilościowe określenie liczby adypocytów w każdym przekroju i wyznaczenie średniej, uniknie się błędów wynikających z lokalnych różnic w ilości tłuszczu wewnątrzmięśniowego, spowodowanych na przykład błędami podczas iniekcji.

9. Ilościowe oznaczanie adipocytów

  1. Jeśli nie został zainstalowany wcześniej, dodaj wtyczkę Cell Counter do programu ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
  2. Zaimportuj obrazy do ImageJ jako pliki TIF lub oryginalne pliki z mikroskopu. Wyświetl każdy kanał w ImageJ jako osobny plik TIF.
    UWAGA: W przypadku korzystania z plików LIF lub podobnych typów plików z mikroskopu, w opcjach Bio-Formats Import wybierz Hyperstack w polu View Stack With i zaznacz pole Split Channels. Kliknij OK, aby otworzyć plik. Upewnij się również, że pole Autoscale jest odznaczone.
  3. Upewnij się, że obrazy dla każdego kanału są w formacie 8-bitowym (i w skali szarości): Image > Type > 8-bit.
  4. Połącz obrazy DAPI (niebieski), GFP (zielony), PERILIPIN (czerwony) i PHALLOIDIN (szary): Image > Color > Merge Channels.
  5. Sprawdź, czy skala (Analyze > Set Scale) jest ustawiona w mikronach. Używając narzędzia do zaznaczania ręcznego (freehand selection tool), obrysuj uszkodzoną i nieuszkodzoną część każdego przekroju, a następnie zmierz (Analyze > Measure) i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym powierzchnię uszkodzoną w porównaniu z nieuszkodzoną.
    UWAGA: Uszkodzony mięsień można zidentyfikować jako obszary pozbawione włókien mięśniowych lub obszary zasiedlone przez włókna mięśniowe zawierające centralnie położone jądra.
  6. Uruchom Cell Counter: Plugins > CellCounter > Initialize.
  7. Wybierz typ licznika, a następnie policz każdy adipocyt. Zapisz całkowitą liczbę adipocytów w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie oblicz liczbę adipocytów na 1 mm2 obszaru uszkodzonego.

10. Analiza ekspresji genów adipogennych z wykorzystaniem RT-qPCR

  1. Izolacja RNA
    1. Przed rozpoczęciem podgrzać wodę wolną od RNaz do 45 °C i przygotować świeży 70% EtOH (350 µL na próbkę).
    2. Do każdej probówki zawierającej próbkę dodać 1 000 µL tiocyjanianu guanidyny (patrz krok 3.12.). Ważne jest stosowanie probówek zatwierdzonych do homogenizatorów kulkowych.
      UWAGA: Tiocyjanian guanidyny jest toksyczny. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.
    3. Do każdej probówki dodać trzy średnie kulki lub jedną dużą i jedną małą kulkę.
    4. Homogenizować tkankę przy 50 Hz przez 2-4 min za pomocą homogenizatora kulkowego. W zależności od rodzaju tkanki i wielkości próbki może to zająć do 10 min.
    5. Dodać 200 µL chloroformu.
      UWAGA: Chloroform jest toksyczny. Należy stosować środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.
    6. Wstrząsać próbkami przez 15 s. Inkubować przez 2-3 min w temperaturze pokojowej (RT).
    7. Wirować przez 15 min przy 12 000 x g. Odpipetować 350 µL klarownego supernatantu (górna warstwa zawierająca RNA) i przenieść do nowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 350 µL 70% etanolu. Należy uważać, aby nie pobrać dolnych warstw białek i/lub DNA
    8. Przenieść do 700 µL mieszaniny do mini kolumny spinowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 mL. Kontynuować izolację RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    9. Eluować 30-50 µL wody wolnej od RNaz, w zależności od oczekiwanej wydajności. RNA przechowywać na lodzie i zmierzyć wydajność za pomocą spektrofotometru. RNA przechowywać w temperaturze -80 °C
      UWAGA: Można pominąć etap traktowania DNazą, ponieważ ostrożne pobranie jedynie górnych 350 µL warstwy RNA jest wystarczające, aby zapobiec kontaminacji DNA. Poza analizą RT-qPCR, wyizolowane RNA może być również wykorzystane do sekwencjonowania RNA, w którym przypadku etap traktowania DNazą jest wysoce zalecany.
  2. Synteza cDNA
    1. Użyć do 1 µg RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Po zakończeniu procesu dodać 80 µL wody wolnej od RNaz. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. RT-qPCR genów selektywnych dla adipocytów.
    1. W formacie 384-dołkowym dodać 1 µL startera (~1 µM stężenie końcowe) na dno każdego dołka. Wstępne wysuszenie starterów pozwala na uzyskanie bardziej spójnych powtórzeń technicznych. Pozostawić przykryte do całkowitego odparowania starterów (płytkę można umieścić na bloku grzejnym ustawionym na 37 °C, aby przyspieszyć odparowanie).
    2. Przygotować reakcje z próbkami w czterech do ośmiu powtórzeniach technicznych w następujący sposób: 2,5 µL barwnikowego master mixu do RT-PCR, 2,1 µL wody wolnej od RNaz oraz 0,4 µL cDNA (~1 ng), przy całkowitej objętości 5 µL na dołek. Zastosowano następujące warunki cyklu termicznego: denaturacja w 95 °C przez 15 s oraz przyłączanie/elongacja w 60 °C przez 25 s przez 40 cykli.
    3. Znormalizować surowe wartości CT (próg cyklu) do poziomów genów referencyjnych (tj. Hprt i Pde12) poprzez obliczenie ΔΔCT zgodnie z opisem tutaj38. Sekwencje starterów znajdują się w20.
      UWAGA: Należy przestrzegać standardowej procedury analizy RT-qPCR, takiej jak zastosowanie kontroli bez odwrotnej transkrypcji (-RT), reakcji PCR oraz walidacji starterów.

Wyniki

Wizualizacja immunofluorescencyjna tkanki tłuszczowej wewnątrzmięśniowej
Zgodnie z powyższymi krokami i w odniesieniu do Rysunku 1A, pobrano przekroje tkanki mięśnia piszczelowego przedniego (TA) 21 dni po urazie glicerolem, które zostały albo zamrożone szokowo bezpośrednio po pobraniu w izopentanie chłodzonym w LN2, albo utrwalone w 4% PFA przez 2,5 h. Po wykonaniu kriotomii i barwieniu obu próbek, wykonano zdjęcia w połowie brzuszca, czyli w największym obszarze TA. Adipocyty PERILIPIN+ z nieutrwalonych mięśni TA (Rysunek 1B) wykazują znacznie zmienioną morfologię w porównaniu z przekrojami utrwalonymi (Rysunek 1C), co sprawia, że ich identyfikacja, wizualizacja i późniejsza kwantyfikacja są znacznie trudniejsze i potencjalnie niedokładne. Należy zauważyć, że pierwsze krople lipidowe PERILIPIN+ wykryto około 5 dni po urazie, a większość adipocytów uformowała się do 7. dnia. Do 21. dnia po urazie adipocyty były w pełni dojrzałe.

Ponieważ ilość tłuszczu na TA silnie koreluje z ciężkością wywołanego uszkodzenia, mięśnie TA muszą zostać znacząco uszkodzone, aby można było skutecznie obserwować i badać tworzenie tłuszczu wewnątrzmięśniowego. Ćwiczenie iniekcji z użyciem tuszu w preparatach pośmiertnych TA jest doskonałym sposobem na zwiększenie stopnia uszkodzenia. Skuteczne uszkodzenia zazwyczaj obejmują powyżej 50% mięśnia. Należy zauważyć, że uszkodzone obszary mięśnia reprezentują miejsca pozbawione włókien mięśniowych lub obszary zasiedlone przez włókna mięśniowe zawierające co najmniej jedno jądro położone centralnie, co jest znanym wyróżnikiem regenerującego się włókna mięśniowego.

Niniejszy protokół można łatwo dostosować do barwienia FAP oraz tłuszczu w 3D. W tym celu po utrwaleniu ostrożnie odseparowano liczne włókna mięśniowe z mięśnia TA, a następnie przeprowadzono immunofluorescencję całego preparatu (whole-mount). Kluczowe jest odpowiednie przymocowanie włókien do szkiełka przedmiotowego przy jednoczesnym unikaniu nadmiernej kompresji tkanki. Dzięki zastosowaniu formowalnych podkładek z gliny użytkownik może dostosować wymaganą grubość i przymocować szkiełko nakrywkowe do przedmiotu, co umożliwia nawet zastosowanie mikroskopu odwróconego (Rysunek 4A). Metoda ta została z sukcesem wykorzystana do znakowania FAP PDGFRα+, włókien mięśniowych Phalloidin+ oraz adipocytów wykazujących ekspresję PERILIPIN (Rysunek 4B, Supplemental Video 1 i Supplemental Video 2). Po uzyskaniu obrazów na wielu płaszczyznach z, obejmujących grubość do 150 µm, do stworzenia rekonstrukcji 3D wykorzystano moduł renderowania 3D w oprogramowaniu mikroskopu.

figure-results-1
Rycina 4: Barwienie immunofluorescencyjne całego preparatu (whole-mount). (A) Widok z góry i z boku sposób montowania próbki i nakładania szkiełka nakrywnego do barwienia całego preparatu. (B) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D komórek FAP (zielone; lewo) i adipocytów (czerwone; prawo) wraz z włóknami mięśniowymi (szare) i jądrami komórkowymi (niebieskie). Paski skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ilościowe oznaczanie tłuszczu wewnątrzmięśniowego
Po wykonaniu zdjęć tłuszczu wewnątrzmięśniowego, funkcję Cell Counter w programie ImageJ/FIJI wykorzystano do ręcznego policzenia liczby adipocytów PERLIPIN+ (Rycina 5A). Następnie określono całkowitą powierzchnię przekroju mięśnia, a także powierzchnię uszkodzoną, zdefiniowaną przez obecność jąder położonych centralnie wewnątrz włókien mięśniowych. Aby skontrolować stopień nasilenia urazu, całkowitą liczbę adipocytów podzielono przez powierzchnię uszkodzoną, co pozwoliło uzyskać liczbę komórek tłuszczowych na 1 mm2 uszkodzonego mięśnia. Zazwyczaj mięśnie TA wykazujące <30% uszkodzeń są wykluczane z analiz ilościowych. Należy zauważyć, że mimo iż adipocyty są rzadkie w przypadku braku urazu (od zera do ośmiu na powierzchnię przekroju), całkowita liczba adipocytów jest nadal normalizowana względem całkowitej powierzchni. Jak podkreślono na Rycynie 5B, uraz wywołany glicerolem powoduje powstanie ogromnych ilości tłuszczu wewnątrzmięśniowego w porównaniu do nieuszkodzonego mięśnia TA. Alternatywnie, ponieważ barwienie Perilipiny jest bardzo czyste i charakteryzuje się wysokim stosunkiem sygnału do szumu, można również zastosować funkcję Analyze Particle, aby określić całkowitą powierzchnię zajmowaną przez Perilipiny. Metoda ta nie pozwoli jednak na rozróżnienie między mniejszymi a mniejszą liczbą adipocytów. Wykonano zdjęcia i dokonano pomiarów ilościowych do trzech przekrojów z minimum czterech osobników, a następnie podano średnią liczbę komórek tłuszczowych obecnych u jednej myszy.

figure-results-2
Rysunek 5: Ilościowe oznaczenie tłuszczu wewnątrzmięśniowego. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący sposób zliczania adipocytów PERILIPIN+ (białe) przy użyciu funkcji Cell Counter w programie ImageJ. Pasek skali: 50 µm. (B) Ilościowe oznaczenie wszystkich adipocytów w mięśniu TA 21 dni po wstrzyknięciu glicerolu, znormalizowane do 1 mm2 obszaru uszkodzenia. Każda kropka reprezentuje średnią z jednej myszy. Słupki błędu przedstawiają SEM. **** = p < 0.0001. (C) Warstwa RNA po homogenizacji i następującym po niej rozdziele faz za pomocą chloroformu, wykorzystywana do analizy RT-qPCR. (D) Krotność zmian w poziomach ekspresji Pparg i Cepbα, wczesnych genów adipogennych, oraz Plin1 i Adipoq, dwóch markerów dojrzałych adipocytów, w różnych punktach czasowych po uszkodzeniu glicerolem. Każda kropka reprezentuje średnią z jednej myszy. Słupki błędu przedstawiają SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby niezależnie potwierdzić ilość obecnej tkanki tłuszczowej wewnątrzmięśniowej, można oznaczyć poziomy ekspresji genów różnych markerów adipogennych. W tym celu RNA można wyizolować z części tego samego mięśnia TA użytego do immunofluorescencji (patrz kroki powyżej) w różnych punktach czasowych po urazie. Do homogenizacji tkanki zastosowano homogenizator kuleczkowy (bead beater) w połączeniu z tiocyjanianem guanidyny. Po dodaniu chloroformu i odwirowaniu ostrożnie wyekstrahowano górną warstwę zawierającą RNA, a do oczyszczania RNA użyto minikolumienek wirowych (Rysunek 5C). Metoda ta rutynowo pozwala uzyskać wysoką jakość i ilość RNA odpowiednią do wszystkich analiz następczych, takich jak RT-qPCR i RNAseq. W przypadku RT-qPCR określono względne poziomy ekspresji genów adipogennych w stosunku do genów housekeepingowych, a wszelkie zmiany względne oceniono metodą ΔΔCT38. Jak przedstawiono na Rysunku 5D, w porównaniu z nieuszkodzonym mięśniem TA, uraz glicerynowy indukuje ekspresję wczesnych markerów adipogennych, takich jak Pparg i Cebpα, już 3 dni po urazie. Markery dojrzałe, takie jak Adiponectin (Adipoq) i Perilipin (Plin1), mogą być wykrywalne już 5 dni po urazie glicerynowym.

Genetyczne śledzenie linii adipocytów
Przedstawiony tutaj protokół barwienia adipocytów można łatwo dostosować w celu włączenia genetycznego śledzenia linii FAP, aby mapować i monitorować ich przekształcanie w adipocyty. Wykazaliśmy na przykład wcześniej, że rekombinację można było indukować via podaniem tamoksyfenu u myszy PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP  na 2 tygodnie przed urazem, co skutecznie usunęło sekwencję stop floxed i trwale aktywowało ekspresję EYFP w FAP (Rysunek 6A). Osiągnęliśmy wysoką wydajność rekombinacji przy zastosowaniu zaprezentowanego tutaj schematu podawania tamoksyfenu, gdzie ~75% FAP PDGFRα+ wykazywało ekspresję EYFP20, co jest zgodne z wynikami raportowanymi przez inne laboratoria27,39,40. Dowodząc, że FAP są rzeczywiście komórkowym pochodzeniem tłuszczu wewnątrzmięśniowego, wykazaliśmy, że większość FAP przekształciła się w adipocyty EYFP+ wykazujące ekspresję PERILIPINY 7 dni po urazie glicerolem (Rysunek 6B).

figure-results-3
Rycina 6: Śledzenie linii komórkowych FAP. (A) Schematyczny przegląd organizacji eksperymentalnej. (B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne wykazujące skuteczną rekombinację i aktywację EYFP (żółty) w komórkach FAP PDGFRα+ (czerwony, groty strzałek) oraz adipocytach PERILIPIN+ (czerwony, gwiazdki). Paski skali: 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykrywanie wielu typów komórek
Niniejszy protokół może być również wykorzystany do wizualizacji komponentu miogennego. Przy użyciu przeciwciał przeciwko PAX7 i MYOD1 można łatwo wykryć odpowiednio komórki macierzyste mięśni (MuSCs) oraz mioblasty 5 dni po uszkodzeniu glicerolem, nawet w przekroju tkanki mięśniowej utrwalonej w PFA (Rysunek 7). Zatem przedstawiony protokół jest wszechstronny i możliwy do dostosowania nie tylko do znakowania i obrazowania adipocytów oraz FAPs, ale także innych typów komórek linii miogennej.

figure-results-4
Rycina 7: Barwienie immunofluorescencyjne komórek macierzystych mięśni i mioblastów. (A) Schematyczny przegląd układu eksperymentalnego. (B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne pokazujące prawidłowe barwienie komórek macierzystych mięśni (MuSC) (żółty, lewo) przeciwciałem PAX7 oraz mioblastów (żółty, prawo) przeciwciałem MYOD1. LAMININA obrysowuje włókna mięśniowe (biały), a jądra komórkowe są w kolorze cyjanowym. Paski skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wideo dodatkowe 1: Rendering 3D FAPs. Rekonstrukcja trójwymiarowa włókien mięśniowych, FAPs oraz jąder komórkowych, odpowiednio barwionych na PHALLOIDIN (szary), PDGFRα (zielony) i DAPI (niebieski), 21 dni po urazie. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 2: Rendering 3D tłuszczu wewnątrzmięśniowego. Rendering wolumetryczny pęczków włókien mięśniowych (szary, PHALLOIDIN) oraz tłuszczu wewnątrzmięśniowego (czerwony, PERILIPIN), który zastąpił włókno mięśniowe 21 dni po uszkodzeniu glicerolem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia obszerny i szczegółowy protokół, który pozwala na efektywną wizualizację i rygorystyczną kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Dzięki podziale tego samego mięśnia na dwie części, z których jedna jest używana do immunofluorescencji, a druga do analizy RT-qPCR, protokół ten jest również bardzo wszechstronny. Można go również połączyć ze śledzeniem linii genetycznej FAP w celu zbadania ich konwersji do adipocytów w określonych warunkach i jest wysoce przystosowany do znakowania i obrazowania wielu dodatkowych typów komórek.

Najczęściej stosowanymi sposobami wizualizacji tłuszczu śródmięśniowego są skrawki parafiny, a następnie barwienie hematoksyliną i eozyną lub zamrożone skrawki barwione na barwniki lipofilowe, takie jak Oil Red O (ORO). Jednak podczas gdy tkanki przetwarzane parafiną zachowują najlepszą histologię, ten sam proces ekstrahuje również wszystkie lipidy, zapobiegając stosowaniu barwników lipofilowych. Chociaż metody barwienia lipofilowego będą działać zarówno na odcinkach tkanek utrwalonych, jak i nieutrwalonych PFA, kropelki lipidów są łatwo przemieszczane przez wywieranie nacisku na szkiełko nakrywkowe, zniekształcając w ten sposób przestrzenny rozkład tłuszczu śródmięśniowego. Aby obejść ten problem, w niedawnym badaniu opracowano rygorystyczny protokół wizualizacji adipocytów ORO+ przy użyciu podejścia całościowego. W tym celu autorzy zdecelularyzowali TA, aby uwidocznić przestrzenny rozkład śródmięśniowej tkanki tłuszczowej w całym TA41. Choć ta technika jest potężna, zapobiega również stosowaniu innych współbarwień do oznaczania dodatkowych struktur komórkowych. Przedstawione tutaj podejście do immunofluorescencji wierzchowca może być wykorzystane do współbarwienia adipocytów różnymi markerami, co pozwala na dokładne mapowanie środowiska komórkowego. Jednym z głównych wyzwań jest jednak przenikanie przeciwciał do tkanek. Im więcej włókien jest utrzymywanych razem, tym trudniej będzie przeciwciałom równomiernie przeniknąć i związać wszystkie dostępne antygeny. Dlatego ta metoda jest najbardziej skuteczna, gdy patrzy się na małe grupy włókien. Jednocześnie jest to również ograniczenie, ponieważ ogólna anatomiczna lokalizacja śródmięśniowej tkanki tłuszczowej jest tracona, gdy skupiamy się tylko na małych, złuszczonych wiązkach włókien. Jednak dzięki obecnemu rozwojowi nowatorskich metod oczyszczania tkanek oraz nowej technologii obrazowania, w przyszłości możliwa będzie większa penetracja i wizualizacja tkanek 42,43,44.

Podczas gdy wcześniejsze utrwalenie tkanki mięśniowej zachowuje morfologię adipocytów, stwarza również wyzwanie w ocenie wielkości włókien mięśniowych, która jest ważną miarą zdrowia mięśni. Rozmiar włókien mięśniowych określa się poprzez pomiar pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych. Wcześniej informowaliśmy, że wcześniejsze utrwalenie tkanki mięśniowej spowoduje, że większość dostępnych markerów do zarysowania włókien mięśniowych ulegnie awarii31. Aby pokonać tę przeszkodę, opracowaliśmy nowatorski potok segmentacji obrazu, który umożliwia pomiar rozmiaru włókien mięśniowych nawet w stałych odcinkach mięśni31. W ten sposób stworzyliśmy solidny i wydajny rurociąg przetwarzania tkanek, który w połączeniu z tym protokołem pokonuje większość wad spowodowanych wcześniejszym utrwaleniem tkanki mięśniowej.

Kolejną ważną zaletą tego podejścia jest wszechstronność. Dzieląc TA na dwie części, maksymalizuje się ilość informacji, które można uzyskać z jednego mięśnia. To nie tylko zmniejsza liczbę zwierząt, ale także dodaje dodatkową warstwę kontroli, potwierdzając histologię poprzez ekspresję genów i odwrotnie. Ponadto można badać wiele różnych genów poza genami adipogennymi. Wyizolowane RNA można również wykorzystać w eksperymencie RNAseq całych mięśni. Wreszcie, zamrożony kawałek mięśni może być również używany do pracy z białkami. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest możliwość, że uraz nie będzie spójny na całej długości TA. Może to prowadzić do scenariusza, w którym dwie części mięśni różnią się pod względem ilości zawartego w nich tłuszczu śródmięśniowego, co może uzasadniać wykluczenie takiej próbki z dalszej analizy. W związku z tym zaleca się, aby nie polegać tylko na RT-qPCR w celu wyciągnięcia głównych wniosków na temat ilości tłuszczu śródmięśniowego, ale raczej jako danych uzupełniających do histologicznych ocen ilościowych.

Łącznie protokół ten nakreśla solidny, wydajny i rygorystyczny proces przetwarzania tkanek, który umożliwi wizualizację i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej, co jest pierwszym krokiem w opracowywaniu nowych opcji leczenia w celu zwalczania zwłóknienia tłuszczowego. Jednocześnie jest wszechstronny i może być dostosowany do wielu różnych typów komórek w mięśniach, a także adipocytów w innych tkankach.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Kopinke za pomoc w zbieraniu danych i krytycznym czytaniu manuskryptu. Dziękujemy również członkom Instytutu Myologii Uniwersytetu Florydy za ich cenny wkład w prace nad manuskryptem. Prace były wspierane przez grant NIH 1R01AR079449. Rysunek 2 został stworzony za pomocą Biorender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% PFA (opakowanie 12 butelek o pojemności 10 ml)Elektronowa miskroskopia Sciences15710
2,0 ml probówki do mikrowirówekFisher Scientific05-408-138mikrowirówki do zamrażania/ubijania kulek
2-metylobutan (4 l)Fisher ChemicalO3551-4izopentan
Absolutny etanol (200 dowodów)ThermoFisher ScientificBP2818100
AffiniPure Fab fragment osła anty-myszJackson ImmunoResearch715-007-003blokowanie myszy na myszy
Alexa Fluor 488 wtórne przeciwciało anty-kurczaka osłaJackson ImmunoResearch703-545-155
Alexa Fluor 488 drugorzędowe przeciwciało przeciw myszomInvitrogenA21202
Alexa Fluor 488 przeciwciało wtórneprzeciwko królikowi osłaInvitrogenA21206
Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne przeciwko kozom osłaInvitrogenA11057
Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne przeciwko królikowiInvitrogenA11037
Alexa Fluor 568 Przeciwciało falloidynyInvitrogenA12380Rozpuszczone w 1,5 ml metanolu (~66 &mikro; Roztwór roboczy M)
BioLite 24-dołkowe MultidishThermoFisher Scientific 93018624-dołkowa płytka do inkubacji tkanek PFA
Biometra TOneanalytikjena8462070301Termocykler
Przeciwciało anty-GFP kurczakaAvesLabs GFP-1020
Chloroform/alkohol izoamylowy 24:1(v/v) do biologii molekularnej, DNAzy, RNAzy i bez proteazyThermoFisher ScientificAC327155000
Olej kukurydzianySigma AldrichC8267
DAPI bejcaInvitrogenD1306150 µ Roztwór roboczy M w dH2O
Serum osła (100 ml)Milipore Sigma5058837do roztworu blokującego
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11251-20pęseta z ostrymi końcówkami
Cienkie nożyczki proste 9 cmFine Science Tools14060-09
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01podłoże montażowe
Glicerol, 99,5%, do biologii molekularnej (500 ml)Acros Organics327255000
Koza przeciwciało anty-PDGFR&alfaR& DAF1062
Piec do hybrydyzacjiVWR230301Vdo inkubacji tamoksyfenu
ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP PenVector LaboratoriesHydrofobowy wstrzykiwaczH-4000
Strzykawka insulinowa z mikrocienką igłą dożylną (28 G)BD
z końcówką wsuwaną, 1 mlBD329654Strzykawka insulinowa bez igły, do podawania doustnego
Zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad1708890
IsofluranePatterson Veterinary78938441
Mikroskop odwrócony Leica DMi8 MikroskopLeicaużywany do szerokokątnego obrazowania IF i konfokalnego
MikroszkiełkaVWR48311-703dodatnio naładowane preparaty mikroskopowe
mysie przeciwciałoanty-MYODMysieMA1-41017
DSHBAB 428528
MX35 Premier+ Ostrza mikrotomuThermoFisher Scientific3052835
Spektrofotometr NanoDrop 2000 SpektrofotometrThermoFisher ScientificND2000do pomiaru wydajności RNA
Play-DohHasbro
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisher ScientificA25742zielony barwnik PCR master mix
Puralube Maść weterynaryjnaPuralube17033-211-38weterynaryjna maść okulistyczna
QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR SystemApplied Biosystems4485694qPCR
Przeciwciało przeciw perylipinie królikaTechnologia sygnalizacji komórkowej9349S
Wytrząsarka z czerwonym wirnikiemWytrząsarka Hoefer ScientificPR70-115Vdo barwienia IF
Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover GlassSzkiełka nakrywkoweThermoFisher Scientific152460
RNeasy Mini KitQIAGEN74106zawiera mini kolumny wirujące
Safe-Lock Tubes 1,5 ml, naturalneEppendorf22363204
Sample Tubes RB (2 mL)QIAGEN990381
Azydek soduAlfa Aesar14314
Koraliki ze stali nierdzewnej, 2,8 mmPrecellysKT03961-1-101. Małekoraliki
Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mmKoraliki średnieQIAGEN69989
Koraliki ze stali nierdzewnej, dużekoraliki7 mm QIAGEN69990
Skalpele jednorazowe ze stali nierdzewnejSkalpel Miltex327-4102
Rurka do karmienia ze stali nierdzewnej, 20 G x 38 mm, prostaInstech LaboratoriesIgła
do pomiaru fal FTSS-20S-3TamoxifenToronto Research ChemicalsT006000
Tissue Plus O.C.T. CompoundFisher HealthCare4585do zatapiania
TissueLyser LTQIAGEN85600ubijak do koralików
Adapter TissueLyser LT, 12-tubowyQIAGEN69980
Tissue-Tek CryomoldSakura4566formy do próbek
Triton X-100OdczynnikAesar A16046
Tiocyjanian guaniduThermoFisher Scientific15596026
Tween20 (500 mL)Fisher BioReagentsBP337-500
Mikroprowadnice VWR - Superfrost PlusSłoiki48311703
Wheaton CoplinSłoik Millipore SigmaS6016Coplin
Strzykawka do insuliny 329461 przeciwciało anty-PAX7 (supernatant) Invitrogen Mieszanka modelarskaBK podłoże TRIzol Alfa do barwienia VWR

Bibliografia

  1. Milad, N., et al. Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).
  2. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
  3. Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  4. Goodpaster, B. H., et al. The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).
  5. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
  6. Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
  7. Burakiewicz, J., et al. Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).
  8. Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. MRI of normal and pathologic skeletal muscle. American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).
  9. Willcocks, R. J., et al. Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort. Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).
  10. Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).
  11. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).
  12. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  13. Joe, A. W., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  14. Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
  15. Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration. Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).
  16. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).
  17. Hogarth, M. W., et al. Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B. Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).
  18. Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  19. Stumm, J., et al. Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury. Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).
  20. Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
  21. Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells. PLoS One. 7 (10), 47496(2012).
  22. Sun, Y. -M., et al. PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).
  23. Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).
  24. Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
  25. Santini, M. P., et al. Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner. Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).
  26. Uezumi, A., et al. Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle. Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).
  27. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  28. Soliman, H., et al. Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  29. Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).
  30. Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
  31. Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle. Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).
  32. Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
  33. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  34. Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), 71084(2013).
  35. Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).
  36. Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).
  37. Kawai, H., et al. Experimental glycerol myopathy: a histological study. Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).
  38. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  39. Uezumi, A., et al. Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).
  40. Biferali, B., et al. Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair. Science Advances. 7 (23), 9371(2021).
  41. Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).
  42. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).
  43. Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease. iScience. 23 (8), 101432(2020).
  44. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Progenitory komórki fibro-adypogennemorfologia adipocytówregeneracja mięśnigenetyczne śledzenie linii komórkowychobrazowanie immunofluorescencyjneRT-qPCRmarkery adypogenneutrwalanie tkanek
Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.