Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64003

⸱

8 czerwca 2022

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

Streszczenie

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest wyniszczającą chorobą dotykającą wcześniaki, charakteryzującą się zapaleniem i martwicą jelit. Enteroidy stały się ostatnio obiecującym systemem do modelowania patologii żołądkowo-jelitowych. Jednak obecnie stosowane metody manipulacji enteroidami albo nie mają dostępu do powierzchni wierzchołkowej nabłonka (trójwymiarowe [3D]), albo są czasochłonne i zasobożerne (dwuwymiarowe [2D] monowarstwy). Metody te często wymagają dodatkowych kroków, takich jak mikroiniekcja, aby model stał się fizjologicznie translowalny. W tym miejscu opisujemy fizjologicznie istotny i niedrogi protokół badania NEC in vitro poprzez odwrócenie polaryzacji enteroidów, w wyniku czego powierzchnia wierzchołkowa jest skierowana na zewnątrz (wierzchołek na zewnątrz). Zapewniony jest również protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu zbadania integralności bariery enteroidalnej i ekspresji białka połączeniowego po ekspozycji na czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) lub lipopolisacharyd (LPS) w warunkach normoksyjnych lub niedotlenionych. Ocenia się również żywotność enteroidów 3D wierzchołkowych wystawionych na normoksyjny lub niedotleniony LPS lub TNF-α przez 24 godziny. Enteroidy wystawione na działanie LPS lub TNF-α, w połączeniu z niedotlenieniem, wykazywały zakłócenie architektury nabłonka, utratę ekspresji białka połączenia adherens i zmniejszenie żywotności komórek. Protokół ten opisuje nowy model NEC-in-a-dish z wierzchołkowym naczyniem, który stanowi fizjologicznie istotną i opłacalną platformę do identyfikacji potencjalnych celów nabłonkowych dla terapii NEC i badania odpowiedzi przedwczesnej jelit na terapie.

Wprowadzenie

Martwicze zapalenie jelit (NEC), ciężka choroba zapalna jelita cienkiego występująca u nawet 10% wcześniaków, jest powszechnie kojarzona z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością1,2. Śmiertelność zbliżająca się do 50% u niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej (<1500 g), wymagających interwencji chirurgicznej, nie jest rzadkością3. Chociaż dokładna etiologia NEC nie jest obecnie poznana, uważa się, że czynniki ryzyka, takie jak karmienie mlekiem modyfikowanym, łączą się z anomaliami fizjologicznymi, takimi jak dysbioza, niedojrzały nabłonek jelitowy i dysfunkcyjna bariera jelitowa, w rozwoju choroby2,4. Pomimo znacznych wysiłków, w ciągu ostatniej dekady nastąpił niewielki postęp w zapobieganiu lub leczeniu NEC5. Nowatorska metoda in vitro do badania NEC i związanej z nim dysfunkcji bariery nabłonkowej jelit jest niezbędna do lepszego zrozumienia patogenezy choroby, ponieważ wyniki z modeli zwierzęcych jak dotąd słabo przekładały się na łóżko6.

Do zbadania mechanizmów zachodzących podczas NEC wykorzystano wiele modeli in vitro. Ludzka linia komórek nabłonka jelitowego, Caco-2, jest jednym z najczęściej wykorzystywanych modeli in vitro NEC7,8. Komórki Caco-2 naśladują cechy morfologiczne jelita cienkiego na granicy szczoteczki, ale jako linia komórkowa nie różnicują się w szeroką gamę typów komórek in vivo, w tym komórki kubkowe wytwarzające śluz, wymagane dla wysoce translacyjnego modelu. HT-29-MTX, ludzkie komórki gruczolakoraka jelita grubego, zawierają mieszany fenotyp enterocytów i komórek kubkowych, ale nadal brakuje im typów komórek opartych na krypcie nabłonka jelitowego9. IEC-6 i IEC-18 są nieprzekształconymi liniami komórkowymi o niedojrzałej morfologii przypominającej kryptę jelita krętego, ale nie pochodzą z tkanki ludzkiej, co ogranicza ich zdolność translacyjną. Linie komórek jelitowych FHs 74-Int i H4 pochodzą z ludzkich tkanek płodowych i nie tworzą ścisłych połączeń ani spolaryzowanych monowarstw10,11, a zatem są niedojrzałe w porównaniu nawet z najbardziej wcześniakami podatnymi na NEC. Zazwyczaj modele NEC in vitro wykorzystują leczenie lipopolisacharydami (LPS) w celu wywołania receptora toll-podobnego 4 (TLR4), głównego receptora inicjującego zapalenie jelit w NEC12. Uszkodzenia, w których pośredniczy traktowanie reaktywnymi formami tlenu (ROS), zwykle za pomocą nadtlenku wodoru, są często wykorzystywane do indukowania uszkodzeń oksydacyjnych podobnych do NEC i apoptozy13,14. Jako główny czynnik powodujący zapalenie jelit, czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α), dalszy składnik sygnalizacji zapalnej TLR4, jest również powszechnie stosowany w tych modelach in vitro do naśladowania patogenezy in vivo15.

Organoidy, generowane z indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), zyskały na popularności jako model jelita in vitro ze względu na ich zdolność do rekapitulacji złożonej architektury in vivo i składu typu komórki tkanki, z której pochodzą16,17. Pokrewny system in vitro, enteroidy, to organoidy pochodzące z wyciętych krypt jelitowych, które są łatwiejsze do założenia i utrzymania niż organoidy pochodzące z iPSC. Enteroidy są zwykle hodowane w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z dostępem eksperymentalnym ograniczonym do powierzchni komórki podstawno-bocznej. Metody, takie jak mikroiniekcja18,19, zostały opracowane w celu pokonania tej bariery na powierzchni wierzchołkowej, ale nagromadzenie złuszczonych resztek komórkowych i śluzu w świetle sprawia, że mikroiniekcja jest zarówno technicznie trudna, jak i niespójna. Ponieważ niestandardowe platformy mikroiniekcji robotycznych nie są powszechnie dostępne20, różnice między laboratoriami w zakresie zdolności technicznych i ogólnej techniki stają się istotnymi zmiennymi, które należy przezwyciężyć za pomocą protokołów mikroiniekcji. Dwuwymiarowe (2D) monowarstwy pochodzące ze zdysocjowanych enteroidów 3D, nadal zawierające wszystkie główne typy komórek nabłonka jelitowego, umożliwiają dostęp do powierzchni wierzchołkowej, ale tradycyjnie były trudne do utrzymania bez warstwy zasilającej mezenchymalne miofibroblasty21. Podczas gdy przepuszczalne dla hodowli komórkowych nośniki mogą być używane do uzyskiwania dostępu zarówno do wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej strony monowarstw enteroidalnych bez użycia leżących poniżej miofibroblastów, wstawki te wymagają wycięcia i zamontowania błony przed użyciem z modalnościami takimi jak mikroskopia konfokalna, co skutkuje bardziej wymagającym technicznie i trudnym procesem przy użyciu tradycyjnych metod mikroskopowych22. NEC został zamodelowany in vitro przy użyciu tradycyjnych enteroidów 3D23,24,25 i przepuszczalne podpory26,27, a zapalenie jelit zostało niedawno zreplikowane za pomocą modeli jelit na chipie28,29. Podczas gdy modele typu gut-on-a-chip zawierające mikrofluidykę są zdecydowanie najbardziej zaawansowanymi i możliwymi do przetłumaczenia modelami, technologia ta jest droga, złożona i niedostępna dla większości badaczy30.

Ostatnie postępy w technikach enteroidów wierzchołkowych umożliwiły łatwiejszy dostęp do powierzchni wierzchołkowej enteroidów 3D bez ryzyka uszkodzenia integralności strukturalnej nabłonka in vitro31,32,33. Enteroidy wierzchołkowe mają taki sam skład komórek i funkcję barierową nabłonka jelitowego in vivo, ale w przeciwieństwie do typowych enteroidów 3D, powierzchnie wierzchołkowe tych komórek są skierowane w stronę pożywki hodowlanej, co pozwala na bardziej fizjologicznie istotne badania nad wchłanianiem składników odżywczych, infekcją mikrobiologiczną i wydzielaniem światła31. Dodatkową zaletą enteroidów wierzchołkowych jest możliwość jednorodnego rozprowadzania czynników doświadczalnych do enteroidów. Różnicowanie objętości leczenia w zależności od wielkości enteroidu nie jest wymagane, jak ma to miejsce w przypadku mikroiniekcji, a zdolność do utrzymania tych enteroidów w hodowli zawiesinowej neguje wszelkie zakłócenia ECM w dyfuzji czynnika eksperymentalnego32.

Martwicze zapalenie jelit jest chorobą wieloczynnikową, obejmującą wiele typów komórek nabłonka jelitowego oraz różne czynniki środowiskowe i patofizjologiczne34. Zróżnicowany skład komórkowy enteroidów jelitowych stanowi wyraźną poprawę w porównaniu z monokulturami w modelowaniu złożonej choroby, takiej jak NEC. Co ciekawe, podczas gdy pojedyncza ekspozycja na stan zapalny jest często wystarczająca do wywołania uszkodzeń w monokulturach in vitro, enteroidy, podobnie jak w przypadku modeli mysich23, wydają się wymagać co najmniej dwóch składników zapalnych, aby wywołać uszkodzenia podobne do NEC6. W tym miejscu przedstawiamy model NEC-in-a-dish z wierzchołkowym wyjściem, wykorzystujący enteroidy wierzchołkowe w połączeniu z niedotlenieniem (ważna cecha kliniczna NEC6) oraz LPS lub TNF-α, jako ulepszony i bardziej fizjologicznie istotny model in vitro do badania odpowiedzi nabłonka na zapalenie podobne do NEC i, potencjalnie, identyfikacji celów terapeutycznych. Opisujemy protokół odwracania polarności enteroidów 3D jelita cienkiego, a także protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu identyfikacji przerwania bariery nabłonkowej i zmian ekspresji białek połączeniowych. Na koniec demonstrujemy prosty test żywotności enteroidów, aby określić wpływ naszego modelu NEC-in-a-dish z podwójnym uderzeniem, wierzchołkiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Oklahomie. Próbki jelita cienkiego od wcześniaka naczelnego (NHP, 90% ciąży, pawian oliwkowy, Papio anubis) uzyskano po eutanazji do oddzielnego badania (Protokół #101523-16-039-I).

1. Ustanowienie modelu NEC-in-a-dish z wierzchołkowym enteroidem

  1. Przygotowanie pożywek i leczenia jelit
    UWAGA: Po przygotowaniu zgodnie ze standardową techniką aseptyczną podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
    1. Przygotować pożywkę wolną od antybiotyków (AFM), mieszając 50 ml ludzkiej pożywki wzrostowej z organoidami z 50 ml suplementu organoidowego (patrz tabela materiałów). Przygotować 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego/1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (EDTA/PBS), dodając 100 μL 0,5 M EDTA do 9,900 μL PBS.
    2. Schłodzić zmodyfikowaną pożywkę orła/składnik odżywczy Dulbecco F12 + 15 mM bufor HEPES (DMEM/F12) w temperaturze 2-8 °C.
    3. Przygotować roztwór podstawowy TNF-α, zawieszając 100 μg proszku TNF-α w 1 ml 1x PBS. Następnie rozcieńczyć materiał podstawowy TNF-α do stężeń 20 ng/ml i 50 ng/ml, używając AFM jako rozpuszczalnika. Przygotować roztwór podstawowy LPS, zawieszając 2 mg LPS w 1 ml 1x PBS. Następnie rozcieńczyć podstawowy LPS do 100 μg/ml i 200 μg/ml, używając AFM jako rozpuszczalnika.
  2. Odwrócenie polaryzacji enteroidów 3D
    UWAGA: Poniższa procedura jest przeznaczona do odwrócenia pojedynczej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem na dwie 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej o bardzo niskim przyczepie. Płytki do hodowli tkankowych należy ogrzać do temperatury 37 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Wyprowadzenie podstawno-bocznych enteroidów 3D zostało osiągnięte zgodnie z wcześniejszym opisem wielu grup35,36, z niewielkimi modyfikacjami dla mediów (szczegółowo powyżej). Ogólna procedura wyprowadzania enteroidów nie różni się od procedury u ludzi. Krótko mówiąc, wycięta tkanka jest myta, cięta na małe fragmenty i inkubowana w buforze do rozbijania komórek. Roztwór komórkowy jest następnie przepuszczany przez sitko komórkowe o średnicy 70 μM, w wyniku czego powstają krypty platerowane o dużej gęstości.
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki z 24-dołkowej płytki z ustalonymi 3D enteroidami podstawno-bocznymi.
    2. Dodać 500 μl 5 mM lodowatego EDTA/PBS do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i delikatnie mechanicznie rozbić kopułę ekstraktu z błony podstawnej/ECM, pipetując w górę iw dół pipetą p200 co najmniej 5x-6x.
    3. Przenieś zawartość czterech studzienek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 8 ml lodowatego EDTA/PBS do stożkowej probówki. Przenieś pozostałe 20 studzienek w ten sam sposób.
    4. Inkubować stożkowe probówki o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę na obrotowej platformie lub wytrząsarce z prędkością 330 obr./min. Po 1 godzinie inkubacji odwirować stożkowe probówki o stężeniu 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant z każdej probówki.
    5. Połączyć i przemyć granulki komórek za pomocą 5 ml DMEM/F12 i rozprowadzić zawiesinę komórek do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    6. Osadzać komórki przez odwirowywanie przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 12 ml AFM do każdej probówki, upewniając się, że granulki komórek są ponownie zawieszone.
    7. Odpipetować 500 μl zawiesiny enteroidalnej do każdego dołka z dwóch 24-dołkowych płytek o bardzo niskim nasadce.
    8. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-5 dni lub do momentu, gdy enteroidy odwrócą polaryzację.
    9. Aby sprawdzić odwrócenie enteroidu, najpierw ustal potwierdzające barwienie immunofluorescencyjne i średni czas do odwrócenia (~3 dni), a następnie potwierdź odwrócenie polaryzacji za pomocą podstawowej wizualizacji mikroskopu świetlnego. Enteroidy wierzchołkowe są bardzo komórkowe z wyglądu, podczas gdy enteroidy podstawno-boczne są często zdominowane przez obecność dużego centralnego światła lub pączkowania (patrz rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Po ustandaryzowaniu procedury współczynnik konwersji na wierzchołkowy zwykle przekracza 95%. Zastosowanie enteroidów wierzchołkowych jest przeznaczone jako eksperyment terminalny, chociaż teoretycznie możliwe jest przejście enteroidów wierzchołkowych do niewielkiej liczby enteroidów
      10. zewnątrz-boczno-podstawnych.
  3. Wierzchołek NEC-in-a-dish
    UWAGA: Gdy enteroidy odwrócą polarność, szybko użyj kultur w kolejnych eksperymentach, ponieważ ich długowieczność w konformacji wierzchołkowej nie została potwierdzona dłużej niż 3-4 dni. W przypadku następującego modelu NEC-in-a-dish, enteroidy były traktowane przez 24 godziny, a następnie zebrane natychmiast po tym i zachowane do dalszych eksperymentów.
    1. Gdy enteroidy wizualnie odwrócą polaryzację z co najmniej 95% skutecznością, wyjmij płytki z inkubatora i zbierz osiem dołków z 24-dołkowej płytki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ponieważ enteroidy wierzchołkowe znajdują się w zawiesinie, wystarczy odpipetować roztwór enteroid/pożywka. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Po granulowaniu komórek usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 4 ml AFM zmieszanym z żądaną objętością (10 μl tutaj, aby dopasować najwyższą dodaną objętość traktowania) 1x PBS (kontrola).
    3. Odpipetować 500 μl zawiesiny enteroidowej/PBS/AFM do ośmiu dołków 24-dołkowej płytki o bardzo niskim stopniu mocowania i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
    4. Powtórz kroki 1.3.1.-1.3.3. dla zabiegów TNF-α (20 ng/ml i 50 ng/ml) i LPS (100 μg/ml i 200 μg/mL) w normoksji. W przypadku wszystkich zabiegów hipoksji powtórzyć kroki 1.3.1.-1.3.3., ale umieścić płytkę w oddzielnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 1% O2 przez 24 godziny
      UWAGA: Krok 1.3.4. można to zrobić jednocześnie z krokami 1.3.1.-1.3.3, ale dla jasności, powyższa procedura została oddzielona przez leczenie w celu zmniejszenia złożoności.

2. Barwienie immunofluorescencyjne i mikroskopia konfokalna

  1. Przygotowanie roztworów barwiących
    1. Przygotować 0,1% Triton X-100, mieszając 7 μl Triton X-100 w 1x PBS do końcowej objętości 7 ml. Przygotować PBST (PBS-Tween), dodając 30 μl Tween-20 do 1x PBS do końcowej objętości 30 ml.
    2. Przygotuj 10% normalnej surowicy osła (NDS)/PBST, dodając 700 μl NDS do 6,3 ml PBST. Przygotować 1% NDS/PBST, dodając 70 μl NDS do PBST do końcowej objętości 7 ml.
      UWAGA: Surowica osła została tutaj użyta do skorelowania z drugorzędowym przeciwciałem gospodarza. Jednak gatunki surowicy blokującej powinny być zgodne z drugorzędowymi gatunkami przeciwciał, aby prawidłowo blokować nieswoiste wiązanie.
  2. Barwienie (dzień 1)
    1. Przenieść zawartość czterech dołków 24-dołkowej płytki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórz dla wszystkich pożądanych dołków/zabiegów, z każdym zabiegiem w osobnej tubce. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Po osadzeniu enteroidów należy usunąć supernatant.
    2. Zawiesić granulki komórkowe w 300 μl 4% utrwalacza formaldehydu na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Po 30 minutach odwirować probówki o sile 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i przemyć osad 500 μl sterylnego RT 1x PBS.
    3. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 500 μl 0,1% Triton X-100 i odstawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Po upływie 1 godziny odwirować probówki o sile 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Przemyć 500 μl 1x PBS i umieścić probówki na rotatorze lub wytrząsarce z prędkością 200 obr./min na 15 minut w temperaturze 2-8 °C. Powtórz to w sumie 4 razy.
    5. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Dodać 500 μl 10% NDS/PBST i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Podczas inkubacji należy przygotować pierwszorzędowe roztwory przeciwciał, łącząc 20 μl rekombinowanego przeciwciała anty-villin, 10 μl przeciwciała E-kadheryny i 1970 μl 1% NDS/PBST dla ośmiu dołków 24-dołkowej płytki.
    6. Po 45 minutach inkubacji odwirować probówki o sile 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Umieścić probówki na lodzie. Usunąć supernatant i zastąpić go 250 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 2-8 °C.
  3. Barwienie (dzień 2)
    1. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Dodać 250-500 μL PBST do każdej probówki, w zależności od wielkości granulki, i umieścić na rotatorze lub wytrząsarce z prędkością 200 obr./min na 1 godzinę w temperaturze 2-8 °C. Powtórzyć płukanie PBST 4x.
    2. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych, dodając 52 μl Cy3 IgG przeciwko królikowi osła (H + L) do 50% glicerolu i 5,2 μl przeciwciał drugorzędowych przeciwko myszym osiołkom przeciwko zieleni fluorescencyjnej 488 do 5142,8 μl 1% NDS / PBST.
    3. Po ostatnim płukaniu PBST i odwirowaniu usunąć supernatant z probówek. Dozować 200 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej probówki i inkubować w ciemności przez noc w temperaturze 2-8 °C.
  4. Montaż barwionych enteroidów wierzchołkowych (Dzień 1)
    1. Przynieś do RT montant na bazie glicerolu zawierający niebieski barwnik jądrowy przez ponad 1 godzinę.
    2. Odwirować probówki o stężeniu 300 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć 100 μl supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałych ~100 μl supernatantu. Przenieść zawiesinę komórek do probówek o pojemności 0,5 ml.
    3. Odwiruj probówki w mini wirówce przez 20 sekund, aby granulować komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w 100 μl dalekiej czerwieni barwienia kwasem nukleinowym. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    4. Odwiruj probówki w mini wirówce przez 20 sekund, aby granulować komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w 100 μl 1x PBS. Powtórz dla drugiego prania.
    5. Odwirować probówki w mini wirówce przez 20 sekund, aby osadzać komórki i usunąć 70 μl supernatantu. Zawiesić komórki w pozostałej objętości PBS i przenieść zawartość na oznakowane szkiełko nakrywkowe (24 mm x 60 mm).
    6. Nanieść 75 μl preparatu mocującego bezpośrednio na próbkę i usunąć wszelkie pęcherzyki za pomocą końcówki pipety. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do utwardzenia przez noc (18-24 h) w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. Montaż barwionych enteroidów wierzchołkowych (Dzień 2)
    1. Po utwardzeniu przez noc nałóż cienką warstwę (~15 μL) glicerolu na szkiełka nakrywkowe. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i delikatnie dociśnij. Stuknij, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
    2. Pozwól szkiełku nakrywkowemu ustawić się w temperaturze RT w ciemności przez co najmniej 2 godziny, a następnie zobrazuj go w 20-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby uzyskać mikroskopową wizualizację enteroidów przy użyciu różnych metod akwizycji konfokalnej, zapoznaj się z Lallemant et al.37.
  6. Kwantyfikacja immunofluorescencyjna
    UWAGA: Ta metoda określa skorygowaną fluorescencję całkowitą, usuwając sygnał tła za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Otwórz obrazy konfokalne w ImageJ i obrysuj żądany obszar za pomocą narzędzia do tworzenia obszaru zainteresowania (ROI).
    2. Ustaw parametry zdefiniowane przez użytkownika, przechodząc do opcji Analizuj > Ustaw pomiary. Wybierz opcję Obszar > Zintegrowana gęstość > Średnia wartość szarości na karcie ustawień.
    3. Przejdź do sekcji Analizuj > mierz. Pojawi się wyskakujące okienko zawierające pomiary. Skopiuj te pomiary i wklej je do arkusza kalkulacyjnego.
    4. Aby odjąć sygnał tła, wybierz mały niefluorescencyjny obszar obrazu. Przejdź do pozycji Analizuj > mierz dla tego regionu. Pojawi się wyskakujące okienko zawierające pomiary. Skopiuj dane wyjściowe i wklej je do arkusza kalkulacyjnego.
    5. Pomnóż obszar wybranej komórki przez średnią fluorescencję odczytów tła i odejmij sumę od gęstości zintegrowanej, aby obliczyć skorygowaną całkowitą fluorescencję komórki (CTCF). Powtórz powyższe kroki dla wszystkich interesujących Cię obrazów, zachowując zapisy w arkuszu kalkulacyjnym lub pakiecie oprogramowania statystycznego (patrz Spis materiałów).

3. Żywotność komórek NEC-in-a-dish wierzchołkowo-wierzchołkowych

  1. Leczenie enteroidów
    1. Ustal wierzchołkowy model NEC-in-a-dish na 24 godziny, jak w kroku 1.
    2. Rozmrozić odczynnik do oznaczania żywotności komórek przez noc w temperaturze 4 °C. W dniu próby doprowadzić odczynnik do RT 30 minut przed użyciem. Odwróć odczynnik, aby wymieszać.
    3. Przed wykonaniem testu należy usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki, pozostawiając pozostałe 400 μl. Do każdej studzienki dodać 400 μl odczynnika do oznaczania żywotności komórek.
    4. Energicznie dobrze wymieszać zawartość na wytrząsarce płytkowej w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 obr./min, aby wywołać lizę komórek. Po wstrząśnięciu inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 25 minut.
    5. Po 25 minutach inkubacji wymieszać zawartość jednego dołka za pomocą pipetowania i przenieść 200 μl z 800 μl do jednego dołka na 96-dołkowej, nieprzezroczystej, polistyrenowej płytce z przezroczystym dnem. Powtórzyć tę czynność dla pozostałych 600 μl, tworząc cztery kontrpróby techniczne na studzienkę. W ten sposób przenieść pozostałą zawartość każdej studzienki z płytki 24-dołkowej do płytki 96-dołkowej.
    6. Korzystając z czytnika płytek zdolnego do luminescencji, rejestruj wartości przy całkowaniu 0,25 ms i porównuj względne wartości między zabiegami. Alternatywnie, porównaj luminescencję leczenia z wzorcem adenozynotrifosforanu (ATP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystanie enteroidów do modelowania zapalenia jelit, nawet w kontekście martwiczo-wybroczynowego zapalenia jelit, jest obecnie powszechne. Jednak większość stosowanych obecnie metod albo nie zapewnia dostępu do powierzchni apikalnej enteroidów, co niweluje istotność fizjologiczną związków przeznaczonych do późniejszego zastosowania jako leki podawane doustnie, albo jest technicznie trudna i czasochłonna, jak w przypadku monowarstw pochodnych enteroidów. Aby zwiększyć użyteczność obecnych in vitro w modelach ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niedawny rozwój modeli enteroidalnych pochodzących z krypt nabłonka jelitowego pozwala na bardziej fizjologicznie istotną tkankę in vitro , w której można badać patogenezę martwiczego zapalenia jelit. Pomimo uwzględnienia wszystkich głównych zróżnicowanych typów komórek nabłonka jelitowego, enteroidy 3D nadal podlegają kilku istotnym ograniczeniom. Konwencjonalne, podstawno-boczne enteroidy są zawieszone w kopułach hydrożelowych 3D ECM, których skład i gęstość mogą ograniczać normalną dyfuzję w środowisku hodowl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy National Institutes of Health. HC jest wspierany przez P20GM134973 grantowe z National Institutes of Health. KB jest wspierany przez granty Fundacji Szpitala Dziecięcego (CHF) i Fundacji Zdrowia Prezbiteriańskiego (PHF). Dziękujemy Laboratorium Biologii Molekularnej i Badań Cytometrycznych w OUHSC za korzystanie z Core Facility, który zapewnił obrazowanie konfokalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0Fisher Scientific15575-020
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Rurka stożkowa 15 mlVWR89039-666
Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3DPromegaG9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-dołkowe mikropłytkiFisher Scientific07-200-602
Szkło nakrywkowe 24 mm x 60 mmThermo Scientific102460
Przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej osła, Alexa Fluor 488Thermo ScientificA-21202
Przeciwciało przeciw królikowi IgG osła, koniugat Cy3Sigma-AldrichAP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Szynka Mieszanina F-12 (DMEM-F12) z 15 mM buforem HEPESSTEMCELL Technologies36254
Przeciwciało E-kadheryny (7H12)Novus BiologicalsNBP2-19051
Roztwór formaldehydu 4%, buforowany, pH 6,9Milipore Sigma1004960700
GlicerolSigma-Aldrich56-81-5
ImageJFidżiN/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010
Mikroskop konfokalny Leica SP8Leica Biosystems
z Escherichia coli O111:B4, oczyszczone za pomocą chromatografii filtracyjnej w żeluMillipore SigmaL3012-10MG
Fisher Scientific12-544-7
Normalna surowica osłaSigma-Aldrich566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, płaskodenna mikropłytkaThermo Scientific136101
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), 1x [-] wapń, magnez, pH 7,4Corning21-040-CM
Prolong Szklany uchwyt zapobiegający blaknięciu z NucBlueFisher ScientificP36983
Rekombinowane przeciwciało anty-Villin [SP145]Abcamab130751
Rekombinowane ludzkie białko TNF-&alfa 100 &mikro; gBio-Techne210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Wielomodowy czytnik mikropłytekUrządzenia molekularne
Inkubator trójgazowy z płaszczem wodnym Thermo Forma Series II, 184LJodek Fisher Scientific3140
TO-PRO-3 (642/661)Thermo ScientificT3605
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Probówki, 0,5 mL, płaskie ThermoScientificAB0350
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5
Lipopolisacharydy Szkiełka mikroskopowe

Bibliografia

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890(2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359(2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15(2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265(2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750(2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475(2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8(2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141(2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325(2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372(2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372(2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enteroidy o odwr conej polarno ci Apical Outodwr cenie polarno ci enteroid wzapalenie jelitmodel in vitrointegralno barierybarwienie immunofluorescencyjnetest ywotno ci kom rektraktowanie hipoksjmikroskopia konfokalna
In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.