Artykuł metodologiczny

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

DOI:

10.3791/63996

⸱

26 maja 2022

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Myology Institute, University of Florida College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastąpienie zdrowej tkanki mięśniowej tłuszczem śródmięśniowym jest charakterystyczną cechą ludzkich chorób i schorzeń. Protokół ten określa, jak wizualizować, obrazować i określać ilościowo śródmięśniową tkankę tłuszczową, umożliwiając rygorystyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw tworzenia się śródmięśniowej tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibro-adipogenne komórki progenitorowe (FAP) to mezenchymalne komórki zrębowe, które odgrywają kluczową rolę podczas homeostazy i regeneracji mięśni szkieletowych. FAP budują i utrzymują macierz zewnątrzkomórkową, która działa jak molekularne rusztowanie z włókien mięśniowych. Ponadto FAP są niezbędne do regeneracji włókien mięśniowych, ponieważ wydzielają wiele korzystnych czynników wyczuwanych przez komórki macierzyste mięśni (MuSC). Jednak w stanach chorobowych FAP są komórkowym pochodzeniem śródmięśniowej tkanki tłuszczowej i zwłókniejącej tkanki bliznowatej. To zwłóknienie tłuszczowe jest cechą charakterystyczną sarkopenii i chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a. Jedną z istotnych barier w ustaleniu, dlaczego i w jaki sposób FAP różnicują się w tłuszcz śródmięśniowy, jest skuteczne zachowanie i późniejsza wizualizacja adipocytów, zwłaszcza w zamrożonych skrawkach tkanek. Konwencjonalne metody przetwarzania tkanki mięśni szkieletowych, takie jak szybkie zamrażanie, nie zachowują prawidłowo morfologii poszczególnych adipocytów, uniemożliwiając w ten sposób dokładną wizualizację i kwantyfikację. Aby pokonać tę przeszkodę, opracowano rygorystyczny protokół, który zachowuje morfologię adipocytów w sekcjach mięśni szkieletowych, umożliwiając wizualizację, obrazowanie i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Protokół określa również, w jaki sposób przetwarzać część tkanki mięśniowej do RT-qPCR, umożliwiając użytkownikom potwierdzenie zaobserwowanych zmian w tworzeniu tłuszczu poprzez oglądanie różnic w ekspresji genów adipogennych. Dodatkowo można go dostosować do wizualizacji adipocytów poprzez immunofluorescencję całych próbek mięśniowych. Wreszcie, protokół ten określa, w jaki sposób przeprowadzić genetyczne śledzenie linii FAP eksprymujących Pdgfrα w celu zbadania adipogennej konwersji FAP. Protokół ten konsekwentnie zapewnia wysokiej rozdzielczości i morfologicznie dokładne obrazy immunofluorescencyjne adipocytów, wraz z potwierdzeniem za pomocą RT-qPCR, co pozwala na solidną, rygorystyczną i powtarzalną wizualizację i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Opisany tutaj proces analizy jest pierwszym krokiem do lepszego zrozumienia, w jaki sposób FAP różnicują się w tłuszcz śródmięśniowy i zapewnia ramy do walidacji nowatorskich interwencji zapobiegających tworzeniu się tłuszczu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infiltracja zdrowej tkanki mięśniowej z zwłóknieniem tłuszczowym jest charakterystyczną cechą dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) i innych chorób nerwowo-mięśniowych, a także sarkopenii, otyłości i cukrzycy1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Chociaż zwiększona infiltracja tłuszczu w tych stanach jest silnie związana ze zmniejszoną funkcją mięśni, nasza wiedza na temat tego, dlaczego i jak tworzy się tłuszcz śródmięśniowy, jest nadal ograniczona. FAP to multipotencjalna populacja mezenchymalnych komórek zrębu obecna w większości dorosłych narządów, w tym mięśni szkieletowych11,12. Jednak z wiekiem i w chorobach przewlekłych FAP wytwarzają zwłókniałą tkankę bliznowatą i różnicują się w adipocyty, które znajdują się między poszczególnymi włóknami mięśniowymi i tworzą tłuszcz śródmięśniowy13,14,15,16,17,18,19,20.

Aby rozpocząć walkę z tworzeniem się tłuszczu w mięśniach, należy określić mechanizmy przekształcania FAP w adipocyty. PDGFRα jest "złotym standardem" w tej dziedzinie do identyfikacji FAP w mięśniach wielu gatunków13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. W rezultacie, pod kontrolą promotora Pdgfrα wygenerowano kilka mysich linii Cre indukowanych tamoksyfenem, co pozwoliło na genetyczne manipulowanie FAP in vivo przy użyciu systemu Cre-LoxP27,28,29. Na przykład, łącząc tę indukowalną linię Cre z reporterem genetycznym, można przeprowadzić śledzenie linii FAP, strategię, którą z powodzeniem zastosowaliśmy do FAP mapy losu w mięśniach i białej tkance tłuszczowej20,30. Oprócz śledzenia linii, te linie Cre dostarczają cennych narzędzi do badania konwersji FAP do tłuszczu.

Jedną z głównych przeszkód w zdefiniowaniu mechanizmu adipogennej konwersji FAPs w tłuszcz śródmięśniowy jest możliwość rygorystycznego i powtarzalnego ilościowego określenia ilości tłuszczu śródmięśniowego, który powstał w różnych warunkach. Kluczem jest zrównoważenie zachowania tkanki mięśniowej i tłuszczowej oraz dopasowanie tego do dostępnych metod barwienia w celu wizualizacji adipocytów. Na przykład mięśnie szkieletowe są często zamrażane bez uprzedniego utrwalenia, co zachowuje włókna mięśniowe, ale zaburza morfologię adipocytów (Rysunek 1). W przeciwieństwie do tego, utrwalanie, po którym następuje zatapianie parafiny, przy zachowaniu najlepszej histologii tkanek, w tym adipocytów, usuwa wszystkie lipidy, czyniąc w ten sposób większość barwników lipofilowych, takich jak powszechnie stosowany barwnik Oil Red O, bezużytecznymi.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy śródmięśniowej tkanki tłuszczowej w tkankach mięśniowych zamrożonych na zatrzask w porównaniu z utrwalonymi. (A) Schematyczny przegląd konfiguracji eksperymentalnej. Obrazy immunofluorescencyjne pokazujące adipocyty (żółty), włókna mięśniowe (szare) i jądra (cyjan) w obrębie zarówno (B) zamrożonych, jak i (C) utrwalonych TA w 21 dni po uszkodzeniu glicerolu. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Opisany tutaj protokół zachowuje morfologię włókien mięśniowych i adipocytów oraz umożliwia wizualizację i analizę wielu typów komórek. Podejście to opiera się na barwieniu immunofluorescencyjnym adipocytów w tkance mięśniowej utrwalonej paraformaldehydem (PFA), co pozwala na współbarwienie wieloma przeciwciałami. Można go również łatwo dostosować do przestrzennego wyświetlania śródmięśniowego tłuszczu w nienaruszonej tkance za pomocą obrazowania całościowego, dostarczając w ten sposób informacji na temat mikrośrodowiska komórkowego tłuszczu w mięśniach. Ponadto protokół ten można połączyć z naszym niedawno opublikowanym podejściem do określania pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych w utrwalonych tkankach mięśniowych31, co jest ważnym pomiarem do oceny zdrowia mięśni. Połączenie tego podejścia ze śledzeniem linii genetycznej w celu zmapowania losu jest również przedstawione tutaj. W ten sposób opisany tutaj wszechstronny protokół umożliwia rygorystyczną i powtarzalną ocenę FAP i ich różnicowanie w tłuszcz śródmięśniowy w skrawkach tkanek i nienaruszonych tkankach.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Przegląd schematu protokołu. Schematyczny przegląd przetwarzania tkanek, w którym jedna trzecia TA jest usuwana, zamrażana i homogenizowana w celu późniejszej izolacji RNA i analizy transkrypcji za pomocą RT-qPCR. Pozostałe dwie trzecie TA jest utrwalone przez PFA i przetworzone do barwienia immunologicznego na zamrożonych odcinkach lub włóknach w całości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Florydy.

1. Śledzenie linii genetycznej FAP

UWAGA: Jeśli śledzenie linii genetycznej FAP nie jest pożądane, krok 1 można pominąć.

  1. Aby przeprowadzić śledzenie linii FAP, należy uzyskać niezbędne allele myszy.
    UWAGA: Wygenerowano kilka linii Cre indukowanych tamoksyfenem, pod kontrolą promotora Pdgfrα, aby skutecznie celować w FAP, w tym z laboratoriów Hogan29, Rando27 i Bergles32. Jako genetyczny reporter aktywności Cre, dostępne są liczne allele reporterowe Rosa26, takie jak Rosa26EYFP33. Chociaż sugeruje się, aby każde laboratorium określiło, która kombinacja Cre-Reporter jest najbardziej skuteczna, krzyżując myszy PdgfrαCreERT2 (29 i Jax# 032770) z reporterem Rosa26EYFP (33 i Jax# 006148), otrzymany PdgfrαCreERT2; Myszy Rosa26EYFPmogą być używane do efektywnego i specyficznego oznaczania FAPs20. Aby prześledzić losy dojrzałych FAP, zaleca się poczekać, aż myszy osiągną wiek co najmniej ~10 tygodni przed podaniem tamoksyfenu. Eksperymenty ze śledzeniem linii mogą być przeprowadzane zarówno na mężczyznach, jak i kobietach.
  2. Podawanie tamoksyfenu przez doustne podawanie
    1. Przygotuj 40 mg/ml tamoksyfenu w oleju kukurydzianym i dobrze wymieszaj 1 dzień przed zbożem. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C w obrotowym piecu do hybrydyzacji.
      UWAGA: Tamoksyfen jest substancją rakotwórczą i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Zawsze noś rękawiczki podczas obchodzenia się z proszkiem i noś maskę podczas ważenia go w postaci proszku, ponieważ istnieje niebezpieczeństwo wdychania.
    2. Oczyść obszar zgodnie z protokołem i przymocuj igłę do wstrzykiwania do strzykawki o pojemności 1 ml. Pobrać 200 μl tamoksyfenu do strzykawki.
    3. Scruff PdgfrαCreERT2 ; Myszy Rosa26EYFP (10 tygodniowe; używane obie płcie), kładąc je na płaskiej powierzchni i mocno chwytając podstawę ogona. Wolną ręką chwyć środek myszy kciukiem i palcem wskazującym, a następnie delikatnie i z lekkim naciskiem przesuń uchwyt, aż znajdzie się tuż za ramiona.
    4. Ściśnij skórę kciukiem i palcem wskazującym, podnieś mysz i odwróć rękę tak, aby mysz była skierowana w stronę użytkownika, a następnie wsuń ogon między mały i serdeczny palec dłoni trzymającej mysz.
    5. W tym momencie upewnij się, że mysz jest dobrze unieruchomiona i nie jest w stanie poruszać głową ani ramionami. Włóż igłę do wbijania do ust i użyj jej, aby lekko odchylić głowę myszy do tyłu; Dzięki temu przełyk jest lepiej dostępny.
    6. Ostrożnie i powoli wbić igłę do przełyku. Nie wciskać igły na siłę, jeśli napotkany jest jakikolwiek opór; Igła powinna łatwo zsunąć się w dół. Powoli wstrzykiwać tamoksyfen. Monitoruj myszy przez 15-20 minut, aby upewnić się, że podczas gavowania nie wystąpią żadne problemy.
      UWAGA: Podawanie tamoksyfenu przez 2 kolejne dni zazwyczaj powoduje ~75%-85% skuteczności rekombinacji FAP bez powodowania żadnych działań niepożądanych. Zaleca się, aby użytkownik odczekał 1-2 tygodnie przed wywołaniem urazu, co pozwoli na usunięcie pozostałego tamoksyfenu z systemu i odwrócenie pozostałego białka.

2. Uraz mięśnia piszczelowego przedniego (TA)

UWAGA: Do badania tłuszczu śródmięśniowego zaleca się użycie modelu uszkodzenia opartego na glicerolu (50% glicerolu w sterylnym roztworze soli fizjologicznej), co powoduje masowe tworzenie się tłuszczu śródmięśniowego34,35,36,37.

  1. Przygotuj maszynę do znieczulania, dodając izofluran i upewniając się, że rurki zarówno w komorze myszy, jak i stożku nosowym są otwarte. Wyczyść komorę i obszar roboczy 70% roztworem etanolu lub nadtlenku (w zależności od protokołów).
  2. Ustaw natężenie przepływu tlenu na 2,5 l/min, a stężenie izofluranu na 2,5%. Umieść mysz w komorze anestezjologicznej i odczekaj ~5 minut, aż zostanie znieczulona.
  3. Połóż mysz na wznak na czystej poduszce grzewczej i włóż nos do stożka nosowego. Delikatnie nałóż maść okulistyczną weterynarza na oczy za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Stale monitoruj znieczulenie i wykonaj uszczypnięcie palca u nogi myszy przed urazem, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
  4. Oczyść nogę, która ma być wstrzyknięta, świeżą chusteczką nasączoną alkoholem w celu dezynfekcji.
  5. Pobrać 30-50 μl 50% glicerolu (w zależności od wielkości myszy) do strzykawki insulinowej. Delikatnie rozczesz włosy na goleni, aby odsłonić położenie TA.
    UWAGA: Łatwiej jest poruszać włosami i uzyskać lepszą wizualizację, gdy są one jeszcze mokre od chusteczki nasączonej alkoholem.
  6. Po zlokalizowaniu TA (tuż obok kości piszczelowej, lekko wystaje przez skórę i można ją wyczuć delikatnym badaniem palpacyjnym), wbij igłę w TA dystalnie, w pobliżu kostki. Całkowicie włóż igłę do mięśnia i powoli wstrzyknij glicerol, stopniowo wycofując igłę, co pomaga uszkodzić większość mięśni.
    UWAGA: Najlepiej jest wkładać igłę równolegle do nogi, pod lekko podniesionym kątem. Dobry uraz zazwyczaj powoduje zgięcie grzbietowe, ponieważ TA kurczy się po wycofaniu igły. Jeśli palce u nóg myszy rozłożą się, prawdopodobnie wstrzyknięto mięsień prostownik długi palca (EDL).
  7. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez około 15-20 minut, aby zapewnić powrót do zdrowia po znieczuleniu.
  8. Wyrzuć igłę do pojemnika na ostre przedmioty. Nigdy nie zakręcaj igły.
    UWAGA: Analgezja po wstrzyknięciu glicerolu powinna być zapewniona zgodnie z aprobatą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. Adipocyty można zaobserwować już po 5 dniach od urazu (dpi). Do 7 dpi wszystkie adipocyty są już uformowane, a do 21 dpi są w pełni dojrzałe.

3. Pobieranie tkanek

  1. Przygotuj 4% PFA w 1x PBS i umieść na lodzie przed rozpoczęciem zbiorów.
  2. Umieść dowolne płytki (12- lub 24-dołkowe) używane do utrwalania mięśni na lodzie i dodaj 4% PFA do każdej studzienki, upewniając się, że każda studzienka ma 10-20 razy większą objętość PFA niż naprawiana tkanka.
  3. Między 7 a 21 dniem po uszkodzeniu glicerolem należy poddać mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (tj. przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy).
  4. Rozpocznij pobieranie wszelkich tkanek, które mają być użyte do histologii lub izolacji RNA.
    UWAGA: Tkanki powinny być zamrożone lub umieszczone w PFA w ciągu 10-15 minut od poświęcenia (Rysunek 2).
  5. Obficie spryskaj wszystkie obszary myszy, które mają być cięte, 70% etanolem, aby chronić włosy przed sekcją i narzędziami.
  6. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę wokół górnej części nogi, w pobliżu miednicy (Rysunek 3A).
  7. Delikatnie pociągnij skórę nogi od góry do dołu do kostki (Rysunek 3B).
    UWAGA: TA to mięsień w kształcie łzy z wyraźnie zaznaczonym dystalnym ścięgnem przyczepionym do przyśrodkowego pisma klinowego i pierwszej kości śródstopia. Jest boczny do kości piszczelowej i rozciąga się do dolnej części kolana.
  8. Najpierw usuń zewnętrzną warstwę tkanki łącznej (epimysium) za pomocą pęsety z ostrą końcówką przed pobraniem TA (Rysunek 3C). Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby lepiej uwidocznić epimysium.
  9. Wsuń pęsetę pod TA od dołu mięśnia, zaczynając od dystalnego ścięgna i delikatnie pociągnij w górę w kierunku kolana (Rysunek 3D). Zatrzymaj się na końcu mięśnia; Nie przekraczaj oporu odczuwalnego w dolnej części kolana.
  10. Jeśli przed dotarciem do dolnej części kolana występuje znaczny opór, zatrzymaj się i kontynuuj usuwanie resztek warstwy tkanki łącznej.
    UWAGA: Istnieje inne dystalne ścięgno tuż obok ścięgna TA, które przyczepia się do EDL, który jest smukłym mięśniem bocznym do TA. Ostrożność, aby wsunąć pęsetę tylko pod ścięgno TA, zapobiega przypadkowemu zebraniu EDL, ale można go również łatwo usunąć po utrwaleniu.
  11. Gdy TA zostanie częściowo podniesiona z nogi za pomocą pęsety, użyj tego samego ruchu skalpelem, aby przeciąć połączenie TA z dolną częścią kolana (Rysunek 3E). Przetnij ścięgno w kostce nożyczkami, aby całkowicie usunąć TA. Dotykaj tylko mięśnia przy ścięgnie, aby uniknąć uszkodzenia włókien.
  12. Odetnij 1/3 TA na końcu naprzeciwko ścięgna (Rysunek 3F), umieść ją w probówce do mikrowirówki i zamroź błyskawicznie, wrzucając ją do ciekłego azotu (Rysunek 3H).
  13. Zanurz pozostałe 2/3 tkanki w znakowanej studzience z 4% PFA do histologii (Ryc. 3I). Pamiętaj, aby śledzić, kiedy pierwsza i ostatnia tkanka została umieszczona w utrwalaczu. Umieścić na wytrząsarce na 2-2,5 godziny w temperaturze 4 °C.
  14. Czas utrwalenia zależy od tkanki i jej wielkości. Określ czas potrzebny do utrwalenia tkanek. Utrwalanie TA przez 2-2,5 h w temperaturze 4 °C zazwyczaj dobrze zachowuje morfologię adipocytów, nie powodując nadmiernego utrwalenia tkanki.
    UWAGA: Jeśli planujesz użyć TA do barwienia immunofluorescencyjnego całej góry, pomiń resztę tego protokołu, aż dojdziesz do Sekcji 7: "Barwienie immunofluorescencyjne całej góry".
  15. Po utrwaleniu usuń PFA ze studzienek, spłucz chusteczki zimnym 1x PBS 2-3 razy, a następnie przemyj 2-3 razy zimnym 1x PBS przez 5 minut na mycie.
  16. Usuń PBS z dołków i dodaj tyle 30% sacharozy do 1x PBS, aby tkanka mogła unosić się na wodzie. Umieścić na shakerze w temperaturze 4 °C na noc.

figure-protocol-1
Rysunek 3: Podsumowanie pobierania tkanek. (A) Skóra jest nacięta u podstawy nogi i (B) mięśnie kończyn tylnych są odsłonięte. (C) Po usunięciu epimysium z TA, (D) kleszcze są używane do częściowego oddzielenia mięśnia i zapewnienia, że epimysium zostało całkowicie usunięte. (E) TA jest odcinany od nogi za pomocą skalpela i usuwany po przecięciu ścięgna. (G) Po pocięciu TA na jedną trzecią i dwie trzecie części, (H) jedna trzecia jest zamrażana w ciekłym azocie do analizy RT-qPCR, a (I) pozostałe dwie trzecie są utrwalane w 4% PFA do histologii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Osadzanie

  1. Przygotuj formy do próbek do użycia do zatopienia, etykietując i wypełniając wystarczającą ilością podłoża do zatapiania, aby całkowicie zanurzyć tkanki.
  2. Wyjmij tkanki z dołków, osusz nadmiar sacharozy na ręczniku papierowym i przenieś do form do zamrażania wypełnionych podłożem próbek.
    UWAGA: Warto wiedzieć, w jakiej orientacji forma powinna być podzielona na kriostat. W ten sposób użytkownik może zorientować tkanki w formie w taki sposób, aby obszar zainteresowania był łatwo dostępny. W przypadku TA można to osiągnąć, umieszczając najgrubszy koniec (przeciwny do strony ścięgna) skierowany w stronę powierzchni, która zostanie przecięta. Pozwala to na łatwe przecięcie TA w najgrubszej części (brzuch) i umożliwia przekrojowe cięcie włókien mięśniowych.
  3. Przygotować zawiesinę izopentanową, częściowo zanurzając pojemnik zawierający izopentan w ciekłym azocie. Upewnij się, że w pojemniku jest wystarczająca ilość ciekłego izopentanu, aby zanurzyć około połowy formy próbki, która ma być użyta do osadzenia tkanek.
  4. Rozpocznij zamrażanie form, ostrożnie umieszczając je w zawiesinie izopentanu i upewniając się, że około połowa formy jest zanurzona. Upewnij się również, że forma zamarza równomiernie ze wszystkich czterech stron.
  5. Wyjmij formę z izopentanu tuż przed tym, jak cała forma zostanie widocznie zamrożona od góry. Ilość czasu, jaką to zajmuje, zależy od używanych form.
  6. Zamrożone foremki należy przechowywać w pojemniku z suchym lodem, zamrażając resztę bloków, a następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Izopentan do zamrażania może być ponownie użyty. Włóż do szklanej butelki, ale nie dokręcaj pokrywki, dopóki izopentan nie osiągnie temperatury pokojowej (RT). W przeciwnym razie zmiana ciśnienia może spowodować rozbicie butelki.

5. Podział na sekcje

  1. Ustaw kriostat na -22 do -24 °C, dodaj formy zawierające TA do kriostatu i odczekaj co najmniej 30 minut na aklimatyzację do temperatury. W międzyczasie oznacz serię dodatnio naładowanych szkiełek mikroskopowych.
  2. Włożyć płytkę zapobiegającą zwijaniu się i wyrównać z kriostatem w taki sposób, aby w płytce znajdowały się minimalne nacięcia w miejscu, w którym styka się ona z blokiem próbki. Zabezpiecz na miejscu.
  3. Włóż nowe ostrze kriostatu do uchwytu ostrza i zabezpiecz je na miejscu.
    UWAGA: Ostrze jest ostre. Zakryj ostrze podczas manipulowania innymi częściami kriostatu lub zamrożonymi formami.
  4. Wyjmij zamrożony blok z formy. Dodaj jednolitą warstwę podłoża do zatapiania do uchwytu kriostatu i umieść blok w podłożu. Pozostaw na 1-3 minuty, aż podłoże do zatapiania zostanie całkowicie zamrożone (nieprzezroczyste białe).
    UWAGA: W przypadku TA najgrubszy obszar (brzuch) powinien być widoczny na uchwycie.
  5. Umieść uchwyt kriostatu z blokiem tkankowym w kriostacie. Odsłoń ostrze i przesuń kriostat do przodu, aż do zetknięcia się z ostrzem. Przeciąć blok na odcinkach 25 μm do momentu, gdy tkanka przestanie być zasłonięta przez podłoże do zatapiania.
    UWAGA: Podczas cięcia wyreguluj kąt kriostatu i/lub położenie stolika tak, aby sekcje miały jednakową grubość. Pomocne może być zebranie kilku sekcji, aby zapewnić jednolitość grubości przekroju. Zaleca się, aby użytkownik znalazł właściwą pozycję płytki przeciwprzechyłowej przed przecięciem do obszaru zainteresowania w obrębie TA (brzucha), ponieważ pozwala to użytkownikowi wypróbować kilka pozycji płytki przeciwprzechylającej się, aż sekcje będą schodzić prosto bez marnowania tkanki.
  6. Zmień grubość przekroju na 10-12 μm i zbierz skrawki na oznaczonych szkiełkach mikroskopowych. Zaleca się szeregowe dzielenie na sekcje poprzez zebranie sąsiednich sekcji na 6-10 szkiełkach (oznaczonych jako 1-x), co pozwala na barwienie wielu markerów. W razie potrzeby użyj cienkiej szczotki, aby rozwinąć sekcje przed zebraniem ich na szkiełku.
    UWAGA: Jeśli sekcje się zwijają, sprawdź, czy temperatura utrzymuje się na stałym poziomie w zakresie od -22 do -24 °C. Jeśli w sekcjach występują pionowe prążki, może to być spowodowane nacięciem w płycie przeciwprzechyłowej lub ostrzu; Można to naprawić, regulując położenie płyty stabilizującej i/lub przełączając się na nowe ostrze.
  7. Po zebraniu sąsiednich odcinków tej samej płaszczyzny przekroju na każdym szkiełku, dostosuj grubość z powrotem do 25 μm, aby przejść 150-200 μm przez blok, a następnie dostosuj grubość z powrotem do 10-12 μm i ponownie rozpocznij cięcie.
    UWAGA: Ta sekcja szeregowa umożliwia użytkownikowi wizualizację, obrazowanie i określanie ilościowe na różnych głębokościach za pomocą TA; Wystarczy od trzech do czterech sekcji szeregowych na prowadnicę.
  8. Przechowywać szkiełka podstawowe i bloki tkanek w temperaturze -80 °C.

6. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) skrawków tkanek

UWAGA: Ponieważ stężenia przeciwciał mogą się różnić w zależności od partii i producenta, zaleca się optymalizację poprzez ocenę kilku różnych stężeń przeciwciał na szkiełkach testowych przed barwieniem interesujących szkiełek.

  1. Rozmrażać/suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej lub na ciepłym talerzu w temperaturze 37 °C przez 10-20 min.
  2. Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować linię na krawędzi papierowej powierzchni szkiełka, w miejscu, w którym styka się ze szkłem.
  3. Umieść szkiełka w słoiku Coplin i umyj 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x na shakerze przez co najmniej 5 minut na pranie, aby nawodnić skrawki tkanki.
    UWAGA: W tym momencie ważne jest, aby nie pozostawić szkiełek bez zanurzenia w PBST (do linii hydrofobowej), w przeciwnym razie skrawki tkanki wyschną.
  4. Umieść szkiełka na stojaku komory nawilżającej i nałóż na nie 310-350 μl roztworu blokującego (5% surowicy osła i 0,3% Triton X-100 w 1x PBS) przez 1-2 godziny w RT.
    UWAGA: Nie jest potrzebny żaden dodatkowy etap przepuszczalności, ponieważ roztwór blokujący zawiera 0,3% Triton X-100, co pozwala na wystarczającą przepuszczalność skrawków tkanki. W przypadku stosowania pierwszorzędowych przeciwciał pochodzących od myszy (tj. PAX7 i MYOD1 wymienionych poniżej) zaleca się włączenie kroku blokowania myszy na myszy przy użyciu fragmentów Fab (1:50) w roztworze blokującym dla etapu blokowania. Pomoże to zmniejszyć tło spowodowane niespecyficznym wiązaniem przeciwciała drugorzędowego myszy z przeciwciałami innymi niż pierwszorzędowe.
  5. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe, które mają być użyte w roztworze blokującym, na krótko przed przejściem do następnego kroku w następujący sposób:
    1. Przeciwciała pierwszorzędowe do barwienia adipocytów i obrazowania całego przekroju: Rozcieńczyć króliczą anty-Perilipinę w stosunku rozcieńczenia 1:1000.
    2. Pierwszorzędowe przeciwciała do śledzenia linii adipocytów: Rozcieńczyć anty-GFP kurczaka w stosunku 1:1000 i króliczą anty-Perilipinę w stosunku 1:1000.
    3. Pierwszorzędowe przeciwciała do śledzenia linii FAPs: Rozcieńczyć anty-GFP kurczaka w stosunku 1:1000 i anty-PDGFRα kozy w stosunku 1:250.
    4. Pierwszorzędowe przeciwciała dla markerów miogennych: Rozcieńczyć mysi anty-PAX7 w stosunku 1:25 lub mysi anty-MYOD1 w stosunku 1:250 i króliczą anty-LAMININĘ w 1:1000,
      UWAGA: Chociaż przeciwciała wymienione powyżej zostały pomyślnie ocenione za pomocą tego protokołu, jest prawdopodobne, że inne markery i przeciwciała do znakowania FAP, adipocytów i/lub innych typów komórek są również zgodne z tym protokołem. Zdecydowanie zaleca się, aby przy pierwszym użyciu przeciwciał pierwszorzędowych użytkownik dołączył szkiełko kontroli ujemnej, w którym pominięto przeciwciała pierwszorzędowe. Pozwoli to kontrolować specyficzność przeciwciał. Wszystkie inne kroki w protokole są przestrzegane, w tym dodawanie przeciwciał drugorzędowych, ale roztwór blokujący jest używany samodzielnie w następnym kroku zamiast przeciwciała pierwszorzędowego w roztworze blokującym.
  6. Zrzucić roztwór blokujący ze szkiełek i nałożyć na 310-350 μl roztworu blokującego z przeciwciałami pierwszorzędowymi i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze nawilżania.
  7. Następnego dnia zrzuć roztwór blokujący/przeciwciała pierwszorzędowe ze szkiełek i umieść je w słoiku Coplin. Opłucz szkiełka 2-3 razy PBST i przemyj 3-5 razy PBST na shakerze przez co najmniej 5 minut na mycie.
  8. Podczas ostatniego płukania należy przygotować przeciwciała drugorzędowe lub wszelkie bezpośrednie koniugaty do użycia w roztworze blokującym. Zminimalizuj ilość czasu, jaki te przeciwciała spędzają w świetle, aby uniknąć fotowybielania.
    1. Rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe / koniugaty bezpośrednie: 488 nm anty-kurczaka osła (1:1000) lub anty-królika (1:1000) lub anty-myszy (1:1000), 568 nm anty-kozy osła (1:1000) lub anty-królika (1:1000) lub falloidyny (włókna mięśniowe; 1:100), barwnik DAPI (jądra; 1:500).
  9. Na szkiełka należy nałożyć 310-350 μl roztworu blokującego z przeciwciałami drugorzędowymi i/lub bezpośrednimi koniugatami w komorze nawilżającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Od teraz chroń próbki przed światłem.
  10. Zrzuć roztwór blokujący/przeciwciała drugorzędowe i umieść je w słoiku Coplin. Spłucz PBST raz i umyj 3-5x PBST na shakerze przez co najmniej 5 minut na pranie. Słoik Coplin należy przykryć, aby zapobiec ekspozycji na światło.
  11. Osusz szkiełka tak dobrze, jak to możliwe, stukając w krawędzie i wycierając tył o ręcznik papierowy, ale nie pozwól, aby sekcje tkanki wyschły.
  12. Dodać trzy lub cztery krople wodnego podłoża mocującego do górnej poziomej krawędzi szkiełka i delikatnie dodać szkiełko nakrywkowe. Nie naciskaj ani nie przesuwaj, jeśli pod szkiełkiem nakrywkowym tworzą się pęcherzyki powietrza; Każdy nacisk lub ruch może zniekształcić delikatną architekturę komórkową adipocytów.
  13. Poczekaj, aż podłoże montażowe otworzy się w ciemności przez noc przed obrazowaniem.

7. Barwienie immunofluorescencyjne w całości

  1. Po ~1 godzinie utrwalenia (patrz krok 3.14) użyj pęsety z ostrą końcówką, aby usunąć włókna mięśniowe z zamocowanego TA.
  2. Umieść oddzielone włókna w 24-dołkowej płytce i myj 3x przez 3 minuty każdy PBST. We wszystkich kolejnych inkubacjach należy dodać pokrywkę, aby zapobiec parowaniu.
  3. Inkubować przez 1 godzinę w 1% Triton X-100 w 1x PBS w temperaturze RT (200-300 μL) na wytrząsarce, aby umożliwić lepszą penetrację przeciwciał.
  4. Po kilkukrotnym spłukaniu PBST, nałożyć roztwór blokujący (200-300 μl) i zablokować na nutatorze lub wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w pożądanym stężeniu (podwojenie stężenia wydaje się być dobrym punktem wyjścia) w roztworze blokującym. Próbki należy inkubować (200–300 μl) na nutatorze lub wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Próbki należy dokładnie myć PBST przez cały dzień z częstymi zmianami przy temperaturze pokojowej na wytrząsarce, około 4-6 razy przez 30-60 minut przy każdym myciu.
  7. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w roztworze blokującym do pożądanego stężenia (1:500 zwykle działa dobrze) plus barwienie jądrowe i inkubować próbki (200-300 μl) na nutatorze lub wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Próbki należy dokładnie myć PBST przez cały dzień z częstymi zmianami przy temperaturze pokojowej na wytrząsarce, około 4-6 razy przez 30-60 minut każde mycie lub myć przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Aby zamontować, delikatnie osusz nadmiar PBST, a następnie umieść włókna w jednej lub dwóch kroplach podłoża montażowego na szklanym szkiełku podstawowym (Rysunek 4A). Aby podnieść szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm), dodaj małe gliniane nóżki; Zapobiegnie to zgnieceniu włókien i przymocuje szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Dobrze sprawdzają się w tym celu związki modelarskie. Po zabezpieczeniu szkiełka nakrywkowego dodaj więcej podłoża do krawędzi, aż obszar pod szkiełkiem nakrywkowym będzie pełny.
    UWAGA: Zamiast używać podłoża montażowego zawierającego środki zapobiegające blaknięciu, tkankę można również przesuwać przez rosnącą serię glicerolu (od 30% do 80% glicerolu w PBS).
  10. Odczekaj 1-2 dni przed obrazowaniem, aby umożliwić utwardzenie podłoża mocującego.

8. Obrazowanie śródmięśniowej tkanki tłuszczowej

  1. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Zabezpiecz zjeżdżalnię na stoliku.
    UWAGA: Do obrazowania adipocytów w przekrojach mięśniowych często wystarcza obiektyw 5x lub 10x w połączeniu z mikroskopią szerokokątną. Do wizualizacji WM-IF wymagany jest mikroskop konfokalny.
  2. Użyj dowolnego kanału, aby zidentyfikować obszar, który ma zostać zobrazowany.
  3. W oprogramowaniu do obrazowania dostosuj wzmocnienie i czas ekspozycji dla każdego kanału.
  4. Wykonaj zdjęcia całej tkanki w każdym kanale (automatycznie lub ręcznie, w zależności od użytego mikroskopu i oprogramowania) i połącz poszczególne płytki, aby utworzyć kompozyt o pełnym przekroju TA.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie zdjęć dwóch lub trzech różnych sekcji tej samej TA na różnych głębokościach. Określając ilościowo adipocyty w każdej sekcji, a następnie podając średnią, uniknie się zlokalizowanych różnic w ilości tłuszczu śródmięśniowego, spowodowanych na przykład błędami iniekcji.

9. Kwantyfikacja adipocytów

  1. Jeśli wtyczka Cell Counter nie została wcześniej zainstalowana, dodaj ją do programu ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
  2. Zaimportuj obrazy do ImageJ jako pliki TIF lub oryginalne pliki mikroskopu. Wyświetlanie każdego kanału w ImageJ jako osobnego pliku TIF.
    UWAGA: W przypadku korzystania z LIF lub podobnych typów plików mikroskopu, w obszarze Opcje importu formatów biologicznych wybierz Hyperstack dla opcji Wyświetl stos z i zaznacz pole wyboru Podziel kanały. Kliknij przycisk OK, aby otworzyć plik. Upewnij się również, że pole Autoskalowanie nie jest zaznaczone.
  3. Upewnij się, że obrazy dla każdego kanału są w formacie 8-bitowym (i szarym): Typ > obrazu > 8-bitowy.
  4. Scalanie obrazów DAPI (niebieski), GFP (zielony), PERILIPIN (czerwony) i PHALLOIDIN (szary): Obraz > Kolor > Scal kanały.
  5. Sprawdź, czy skala (Analizuj > ustaw skalę) jest wyrażona w mikronach. Korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego, obrysuj zranioną i nieuszkodzoną część każdego przekroju, a następnie zmierz (Analizuj > Zmierz) i zapisz obszar zraniony i nieuszkodzony w arkuszu kalkulacyjnym.
    UWAGA: Uszkodzone mięśnie można zidentyfikować jako obszary pozbawione włókien mięśniowych lub obszary wypełnione włóknami mięśniowymi, które zawierają centralnie położone jądra.
  6. Uruchom licznik komórek: Wtyczki > CellCounter > inicjalizacji.
  7. Wybierz typ licznika, a następnie policz każdy adipocyt. Zapisz całkowitą liczbę adipocytów w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie oblicz liczbę adipocytów na 1 mm2 uszkodzonego obszaru.

10. Analiza ekspresji genów adipogennych za pomocą RT-qPCR

  1. Izolacja RNA
    1. Przed rozpoczęciem podgrzej wodę wolną od RNaz do 45 °C i przygotuj świeży 70% EtOH (350 μl na próbkę).
    2. Dodać 1 000 μl tiocyjanianu guanidu do każdej probówki zawierającej próbkę (patrz krok 3.12). Ważne jest, aby używane były rurki zatwierdzone przez ubijaki.
      UWAGA: Tiocyjanian guanidu jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i uchwyt w dygestorium.
    3. Dodaj trzy średnie koraliki lub jeden duży i jeden mały koralik do każdej tuby.
    4. Homogenizować tkankę przy 50 Hz przez 2-4 minuty za pomocą ubijaka do kulek. W zależności od rodzaju tkanki i wielkości próbki może to potrwać do 10 minut.
    5. Dodać 200 μl chloroformu.
      UWAGA: Chloroform jest toksyczny. Nosić środki ochrony osobistej i uchwyt w dygestorium.
    6. Wstrząsać próbkami przez 15 s. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
    7. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g. Odpipetować 350 μl klarownego supernatantu (górna warstwa zawierająca RNA) i dodać do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 350 μl 70% etanolu. Uważaj, aby nie zassać dolnych warstw białka i/lub DNA
    8. Przenieść do 700 μl mieszaniny do mini kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Kontynuuj izolację RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    9. Eluować 30-50 μl wody wolnej od RNaz, w zależności od oczekiwanego plonu. Trzymaj RNA na lodzie i zmierz wydajność za pomocą spektrofotometru. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C
      UWAGA: Możliwe jest pominięcie etapu leczenia DNazą, ponieważ ostrożne usunięcie tylko górnych 350 μl warstwy RNA jest wystarczające, aby zapobiec zanieczyszczeniu DNA. Oprócz analizy RT-qPCR, wyizolowany RNA może być również używany do sekwencjonowania RNA, w którym to przypadku zdecydowanie zaleca się etap leczenia DNazą.
  2. Synteza cDNA
    1. Użyj do 1 μg RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Po zakończeniu cyklu dodaj 80 μl wody wolnej od RNaz. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. RT-qPCR genów selektywnych względem adipocytów.
    1. Używając formatu 384-dołkowego, dodaj 1 μl startera (~1 μM stężenie końcowe) na dno każdego dołka. Wstępne suszenie podkładów skutkuje ściślejszymi powtórzeniami technicznymi. Pozostawić pod przykryciem do momentu całkowitego odparowania podkładów (płytkę można umieścić na bloku grzewczym ustawionym na 37 °C, aby przyspieszyć parowanie).
    2. Przygotuj reakcje próbek z czterema do ośmiu kontrprób technicznych w następujący sposób: 2,5 μl głównej mieszanki RT-PCR na bazie barwnika, 2,1 μl wody wolnej od RNaz i 0,4 μl cDNA (~1 ng) o całkowitej objętości 5 μl na studzienkę. Zastosowano następujące warunki cykli termicznych: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 15 s i wyżarzanie/rozciąganie w temperaturze 60 °C przez 25 s przez 40 cykli.
    3. Znormalizuj surowe wartości CT (próg cyklu) do poziomów genów porządkowych (tj. Hprt i Pde12), obliczając ΔΔCT zgodnie z opisem tutaj38. Zobacz20 dla sekwencji starterów.
      UWAGA: Należy postępować zgodnie ze standardową praktyką analizy RT-qPCR, taką jak stosowanie kontroli odwrotnej transkrypcji minus (-RT), reakcji PCR i walidacji starterów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunofluorescencyjna wizualizacja domięśniowego tłuszczu
Postępując zgodnie z powyższymi krokami i przeglądając Rysunek 1A, skrawki tkanki TA zostały pobrane z 21 dni po urazie glicerolu, które zostały albo zamrożone natychmiast po zbiorze w izopentanie chłodzonym LN2, albo utrwalone w 4% PFA przez 2,5 godziny. Po kriosekcji i barwieniu obu próbek, zdjęcia wykonano w połowie brzucha, największym obszarze TA. Adipocyty PERILIPIN+ z nieustalonych TA (Figura 1B) mają znacznie zmienioną morfologię w porównaniu z ustalonymi sekcjami (Figura 1C), co sprawia, że ich identyfikacja, wizualizacja i późniejsza kwantyfikacja są znacznie trudniejsze i potencjalnie niedokładne. Należy zauważyć, że pierwsze kropelki lipidu PERILIPIN+ wykryto około 5 dni po urazie, przy czym większość adipocytów utworzyła się do 7 dnia. Po 21 dniach od urazu adipocyty osiągnęły pełną dojrzałość.

Ponieważ ilość tłuszczu na TA silnie koreluje z ciężkością wywołanego urazu, TA muszą być znacznie uszkodzone, aby skutecznie obserwować i badać tworzenie się tłuszczu śródmięśniowego. Ćwiczenie wstrzykiwań przy użyciu tuszu do zwłok to świetny sposób na poprawę ciężkości obrażeń. Udane urazy zwykle dotyczą powyżej 50% mięśnia. Należy zauważyć, że uszkodzone obszary mięśni reprezentują obszary pozbawione włókien mięśniowych lub obszary wypełnione włóknami mięśniowymi, które zawierają co najmniej jedno centralnie położone jądro, znaną cechę regenerującego się włókna mięśniowego.

Ten protokół można łatwo dostosować do barwienia FAPów i tłuszczu w 3D. W tym celu starannie oddzielono wiele włókien mięśniowych z TA po utrwaleniu, a następnie przeprowadzono immunofluorescencję całego wierzchowca. Kluczem jest odpowiednie przymocowanie włókien do szkiełka i jednocześnie uniknięcie nadmiernego ucisku tkanki. Korzystając z formowalnych glinianych nóżek, użytkownik może dostosować wymaganą grubość i przymocować szkiełko nakrywkowe do szkiełka, umożliwiając nawet użycie mikroskopu odwróconego (Rysunek 4A). Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do znakowania PDGFRα + FAP, włókien mięśniowych Phalloidyny + i adipocytów eksprymujących PERILIPINĘ (Figura 4B, Dodatkowe wideo 1 i Uzupełniające wideo 2). Po uzyskaniu obrazów w wielu płaszczyznach z o grubości do 150 μm, moduł renderowania 3D w oprogramowaniu mikroskopowym został wykorzystany do stworzenia rekonstrukcji 3D.

figure-results-1
Rysunek 4: Barwienie immunofluorescencyjne w całości. (A) Widok z góry i z boku, jak zamontować próbkę i dodać szkiełko nakrywkowe do barwienia całego mocowania. (B) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D FAP (zielony; po lewej) i adipocytów (czerwony; po prawej) wraz z włóknami mięśniowymi (szary) i jądrami (niebieski). Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kwantyfikacja tłuszczu śródmięśniowego
Po wykonaniu zdjęć tłuszczu śródmięśniowego, funkcja licznika komórek w ImageJ/FIJI została użyta do ręcznego zliczenia liczby adipocytów PERLIPIN+ (Figura 5A). Następnie oznaczono łączną powierzchnię odcinka mięśniowego oraz obszar uszkodzony, zdefiniowany przez centralnie położone jądra w obrębie włókien mięśniowych. Aby kontrolować ciężkość urazu, całkowitą liczbę adipocytów podzielono przez uszkodzony obszar, co dało liczbę komórek tłuszczowych na 1mm2 uszkodzonego mięśnia. Zazwyczaj TA, które wykazują <30% urazu, są wyłączone z kwantyfikacji. Należy zauważyć, że chociaż adipocyty są rzadkie bez uszkodzenia, od zera do ośmiu na obszar przekroju poprzecznego, całkowita liczba adipocytów jest nadal znormalizowana przez całkowitą powierzchnię. Jak podkreślono w Rysunek 5B, uraz glicerolu powoduje ogromne ilości tłuszczu śródmięśniowego w porównaniu z nieuszkodzonym mięśniem TA. Alternatywnie, ponieważ barwienie perilipiny jest bardzo czyste z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, możliwe jest również użycie funkcji Analizuj cząstki w celu określenia całkowitego obszaru zajmowanego przez perilipinę. Jednak ta metoda nie będzie w stanie odróżnić mniejszych od mniejszych adipocytów. Zobrazowano i określono ilościowo do trzech sekcji z co najmniej czterech pojedynczych zwierząt, a także podano średnią liczbę komórek tłuszczowych obecnych na mysz.

figure-results-2
Rysunek 5: Kwantyfikacja tłuszczu śródmięśniowego. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący, jak liczyć adipocyty PERILIPIN+ (białe) za pomocą funkcji Cell Counter w ImageJ. Pasek skali: 50 μm. (B) Oznaczanie ilościowe całych adipocytów TA 21 dni po wstrzyknięciu glicerolu znormalizowane do 1 mm2 uszkodzonego obszaru. Każda kropka reprezentuje średnią z jednej myszy. Słupki błędów pokazane jako SEM. **** = p < 0,0001. (C) Warstwa RNA po homogenizacji, a następnie rozdzieleniu faz za pomocą chloroformu jest używana do analizy RT-qPCR. (D) Krotne zmiany w poziomach ekspresji Pparg i Cepbα, wczesnych genów adipogennych oraz Plin1 i Adipoq, dwóch dojrzałych markerów adipocytów, w różnych punktach czasowych po uszkodzeniu glicerolu. Każda kropka reprezentuje średnią z jednej myszy. Słupki błędów pokazane jako SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby niezależnie potwierdzić ilość obecnego tłuszczu śródmięśniowego, można określić poziomy ekspresji genów różnych markerów adipogennych. W tym celu RNA można wyizolować z części tego samego mięśnia TA, który jest używany do immunofluorescencji (patrz kroki powyżej) w różnych punktach po urazie. Do homogenizacji tkanki użyto ubijaka do kulek w połączeniu z tiocyjanianem guanidu. Po dodaniu chloroformu, a następnie odwirowaniu, górna warstwa zawierająca RNA została ostrożnie wyekstrahowana, a do oczyszczania RNA użyto mini kolumn wirowych (Rysunek 5C). Metoda ta rutynowo pozwala uzyskać wysoką jakość i ilość RNA odpowiednią do wszystkich dalszych analiz, takich jak RT-qPCR i RNAseq. W przypadku RT-qPCR określono względne poziomy ekspresji genów adipogennych do genów porządkowych, a wszelkie względne zmiany oceniono metodą ΔΔCT38. Jak opisano w Rysunek 5D, w porównaniu do nieuszkodzonego mięśnia TA, uszkodzenie glicerolu indukuje ekspresję wczesnych markerów adipogennych, takich jak Pparg i Cebpα, już 3 dni po urazie. Dojrzałe markery, takie jak adiponektyna (Adipoq) i perylopina (Plin1), można wykryć już po 5 dniach od uszkodzenia gliceryny.

Genetyczne śledzenie linii adipocytów
Przedstawiony tutaj protokół barwienia adipocytów można łatwo dostosować tak, aby obejmował śledzenie linii genetycznej FAP w celu mapowania i śledzenia ich losu w adipocytach. Na przykład wykazaliśmy wcześniej, że rekombinacja może być indukowana poprzez podawanie tamoksyfenu w PdgfrαCreERT2; MyszyEYFP Rosa26 2 tygodnie przed urazem, skutecznie usuwając floksowane kodowanie stop i nieusuwalnie aktywując ekspresję EYFP w FAP (Rysunek 6A). Osiągnęliśmy wysoką skuteczność rekombinacji przy użyciu schematu tamoksyfenu przedstawionego tutaj, przy czym ~75% FAP PDGFRα+ wyrażało EYFP20, podobnie jak inne laboratoria zgłosiły27,39,40. Wykazując, że FAP są rzeczywiście komórkowym pochodzeniem tłuszczu śródmięśniowego, większość FAP przekształciła się w adipocyty eksprymujące EYFP+ PERILIPINA 7 dni po uszkodzeniu glicerolu (Figura 6B).

figure-results-3
Rysunek 6: Śledzenie pochodzenia FAPów. (A) Schematyczny przegląd konfiguracji eksperymentalnej. (B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne pokazujące udaną rekombinację i aktywację EYFP (żółty) w obrębie PDGFRα + FAP (czerwony, groty strzałek) i adipocytów PERILIPIN+ (czerwony, gwiazdki). Podziałka skali: 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykrywanie wielu typów komórek
Protokół ten może być również wykorzystany do wizualizacji przedziału miogennego. Stosując przeciwciała przeciwko PAX7 i MYOD1, komórki macierzyste mięśni (MuSC) i mioblasty można łatwo wykryć 5 dni po uszkodzeniu glicerolu nawet w skrawku tkanki mięśniowej utrwalonej PFA (Ryc. 7). Dzięki temu prezentowany protokół jest wszechstronny i można go dostosować nie tylko do znakowania i obrazowania adipocytów i FAP, ale także innych typów komórek linii miogennej.

figure-results-4
Rysunek 7: Barwienie immunofluorescencyjne komórek macierzystych mięśni i mioblastów. (A) Schematyczny przegląd konfiguracji eksperymentalnej. (B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne pokazujące udane barwienie komórek macierzystych mięśni (MuSC) (żółty, po lewej) za pomocą PAX7 i mioblastów (żółty, po prawej) za pomocą MYOD1. LAMININ zarysowuje włókna mięśniowe (białe), a jądra są w kolorze cyjanu. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Renderowanie 3D FAP. Trójwymiarowa rekonstrukcja włókien mięśniowych, FAP i jąder wybarwionych odpowiednio na faloidynę (szary), PDGFRα (zielony) i DAPI (niebieski) 21 dni po urazie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo 2: Renderowanie 3D tłuszczu śródmięśniowego. Wolumetryczne renderowanie wiązek włókien mięśniowych (szary, FALOIDYNA) i tłuszczu śródmięśniowego (czerwony, PERILIPIN), który zastąpił miofiber 21 dni po uszkodzeniu glicerolu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia obszerny i szczegółowy protokół, który pozwala na efektywną wizualizację i rygorystyczną kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej. Dzięki podziale tego samego mięśnia na dwie części, z których jedna jest używana do immunofluorescencji, a druga do analizy RT-qPCR, protokół ten jest również bardzo wszechstronny. Można go również połączyć ze śledzeniem linii genetycznej FAP w celu zbadania ich konwersji do adipocytów w określonych warunkach i jest wysoce przystosowany do znakowania i obrazowania wielu dodatkowych typów komórek.

Najczęściej stosowanymi sposobami wizualizacji tłuszczu śródmięśniowego są skrawki parafiny, a następnie barwienie hematoksyliną i eozyną lub zamrożone skrawki barwione na barwniki lipofilowe, takie jak Oil Red O (ORO). Jednak podczas gdy tkanki przetwarzane parafiną zachowują najlepszą histologię, ten sam proces ekstrahuje również wszystkie lipidy, zapobiegając stosowaniu barwników lipofilowych. Chociaż metody barwienia lipofilowego będą działać zarówno na odcinkach tkanek utrwalonych, jak i nieutrwalonych PFA, kropelki lipidów są łatwo przemieszczane przez wywieranie nacisku na szkiełko nakrywkowe, zniekształcając w ten sposób przestrzenny rozkład tłuszczu śródmięśniowego. Aby obejść ten problem, w niedawnym badaniu opracowano rygorystyczny protokół wizualizacji adipocytów ORO+ przy użyciu podejścia całościowego. W tym celu autorzy zdecelularyzowali TA, aby uwidocznić przestrzenny rozkład śródmięśniowej tkanki tłuszczowej w całym TA41. Choć ta technika jest potężna, zapobiega również stosowaniu innych współbarwień do oznaczania dodatkowych struktur komórkowych. Przedstawione tutaj podejście do immunofluorescencji wierzchowca może być wykorzystane do współbarwienia adipocytów różnymi markerami, co pozwala na dokładne mapowanie środowiska komórkowego. Jednym z głównych wyzwań jest jednak przenikanie przeciwciał do tkanek. Im więcej włókien jest utrzymywanych razem, tym trudniej będzie przeciwciałom równomiernie przeniknąć i związać wszystkie dostępne antygeny. Dlatego ta metoda jest najbardziej skuteczna, gdy patrzy się na małe grupy włókien. Jednocześnie jest to również ograniczenie, ponieważ ogólna anatomiczna lokalizacja śródmięśniowej tkanki tłuszczowej jest tracona, gdy skupiamy się tylko na małych, złuszczonych wiązkach włókien. Jednak dzięki obecnemu rozwojowi nowatorskich metod oczyszczania tkanek oraz nowej technologii obrazowania, w przyszłości możliwa będzie większa penetracja i wizualizacja tkanek 42,43,44.

Podczas gdy wcześniejsze utrwalenie tkanki mięśniowej zachowuje morfologię adipocytów, stwarza również wyzwanie w ocenie wielkości włókien mięśniowych, która jest ważną miarą zdrowia mięśni. Rozmiar włókien mięśniowych określa się poprzez pomiar pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych. Wcześniej informowaliśmy, że wcześniejsze utrwalenie tkanki mięśniowej spowoduje, że większość dostępnych markerów do zarysowania włókien mięśniowych ulegnie awarii31. Aby pokonać tę przeszkodę, opracowaliśmy nowatorski potok segmentacji obrazu, który umożliwia pomiar rozmiaru włókien mięśniowych nawet w stałych odcinkach mięśni31. W ten sposób stworzyliśmy solidny i wydajny rurociąg przetwarzania tkanek, który w połączeniu z tym protokołem pokonuje większość wad spowodowanych wcześniejszym utrwaleniem tkanki mięśniowej.

Kolejną ważną zaletą tego podejścia jest wszechstronność. Dzieląc TA na dwie części, maksymalizuje się ilość informacji, które można uzyskać z jednego mięśnia. To nie tylko zmniejsza liczbę zwierząt, ale także dodaje dodatkową warstwę kontroli, potwierdzając histologię poprzez ekspresję genów i odwrotnie. Ponadto można badać wiele różnych genów poza genami adipogennymi. Wyizolowane RNA można również wykorzystać w eksperymencie RNAseq całych mięśni. Wreszcie, zamrożony kawałek mięśni może być również używany do pracy z białkami. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest możliwość, że uraz nie będzie spójny na całej długości TA. Może to prowadzić do scenariusza, w którym dwie części mięśni różnią się pod względem ilości zawartego w nich tłuszczu śródmięśniowego, co może uzasadniać wykluczenie takiej próbki z dalszej analizy. W związku z tym zaleca się, aby nie polegać tylko na RT-qPCR w celu wyciągnięcia głównych wniosków na temat ilości tłuszczu śródmięśniowego, ale raczej jako danych uzupełniających do histologicznych ocen ilościowych.

Łącznie protokół ten nakreśla solidny, wydajny i rygorystyczny proces przetwarzania tkanek, który umożliwi wizualizację i kwantyfikację śródmięśniowej tkanki tłuszczowej, co jest pierwszym krokiem w opracowywaniu nowych opcji leczenia w celu zwalczania zwłóknienia tłuszczowego. Jednocześnie jest wszechstronny i może być dostosowany do wielu różnych typów komórek w mięśniach, a także adipocytów w innych tkankach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Kopinke za pomoc w zbieraniu danych i krytycznym czytaniu manuskryptu. Dziękujemy również członkom Instytutu Myologii Uniwersytetu Florydy za ich cenny wkład w prace nad manuskryptem. Prace były wspierane przez grant NIH 1R01AR079449. Rysunek 2 został stworzony za pomocą Biorender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% PFA (opakowanie 12 butelek o pojemności 10 ml)Elektronowa miskroskopia Sciences15710
2,0 ml probówki do mikrowirówekFisher Scientific05-408-138mikrowirówki do zamrażania/ubijania kulek
2-metylobutan (4 l)Fisher ChemicalO3551-4izopentan
Absolutny etanol (200 dowodów)ThermoFisher ScientificBP2818100
AffiniPure Fab fragment osła anty-myszJackson ImmunoResearch715-007-003blokowanie myszy na myszy
Alexa Fluor 488 wtórne przeciwciało anty-kurczaka osłaJackson ImmunoResearch703-545-155
Alexa Fluor 488 drugorzędowe przeciwciało przeciw myszomInvitrogenA21202
Alexa Fluor 488 przeciwciało wtórneprzeciwko królikowi osłaInvitrogenA21206
Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne przeciwko kozom osłaInvitrogenA11057
Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne przeciwko królikowiInvitrogenA11037
Alexa Fluor 568 Przeciwciało falloidynyInvitrogenA12380Rozpuszczone w 1,5 ml metanolu (~66 &mikro; Roztwór roboczy M)
BioLite 24-dołkowe MultidishThermoFisher Scientific 93018624-dołkowa płytka do inkubacji tkanek PFA
Biometra TOneanalytikjena8462070301Termocykler
Przeciwciało anty-GFP kurczakaAvesLabs GFP-1020
Chloroform/alkohol izoamylowy 24:1(v/v) do biologii molekularnej, DNAzy, RNAzy i bez proteazyThermoFisher ScientificAC327155000
Olej kukurydzianySigma AldrichC8267
DAPI bejcaInvitrogenD1306150 µ Roztwór roboczy M w dH2O
Serum osła (100 ml)Milipore Sigma5058837do roztworu blokującego
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11251-20pęseta z ostrymi końcówkami
Cienkie nożyczki proste 9 cmFine Science Tools14060-09
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01podłoże montażowe
Glicerol, 99,5%, do biologii molekularnej (500 ml)Acros Organics327255000
Koza przeciwciało anty-PDGFR&alfaR& DAF1062
Piec do hybrydyzacjiVWR230301Vdo inkubacji tamoksyfenu
ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP PenVector LaboratoriesHydrofobowy wstrzykiwaczH-4000
Strzykawka insulinowa z mikrocienką igłą dożylną (28 G)BD
z końcówką wsuwaną, 1 mlBD329654Strzykawka insulinowa bez igły, do podawania doustnego
Zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad1708890
IsofluranePatterson Veterinary78938441
Mikroskop odwrócony Leica DMi8 MikroskopLeicaużywany do szerokokątnego obrazowania IF i konfokalnego
MikroszkiełkaVWR48311-703dodatnio naładowane preparaty mikroskopowe
mysie przeciwciałoanty-MYODMysieMA1-41017
DSHBAB 428528
MX35 Premier+ Ostrza mikrotomuThermoFisher Scientific3052835
Spektrofotometr NanoDrop 2000 SpektrofotometrThermoFisher ScientificND2000do pomiaru wydajności RNA
Play-DohHasbro
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisher ScientificA25742zielony barwnik PCR master mix
Puralube Maść weterynaryjnaPuralube17033-211-38weterynaryjna maść okulistyczna
QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR SystemApplied Biosystems4485694qPCR
Przeciwciało przeciw perylipinie królikaTechnologia sygnalizacji komórkowej9349S
Wytrząsarka z czerwonym wirnikiemWytrząsarka Hoefer ScientificPR70-115Vdo barwienia IF
Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover GlassSzkiełka nakrywkoweThermoFisher Scientific152460
RNeasy Mini KitQIAGEN74106zawiera mini kolumny wirujące
Safe-Lock Tubes 1,5 ml, naturalneEppendorf22363204
Sample Tubes RB (2 mL)QIAGEN990381
Azydek soduAlfa Aesar14314
Koraliki ze stali nierdzewnej, 2,8 mmPrecellysKT03961-1-101. Małekoraliki
Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mmKoraliki średnieQIAGEN69989
Koraliki ze stali nierdzewnej, dużekoraliki7 mm QIAGEN69990
Skalpele jednorazowe ze stali nierdzewnejSkalpel Miltex327-4102
Rurka do karmienia ze stali nierdzewnej, 20 G x 38 mm, prostaInstech LaboratoriesIgła
do pomiaru fal FTSS-20S-3TamoxifenToronto Research ChemicalsT006000
Tissue Plus O.C.T. CompoundFisher HealthCare4585do zatapiania
TissueLyser LTQIAGEN85600ubijak do koralików
Adapter TissueLyser LT, 12-tubowyQIAGEN69980
Tissue-Tek CryomoldSakura4566formy do próbek
Triton X-100OdczynnikAesar A16046
Tiocyjanian guaniduThermoFisher Scientific15596026
Tween20 (500 mL)Fisher BioReagentsBP337-500
Mikroprowadnice VWR - Superfrost PlusSłoiki48311703
Wheaton CoplinSłoik Millipore SigmaS6016Coplin
Strzykawka do insuliny 329461 przeciwciało anty-PAX7 (supernatant) Invitrogen Mieszanka modelarskaBK podłoże TRIzol Alfa do barwienia VWR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Milad, N., et al. Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).
  2. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
  3. Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  4. Goodpaster, B. H., et al. The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).
  5. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
  6. Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
  7. Burakiewicz, J., et al. Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).
  8. Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. MRI of normal and pathologic skeletal muscle. American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).
  9. Willcocks, R. J., et al. Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort. Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).
  10. Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).
  11. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).
  12. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  13. Joe, A. W., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  14. Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
  15. Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration. Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).
  16. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).
  17. Hogarth, M. W., et al. Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B. Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).
  18. Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  19. Stumm, J., et al. Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury. Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).
  20. Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
  21. Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells. PLoS One. 7 (10), 47496(2012).
  22. Sun, Y. -M., et al. PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).
  23. Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).
  24. Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
  25. Santini, M. P., et al. Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner. Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).
  26. Uezumi, A., et al. Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle. Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).
  27. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  28. Soliman, H., et al. Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  29. Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).
  30. Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
  31. Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle. Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).
  32. Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
  33. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  34. Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), 71084(2013).
  35. Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).
  36. Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).
  37. Kawai, H., et al. Experimental glycerol myopathy: a histological study. Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).
  38. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  39. Uezumi, A., et al. Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).
  40. Biferali, B., et al. Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair. Science Advances. 7 (23), 9371(2021).
  41. Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).
  42. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).
  43. Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease. iScience. 23 (8), 101432(2020).
  44. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Progenitory kom rki fibro adypogennemorfologia adipocyt wregeneracja mi nigenetyczne ledzenie linii kom rkowychobrazowanie immunofluorescencyjneRT qPCRmarkery adypogenneutrwalanie tkanek

Powiązane artykuły