Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

DOI:

10.3791/64001

⸱

20 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Howard Hughes Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przechwytywanie konformacji chromosomów (3C) służy do wykrywania trójwymiarowych oddziaływań chromatyny. Zazwyczaj chemiczne sieciowanie formaldehydem (FA) stosuje się do utrwalania oddziaływań chromatyny. Następnie trawienie chromatyny enzymem restrykcyjnym i późniejsza religacja końców fragmentów przekształca trójwymiarową (3D) bliskość w unikalne produkty ligacji. Wreszcie, po odwróceniu wiązań krzyżowych, usunięciu białka i izolacji DNA, DNA jest ścinane i przygotowywane do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Częstość ligacji zbliżeniowej par loci jest miarą częstości ich kolokalizacji w przestrzeni trójwymiarowej w populacji komórek.

Sekwencjonowana biblioteka Hi-C dostarcza informacji o częstości interakcji między wszystkimi parami loci dla całego genomu. Rozdzielczość i precyzja Hi-C opiera się na wydajnym sieciowaniu, które utrzymuje kontakty chromatyny oraz częstą i równomierną fragmentację chromatyny. W artykule opisano ulepszony protokół Hi-C in situ, Hi-C 3.0, który zwiększa efektywność sieciowania poprzez połączenie dwóch środków sieciujących (formaldehydu [FA] i glutaranu disuccinimidylu [DSG]), a następnie dokładniejsze trawienie przy użyciu dwóch enzymów restrykcyjnych (DpnII i DdeI). Hi-C 3.0 to pojedynczy protokół do dokładnej kwantyfikacji cech fałdowania genomu w mniejszych skalach, takich jak pętle i domeny kojarzenia topologicznego (TAD), a także cech w większych skalach obejmujących jądro, takich jak przedziały.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przechwytywanie konformacji chromosomów jest używane od 2002 roku1. Zasadniczo, każdy wariant wychwytywania konformacji opiera się na utrwaleniu interakcji DNA-białko i białko-białko w celu zachowania organizacji chromatyny 3D. Po tym następuje fragmentacja DNA, zwykle trawienie restrykcyjne, a na końcu religacja pobliskiego DNA kończy się w celu przekształcenia przestrzennie proksymalnych loci w unikalne kowalencyjne sekwencje DNA. Początkowe protokoły 3C wykorzystywały PCR do próbkowania określonych interakcji "jeden do jednego". Kolejne testy 4C pozwoliły na wykrycie interakcji "jeden do wszystkich"2, podczas gdy 5C wykryło interakcje "wiele-do-wielu"3. Przechwytywanie konformacji chromosomów przyniosło pełne owoce po wdrożeniu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (NGS) nowej generacji, które umożliwiło wykrywanie interakcji genomowych "all-to-all" przy użyciu całego genomu Hi-C4 i porównywalnych technik, takich jak 3C-seq5, TCC6 i Micro-C7,8 (zobacz także recenzję Denkera i De Laat9).

W Hi-C, biotynylowane nukleotydy są używane do oznaczania 5′ nawisów po trawieniu i przed podwiązaniem (Rysunek 1). Pozwala to na selekcję prawidłowo strawionych i zreligowanych fragmentów za pomocą kulek pokrytych streptawidyną, co odróżnia go od GCC10. Ważna aktualizacja protokołu Hi-C została wdrożona przez Rao et al.11, którzy przeprowadzili trawienie i religację w nienaruszonych jądrach (tj. in situ) w celu zmniejszenia fałszywych produktów ligacji. Co więcej, zastąpienie trawienia HindIII trawieniem MboI (lub DpnII) zmniejszyło rozmiar fragmentu i zwiększyło potencjał rozdzielczy Hi-C. Wzrost ten pozwolił na wykrycie struktur o stosunkowo małej skali i bardziej precyzyjną lokalizację genomową punktów styku, takich jak pętle DNA między małymi elementami cis, np. pętle między miejscami związanymi z CTCF generowane przez wytłaczanie pętli11,12. Potencjał ten ma jednak swoją cenę. Po pierwsze, dwukrotny wzrost rozdzielczości wymaga czterokrotnego (22) zwiększenia sekwencjonowania reads13. Po drugie, małe rozmiary fragmentów zwiększają prawdopodobieństwo pomylenia niestrawionych sąsiednich fragmentów z fragmentami strawionymi i zreligowanymi14. Jak wspomniano, w Hi-C strawione i zreligowane fragmenty różnią się od niestrawionych fragmentów obecnością biotyny na złączu ligacyjnym. Jednak prawidłowe usuwanie biotyny z nieligowanych końców jest wymagane, aby zapewnić, że tylko połączenia ligacyjne są ściągane w dół14,15.

Wraz ze spadkiem kosztów NGS, możliwe staje się bardziej szczegółowe badanie fałdowania chromosomów. Aby zmniejszyć rozmiar fragmentów DNA, a tym samym zwiększyć rozdzielczość, protokół Hi-C można dostosować do częstszego stosowania enzymów ograniczających cięcie16 lub do stosowania kombinacji enzymów restrykcyjnych17,18,19. Alternatywnie, MNase7,8 w Micro-C i DNase w DNase Hi-C20 można miareczkować w celu uzyskania optymalnego trawienia.

Niedawna systematyczna ocena podstaw metod 3C wykazała, że wykrywanie cech fałdowania chromosomów w każdej skali długości znacznie się poprawiło dzięki sekwencyjnemu sieciowaniu z 1% FA, a następnie 3 mM DSG17. Co więcej, Hi-C z trawieniem HindIII był najlepszą opcją do wykrywania cech fałdowania na dużą skalę, takich jak przedziały, a Micro-C był lepszy w wykrywaniu cech fałdowania na małą skalę, takich jak pętle DNA. Wyniki te doprowadziły do opracowania pojedynczej strategii "Hi-C 3.0" o wysokiej rozdzielczości, która wykorzystuje kombinację środków sieciujących FA i DSG, a następnie podwójne trawienie endonukleazami DpnII i DdeI21. Hi-C 3.0 zapewnia skuteczną strategię do ogólnego użytku, ponieważ dokładnie wykrywa cechy składania we wszystkich skalach długości17. Eksperymentalna część protokołu Hi-C 3.0 jest szczegółowo opisana tutaj i pokazane są typowe wyniki, których można się spodziewać po sekwencjonowaniu.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Procedura Hi-C w sześciu krokach. Komórki są utrwalane najpierw za pomocą FA, a następnie DSG (1). Następnie liza poprzedza podwójne trawienie z DdeI i DpnII (2). Biotyna jest dodawana przez wypełnienie zwisu, a proksymalnie stępione końce są ligowane (3) przed oczyszczeniem DNA (4). Biotyna jest usuwana z niezwiązanych końcówek przed sonikacją i wyborem wielkości (5). Wreszcie, ściąganie biotyny pozwala na ligację adaptera i amplifikację biblioteki przez PCR (6). Skróty: FA = formaldehyd; DSG = glutaran disuccinimidylu; B = Biotyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrwalenie przez sieciowanie

  1. Utrwalanie formaldehydu: zaczynając od komórek w monowarstwie
    1. Umieść komórki w odpowiednim podłożu, aby zebrać 5 × 106 komórek na płytkę 150 mm.
      UWAGA: Użytkownicy mogą wybrać dowolny preferowany pojemnik, który zapewnia optymalny wzrost dowolnej linii komórkowej ssaków. Dodatkowo komórki można wyizolować z tkanki.
    2. Odessać pożywkę pipetą Pasteura sprzężoną z pułapką próżniową z płytki 150 mm, przemyć 2x ~10 ml HBSS.
    3. Bezpośrednio przed sieciowaniem przygotuj 1% roztwór sieciujący FA w probówce o pojemności 50 ml, łącząc 22,5 ml HBSS i 625 μl 37% FA do końcowego stężenia 1%. Delikatnie wymieszaj, kołysząc.
      UWAGA: Używać dygestorium; Formaldehyd jest toksyczny.
    4. Aby usieciować komórki, wlej 23,125 ml 1% roztworu FA na każdą 15 cm płytkę.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i delikatnie kołysać płytkami ręcznie co 2 minuty.
    6. Dodać 1,25 ml 2,5 M glicyny (128 mM końcowej) i delikatnie zamieszać płytkę, aby wygasić reakcję sieciowania.
    7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i kontynuować inkubację na lodzie przez co najmniej 15 minut, aby zatrzymać sieciowanie.
    8. Zeskrob komórki z płytek za pomocą skrobaka do komórek lub gumowego policjanta.
    9. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pipetą. Odwirować przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant przez aspirację.
    10. Przepłukać osad komórkowy 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, używając pipety do ponownego zawieszenia. Następnie odwirować przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przejdź natychmiast do DSG crosslinking.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas mycia osadu komórkowego, ponieważ granulki komórek mogą być luźne, a komórki mogą zostać utracone.
  2. Wiązanie formaldehydu: zaczynając od komórek w zawiesinie
    1. Umieść komórki w odpowiednim podłożu, aby zebrać 5 × 106 komórek na naczynie.
      UWAGA: Użytkownicy mogą wybrać dowolny preferowany pojemnik, który zapewnia optymalny wzrost komórek dowolnej linii komórkowej ssaków.
    2. Bezpośrednio przed zbiorem należy policzyć komórki i przenieść 5 × 106 komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Delikatnie granulować komórki, odwirowując przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Przygotuj 1% roztwór sieciujący FA, dodając 1,25 ml 37% FA do 45 ml HBSS i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.
      UWAGA: Dodaj całe 1,25 ml FA bez dzielenia ilości.
      UWAGA: Formaldehyd jest wysoce toksyczny.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 46,25 ml 1% roztworu sieciującego FA przygotowanego w poprzednim kroku, pipetując w górę iw dół.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut na rotatorze, kołysce lub poprzez delikatne ręczne odwracanie rurki co 1-2 minuty.
    7. Ugasić reakcję sieciowania, dodając 2,5 ml 2,5 M glicyny (128 mM końcowej) i dobrze wymieszać, odwracając probówkę.
    8. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie na lodzie przez co najmniej 15 minut, aby całkowicie zatrzymać sieciowanie.
    9. Odwirować w temperaturze pokojowej w celu osadzenia usieciowanych komórek o masie 1 000 × g przez 10 minut i odrzucić supernatant przez aspirację.
    10. Umyj komórki raz 10 ml DPBS, a następnie odwiruj przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odrzucić supernatant za pomocą pipety i natychmiast przystąpić do sieciowania DSG.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas mycia osadu komórkowego, ponieważ granulki komórek mogą być luźne, a komórki mogą zostać utracone.
  3. Sieciowanie glutaranem disuccinimidylu
    1. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 9,9 ml DPBS przed dodaniem 100 μl 300 mM DSG (3 mM final). Mieszanie przez inversion.
      UWAGA: DSG jest wrażliwy na wilgoć. Ważne jest, aby w dniu sieciowania przygotować świeży zapas 300 mM DSG w DMSO.
      UWAGA: DSG w DMSO jest wysoce toksyczne.
    2. Sieciować ogniwa w temperaturze pokojowej przez 40 minut na rotatorze.
    3. Dodaj 1,925 ml 2,5 M glicyny (400 mM końcowe), odwróć do wymieszania i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Odwirować komórki w stężeniu 2 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas usuwania supernatantu z luźnych granulek komórkowych.
    5. Zawiesić osad w 1 ml 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)-DPBS i przenieść do probówki o pojemności 1,7 ml.
      UWAGA: Dodatek BSA może pomóc w zmniejszeniu zlepiania się komórek.
    6. Odwirować komórki w temperaturze 2 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety.
      UWAGA: Aby uniknąć utraty osadu, należy szybko i całkowicie usunąć supernatant.
    7. Granulat należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do następnego kroku.

2. Przechwytywanie konformacji chromosomów

  1. Liza komórek i trawienie chromatyny
    1. Zawiesić (pipetować) usieciowane porcje komórek (~5 × 106 komórek) w 1 ml lodowatego buforu do lizy (przepis w tabeli uzupełniającej S1) zawierającego 10 μl koktajlu inhibitorów proteazy i przenieść do homogenizatora z odtążkami na 15 minut inkubacji na lodzie.
      UWAGA: Inhibitory proteazy należy dodać do buforu do lizy bezpośrednio przed użyciem.
    2. Powoli przesuwaj tłuczek A w górę i w dół 30 razy, aby homogenizować komórki na lodzie i inkubuj na lodzie przez 1 minutę, aby komórki ostygły, przed kolejnymi 30 pociągnięciami.
    3. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
      UWAGA: Utrzymuj zawiesinę w ruchu, ponieważ czasami komórki zacinają się w końcówce pipety.
    4. Odwirować zlizowaną zawiesinę o stężeniu 2 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Wyrzucić supernatant i roztrząsnąć lub wymieszać mokry osad w celu ponownego zawieszenia. Usuń jak najwięcej sklarowanego osadu, aby uzyskać substancję podobną do jogurtu z minimalnymi grudkami.
    6. Zawiesić osad w 500 μl lodowatego buforu 1x bufor ograniczający (od 10x; patrz przepis w tabeli uzupełniającej S1) i wirować przez 5 minut przy 2,500 × g. Powtórz ten krok dla drugiego prania.
      UWAGA: Osad w buforze restrykcyjnym 1x jest bardziej ziarnisty niż poprzedni granulat w buforze do lizy.
    7. Ponownie zawiesić komórki w końcowej objętości 360 μL 1x buforu restrykcyjnego przez pipetowanie po dodaniu ~340 μL do przeniesionej objętości osadu, która zależy od wielkości komórki.
    8. Odłóż 18 μl każdego lizatu do zbadania integralności chromatyny (CI). Przechowywać próbki CI w temperaturze 4 °C.
    9. Dodać 38 μl 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) do każdej probówki Hi-C (całkowita objętość 380 μl) i dokładnie wymieszać pipetując bez wprowadzania pęcherzyków.
      UWAGA: SDS jest toksyczny.
    10. Inkubować próbki w temperaturze 65 °C bez wstrząsania dokładnie przez 10 minut, aby otworzyć chromatynę.
    11. Natychmiast umieścić probówki na lodzie i przygotować mieszaninę wytrawiającą z Triton X-100 w celu ugaszenia SDS zgodnie z opisem w Tabeli 1.
    12. Dodać 107 μl mieszaniny wytrawiającej do probówki Hi-C (łącznie 487 μl), aby wytrawić chromatynę przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C w termomikserze z przerywanym wytrząsaniem (np. 900 obr./min, 30 s włączenia, 4 min wyłączenia).
      UWAGA: Dodanie Trytona do końcowego stężenia 1% służy do wygaszenia SDS.
  2. Kończy się biotynylacja DNA
    1. Po całonocnym roztwarzaniu przenieść próbki do temperatury 65 °C na 20 minut, aby dezaktywować pozostałą aktywność endonukleazy.
    2. Podczas inkubacji należy przygotować mieszankę wzorcową do wypełniania, jak pokazano w tabeli 2.
    3. Po inkubacji próbki należy natychmiast umieścić na lodzie.
    4. Odłożyć 10 μl środka do kontroli trawienia (DC) dla każdej próbki i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Usuń skropliny z pokrywki za pomocą pipety lub wirowania. Do każdej próbki dodać 58 μl mieszanki wypełniającej biotyną (całkowita objętość próbki 535 μl) i delikatnie pipetować, nie tworząc pęcherzyków.
    6. Próbki inkubować w temperaturze 23 °C przez 4 godziny w termomikserze (np. 900 obr./min, 30 s włączenia, 4 min przerwy).
  3. Podwiązanie proksymalnych fragmentów DNA
    1. Przygotować mieszankę do ligacji, jak pokazano w tabeli 3, podczas gdy wypełnienie biotyną jest w trakcie inkubacji.
    2. Dodać 665 μl mieszaniny do ligacji do każdej próbki (całkowita objętość próbki 1 200 μl). Delikatnie wymieszać, pipetując.
    3. Próbki inkubować w temperaturze 16 °C przez 4 godziny w termomikserze z okresowym wytrząsaniem (np. 900 obr./min, 30 s włączenia, 4 min wyłączenia). Próbki zawierające kowalencyjnie połączoną chromatynę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.
  4. Odwrócenie sieciowania
    1. Doprowadzić objętość próbek CI i DC do 50 μl za pomocą 1x Tris Low EDTA (TLE; patrz przepis w tabeli uzupełniającej S1).
    2. Dodać 10 μl 10 mg/ml proteinazy K do próbek CI i DC.
    3. Inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z przerywanymi wstrząsami (np. 900 obr./min, 30 s włączenia, 4 min przerwy). Alternatywnie, należy wykonać 30-minutowe odwrócenie sieciowania dla tych kontroli podczas oczyszczania DNA próbek Hi-C.
    4. Do każdej próbki Hi-C dodać 50 μl 10 mg/ml proteinazy K i inkubować w temperaturze 65 °C przez co najmniej 2 godziny z przerywanym wytrząsaniem (np. 900 obr./min, 30 s włączenia, 4 min przerwy).
    5. Dodać kolejne 50 μl 10 mg/ml proteinazy K do każdej probówki Hi-C (całkowita objętość próbki 1 300 μl) i kontynuować inkubację w temperaturze 65 °C przez noc. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu oczyszczenia DNA.
      UWAGA: Rozdzielenie inkubacji proteinazy K zapewnia całkowite trawienie białka.
  5. Oczyszczanie DNA
    1. Pozostawić probówki do ostygnięcia z temperatury 65 °C do temperatury pokojowej.
    2. Przenieś każdą próbkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 2,6 ml (2x objętość) fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego do każdej probówki.
      UWAGA: Fenol: chloroform: alkohol izoamylowy jest bardzo toksycznym środkiem drażniącym i jest potencjalnie rakotwórczy.
    3. Wiruj każdą probówkę przez 1 minutę, a następnie przenieś jej zawartość do probówki z blokadą fazową o pojemności 15 ml.
    4. Odwirowywać próbki przez 5 minut z maksymalną prędkością (1 500–3 500 × g) w wirówce stołowej.
    5. Ostrożnie wlać fazę wodną do probówki ultrawirówki o pojemności 35 ml i dodać ultraczystą wodę do końcowej objętości 1 250 μl.
      UWAGA: Użyj probówek pasujących do dostępnej ultrawirówki lub podziel je na wiele probówek do mikrowirówek.
    6. Dodać 1/10 objętości (~125 μl) 3 M octanu sodu i dobrze wymieszać przez odwrócenie.
    7. Dodaj 2,5 razy większą objętość (~ 3,4 ml) lodowatego 100% etanolu do każdej próbki, zrównoważ probówki do ultrawirowania, dodając lodowato zimny 100% etanol i dobrze wymieszaj przez inwersję.
    8. Inkubować probówki na suchym lodzie przez ~15 min (unikać zestalenia).
    9. Odwirować probówki o sile 18 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W przypadku wirników kątowych: zaznacz rurki, w których będzie znajdować się pellet.
    10. Za pomocą pipety usunąć i całkowicie wyrzucić supernatant od strony niebędącej granulką.
      UWAGA: W tym momencie granulat powinien stać się widoczny i może być oznaczony na tubie, ponieważ może nie być wyraźnie widoczny po wyschnięciu w kolejnym kroku.
    11. Próbki należy suszyć na powietrzu przez około 10 minut lub do momentu, gdy będą widocznie suche.
    12. Rozpuścić każdą granulkę w 450 μl 1x TLE przez pipetowanie lub wirowanie i przenieść do 0,5 ml filtra odśrodkowego (CFU) z odcięciem masy cząsteczkowej 3 kDa.
    13. Odwirować CFU z maksymalną prędkością przez 10 minut i odrzucić przepływ. Umyj każdą probówkę ultrawirówki dodatkowymi 450 μl 1x TLE i przenieś do jej CFU w celu ponownego przemycia.
      UWAGA: Mycie CFU w ten sposób ogranicza utratę DNA przy jednoczesnym zmniejszeniu stężenia soli.
    14. Odwirować CFU z maksymalną prędkością przez 10 minut i odrzucić przepływ.
    15. Dodać 80 μL 1x TLE do kolumny i obrócić kolumnę do nowej probówki zbiorczej przed odwirowaniem przez 2 minuty z maksymalną prędkością, aby uzyskać końcową objętość ~100 μL.
    16. Dodać 1 μl Rnazy A (1 mg/ml; 10-krotne rozcieńczenie 10 mg/ml podstawy) do każdej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C na bloku grzewczym, w łaźni wodnej lub termomikserze przez co najmniej 30 minut.
    17. Po poddaniu działaniu Rnazy pobrać próbki z temperatury 37 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zakończenia kontroli jakości.
  6. Sprawdzanie jakości chromatyny, trawienia enzymatycznego i ligacji próbki
    1. Schłodzić próbki CI i DC do temperatury pokojowej po odwróceniu usieciowania w kroku 2.4.5. Następnie przenieś do wstępnie wywirowanej probówki z blokadą fazową o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Upewnij się, że zawartość blokady fazowej jest odwirowana do postaci osadu (maksymalna prędkość przez 2 min).
    2. Dodać 200 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego: izoamylowego i mieszać próbki przez wirowanie przez 1 min.
    3. Wirować probówki przez 5 minut z maksymalną prędkością.
    4. Przenieś fazę wodną z każdej próbki (~50 μl) do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,7 ml.
    5. Dodać 1 μl Rnazy A (od 1 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
    6. Załadować próbki do 0,8% żelu agarozowego, zgodnie z zaleceniami w tabeli 4.
      UWAGA: Wyniki oczekiwane po kontroli jakości są pokazane w Rysunek 2.
    7. Określić ilościowo DNA za pomocą densytometrii z żelu lub za pomocą Qubit lub Nanodrop.
      UWAGA: Dokładna kwantyfikacja zapewnia prawidłową objętość wejściową w następnej części protokołu. Użyj kilku standardów ze znaną wielkością, aby skonstruować krzywą standardową.

Tabela 1: Odczynniki do mineralizacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Odczynniki do uzupełniania biotyny. *Należy pamiętać, że zmiana enzymów może wymagać różnych i biotynylowanych dNTP. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Odczynniki do podwiązywania. Skrót: BSA = albumina surowicy bydlęcej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Parametry ładowania żelu do oceny jakości i doboru rozmiaru. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Żel agarozowy pokazujący typowe wyniki kontroli jakości po oczyszczeniu DNA. (A) Kontrola CI powinna wskazywać na pasmo DNA o wysokiej masie cząsteczkowej. (B) Próbki DC i Hi-C wykazują różne rozmiary DNA. Próbka Hi-C, po połączeniu w większe fragmenty, powinna mieć większą masę cząsteczkową niż DC. Zakres stężeń markerów pozwala na wygenerowanie krzywej wzorcowej. Należy zauważyć, że w tym przykładzie CI został załadowany na osobny żel, ale zaleca się załadowanie i uruchomienie wszystkich próbek i kontroli razem. Skróty: CI = integralność chromatyny; DC = kontrola trawienia; Hi-C = podwiązany zbliżeniowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania Hi-C

  1. Usuwanie biotyny z niepodwiązanych końcówek
    1. Przygotować reakcje usuwania biotyny, jak pokazano w tabeli 5.
      UWAGA: Zazwyczaj wystarczy 10 μg DNA, ale można użyć do 30 μg.
    2. Rozprowadzić 2 porcje po 65 μl z każdej reakcji 130 μl do dwóch probówek PCR.
    3. Przenieść do termocyklera lub maszyny do PCR i inkubować zgodnie z opisem w tabeli 5.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C (dni do tygodni), -20 °C (długotrwale) lub natychmiast przeniesione do sonikacji.
  2. Sonikacja
    1. Połączyć duplikaty próbek z etapu usuwania biotyny (całkowita objętość próbki 130 μl) w probówce sonikatora o pojemności 130 μl w celu sonikacji.
    2. Sonikować próbki, stosując parametry podane w tabeli 6, aby uzyskać ścisły wąski rozkład poniżej 500 pz.
      UWAGA: Można stosować różne typy sonikatorów, ale dla wąskiego rozkładu fragmentów (100-500 bp), ustawienia sonikatora mogą wymagać optymalizacji.
  3. Wybór rozmiaru za pomocą koralików magnetycznych
    1. Odpipetować sonikowane DNA z probówki (probówek) sonikatora do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,7 ml.
    2. Doprowadzić każdą próbkę do całkowitej objętości 500 μL za pomocą 1x TLE. Postaraj się, aby objętość była jak najbardziej zbliżona do 500 μl, ponieważ stosunek próbki do mieszaniny kulek magnetycznych ma zasadnicze znaczenie przy doborze wielkości.
    3. Dodać 400 μl mieszaniny kulek magnetycznych do każdej probówki, aby uzyskać stosunek mieszaniny kulek magnetycznych do objętości próbki 0,8,
      UWAGA: W tych warunkach kulki wychwytują fragmenty DNA >300 pz, które będą frakcją górną. Supernatant będzie zawierał fragmenty <300 pz, które będą frakcją dolną.
    4. Wymieszaj probówki przez wirowanie i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. W przypadku tego i innych proporcji wyboru wielkości upewnij się, że cała objętość próbki dobrze się miesza. Poszukaj "trybu niekonsekwentnego", który ma niektóre wirniki, który działa dobrze w przypadku mniejszych objętości.
    5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na magnetycznym separatorze cząstek (MPS).
    6. Podczas inkubacji dodać 500 μl mieszaniny kulek magnetycznych do świeżej probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,7 μl dla każdej próbki.
      UWAGA: Probówki te zostaną użyte do następnego wyboru rozmiaru dolnej frakcji poprzez wygenerowanie stosunku mieszaniny kulek magnetycznych do próbki wynoszącego 1,1:1.
    7. Pozostaw rurki na MPS na 5 minut.
    8. Usunąć supernatant z kulek i ponownie zawiesić ze 150 μl mieszaniny kulek magnetycznych.
      UWAGA: Ten krok pozwala uniknąć nasycenia koralików DNA poprzez zwiększenie liczby kulek bez zwiększania objętości.
    9. Przenieść supernatant z kroku 3.3.5 do oznakowanej probówki przygotowanej w celu wyboru frakcji dolnej (krok 3.3.8).
      UWAGA: 150 μL mieszaniny kulek magnetycznych + 400 μL 0,8x mieszaniny kulek magnetycznych (łącznie 550 μL) podzielone przez 500 μL próbki początkowej = 1,1x stosunek mieszaniny kulek magnetycznych do próbki.
    10. Wymieszaj probówki z dolną frakcją przez wirowanie i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.
      UWAGA: Koraliki zwiążą fragmenty DNA >100 pz, co da końcową frakcję związaną z kulkami 100-300 pz.
    11. Umieść probówki z dolną frakcją na MPS na 5 minut (temperatura pokojowa).
    12. Usunąć supernatant i krótko odwirować probówki, aby w jak największym stopniu usunąć supernatant.
    13. Umyj kulki z obu frakcji dwukrotnie za pomocą 200 μl 70% etanolu i za każdym razem odzyskuj kulki przez 5 minut na MPS.
    14. Po szybkim odwirowaniu w wirówce całkowicie usuń etanol i dalej wysusz kulki na MPS.
      UWAGA: Suszyć, aż alkohol całkowicie odparuje. Granulka powinna wyglądać jak gorzka czekolada bez pękania (może zająć ~10 min).
    15. Zawiesić obie frakcje w 50 μl 1x buforu TLE. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i stukać lub przesuwać probówki co drugą minutę, aby stymulować mieszanie i elucję.
    16. Oddzielić kulki od supernatantu na MPS na 5 minut dla obu frakcji.
    17. Zachować supernatant z każdej próbki. Odpipetować supernatant do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,7 ml.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub w temperaturze -20 °C przez długi czas.
    18. Uruchomić 2% żel agarozowy, jak w tabeli 4, aby określić jakość i ilość próbki. Zobacz Rysunek 3 dla przykładu takiego żelu.
      UWAGA: Jeśli z doświadczenia wynika, że sonikacja jest wysoce powtarzalna, można pominąć ten żel i natychmiast przystąpić do zakończenia naprawy. Zaleca się, aby użytkownicy trzymali się górnych frakcji do czasu po miareczkowaniu PCR. Suboptymalne ilości DNA, które wymagałyby dużej amplifikacji PCR, można uratować z materiału w górnej frakcji.
    19. Określ ilościowo ilość DNA z żelu bezpośrednio po wygenerowaniu krzywej wzorcowej ze znanego wejścia drabiny DNA lub za pomocą kubitu lub nanokropli.
  4. Zakończ naprawę
    1. Przygotować końcową mieszankę naprawczą jak w tabeli 7 (podana ilość na reakcję).
    2. Przenieść pozostałe 46 μl eluowanego DNA z dolnej frakcji do probówek PCR i dodać 24 μl przygotowanej mieszanki do naprawy końcówek. Inkubować w maszynie do PCR, zgodnie z propozycją w Tabeli 7.
    3. Po zakończeniu programu należy utrzymywać próbki w temperaturze 4 °C do momentu ich opróżnienia.
  5. Ściąganie biotynylowanych produktów do ligacji z kulkami pokrytymi streptawidyną
    1. Określ ilość kulek pokrytych streptawidyną dla każdej biblioteki z ilościowo określonego rozmiaru (krok 3.3.19).
      UWAGA: Te kulki pokryte streptawidyną (roztwór 10 mg/ml) mogą związać 20 μg dwuniciowego DNA na kulki mg (= 20 μg / 100 μl kulek). Użyć 2 μl na każdy 1 μg DNA Hi-C, ale nie mniej niż 10 μl.
    2. Wymieszaj kulki pokryte streptawidyną i odpipetuj objętość kulek potrzebną dla każdej biblioteki (obliczoną w poprzednim kroku) do pojedynczych probówek o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,7 ml.
    3. Zawiesić kulki w 400 μl buforu do płukania Tween (TWB; patrz przepis w tabeli uzupełniającej S1) i inkubować przez ~3 minuty w temperaturze pokojowej na rotatorze (patrz instrukcje w kroku 3.3.4).
    4. Oddziel kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę i usuń supernatant.
    5. Umyj kulki, pipetując kolejne 400 μl TWB.
    6. Oddziel kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę i usuń supernatant.
    7. Dodaj 400 μl 2x buforu wiążącego (BB) (przepis w tabeli uzupełniającej S1) do kulek i ponownie zawiesić. Dodatkowo dodaj 330 μL 1x TLE i roztwór z End-repair (z kroku 3.4.3).
    8. Próbki należy inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, mieszając na rotatorze.
    9. Oddziel kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę i usuń supernatant.
    10. Dodaj 400 μL 1x BB do kulek i ponownie zawiesić.
    11. Oddziel kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę i usuń supernatant.
    12. Dodaj 100 μL 1x TLE, aby umyć koraliki.
    13. Oddziel kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę i usuń supernatant.
    14. Na koniec dodaj 41 μl 1x TLE, aby ponownie zawiesić kulki.
  6. Ogon A
    1. Przygotować mieszankę ogonów A jak w tabeli 8.
    2. Odpipetować reakcje do probówek PCR i inkubować jak w Tabeli 8.
    3. Umieść probówki PCR na lodzie natychmiast po wyjęciu z termocyklera i przenieś zawartość do probówek o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,7 ml.
    4. Oddzielić kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę i wyrzucić supernatant.
    5. Dodać 400 μl 1x buforu ligacyjnego, rozcieńczonego z 5x buforu ligazy DNA T4 ultraczystą wodą.
    6. Oddziel kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę, a następnie wyrzuć supernatant.
    7. Dodać 1x bufor do podwiązania do końcowej objętości 40 μl.
  7. Olikleotydaże adaptera do wyżarzania
    1. Przygotować oligonukleotyda adaptera o pojemności 100 μM (Tabela 9).
      UWAGA: Zamów 250 nmoli oligonukleotydów oczyszczonych metodą HPLC.
    2. Wyżarzać adaptery w probówkach PCR zgodnie z opisem w tabeli 9.
    3. Za pomocą termocyklera PCR stopniowo zwiększaj temperaturę z 0.5 °C/s do 97.5 °C. Przytrzymaj w temperaturze 97.5 °C przez 2.5 min.
    4. Użyj termocyklera PCR, aby stopniowo zwiększać temperaturę do 0,1 °C/s przez 775 cykli (osiągając 20 °C). Utrzymać temperaturę 4 °C do czasu dalszego użycia.
    5. Dodać 83 μl 1x buforu do wyżarzania (przepis w tabeli uzupełniającej S1), aby rozcieńczyć adaptery do 15 μM. Przechowywać adaptery w temperaturze -20 °C.
  8. Podwiązanie adaptera sekwencyjnego
    1. Przygotować mieszankę do podwiązywania w probówce o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,7 ml (Tabela 10).
    2. Wapnować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    3. Oddzielić kulki od supernatantu na MPS na 1 minutę i wyrzucić supernatant.
    4. Dodać 400 μl TWB i ostrożnie pipetować kulki w górę i w dół przed inkubacją na rotatorze przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Oddzielić kulki od supernatantu na MPS i powtórzyć ten krok jeszcze raz.
    5. Oddziel kulki od supernatantu na MPS (~1 min), wyrzuć supernatant i dodaj 200 μL 1x BB.
    6. Oddzielić kulki od supernatantu na MPS (~1 min) i wyrzucić supernatant.
    7. Dodać 200 μl 1x buforu pre-PCR (z 10x; przepis w tabeli uzupełniającej S1) i przenieść do nowej probówki o niskiej zawartości wiązania 1,7 ml.
    8. Oddzielić kulki od supernatantu na MPS (~1 min) i wyrzucić supernatant.
    9. Dodać 20 μl 1x buforu pre-PCR i wymieszać przez pipetowanie.
      10. Podczas
    10. użytkowania probówki należy przechowywać na lodzie lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Optymalizacja liczby cyklu PCR przez miareczkowanie
    1. Ustawić 30 μl reakcji mieszaniny wzorcowej na próbkę, jak w tabeli 11 (podana ilość na reakcję).
    2. Uruchomić najmniejszą liczbę cykli i pobrać podwielokrotność 5 μl. Uruchomić dodatkowe 2-3 cykle na pozostałej reakcji przed pobraniem następnych 5 μl podwielokrotności. Powtórz tę czynność, aby zebrać cztery porcje.
    3. Dla każdej podwielokrotności należy zastosować parametry PCR z tabeli 11.
    4. Dodać 5 μl wody i 2 μl 6x barwnika do każdych 5 μl próbki. Uruchom na 2% żelu do gazorozy TBE (przepis w tabeli uzupełniającej S1) z 25-150 ng drabinki o niskiej masie cząsteczkowej. Zobacz Rysunek 4, aby uzyskać oczekiwane wyniki.
      UWAGA: Optymalna liczba cykli dla końcowej amplifikacji PCR w bibliotece [krok 3.10] to najmniejsza liczba cykli, aby uzyskać widoczny produkt na żelu minus jeden cykl.
  10. Końcowa amplifikacja PCR w bibliotece
    1. Ustawić reakcje 12 x 30 μl, aby amplifikować każdą końcową bibliotekę do sekwencjonowania, jak w tabeli 11.
    2. Cyklicznie przeprowadzać reakcje PCR zgodnie z tabelą 11 po określeniu liczby cykli po miareczkowaniu PCR (krok 3.9.3).
    3. Po zakończeniu PCR połącz próbki z powtórzonymi próbkami w probówce o pojemności 1,7 ml o niskiej zawartości wiązania mikrofuge.
    4. Umieścić probówki na MPS i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,7 ml o niskiej wiązalności.
    5. Zawiesić resztki kulek pokrytych streptawidyną w 20 μl 1x buforu pre-PCR.
      UWAGA: Ten szablon może być ponownie użyty, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub tygodni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.
  11. Usuwanie podkładów za pomocą mieszanki kulek magnetycznych
    1. Użyj 1x bufor TLE (przepis w tabeli uzupełniającej S1), aby dostosować objętość od kroku 3.10.4 do dokładnie 360 μl.
    2. Do każdej próbki dodać 360 μl mieszaniny kulek magnetycznych i pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
    3. Na rotatorze mieszać próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Oddziel kulki od supernatantu na MPS w temperaturze pokojowej (3-5 min).
    5. Umyj koraliki dwukrotnie przy użyciu 200 μl 70% etanolu i za każdym razem odzyskuj kulki na 5 minut na MPS.
    6. Szybko odwiruj w wirówce i całkowicie odpipetuj etanol. Wysuszyć kulki w powietrzu na MPS, aby dalej odparować etanol.
      UWAGA: Granulka powinna wyglądać jak gorzka czekolada bez pękania (może to zająć ~10 min).
    7. Dodać 30 μl ultraczystej wody i ponownie zawiesić w celu elucji DNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przesuwaj probówki co 2 minuty, aby ułatwić mieszanie.
    8. Oddzielić kulki od supernatantu na MPS na 5 minut.
    9. Zebrać supernatant z każdej próbki do świeżej probówki o pojemności 1,7 ml.
    10. Uruchom 1 μl biblioteki na 2% żelu agarozowym TBE (przepis w tabeli uzupełniającej S1), aby uzyskać rozkład wielkości fragmentów i określić ilościowo końcową bibliotekę (Rysunek 5).
      UWAGA: Roztwarzanie ClaI może wystąpić tylko dla połączeń DpnII-DpnII i służy jako dodatnia kontrola ligacji, która powinna skutkować niższym rozkładem wielkości fragmentów dla biblioteki końcowej. Końcowe biblioteki mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C, długotrwale w temperaturze -20 °C lub natychmiast rozcieńczone i przekazane do sekwencjonowania.

Tabela 5: Odczynniki do usuwania biotyny i temperatury Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Parametry sonikacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Koniec napraw odczynników i temperatur. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 8: Odczynniki i temperatury ogonów A. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 9: Startery do PCR i oligonukleotydy z adapterami z odczynnikami do wyżarzania. Skrót: 5PHOS = 5' fosforan. Gwiazdki wskazują na fosforonowane zasady DNA. #Połącz indeksowany oligo z uniwersalnym oligo do wyżarzania w indeksowanym adapterze. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 10: Odczynniki do podwiązania adaptera. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 11: Odczynniki PCR i parametry cykliczne. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Żel agarozowy pokazujący typowe wyniki selekcji po rozmiarze. Pokazano górną i dolną frakcję dla czterech próbek (ponumerowanych 1-4) DpnII-DdeI Hi-C. Pierwszy pas dla każdej próbki zawiera frakcję górną, pochodzącą z mieszaniny kulek magnetycznych 0,8x, a drugi i trzeci pas zawiera rozcieńczenie frakcji dolnej pochodzącej z mieszaniny kulek magnetycznych 1,1x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Żel agarozowy z wynikami miareczkowania PCR. Począwszy od 5 cykli PCR, próbki są pobierane po każdych 2 cyklach (5, 7, 9 i 11 cyklach) dla każdej z czterech bibliotek. Na podstawie tej liczby wybrano 6 cykli jako optymalny cykl dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Końcowe produkty PCR. Po oczyszczeniu i wybraniu rozmiaru, produkty PCR (Hi-C) zostały załadowane obok strawionej przez ClaI frakcji tej samej biblioteki (ClaI). Fragmenty strawione przez ClaI wskazują na obecność poszukiwanych ligacji DpnII-DpnII. Należy pamiętać, że ClaI nie trawi połączeń DpnII-DdeI i dlatego nie wszystkie ligacje przyczynią się do zmniejszenia rozmiaru z powodu tego ograniczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki w tym manuskrypcie zostały wygenerowane z oddzielnego, powtórzonego eksperymentu opublikowanego wcześniej przez Lafontaine et al.21. Po uzyskaniu danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, do przetworzenia danych Hi-C wykorzystano Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c). Podobny potok można znaleźć na portalu danych projektu 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Krótko mówiąc, destylator rurociągowy Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) został wdrożony w celu (1) wyrównania sekwencji cząsteczek Hi-C do genomu referencyjnego, (2) przeanalizowania wyrównania .sam i utworzenia plików z parami Hi-C, (3) filtrowania duplikatów PCR i (4) agregowania par w binowane matryce interakcji Hi-C. Te sformatowane matryce HDF5, zwane chłodnicami, mogą być następnie (1) przeglądane na serwerze HiGlass (https://higlass.io/) i (2) analizowane przy użyciu dużego zestawu narzędzi obliczeniowych typu open source obecnych w kolekcji "cooltools" utrzymywanej przez Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) w celu wyodrębnienia i ilościowego określenia cech składania, takich jak przedziały, TAD i pętle.

Niektóre wskaźniki jakości bibliotek Hi-C3.0 mogą być oceniane natychmiast po zmapowaniu par odczytu do genomu referencyjnego, za pomocą kilku prostych wskaźników/wskaźników. Po pierwsze, zazwyczaj ~50% sekwencjonowanych par odczytu można jednoznacznie zmapować dla komórek ludzkich. Ze względu na polimeryczny charakter chromosomów, większość z tych zmapowanych odczytów (~60%-90%) reprezentuje interakcje w obrębie chromosomu (cis), przy czym częstość interakcji szybko zanika wraz ze wzrostem odległości genomowej (rozpad zależny od odległości). Rozpad zależny od odległości można najlepiej zobrazować na "wykresie skalowania", który pokazuje prawdopodobieństwo kontaktu (na ramię chromosomu) w funkcji odległości genomowej. Odkryliśmy, że użycie różnych środków sieciujących i enzymów może zmienić zależny od odległości rozpad na długich i krótkich dystansach17. Dodanie sieciowania DSG zwiększa wykrywalność oddziaływań na krótkich dystansach w połączeniu z enzymami, takimi jak Mnase i kombinacjami DpnII-DdeI, które wytwarzają mniejsze fragmenty (Rysunek 6A).

Rozpad zależny od odległości można również zaobserwować bezpośrednio na podstawie matryc interakcji 2D: interakcje stają się rzadsze, gdy znajdują się dalej od centralnej przekątnej (Rysunek 6B). Ponadto cechy fałdowania genomu, takie jak przedziały, TAD i pętle, można zidentyfikować na podstawie matryc Hi-C i wykresów skalowania jako odchylenia od ogólnego rozpadu zależnego od średniej odległości w całym genomie. Co ważne, sieciowanie za pomocą DSG oprócz FA zmniejsza losowe ligacje, które są nieograniczone ze względu na polimerowy charakter chromosomów, a zatem bardziej prawdopodobne jest, że wystąpią między chromosomami (w trans) (Figura 6C). Zmniejszenie losowej ligacji prowadzi do zwiększenia stosunku sygnału do szumu, szczególnie w przypadku interakcji międzychromosomowych i wewnątrzchromosomalnych bardzo dalekiego zasięgu (>10-50 Mb).

figure-results-1
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki zmapowanych i przefiltrowanych bibliotek Hi-C. (A) Wykresy skalowania z prawdopodobieństwem kontaktu i jego pochodną dla różnych enzymów, uporządkowane według długości fragmentu (na górze) i sieciowanie za pomocą FA lub FA + DSG (na dole). Mineralizacja za pomocą MNAzy (mikroC) lub DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) znacznie zwiększa kontakty krótkiego zasięgu (na górze), podobnie jak dodawanie DSG do FA (na dole). (B) Kolumny pokazują mapy cieplne Hi-C trawienia DpnII po samym sieciowaniu FA i trawienia DpnII lub DdeI po sieciowaniu FA + DSG. Białe strzałki pokazują rosnącą siłę "kropek" po usieciowaniu DSG i trawieniu DdeI, co sugeruje lepsze wykrywanie pętli DNA. Wiersze pokazują różne części chromosomu 3 w rosnącej rozdzielczości, wyrównując się z panelem C: górny rząd: cały chromosom 3 (0-198,295,559 Mb); środkowy rząd: 186-196 Mb; dolny rząd: 191,0-191,5 Mb. (C) Wykresy zasięgu dla regionów przedstawionych w A. Czarne strzałki pokazują dolne pokrycie (%cis odczytuje) dla sieciowania tylko FA. Skróty: FA = formaldehyd; DSG = glutaran disuccinimidylu; CHR = chromosom. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nie wszystkie zmapowane odczyty są użyteczne. Drugim wskaźnikiem jakości jest liczba duplikatów PCR. Jest bardzo mało prawdopodobne, aby dokładne zduplikowane odczyty wystąpiły przypadkowo po podwiązaniu i sonikacji. W związku z tym takie odczyty prawdopodobnie wynikały z amplifikacji PCR i muszą zostać odfiltrowane. Duplikaty często powstają, gdy do amplifikacji bibliotek o niskiej złożoności wymaganych jest zbyt wiele cykli PCR. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku Hi-C większość bibliotek potrzebuje tylko 5-8 cykli końcowej amplifikacji PCR, zgodnie z miareczkowaniem PCR (patrz krok 3.9; Rysunek 4). Jednak biblioteki o wystarczającej złożoności można uzyskać nawet po 14 cyklach amplifikacji PCR.

Inna kategoria zduplikowanych odczytów, tak zwane duplikaty optyczne, może powstać w wyniku procesu amplifikacji na platformach sekwencjonowania Illumina, które używają komórek przepływowych o wzorze (takich jak HiSeq4000). Duplikaty optyczne są znajdowane albo w wyniku przeciążenia komórki przepływowej, co powoduje, że (duże) klastry są nazywane dwoma oddzielnymi klastrami, albo w wyniku lokalnego ponownego grupowania oryginalnej cząsteczki o sparowanym końcu po pierwszej rundzie PCR. Ponieważ oba typy duplikatów optycznych są lokalne, można je zidentyfikować i odróżnić od duplikatów PCR na podstawie ich lokalizacji na komórce przepływowej. Podczas gdy biblioteki z duplikatami PCR >15% wymagałyby regeneracji, biblioteki z duplikatami optycznymi mogą być ponownie ładowane po zoptymalizowaniu procesu ładowania.

Tabela uzupełniająca S1: i roztwory. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne etapy obsługi komórek
Chociaż możliwe jest użycie mniejszej liczby komórek wejściowych, protokół ten został zoptymalizowany dla ~5 × 106 komórek na linię sekwencjonowania (~400 mln odczytów), aby zapewnić odpowiednią złożoność po głębokim sekwencjonowaniu. Komórki najlepiej liczyć przed utrwaleniem. W przypadku generowania bibliotek ultragłębokich zazwyczaj mnożymy liczbę linii (i komórek), aż do osiągnięcia żądanej głębokości odczytu. W celu optymalnego utrwalenia, pożywkę zawierającą surowicę należy zastąpić PBS przed utrwaleniem FA, a roztwory utrwalające należy dodać natychmiast i bez gradientów stężeń15,22. W przypadku zbierania komórek skrobanie jest preferowane zamiast trypsynizacji, ponieważ przejście od bardziej płaskiego do kulistego kształtu po trypsynizacji może wpływać na konformację jądrową. Po dodaniu DSG luźne i grudkowate granulki komórkowe łatwo się gubią. Na tym etapie należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z komórkami i dodać do 0,05% BSA, aby zmniejszyć zbrylanie.

Modyfikacje metody
Protokół ten został opracowany przy użyciu komórek ludzkich17. Jednak w oparciu o doświadczenie w wychwytywaniu konformacji chromosomów, protokół ten powinien działać w przypadku większości komórek eukariotycznych. W przypadku znacznie niższego wkładu (~1 × 106 komórek) zalecamy użycie połowy objętości do procedur wychwytywania lizy i konformacji [kroki 2.1-2.4]. Pozwoliłoby to również na przeprowadzenie izolacji DNA [krok 2.5] w wirówce stołowej z probówkami o pojemności 1,7 ml, co mogłoby poprawić granulowanie przy niskich stężeniach DNA. Kwantyfikacja DNA (krok 2.6.6) wskaże, jak należy postępować. W przypadku małych ilości wyizolowanego DNA (1-5 μg) sugerujemy pominięcie wyboru rozmiaru (krok 3.3) i przystąpienie do usuwania biotyny po zmniejszeniu objętości ze 130 μL do ~45 μL za pomocą CFU.

Protokół ten został opracowany specjalnie w celu zapewnienia wysokiej jakości danych po późniejszym sieciowaniu z FA i DSG oraz trawieniu z DpnII i DdeI. Jednak alternatywne strategie sieciowania, takie jak FA, a następnie EGS (bursztynian glikolu etylenowego)), który jest również stosowany w ChIP-seq23 i ChIA-PET24, mogą działać równie dobrze17. Podobnie do trawienia można stosować różne kombinacje enzymów, takie jak DpnII i HinfI18 lub MboI, MseI i NlaIII19 . Dostosowując kombinacje enzymów, należy pamiętać o stosowaniu biotynylowanych nukleotydów, które mogą wypełnić określone 5' zwisy i używać najbardziej optymalnych dla każdego koktajlu. DpnII jest dostarczany z własnym buforem, a producent enzymu zaleca określony bufor do trawienia DdeI. Jednak w przypadku podwójnego trawienia z DpnII i DdeI w tym protokole zalecany jest bufor restrykcyjny, ponieważ jest on oceniany na 100% aktywność dla obu enzymów.

Rozwiązywanie problemów z przechwytywaniem konformacji
Trzy kluczowe etapy wychwytywania konformacji chromosomów: sieciowanie, trawienie i religacja zostały wykonane, zanim wyniki będzie można zwizualizować na żelu. Aby określić jakość każdego z tych trzech etapów i określić, gdzie mogły wystąpić problemy, pobiera się podwielokrotności przed (CI) i po trawieniu (DC) i umieszcza je w żelu wraz z ligowaną próbką Hi-C (ryc. 2). Żel ten służy do określenia jakości próbki Hi-C i tego, czy warto będzie kontynuować protokół. Bez CI i DC trudno jest wskazać potencjalne nieoptymalne kroki. Warto zauważyć, że nieoptymalne podwiązanie może być spowodowane problemem w samym podwiązaniu, wypełnieniu lub problemem z sieciowaniem. Aby rozwiązać problemy z sieciowaniem, pamiętaj, aby nie używać więcej niż 1 × 107 komórek na bibliotekę i zacznij od świeżych odczynników do sieciowania i czystych komórek (tj. przepłukanych PBS). W przypadku podwiązania upewnij się, że komórki i mieszanina ligacji są trzymane na lodzie. Dodać ligazę DNA T4 tuż przed 4 godzinną inkubacją w temperaturze 16 °C i dobrze wymieszać.

Rozwiązywanie problemów z przygotowywaniem biblioteki
Jeśli potrzebnych jest więcej niż 10 cykli PCR lub po miareczkowaniu PCR na żelu nie widać produktu PCR (ryc. 4), istnieje kilka opcji zapisania próbki Hi-C. Wracając do miareczkowania PCR, pierwszą opcją jest ponowna próba PCR. Jeśli nadal nie ma wystarczającej ilości produktu, można spróbować kolejnej rundy ogona A i podwiązania adaptera (krok 3.6) po dwukrotnym umyciu kulek buforem 1x TLE. Po tym dodatkowym ogonie A i podwiązaniu adapterem można przejść do miareczkowania PCR jak poprzednio. Jeśli nadal nie ma produktu, ostatnią opcją jest ponowne rozpoznanie ułamka 0,8x z kroku 3.3 i kontynuowanie od tego miejsca.

Ograniczenia i zalety Hi-C3.0
Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że Hi-C jest metodą opartą na populacji, która rejestruje średnią częstotliwość interakcji między parami loci w populacji komórek. Niektóre analizy obliczeniowe mają na celu rozwikłanie kombinacji konformacji z populacji25, ale w zasadzie Hi-C jest ślepy na różnice między komórkami. Chociaż możliwe jest wykonanie pojedynczej komórki Hi-C26,27 i można dokonać wnioskowania obliczeniowego28, jednokomórkowa Hi-C nie nadaje się do uzyskiwania informacji 3C o ultrawysokiej rozdzielczości. Dodatkowym ograniczeniem Hi-C jest to, że wykrywa on tylko oddziaływania parami. Do wykrywania oddziaływań wielokontaktowych można użyć częstych obcinaczy w połączeniu z sekwencjonowaniem krótkiego odczytu (Illumina)16 lub wykonać wielokontaktowe 3C29 lub 4C30, używając sekwencjonowania długiego odczytu z platform PacBio lub Oxford Nanopore. Opracowano również pochodne Hi-C do specyficznego wykrywania kontaktów między chromatydami siostrzanymi i wzdłuż nich31,32.

Chociaż Hi-C19 i Micro-C33 mogą być używane do generowania map kontaktowych w rozdzielczościach subkilobazowych, oba wymagają dużej ilości odczytów sekwencjonowania, co może stać się kosztownym przedsięwzięciem. Aby uzyskać podobną, a nawet wyższą rozdzielczość bez ponoszenia kosztów, można zastosować wzbogacanie o określone regiony genomu (capture-C34) lub specyficzne interakcje białkowe (ChiA-PET35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37). Zaletą i wadą tych aplikacji wzbogacających jest to, że próbkowana jest tylko ograniczona liczba interakcji. Przy takich wzbogaceniach zatraca się globalny aspekt Hi-C (i możliwość globalnej normalizacji).

Znaczenie i potencjalne zastosowania Hi-C3.0
Protokół ten został zaprojektowany, aby umożliwić uzyskanie wysokiej rozdzielczości, ultragłębokiego 3C, przy jednoczesnym wykrywaniu elementów składania na dużą skalę, takich jak TAD i komory17 (ilustracja 6). Protokół ten zaczyna się od 5 × 106 komórek na probówkę dla każdej biblioteki Hi-C, co powinno wystarczyć do sekwencjonowania jednej lub dwóch linii w komórce przepływowej, aby uzyskać do 1 miliarda odczytów sparowanych końców. Do ultragłębokiego sekwencjonowania należy przygotować wiele probówek po 5 × 106 komórek, w zależności od liczby zmapowanych odczytów i duplikatów PCR. Przy najwyższej rozdzielczości (<1 kb) interakcje pętlowe występują głównie między miejscami CTCF, ale można również wykryć interakcje promotor-wzmacniacz. Czytelnicy mogą zapoznać się z Akgol Oksuz et al.17 w celu uzyskania szczegółowego opisu analizy danych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Denisowi Lafontaine'owi za opracowanie protokołu i Sergeyowi Venevowi za pomoc bioinformatyczną. Praca ta została wsparta grantem z National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program dla J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa.

Ten artykuł podlega polityce HHMI dotyczącej otwartego dostępu do publikacji. Szefowie laboratoriów HHMI wcześniej udzielali niewyłącznej licencji CC BY 4.0 dla publiczności i licencji podlegającej sublicencjonowaniu dla HHMI w swoich artykułach badawczych. Zgodnie z tymi licencjami, zaakceptowany przez autora manuskrypt tego artykułu może być bezpłatnie udostępniony na licencji CC BY 4.0 natychmiast po publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb DrabinaNew England BiolabsN3232L
AgaroseInvitrogen16500100
Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XP, 60 mlBeckman CoulterA63881
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 (CFU)EMD MiliporeUFC500396
bufor do wyżarzania (5x)Zobacz przepis w materiałach
ATP 10 mMThermoFisherR0441
Avanti J-25i Ultrawirówka z chłodzeniem o dużej prędkości BeckmanCoulter
Probówka ultrawirówkowa Beckman Coulter 35 mlBeckman Coulter357002
Bufor wiążący (2x)Zobacz przepis w materiałach
biotyna-14-dATP 0,4 mMInvitrogen19524-016
BSA 10 mg/mlNew England BiolabsB9000Srozcieńczony od 20 mg/ml
Skrobak do komórekFalcon353089
Skrobak do komórekCorning3008
Stożkowe probówki polipropylenowe 50 mlDenvilleC1062-P
Rurka stożkowa 15 mlDenvilleC1017-P
Mikrorurka Covaris AFA z włóknem AFA Zatrzask 130 &MICRO; LCovaris520045/520077
Covaris SonicatorCovarisE220/E220evolution/M220
Kolba hodowlana 175 cm2Falcon353112
Płytki hodowlane 150 mm x 25 mmCorning430599
dATP 1mM Invitrogen56172
dCTP 10 mMInvitrogen56173
DdeINew England BiolabsR0175L
dGTP 10 mMInvitrogen56174
DMSOSigmaD2650-5x10ML
dNTP mix 25 mMHomogenizator Invitrogen10297117
DounceDWK Life Sciences8853010002/8853030002
DPBSGibco14190-144
DPNIINew England BiolabsR0543M
DSGThermoScientific20593
dTTP 10 mMInvitrogen56175
Etanol 70%FisherA409-4Rozcieńczony ze 100%
bromku etydynyFisherBP1302-10
Formaldehyd (37%)FisherBP531-500
Barwnik ładujący w żelu (6x)New England BiolabsB7024S
Glicyna w ultraczystej wodzie 2,5 MSigmaG8898-1KG
HBSSGibco14025-092
Detergent Igepal CA-630MP Biomedicals198596
Klenow Polimeraza DNA 5 U/&mikro; LNew England BiolabsM0210L
Fragment Klenowa 3-->5' egzo-, 5 U/&mikro; LNew England BiolabsM0212L
(10x)New England BiolabsB7203S
Probówka wirówkowa LoBind
Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowejEngland BiolabsN3233L
materiały
Magnetyczny separator cząstekThermoFisher12321D
Probówki do mikrofuge 1,7 mlAxygenMCT-175-C
MyOne Streptawidyna C1 kulkiInvitrogen65001
NEBuffer 2.1 (10x)New England BiolabsB7002S
NEBuffer 3.1 (10x)New England BiolabsB7203S
PBSGibco70013-032
Probówki do PCR (paskowe) BioradTBS0201/ TCS0803
Termocykler do PCRBioradT100
Pfu Ultra II Bufor (10x)AgilentW zestawie z
polimerazą DNA Pfu Ultra PfuUltra II Fusion HS Agilent600674
Rurka z blokadą fazową 15 mlQiagen129065
Rurki z blokadą fazową 2 mlQiagen129056
Fenol: chloroform: alkohol izoamylowyInvitrogen15593-049
Koktajl inhibitorów proteazyThermoFisher78440
Proteinaza K w wodzie ultraczystej 10 mg/mlInvitrogen25530-031
Wirówka z chłodzeniemEppendorf5810R
RNaza A, bez DNaz i proteaz 10 mg/mlThermo ScientificEN0531
RotatorArgos technologiesEW-04397-40 lub platforma
SDS 1%FisherBP13111
Octan sodu pH = 5,2, 3 MSigma
Sub-Cell GT System Elektroforezy PoziomejBiorad1704401
Ligaza DNA T4 1 U/&mikro; LInvitrogen100004817
Polimeraza DNAT4 New England BiolabsM0203L
Polimeraza DNA T4New England BiolabsM0203L
Polimeraza DNA T4 3 U/&mikro; LBufor ligacyjny New England BiolabsM0203L
T4 (5x)InvitrogenY90001
Kinaza polinukleotydowa T4 10 U/&mikro; LNew England BiolabsM0201L
Wirówka stołowaEppendorf5425
Bufor TBEZobacz przepis w materiałach
Tris Low EDTA Buffer (TLE)Zobacz przepis w materiałach
Triton X-100 (10%)Sigma93443
Adapter Truseq oligosZintegrowane DNA Technologie (IDT))https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry250 nmol i oczyszczony HPLC
detergent Tween 20Fisher9005-64-5
Bufor do płukania TweenZobacz przepis w materiałach
VortexScientific Industries(G560) SI-0236
uzupełniającychuzupełniających dATP 10 mM Invitrogen 56172 Bufor ligacyjny z ciekłym azotem 1,7 ml Eppendorf 22431021 New Bufor do lizy Zobacz przepis w uzupełnieniu bujanauzupełniającychuzupełniającychuzupełniających

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  2. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  3. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  4. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  5. Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
  6. Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling. Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).
  7. Hsieh, T. H., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  8. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  9. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  10. Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture. Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).
  11. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  12. Alipour, E., Marko, J. F. Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).
  13. Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines. Methods. 72, 65-75 (2015).
  14. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  15. Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time. Methods. 142, 47-58 (2018).
  16. Darrow, E. M., et al. Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).
  17. Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
  18. Ghuryeid, J., et al. Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly. PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273(2019).
  19. Gu, H., et al. Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not. bioRxiv. , (2021).
  20. Ramani, V., et al. Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C. Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).
  21. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture. Current Protocols. 1 (7), 198(2021).
  22. Belton, J. -M. M., et al. Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  23. Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example. Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).
  24. Wang, P., et al. In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. Current Protocols. 1 (8), 174(2021).
  25. Tjong, H., et al. Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).
  26. Nagano, T., et al. Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution. Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).
  27. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  28. Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data. Nature Communications. 12 (1), 4369(2021).
  29. Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).
  30. Vermeulen, C., et al. Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies. Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).
  31. Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC. Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).
  32. Mitter, M., et al. Conformation of sister chromatids in the replicated human genome. Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).
  33. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  34. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
  35. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  36. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  37. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przechwytywanie konformacji chromosom wprotok Hi Coddzia ywania chromatynysieciowanie formaldehydemsieciowanie DSGtrawienie enzymami restrykcyjnymiprodukty ligacjizwijanie genomup tle chromatynydomeny asocjuj ce topologicznie

Powiązane artykuły