Method Article

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

DOI:

10.3791/64015

⸱

June 29th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w terapiach immunologicznych zrewolucjonizowały leczenie i badania nad rakiem. Wywołało to rosnące zapotrzebowanie na charakterystykę krajobrazu immunologicznego nowotworu. Chociaż standardowa immunohistochemia nadaje się do badania architektury tkankowej, ogranicza się do analizy niewielkiej liczby markerów. I odwrotnie, techniki takie jak cytometria przepływowa mogą oceniać wiele markerów jednocześnie, chociaż informacje o morfologii tkanek są tracone. W ostatnich latach strategie multipleksowe, które integrują analizę fenotypową i przestrzenną, pojawiły się jako kompleksowe podejścia do charakterystyki krajobrazu immunologicznego nowotworu. W tym artykule omówiono innowacyjną technologię łączącą przeciwciała znakowane metalem i spektrometrię mas jonów wtórnych, koncentrując się na etapach technicznych w opracowywaniu i optymalizacji testów, przygotowaniu tkanek oraz pozyskiwaniu i przetwarzaniu obrazów. Przed barwieniem należy opracować i zoptymalizować panel przeciwciał znakowany metalem. Ten system obrazowania hi-plex obsługuje do 40 przeciwciał znakowanych metalem w jednym wycinku tkanki. Warto zauważyć, że ryzyko zakłóceń sygnału wzrasta wraz z liczbą znaczników zawartych w panelu. Po zaprojektowaniu panelu należy zwrócić szczególną uwagę na przypisanie izotopu metalu do przeciwciała, aby zminimalizować tę interferencję. Wstępne badanie panelowe przeprowadza się przy użyciu niewielkiego podzbioru przeciwciał, a następnie testuje cały panel w tkankach kontrolnych. Utrwalone formaliną, zatopione w parafinie skrawki tkanek są uzyskiwane i montowane na pozłacanych szkiełkach, a następnie barwione. Barwienie trwa 2 dni i bardzo przypomina standardowe barwienie immunohistochemiczne. Po wybarwieniu próbki umieszcza się je w przyrządzie do akwizycji obrazu. Wybierane są pola widzenia, a obrazy są pobierane, przesyłane i przechowywane. Ostatnim etapem jest przygotowanie obrazu do filtrowania i usuwania zakłóceń za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu systemu. Wadą tej platformy jest brak oprogramowania analitycznego. Jednak generowane obrazy są obsługiwane przez różne oprogramowanie do patologii obliczeniowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie licznych typów komórek otaczających klonalne populacje nowotworów jest kluczowym elementem w kategoryzacji rakotwórczości. Zainteresowanie wyjaśnieniem składu i interakcji mikrośrodowiska nowotworu (TME) stale rosło po ustanowieniu terapii immunologicznej jako części arsenału leczenia raka. W związku z tym strategie leczenia przesunęły się z podejścia skoncentrowanego na nowotworze na podejście skoncentrowane na TME1.

Wysiłki mające na celu wyjaśnienie roli komórek odpornościowych w nadzorze nad nowotworami i ich rozwoju znacznie wzrosły w ostatnich latach2,3. W badaniach medycznych pojawiło się mnóstwo metod, w tym metody oparte na cytometrii oraz technologie obrazowania singleplex i multiplex, w ramach tej próby rozszyfrowania unikalnych interakcji wielu elementów TME.

Pionierskie metody, takie jak cytometria przepływowa (wynaleziona w latach 60.), sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i cytometria masowa, koncentrują się głównie na identyfikacji i ilościowym określaniu składników TME4. Mimo że techniki ilościowe oparte na cytometrii pozwalają na fenotypowanie krajobrazu immunologicznego, określenie przestrzennego rozmieszczenia komórek jest niemożliwe. I odwrotnie, metody takie jak standardowa immunohistochemia pojedynczego pleksu zachowują architekturę tkankową i umożliwiają badaczom analizę dystrybucji komórkowej, chociaż zmniejszona liczba celów w pojedynczym odcinku tkanki jest ograniczeniem tych metod5,6. W ciągu ostatnich kilku lat technologie obrazowania multipleksowego do rozdzielczości pojedynczej komórki, takie jak immunofluorescencja multipleksowa, obrazowanie fluorescencyjne z kodowaniem kreskowym i obrazowa spektrometria mas, pojawiły się jako kompleksowe strategie pozyskiwania informacji na temat jednoczesnego barwienia markerów przy użyciu tego samego przekroju tkanki7.

Tutaj prezentujemy technologię, która łączy przeciwciała oznaczone metalem i spektrometrię mas jonów wtórnych oraz umożliwia kwantyfikację rozdzielczości pojedynczej komórki, koekspresję markerów (fenotypowanie) i analizę przestrzenną przy użyciu próbek tkanek utrwalonych w formalinie, parafinie (FFPE) i świeżo mrożonych (FF)8,9. Próbki FFPE są najczęściej używanymi materiałami do archiwizacji próbek tkanek i stanowią łatwiej dostępne zasoby dla technologii obrazowania multipleksowego niż świeże próbki mrożone10. Dodatkowo technologia ta oferuje możliwość ponownego pozyskania obrazów kilka miesięcy później. W tym artykule omawiamy nasze protokoły barwienia i przetwarzania obrazu przy użyciu próbek tkanek FFPE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki tkanek zostały pobrane do celów badawczych zgodnie z Institutional Review Board of The University of Texas MD Anderson Cancer Center, a próbki zostały dodatkowo pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.

1. Wybór przeciwciał

  1. Zdefiniuj pytania badawcze, aby wybrać najlepsze dostępne klony przeciwciał. Korzystaj z Atlasu Białek Ludzkich, opublikowanych badań i stron internetowych producentów przeciwciał jako zasobów badawczych.
    UWAGA: Wybór odpowiednich kontroli tkanek ludzkich i tych samych kontroli tkanek ludzkich do barwienia na różnych etapach ma kluczowe znaczenie dla upewnienia się, że markery są barwione prawidłowo, we właściwym miejscu i we właściwym przedziale komórkowym. Do walidacji barwienia zawsze zaleca się małą mikromacierz tkankową (TMA), w tym tkanki normalne i tkanki nowotworowe.
  2. Do zaprojektowania panelu należy używać wyłącznie przeciwciał wolnych od nośnika.
    UWAGA: Stosowanie preparatów przeciwciał wolnych od nośnika jest wymagane, jeśli komercyjne przeciwciało wolne od nosiciela nie jest dostępne; Zestawy oczyszczające mogą być używane do dostosowania przeciwciała do właściwej formuły. Wiadomo, że dodatki białkowe, takie jak albumina surowicy bydlęcej, zmniejszają zdolność koniugacji.
  3. Przetestuj i miareczkuj każde przeciwciało przy użyciu standardowej immunohistochemii chromogennej w celu określenia subkomórkowego wzorca ekspresji markera; barwienia błonowego, cytoplazmatycznego lub jądrowego; oraz ekspresji w określonych komórkach w tkankach kontrolnych.
    UWAGA: Jednak każde przeciwciało musi być przetestowane w pH 6 cytrynianu i pH 9 kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i należy określić, czy panel będzie barwiony cytrynianem pH 6 czy pH 9 EDTA. Stosowanie pH 9 EDTA jest zalecane w celu uzyskania dobrych sygnałów, zwłaszcza podczas pracy z tą metodologią.
  4. Wybierz optymalne stężenie barwienia zgodnie ze wzorcem ekspresji w kontrolach pozytywnych.
  5. Przypisz każde przeciwciało do jednego z dostępnych izotopów metali zgodnie z obfitością markerów immunohistochemicznych, lokalizacją subkomórkową i koekspresją komórkową z innymi celami.
  6. Wybarwić przeciwciało odpowiednim przypisanym metalem i porównać z wyrazem w tej samej tkance kontrolnej, która została użyta poprzednio.
    UWAGA: Koniugacja przeciwciał z metalem rozpoczyna się od przygotowania, redukcji i późniejszej koniugacji przeciwciał (plik uzupełniający 1). Każda rurka polimerowa obciążona metalem wystarcza do znakowania 100 μg przeciwciała.

2. Projekt panelu przeciwciał

  1. Twórz małe partie barwienia przeciwciałami. Przetestuj do pięciu markerów w koktajlu.
    UWAGA: Testowanie przeciwciał już sprzężonych i analizowanych za pomocą immunohistochemii w partiach ułatwia wczesną identyfikację interferencji kanałów i daje możliwość rekoniugacji przeciwciał z innym metalem. Daje to również możliwość oceny odpowiedniej koekspresji markerów.
  2. Zabarwić każdą małą partię czterema różnymi stężeniami przeciwciał (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml i 4,0 μg/ml).
    UWAGA: Porównując różne miana, zidentyfikuj stężenie przeciwciał, które skutkuje prawidłową lokalizacją i najwyższą ekspresją przy minimalnym barwieniu tła (najlepszy stosunek sygnału do szumu).

3. Sekcja tkanek FFPE

  1. Wybierz szkiełka pokryte złotem (przeznaczone do tego celu) i trzymaj je blisko mikrotomu. Przygotuj mikrotom, wkładając nowe ostrze do uchwytu. Ustaw grubość przekroju na 4-5 μm.
  2. Połóż bloki FFPE na lodzie przed cięciem. Przygotować kąpiel flotacyjną tkankową, podgrzewając wodę destylowaną lub wodę dejonizowaną (diH2O) do temperatury 40-45 °C.
    UWAGA: Stosowanie diH2O lub wody destylowanej zmniejsza możliwość zanieczyszczenia.
  3. Rozpocznij dzielenie na sekcje. Umieść fragment tkanki w wodzie za pomocą pęsety i pozwól mu się spłaszczyć. Użyj szkiełek, aby usunąć skrawki tkanek z wody.
  4. Umieść szkiełka w stojaku na szkiełka i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.

4. Barwienie przeciwciał FFPE

UWAGA: Proces barwienia odbywa się w dwóch oddzielnych dniach.

UWAGA: Rozwiązania zastosowane w tym protokole są potencjalnie i stanowią zagrożenie dla skóry i oczu. Noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego oraz sprzętu ochronnego na oczy i twarz jest zalecane i stanowi część polityki bezpieczeństwa biologicznego naszej instytucji.

  1. Przygotowanie odczynnika (dzień 1)
    1. Rozcieńczyć 50 ml 20x soli fizjologicznej buforowanej Tris za pomocą Tween (TBS-T) w 950 ml diH2O, aby uzyskać 1 l TBS-T.
    2. Rozcieńczyć 8 ml 10x kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 72 ml diH2O, aby uzyskać 1x roztwór do odzyskiwania epitopów indukowany ciepłem (HIER).
    3. Rozcieńczyć surowicę osła w 1x TBS-T do końcowego stężenia 5%, aby uzyskać bufor blokujący. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
  2. Przygotowanie HIER: Moduł obróbki wstępnej (PT)
    UWAGA: Nosić rękawice chroniące przed chemikaliami podczas pracy z odczynnikami lub częściami zanurzonymi w odczynnikach używanych w module PT.
    1. Rozcieńczyć 140 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w 1,260 ml diH2O, aby uzyskać 1,4 l 1x PBS. Alternatywnie, rozcieńczyć siedem tabletek PBS w 1,4 l diH2O.
    2. Napełnij zbiornik 1,4 l PBS i umieść w zbiorniku przygotowany pojemnik z komorą szkiełkową ze 100 ml roztworu 1x HIER.
    3. Podgrzej zbiornik w module PT do 75 °C.
  3. Usuwanie nadmiaru parafiny
    1. Piec szkiełka w temperaturze 70 °C w piekarniku przez co najmniej 20 minut.
      UWAGA: Niektóre chusteczki lub sekcje mogą wymagać dłuższego czasu pieczenia. Zalecany czas pieczenia tkanki mózgowej lub TMA to 1 godzina. Może to zostać przedłużone do 16 godzin (w nocy) lub w zależności od doświadczenia laboratoryjnego.
    2. Umieść upieczone szkiełka w uchwycie na szkiełka i wykonaj następujące czynności mycia na wytrząsarce pod wyciągiem. Umyj szkiełka w następującym roztworze: Ksylen 2x przez 30 s (bez metalu), 100% alkohol 2x przez 30 s (bez metalu), 95% alkohol 2x przez 30 s (bez metalu), 80% alkohol przez 30 s (bez metalu), 70% alkohol przez 30 s (bez metalu) i diH2O 2x przez 30 s (bez metalu).
    3. Szkiełka należy przechowywać w świeżym pojemniku diH2O do czasu, gdy będą gotowe do pobrania antygenu.
      UWAGA: Szkiełek nie należy suszyć do końca zabiegu.
  4. Pobieranie antygenu
    1. Umieść szkiełka w nagrzanej komorze szkiełkowej zawierającej 1x bufor HIER wewnątrz modułu PT. Umieść pokrywę na zbiorniku. Zamknij i zatrzaśnij pokrywę.
    2. Naciśnij przycisk Menu na module PT, aby otworzyć menu główne i naciśnij przycisk Cykl konfiguracji (czas i temperatura), aby utworzyć program niestandardowy.
    3. Uruchom moduł PT w temperaturze 97 °C na 40 minut, a następnie moduł PT automatycznie ostygnie do 65 °C.
    4. Wyjmij prowadnice z modułu PT po osiągnięciu temperatury 65 °C. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      UWAGA: Moduł PT nie otworzy się, dopóki temperatura nie spadnie do 65 °C. Podczas tego procesu nie dotykaj złotej powierzchni szkiełek i zawsze używaj rękawiczek.
  5. Blokowanie przeciwciał
    1. Ustaw wytrząsarkę na 70 obr./min.
    2. Umyj szkiełka, zanurzając je w 1x TBS-T na 5 min 2x.
    3. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj obwódkę wokół odcinka tkanki w odległości co najmniej 1 mm od krawędzi szkiełka i pozostaw do wyschnięcia na 15-30 s.
      UWAGA: Należy uważać, aby płyn w pisaku nie dotykał części tkanki, aby uniknąć ingerencji tkanek w barwienie. Nie należy zbyt mocno dociskać wstrzykiwacza podczas rysowania bariery, aby uniknąć potencjalnych wycieków. W celu uzyskania optymalnych wyników barwienia i akwizycji obrazu, skrawki tkanek umieszcza się pośrodku pokrytych złotem szkiełek w ramie nie większej niż 15 mm x 30 mm, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na narysowanie bariery bez dotykania tkanki lub punktów prowadzących umieszczonych na zewnętrznej krawędzi szkiełka.
    4. Aby usunąć wszelkie pozostałości pióra, zanurz szkiełka w TBS-T.
    5. W komorze wilgotnościowej o temperaturze pokojowej inkubować wycinek tkanki ze 100-200 μl buforu blokującego przez 20 minut. Pozostawić tkankę inkubowaną w buforze blokującym, aż będzie gotowa mieszanka główna przeciwciał.
  6. Przygotowanie panelu przeciwciał
    UWAGA: Ostateczna objętość koktajlu panelu przeciwciał różni się w zależności od szacowanej powierzchni przekroju tkanki. Aby pokryć powierzchnię 20 mm x 20 mm, przygotuj 100-200 μl koktajlu.
    Wykonaj następujące czynności, aby przygotować koktajl panelowy przeciwciał z przeciwciałami sprzężonymi z izotopami metali:
    1. Potwierdzić końcową objętość koktajlu, która jest równa objętości koktajlu przeciwciał dodanych do objętości buforu blokującego.
    2. Potwierdź specyfikacje dla wszystkich przeciwciał, rozcieńczeń i/lub stężeń przeciwciał w arkuszu kalkulacyjnym panelu dla projektu.
    3. Odkręć wszystkie probówki zawierające przeciwciała w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut. Dodaj pojedyncze przeciwciała do buforu blokującego i bardzo dobrze wymieszaj. Nie należy naruszać dna probówki z przeciwciałami podczas pipetowania.
    4. Przefiltrować panel przeciwciał poprzez wstępne zwilżenie filtra odśrodkowego o wielkości 0,1 μm ze 100 μl buforu blokującego. Obracać filtr przy 10 000 x g przez 2 minuty i usunąć blokujący przepływ buforu za pomocą pipety.
    5. Przenieś panel przeciwciał do kolumny wirującej i obracaj filtr w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty. Wyrzuć kolumnę wirową i użyj przepływu jako przefiltrowanego panelu przeciwciał.
      UWAGA: Barwienie należy wykonać natychmiast po przygotowaniu koktajlu, aby zapobiec wymianie metalu. Jeśli konieczne jest przechowywanie koktajlu przeciwciał przez dłuższy czas, można go poddać liofilizacji.
  7. Barwienie przeciwciałami
    1. Ostrożnie wyjmij bufor blokujący ze slajdów, przechylając każdy slajd na bok i delikatnie stukając krawędziami o wycieraczkę zadaniową.
    2. Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej i dodać do tkanki 100-200 μl głównej mieszanki przeciwciał (unikać kontaktu z tkanką i tworzenia się pęcherzyków powietrza).
    3. Dodaj szkiełka kontrolne dodatnie i ujemne do partii barwienia.
    4. Inkubować szkiełka w temperaturze 4 °C przez noc (14-16 godzin).
  8. Przygotowanie odczynnika (dzień 2)
    1. Rozcieńczyć 100 ml 10x PBS o niskiej zawartości baru, pH 7,4, w 900 ml diH2O, aby uzyskać 1x PBS.
    2. Przygotować 350 ml roboczego roztworu podstawowego 2% aldehydu glutarowego w PBS o niskiej zawartości baru (340 ml PBS o niskiej zawartości baru + 10 ml 70% aldehydu glutarowego).
      UWAGA: Rozcieńczanie należy przeprowadzić pod maską. Aldehyd glutarowy jest bardzo lepką cieczą. Użyj pipety o pojemności 1 ml i za każdym razem dodawaj 1 ml PBS o niskiej zawartości baru do probówki z aldehydem glutarowym, aż stanie się wystarczająco płynny, aby wylać go z probówki.
    3. Rozcieńczyć 10x Tris, pH 8,5, w 900 ml diH20, aby uzyskać 1x Tris.
  9. Utrwalenie i odwodnienie
    1. Usunąć główną mieszankę przeciwciał z każdego szkiełka, przechylając szkiełko na bok i delikatnie stukając krawędzią o wycieraczkę zadaniową.
    2. Umyć szkiełka z lekkim lub umiarkowanym mieszaniem w następujących: 1x TBS-T, 3x razy po 5 min każdy (bez metalu); przefiltrowany 2% aldehydu glutarowego przez 5 min; przefiltrowany 1x tris, pH 8,5, 3x przez 30 s; przefiltrowany diH2O 2x przez 30 s; 70% alkoholu przez 30 s (bez metalu); 80% alkoholu przez 30 s (bez metalu); 95% alkoholu przez 30 s (bez metalu); i 100% alkoholu przez 30 s (bez metalu).
    3. Delikatnie postukaj krawędzią każdego szkiełka o wycieraczkę zadaniową, aby usunąć nadmiar alkoholu i pozwolić resztkowemu alkoholowi odparować w temperaturze pokojowej (~5-10 min).
    4. Suche szkiełka w eksykatorze przez co najmniej 1 godzinę przed uzyskaniem obrazu lub przechowywać je w komorze próżniowej do długotrwałego przechowywania.

5. Akwizycja obrazu

  1. Ustawienia suwaków
    UWAGA: Przed skanowaniem za pomocą urządzenia należy zdefiniować i skonfigurować slajdy za pomocą internetowej aplikacji do zarządzania obrazami, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    1. Na stronie slajdu w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami kliknij pozycję Dostęp do nowego slajdu i wprowadź żądane szczegóły (nazwę, identyfikację slajdu, lokalizację i opis).
    2. Utwórz sekcje skanowania, klikając przycisk Dodaj sekcję. Wypełnij informacje dla każdej sekcji (nazwa projektu, nazwa slajdu, blok i pozycja). Aby zapisać nowo utworzone slajdy/sekcje, kliknij przycisk Prześlij.
    3. Na karcie zasobów otwórz stronę paneli i wybierz panel, który ma być używany. W przypadku nowych paneli kliknij przycisk Utwórz nowy panel.
    4. Po wybraniu panelu kliknij Sekcje. Dodaj sekcje utworzone w kroku 2. , klikając przycisk Edytuj przypisanie sekcji. Zapisz, klikając przycisk Prześlij.
  2. Konfiguracja instrumentu
    UWAGA: Ten przyrząd (patrz Tabela materiałów) jest obsługiwany za pomocą specjalnego oprogramowania sterującego (patrz Tabela materiałów).
    1. Zaloguj się do oprogramowania sterującego. Kliknij Obudź się, jeśli instrument jest w trybie uśpienia.
      UWAGA: Co najmniej 1 godzinę przed operacją zaleca się rozgrzanie przyrządu, co pomaga w stabilizacji ostrości wiązki.
    2. Aby załadować slajd, kliknij pozycję Exchange Sample, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj, aby otworzyć drzwi. Umieść szkiełko w szczelinie załadunkowej próbką skierowaną do góry i etykietą po prawej stronie. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby zamknąć drzwi.
      UWAGA: Jeśli slajd nie zostanie załadowany poprawnie, pojawi się dźwięk ostrzegawczy i powiadomienie o konieczności dostosowania suwaka.
    3. Wybierz projekt, a następnie wybierz nazwę slajdu dla załadowanego przykładu.
    4. Wizualizuj obraz panoramiczny na panelu obrazu optycznego slajdu.
  3. Wybór i akwizycja pola widzenia (FOV)
    1. Kliknij menu Tryb i wybierz SED (Wtórny detektor elektronów). Kliknij menu trybu obrazowania i wybierz QC −300 μm.
    2. Kliknij Jog Stage, aby kontrolować lokalizację FOV, a następnie kliknij strzałki, aby nawigować i wybrać pozycję FOV.
    3. Kliknij Dodaj pole widzenia, ustaw 400 μm x 400 μm jako rozmiar pola i wybierz dokładny jako tryb obrazowania i 1 ms czasu zatrzymania. Kliknij przycisk Confirm.
      UWAGA: Ustawiony czas zatrzymania będzie zależał od żądanej rozdzielczości. Czas przebywania wydłuża się wraz ze wzrostem rozdzielczości. Czas akwizycji może się różnić w zależności od wielu czynników, w tym okresu docierania detektora i długości działania. Nasz średni czas akwizycji dla jednego FOV wynosi około 17 minut. Korzystaj z urządzenia non-stop przez maksymalnie 8 godzin, co pozwala na skanowanie około 28 pól widzenia. Jakość pozyskanych obrazów pogarsza się po wielu kolejnych godzinach użytkowania.
    4. Po utworzeniu listy FOV przejdź do ustawiania ostrości obrazu i dostosuj stygmatyzację, przesuwając wiązkę do obszaru tkanki, który nie będzie obrazowany. Dostosuj parametry, aż uzyskasz wyraźny obraz centralny.
      UWAGA: Aby zoptymalizować akwizycję obrazu, idealnym rozwiązaniem jest utrzymywanie sekcji tkanki wyśrodkowanej na szkiełku. Podczas ustawiania ostrości można uzyskać wyraźny obraz tylko centralnego obszaru. Jeśli przekrój tkanki jest zbyt duży, krawędzie będą nieostre, a obraz będzie rozmyty.
    5. Kliknij Rozpocznij bieg. Pozyskane obrazy zostaną automatycznie przesłane i zapisane w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami.

6. Przygotowanie obrazu

  1. Korekcja izobaryczna obrazu
    UWAGA: Celem korekcji izobarycznej jest usunięcie sygnału rozlewania się między kanałami wynikającego z obecności izotopów o równej lub bardzo podobnej masie, których różnice w masie nie mogą być wykryte za pomocą analizatora masy.
    1. W internetowej aplikacji do zarządzania obrazami kliknij zieloną ikonę Pobierz, aby zapisać obrazy FOV (TIFF).
    2. Pobierz najnowszą wersję oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Spis materiałów) dostępną w zakładce informacje w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami i zapisz ją w pliku. Otwórz plik archiwum .zip i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji. Otwórz oprogramowanie po zakończeniu instalacji.
    3. Wybierz folder zawierający obrazy do poprawienia, klikając ikonę Plik w panelu wprowadzania oprogramowania do przetwarzania obrazu. Zostanie załadowana lista FOV.
    4. Kliknij ikonę Filtruj w okienku wprowadzania, aby zastosować domyślne poprawki. Dla każdego kanału wizualizuj obrazy uzyskane przed i po korekcji po prawej stronie ekranu.
    5. Kliknij ikonę dyskietki w okienku wyjściowym, aby zapisać poprawiony obraz.
  2. Filtrowanie obrazów: Teselacja Woronoju
    UWAGA: Diagramy teselacji Woronoja ilustrują podział przestrzeni zawierający punkty zarodkowe w komórkach Woronoja. Celem jest oszacowanie gęstości komórek i zdefiniowanie granic komórek. Korzystając z obliczeń teselacji Woronoja, generowana jest maska, która jest stosowana do oryginalnego obrazu w celu filtrowania.
    1. Kliknij zakładkę Filtrowanie i wybierz Voronoi Tesselation z menu parametrów filtrowania.
    2. W okienku wprowadzania wybierz obraz MassCorrected.tiff. Kliknij ikonę Filtr w okienku wprowadzania.
    3. Kliknij ikonę dyskietki w okienku wyjściowym, aby zapisać przefiltrowany obraz. Dwa pliki wynikowe będą miały sufiksy -Filtered.tiff i -Filtered.json.
      UWAGA: Obraz o nazwie MassCorrected-Filtered.tiff można następnie przesłać do oprogramowania do analizy cyfrowej innej firmy lub oprogramowania typu open source.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odcinki tkanki TMA z gruczolakorakiem migdałków i płuc (o grubości 5 mm) zostały uzyskane i umieszczone na środku pokrytych złotem szkiełek zgodnie ze specyfikacjami dotyczącymi rozmiaru tkanki i bezpiecznych marginesów szkiełek. Wolne marginesy szkła wynoszące 5 mm i 10 mm między krawędzią tkanki a bocznymi i dolnymi krawędziami szkiełek są niezbędne do optymalnego barwienia. Skrawki tkanki zostały wypieczone przez noc w piecu przed barwieniem, aby zapewnić prawidłowe przyleganie skrawka do szkiełka. Panel przeciwciał s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleksowe wyjaśnienie złożonych, zawiłych interakcji między wieloma składnikami TME pozostaje kluczowym celem badań nad rakiem. W ramach tych wysiłków producenci wprowadzili wiele testów multipleksowych, zwłaszcza w ciągu ostatnich 5 lat. Multipleksowa analiza przestrzenna to wszechstronne i potężne narzędzie, które ułatwia jednoczesną kategoryzację kilku celów przy jednoczesnym zachowaniu morfologii strukturalnej w próbkach guza. Techniki analizy przestrzennej można przeprowadzić przy użyciu obrazowania fluorescencyjn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Donowi Norwoodowi z Editing Services, Research Medical Library w MD Anderson za edycję tego artykułu oraz Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory w Department of Translational Molecular Pathology w MD Anderson. Publikacja ta jest częściowo wynikiem badań ułatwionych przez naukowe i finansowe wsparcie dla Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) udzielone za pośrednictwem National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) dla The University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Monitoring and Analysis Center (CIMAC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% odczynnik AlkoholSigma-AldrichR8382
95% Odczynnik AlkoholSigma-AldrichR3404
80% Odczynnik AlkoholSigma-AldrichR3279
70% Odczynnik AlkoholSigma-AldrichR315
20X TBS-TIonpath567005
10X Nisko-Barowa ścieżka jonowa PBS pH 7,4
10X Tris pH 8,5 Ścieżka jonowa567003
4° C LodówkaThermoScientificREVCO
Końcówki do pipet z barierą aerozolową P10Olympus24-401
Końcówki do pipet z barierą aerozolową P20Olympus24-404
Końcówki do pipet z barierą aerozolową P200Olympus24-412
Końcówki do pipet z barierą aerozolową P1000Olympus24-430
Filtr odśrodkowy Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
Dejonizowanaścieżka jonowa567002
Serum osłaSigma-AldrichD9663
Słoik do barwienia szkiełek EasyDip, zielonamikroskopia elektronowa Sciences71385-G
Słoik do barwienia szkiełek EasyDip, ŻółtaMikroskopia Elektronowa Sciences71385-Y
EasyDip Zestaw do barwienia szkiełek (słoik + stojak), białamikroskopia elektronowa Sciences71388-01
Uchwyt ze stali nierdzewnej EasyDipMikroskopia elektronowa Sciences71388-50
Aldehyd glutarowy 70% EM Mikroskopiaelektronowa Sciences16360
Bufor do odzyskiwania epitopów indukowanych ciepłem (HIER): 10X Tris z EDTA, pH 9DakoS2367
Szkiełko żaroodporne komoraMikroskopia elektronowa Nauki62705-01
Hydrofobowy długopis barierowyFisher50-550-221
Oprogramowanie MIBI/OIonpathNA
Oprogramowanie MIBIcontrolIonpathNA
MIBIscopeIonpathNA
MikrowirówkaEppendorf5415D
MicrotomeLeicaRM2135
Komora wilgotnościowa (komora wilgotna)SimportM922-1
Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)Fisher ScientificBP2944100
Moduł PTTermo ScientificA80400012
sterylne jednorazowe jednostki filtrujące o szybkim przepływieFisher Scientific097403A
m )MillQUFC30VV00
Piekarnik przesuwnyFisher Scientific6901
Eksykator próżniowyVWR30621-076
Wóz zadaniowyKimberly Clark34155
KsylenSigma-Aldrich534056-4L
567004 H2O MIBIslide Ionpath 567001 Shaker BioRocker S2025 Kolumna wirująca (filtr wirowy Ultrafree-MC, 0,5 ml 0,1 i mu;

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).
  3. Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
  4. Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
  5. Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
  6. Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).
  7. Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).
  8. Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
  9. Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
  10. Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
  11. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).
  12. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  13. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  14. Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
  15. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
  16. Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor MicroenvironmentMass Spectrometry ImagingFormalin Fixed TissueParaffin Embedded TissueMultiplex ImagingMetal Labeled AntibodiesAntibody Panel OptimizationTissue CompartmentalizationCell SegmentationDigital Image Analysis

Related Articles