Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Znaczenie licznych typów komórek otaczających klonalne populacje nowotworów jest kluczowym elementem w kategoryzacji rakotwórczości. Zainteresowanie wyjaśnieniem składu i interakcji mikrośrodowiska nowotworu (TME) stale rosło po ustanowieniu terapii immunologicznej jako części arsenału leczenia raka. W związku z tym strategie leczenia przesunęły się z podejścia skoncentrowanego na nowotworze na podejście skoncentrowane na TME¹.

Wysiłki mające na celu wyjaśnienie roli komórek odpornościowych w nadzorze nad nowotworami i ich rozwoju znacznie wzrosły w ostatnich latach^2,3. W badaniach medycznych pojawiło się mnóstwo metod, w tym metody oparte na cytometrii oraz technologie obrazowania singleplex i multiplex, w ramach tej próby rozszyfrowania unikalnych interakcji wielu elementów TME.

Pionierskie metody, takie jak cytometria przepływowa (wynaleziona w latach 60.), sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i cytometria masowa, koncentrują się głównie na identyfikacji i ilościowym określaniu składników TME⁴. Mimo że techniki ilościowe oparte na cytometrii pozwalają na fenotypowanie krajobrazu immunologicznego, określenie przestrzennego rozmieszczenia komórek jest niemożliwe. I odwrotnie, metody takie jak standardowa immunohistochemia pojedynczego pleksu zachowują architekturę tkankową i umożliwiają badaczom analizę dystrybucji komórkowej, chociaż zmniejszona liczba celów w pojedynczym odcinku tkanki jest ograniczeniem tych metod^5,6. W ciągu ostatnich kilku lat technologie obrazowania multipleksowego do rozdzielczości pojedynczej komórki, takie jak immunofluorescencja multipleksowa, obrazowanie fluorescencyjne z kodowaniem kreskowym i obrazowa spektrometria mas, pojawiły się jako kompleksowe strategie pozyskiwania informacji na temat jednoczesnego barwienia markerów przy użyciu tego samego przekroju tkanki7.

Tutaj prezentujemy technologię, która łączy przeciwciała oznaczone metalem i spektrometrię mas jonów wtórnych oraz umożliwia kwantyfikację rozdzielczości pojedynczej komórki, koekspresję markerów (fenotypowanie) i analizę przestrzenną przy użyciu próbek tkanek utrwalonych w formalinie, parafinie (FFPE) i świeżo mrożonych (FF)^8,9. Próbki FFPE są najczęściej używanymi materiałami do archiwizacji próbek tkanek i stanowią łatwiej dostępne zasoby dla technologii obrazowania multipleksowego niż świeże próbki mrożone¹⁰. Dodatkowo technologia ta oferuje możliwość ponownego pozyskania obrazów kilka miesięcy później. W tym artykule omawiamy nasze protokoły barwienia i przetwarzania obrazu przy użyciu próbek tkanek FFPE.

Próbki tkanek zostały pobrane do celów badawczych zgodnie z Institutional Review Board of The University of Texas MD Anderson Cancer Center, a próbki zostały dodatkowo pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.

1. Wybór przeciwciał

1. Zdefiniuj pytania badawcze, aby wybrać najlepsze dostępne klony przeciwciał. Korzystaj z Atlasu Białek Ludzkich, opublikowanych badań i stron internetowych producentów przeciwciał jako zasobów badawczych.
   UWAGA: Wybór odpowiednich kontroli tkanek ludzkich i tych samych kontroli tkanek ludzkich do barwienia na różnych etapach ma kluczowe znaczenie dla upewnienia się, że markery są barwione prawidłowo, we właściwym miejscu i we właściwym przedziale komórkowym. Do walidacji barwienia zawsze zaleca się małą mikromacierz tkankową (TMA), w tym tkanki normalne i tkanki nowotworowe.
2. Do zaprojektowania panelu należy używać wyłącznie przeciwciał wolnych od nośnika.
   UWAGA: Stosowanie preparatów przeciwciał wolnych od nośnika jest wymagane, jeśli komercyjne przeciwciało wolne od nosiciela nie jest dostępne; Zestawy oczyszczające mogą być używane do dostosowania przeciwciała do właściwej formuły. Wiadomo, że dodatki białkowe, takie jak albumina surowicy bydlęcej, zmniejszają zdolność koniugacji.
3. Przetestuj i miareczkuj każde przeciwciało przy użyciu standardowej immunohistochemii chromogennej w celu określenia subkomórkowego wzorca ekspresji markera; barwienia błonowego, cytoplazmatycznego lub jądrowego; oraz ekspresji w określonych komórkach w tkankach kontrolnych.
   UWAGA: Jednak każde przeciwciało musi być przetestowane w pH 6 cytrynianu i pH 9 kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i należy określić, czy panel będzie barwiony cytrynianem pH 6 czy pH 9 EDTA. Stosowanie pH 9 EDTA jest zalecane w celu uzyskania dobrych sygnałów, zwłaszcza podczas pracy z tą metodologią.
4. Wybierz optymalne stężenie barwienia zgodnie ze wzorcem ekspresji w kontrolach pozytywnych.
5. Przypisz każde przeciwciało do jednego z dostępnych izotopów metali zgodnie z obfitością markerów immunohistochemicznych, lokalizacją subkomórkową i koekspresją komórkową z innymi celami.
6. Wybarwić przeciwciało odpowiednim przypisanym metalem i porównać z wyrazem w tej samej tkance kontrolnej, która została użyta poprzednio.
   UWAGA: Koniugacja przeciwciał z metalem rozpoczyna się od przygotowania, redukcji i późniejszej koniugacji przeciwciał (plik uzupełniający 1). Każda rurka polimerowa obciążona metalem wystarcza do znakowania 100 μg przeciwciała.

2. Projekt panelu przeciwciał

1. Twórz małe partie barwienia przeciwciałami. Przetestuj do pięciu markerów w koktajlu.
   UWAGA: Testowanie przeciwciał już sprzężonych i analizowanych za pomocą immunohistochemii w partiach ułatwia wczesną identyfikację interferencji kanałów i daje możliwość rekoniugacji przeciwciał z innym metalem. Daje to również możliwość oceny odpowiedniej koekspresji markerów.
2. Zabarwić każdą małą partię czterema różnymi stężeniami przeciwciał (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml i 4,0 μg/ml).
   UWAGA: Porównując różne miana, zidentyfikuj stężenie przeciwciał, które skutkuje prawidłową lokalizacją i najwyższą ekspresją przy minimalnym barwieniu tła (najlepszy stosunek sygnału do szumu).

3. Sekcja tkanek FFPE

1. Wybierz szkiełka pokryte złotem (przeznaczone do tego celu) i trzymaj je blisko mikrotomu. Przygotuj mikrotom, wkładając nowe ostrze do uchwytu. Ustaw grubość przekroju na 4-5 μm.
2. Połóż bloki FFPE na lodzie przed cięciem. Przygotować kąpiel flotacyjną tkankową, podgrzewając wodę destylowaną lub wodę dejonizowaną (diH₂O) do temperatury 40-45 °C.
   UWAGA: Stosowanie diH₂O lub wody destylowanej zmniejsza możliwość zanieczyszczenia.
3. Rozpocznij dzielenie na sekcje. Umieść fragment tkanki w wodzie za pomocą pęsety i pozwól mu się spłaszczyć. Użyj szkiełek, aby usunąć skrawki tkanek z wody.
4. Umieść szkiełka w stojaku na szkiełka i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.

4. Barwienie przeciwciał FFPE

UWAGA: Proces barwienia odbywa się w dwóch oddzielnych dniach.

UWAGA: Rozwiązania zastosowane w tym protokole są potencjalnie i stanowią zagrożenie dla skóry i oczu. Noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego oraz sprzętu ochronnego na oczy i twarz jest zalecane i stanowi część polityki bezpieczeństwa biologicznego naszej instytucji.

1. Przygotowanie odczynnika (dzień 1)
   1. Rozcieńczyć 50 ml 20x soli fizjologicznej buforowanej Tris za pomocą Tween (TBS-T) w 950 ml diH₂O, aby uzyskać 1 l TBS-T.
   2. Rozcieńczyć 8 ml 10x kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 72 ml diH₂O, aby uzyskać 1x roztwór do odzyskiwania epitopów indukowany ciepłem (HIER).
   3. Rozcieńczyć surowicę osła w 1x TBS-T do końcowego stężenia 5%, aby uzyskać bufor blokujący. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
2. Przygotowanie HIER: Moduł obróbki wstępnej (PT)
   UWAGA: Nosić rękawice chroniące przed chemikaliami podczas pracy z odczynnikami lub częściami zanurzonymi w odczynnikach używanych w module PT.
   1. Rozcieńczyć 140 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w 1,260 ml diH₂O, aby uzyskać 1,4 l 1x PBS. Alternatywnie, rozcieńczyć siedem tabletek PBS w 1,4 l diH₂O.
   2. Napełnij zbiornik 1,4 l PBS i umieść w zbiorniku przygotowany pojemnik z komorą szkiełkową ze 100 ml roztworu 1x HIER.
   3. Podgrzej zbiornik w module PT do 75 °C.
3. Usuwanie nadmiaru parafiny
   1. Piec szkiełka w temperaturze 70 °C w piekarniku przez co najmniej 20 minut.
      UWAGA: Niektóre chusteczki lub sekcje mogą wymagać dłuższego czasu pieczenia. Zalecany czas pieczenia tkanki mózgowej lub TMA to 1 godzina. Może to zostać przedłużone do 16 godzin (w nocy) lub w zależności od doświadczenia laboratoryjnego.
   2. Umieść upieczone szkiełka w uchwycie na szkiełka i wykonaj następujące czynności mycia na wytrząsarce pod wyciągiem. Umyj szkiełka w następującym roztworze: Ksylen 2x przez 30 s (bez metalu), 100% alkohol 2x przez 30 s (bez metalu), 95% alkohol 2x przez 30 s (bez metalu), 80% alkohol przez 30 s (bez metalu), 70% alkohol przez 30 s (bez metalu) i diH₂O 2x przez 30 s (bez metalu).
   3. Szkiełka należy przechowywać w świeżym pojemniku diH₂O do czasu, gdy będą gotowe do pobrania antygenu.
      UWAGA: Szkiełek nie należy suszyć do końca zabiegu.
4. Pobieranie antygenu
   1. Umieść szkiełka w nagrzanej komorze szkiełkowej zawierającej 1x bufor HIER wewnątrz modułu PT. Umieść pokrywę na zbiorniku. Zamknij i zatrzaśnij pokrywę.
   2. Naciśnij przycisk Menu na module PT, aby otworzyć menu główne i naciśnij przycisk Cykl konfiguracji (czas i temperatura), aby utworzyć program niestandardowy.
   3. Uruchom moduł PT w temperaturze 97 °C na 40 minut, a następnie moduł PT automatycznie ostygnie do 65 °C.
   4. Wyjmij prowadnice z modułu PT po osiągnięciu temperatury 65 °C. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      UWAGA: Moduł PT nie otworzy się, dopóki temperatura nie spadnie do 65 °C. Podczas tego procesu nie dotykaj złotej powierzchni szkiełek i zawsze używaj rękawiczek.
5. Blokowanie przeciwciał
   1. Ustaw wytrząsarkę na 70 obr./min.
   2. Umyj szkiełka, zanurzając je w 1x TBS-T na 5 min 2x.
   3. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj obwódkę wokół odcinka tkanki w odległości co najmniej 1 mm od krawędzi szkiełka i pozostaw do wyschnięcia na 15-30 s.
      UWAGA: Należy uważać, aby płyn w pisaku nie dotykał części tkanki, aby uniknąć ingerencji tkanek w barwienie. Nie należy zbyt mocno dociskać wstrzykiwacza podczas rysowania bariery, aby uniknąć potencjalnych wycieków. W celu uzyskania optymalnych wyników barwienia i akwizycji obrazu, skrawki tkanek umieszcza się pośrodku pokrytych złotem szkiełek w ramie nie większej niż 15 mm x 30 mm, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na narysowanie bariery bez dotykania tkanki lub punktów prowadzących umieszczonych na zewnętrznej krawędzi szkiełka.
   4. Aby usunąć wszelkie pozostałości pióra, zanurz szkiełka w TBS-T.
   5. W komorze wilgotnościowej o temperaturze pokojowej inkubować wycinek tkanki ze 100-200 μl buforu blokującego przez 20 minut. Pozostawić tkankę inkubowaną w buforze blokującym, aż będzie gotowa mieszanka główna przeciwciał.
6. Przygotowanie panelu przeciwciał
   UWAGA: Ostateczna objętość koktajlu panelu przeciwciał różni się w zależności od szacowanej powierzchni przekroju tkanki. Aby pokryć powierzchnię 20 mm x 20 mm, przygotuj 100-200 μl koktajlu.
   Wykonaj następujące czynności, aby przygotować koktajl panelowy przeciwciał z przeciwciałami sprzężonymi z izotopami metali:
   1. Potwierdzić końcową objętość koktajlu, która jest równa objętości koktajlu przeciwciał dodanych do objętości buforu blokującego.
   2. Potwierdź specyfikacje dla wszystkich przeciwciał, rozcieńczeń i/lub stężeń przeciwciał w arkuszu kalkulacyjnym panelu dla projektu.
   3. Odkręć wszystkie probówki zawierające przeciwciała w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut. Dodaj pojedyncze przeciwciała do buforu blokującego i bardzo dobrze wymieszaj. Nie należy naruszać dna probówki z przeciwciałami podczas pipetowania.
   4. Przefiltrować panel przeciwciał poprzez wstępne zwilżenie filtra odśrodkowego o wielkości 0,1 μm ze 100 μl buforu blokującego. Obracać filtr przy 10 000 x g przez 2 minuty i usunąć blokujący przepływ buforu za pomocą pipety.
   5. Przenieś panel przeciwciał do kolumny wirującej i obracaj filtr w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty. Wyrzuć kolumnę wirową i użyj przepływu jako przefiltrowanego panelu przeciwciał.
      UWAGA: Barwienie należy wykonać natychmiast po przygotowaniu koktajlu, aby zapobiec wymianie metalu. Jeśli konieczne jest przechowywanie koktajlu przeciwciał przez dłuższy czas, można go poddać liofilizacji.
7. Barwienie przeciwciałami
   1. Ostrożnie wyjmij bufor blokujący ze slajdów, przechylając każdy slajd na bok i delikatnie stukając krawędziami o wycieraczkę zadaniową.
   2. Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej i dodać do tkanki 100-200 μl głównej mieszanki przeciwciał (unikać kontaktu z tkanką i tworzenia się pęcherzyków powietrza).
   3. Dodaj szkiełka kontrolne dodatnie i ujemne do partii barwienia.
   4. Inkubować szkiełka w temperaturze 4 °C przez noc (14-16 godzin).
8. Przygotowanie odczynnika (dzień 2)
   1. Rozcieńczyć 100 ml 10x PBS o niskiej zawartości baru, pH 7,4, w 900 ml diH₂O, aby uzyskać 1x PBS.
   2. Przygotować 350 ml roboczego roztworu podstawowego 2% aldehydu glutarowego w PBS o niskiej zawartości baru (340 ml PBS o niskiej zawartości baru + 10 ml 70% aldehydu glutarowego).
      UWAGA: Rozcieńczanie należy przeprowadzić pod maską. Aldehyd glutarowy jest bardzo lepką cieczą. Użyj pipety o pojemności 1 ml i za każdym razem dodawaj 1 ml PBS o niskiej zawartości baru do probówki z aldehydem glutarowym, aż stanie się wystarczająco płynny, aby wylać go z probówki.
   3. Rozcieńczyć 10x Tris, pH 8,5, w 900 ml diH₂0, aby uzyskać 1x Tris.
9. Utrwalenie i odwodnienie
   1. Usunąć główną mieszankę przeciwciał z każdego szkiełka, przechylając szkiełko na bok i delikatnie stukając krawędzią o wycieraczkę zadaniową.
   2. Umyć szkiełka z lekkim lub umiarkowanym mieszaniem w następujących: 1x TBS-T, 3x razy po 5 min każdy (bez metalu); przefiltrowany 2% aldehydu glutarowego przez 5 min; przefiltrowany 1x tris, pH 8,5, 3x przez 30 s; przefiltrowany diH₂O 2x przez 30 s; 70% alkoholu przez 30 s (bez metalu); 80% alkoholu przez 30 s (bez metalu); 95% alkoholu przez 30 s (bez metalu); i 100% alkoholu przez 30 s (bez metalu).
   3. Delikatnie postukaj krawędzią każdego szkiełka o wycieraczkę zadaniową, aby usunąć nadmiar alkoholu i pozwolić resztkowemu alkoholowi odparować w temperaturze pokojowej (~5-10 min).
   4. Suche szkiełka w eksykatorze przez co najmniej 1 godzinę przed uzyskaniem obrazu lub przechowywać je w komorze próżniowej do długotrwałego przechowywania.

5. Akwizycja obrazu

1. Ustawienia suwaków
   UWAGA: Przed skanowaniem za pomocą urządzenia należy zdefiniować i skonfigurować slajdy za pomocą internetowej aplikacji do zarządzania obrazami, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
   1. Na stronie slajdu w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami kliknij pozycję Dostęp do nowego slajdu i wprowadź żądane szczegóły (nazwę, identyfikację slajdu, lokalizację i opis).
   2. Utwórz sekcje skanowania, klikając przycisk Dodaj sekcję. Wypełnij informacje dla każdej sekcji (nazwa projektu, nazwa slajdu, blok i pozycja). Aby zapisać nowo utworzone slajdy/sekcje, kliknij przycisk Prześlij.
   3. Na karcie zasobów otwórz stronę paneli i wybierz panel, który ma być używany. W przypadku nowych paneli kliknij przycisk Utwórz nowy panel.
   4. Po wybraniu panelu kliknij Sekcje. Dodaj sekcje utworzone w kroku 2. , klikając przycisk Edytuj przypisanie sekcji. Zapisz, klikając przycisk Prześlij.
2. Konfiguracja instrumentu
   UWAGA: Ten przyrząd (patrz Tabela materiałów) jest obsługiwany za pomocą specjalnego oprogramowania sterującego (patrz Tabela materiałów).
   1. Zaloguj się do oprogramowania sterującego. Kliknij Obudź się, jeśli instrument jest w trybie uśpienia.
      UWAGA: Co najmniej 1 godzinę przed operacją zaleca się rozgrzanie przyrządu, co pomaga w stabilizacji ostrości wiązki.
   2. Aby załadować slajd, kliknij pozycję Exchange Sample, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj, aby otworzyć drzwi. Umieść szkiełko w szczelinie załadunkowej próbką skierowaną do góry i etykietą po prawej stronie. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby zamknąć drzwi.
      UWAGA: Jeśli slajd nie zostanie załadowany poprawnie, pojawi się dźwięk ostrzegawczy i powiadomienie o konieczności dostosowania suwaka.
   3. Wybierz projekt, a następnie wybierz nazwę slajdu dla załadowanego przykładu.
   4. Wizualizuj obraz panoramiczny na panelu obrazu optycznego slajdu.
3. Wybór i akwizycja pola widzenia (FOV)
   1. Kliknij menu Tryb i wybierz SED (Wtórny detektor elektronów). Kliknij menu trybu obrazowania i wybierz QC −300 μm.
   2. Kliknij Jog Stage, aby kontrolować lokalizację FOV, a następnie kliknij strzałki, aby nawigować i wybrać pozycję FOV.
   3. Kliknij Dodaj pole widzenia, ustaw 400 μm x 400 μm jako rozmiar pola i wybierz dokładny jako tryb obrazowania i 1 ms czasu zatrzymania. Kliknij przycisk Confirm.
      UWAGA: Ustawiony czas zatrzymania będzie zależał od żądanej rozdzielczości. Czas przebywania wydłuża się wraz ze wzrostem rozdzielczości. Czas akwizycji może się różnić w zależności od wielu czynników, w tym okresu docierania detektora i długości działania. Nasz średni czas akwizycji dla jednego FOV wynosi około 17 minut. Korzystaj z urządzenia non-stop przez maksymalnie 8 godzin, co pozwala na skanowanie około 28 pól widzenia. Jakość pozyskanych obrazów pogarsza się po wielu kolejnych godzinach użytkowania.
   4. Po utworzeniu listy FOV przejdź do ustawiania ostrości obrazu i dostosuj stygmatyzację, przesuwając wiązkę do obszaru tkanki, który nie będzie obrazowany. Dostosuj parametry, aż uzyskasz wyraźny obraz centralny.
      UWAGA: Aby zoptymalizować akwizycję obrazu, idealnym rozwiązaniem jest utrzymywanie sekcji tkanki wyśrodkowanej na szkiełku. Podczas ustawiania ostrości można uzyskać wyraźny obraz tylko centralnego obszaru. Jeśli przekrój tkanki jest zbyt duży, krawędzie będą nieostre, a obraz będzie rozmyty.
   5. Kliknij Rozpocznij bieg. Pozyskane obrazy zostaną automatycznie przesłane i zapisane w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami.

6. Przygotowanie obrazu

1. Korekcja izobaryczna obrazu
   UWAGA: Celem korekcji izobarycznej jest usunięcie sygnału rozlewania się między kanałami wynikającego z obecności izotopów o równej lub bardzo podobnej masie, których różnice w masie nie mogą być wykryte za pomocą analizatora masy.
   1. W internetowej aplikacji do zarządzania obrazami kliknij zieloną ikonę Pobierz, aby zapisać obrazy FOV (TIFF).
   2. Pobierz najnowszą wersję oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Spis materiałów) dostępną w zakładce informacje w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami i zapisz ją w pliku. Otwórz plik archiwum .zip i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji. Otwórz oprogramowanie po zakończeniu instalacji.
   3. Wybierz folder zawierający obrazy do poprawienia, klikając ikonę Plik w panelu wprowadzania oprogramowania do przetwarzania obrazu. Zostanie załadowana lista FOV.
   4. Kliknij ikonę Filtruj w okienku wprowadzania, aby zastosować domyślne poprawki. Dla każdego kanału wizualizuj obrazy uzyskane przed i po korekcji po prawej stronie ekranu.
   5. Kliknij ikonę dyskietki w okienku wyjściowym, aby zapisać poprawiony obraz.
2. Filtrowanie obrazów: Teselacja Woronoju
   UWAGA: Diagramy teselacji Woronoja ilustrują podział przestrzeni zawierający punkty zarodkowe w komórkach Woronoja. Celem jest oszacowanie gęstości komórek i zdefiniowanie granic komórek. Korzystając z obliczeń teselacji Woronoja, generowana jest maska, która jest stosowana do oryginalnego obrazu w celu filtrowania.
   1. Kliknij zakładkę Filtrowanie i wybierz Voronoi Tesselation z menu parametrów filtrowania.
   2. W okienku wprowadzania wybierz obraz MassCorrected.tiff. Kliknij ikonę Filtr w okienku wprowadzania.
   3. Kliknij ikonę dyskietki w okienku wyjściowym, aby zapisać przefiltrowany obraz. Dwa pliki wynikowe będą miały sufiksy -Filtered.tiff i -Filtered.json.
      UWAGA: Obraz o nazwie MassCorrected-Filtered.tiff można następnie przesłać do oprogramowania do analizy cyfrowej innej firmy lub oprogramowania typu open source.

Odcinki tkanki TMA z gruczolakorakiem migdałków i płuc (o grubości 5 mm) zostały uzyskane i umieszczone na środku pokrytych złotem szkiełek zgodnie ze specyfikacjami dotyczącymi rozmiaru tkanki i bezpiecznych marginesów szkiełek. Wolne marginesy szkła wynoszące 5 mm i 10 mm między krawędzią tkanki a bocznymi i dolnymi krawędziami szkiełek są niezbędne do optymalnego barwienia. Skrawki tkanki zostały wypieczone przez noc w piecu przed barwieniem, aby zapewnić prawidłowe przyleganie skrawka do szkiełka. Panel przeciwciał składał się z 23 markerów. W tej samej partii barwienia dołączono szkiełko migdałkowe i szkiełko TMA zawierające wiele tkanek w celu oceny ekspresji markerów słabo wyrażonych w próbkach gruczolakoraka płuc (Ryc. 1). Kontrole dodatnie muszą być wybierane zgodnie z celami przeciwciał stosowanych w panelach; na przykład, aby ocenić ekspresję SOX10, potrzebne są próbki czerniaka, a do oceny ekspresji GAFP potrzebne są próbki glejaka (Rysunek 2).

Rysunek 1: Czystość izotopowa i przesłuch kanałów. Macierz pokazuje procentowy przesłuch pochodzący z czystości sondy i tlenków (niebieskie pola, ≥0,5%; przezroczyste pudełka, <0,5%). W przypadku znaczników masowych wyświetlane są sondy, które przyczyniły się do co najmniej 0,5% przesłuchu do żadnego kanału (zielony), jednego lub dwóch kanałów (żółty) lub więcej niż dwóch kanałów (pomarańczowy). Pokazane są również kanały masowe odbierające co najmniej 0,5% przesłuchu z braku sond (kolor zielony), jednej lub dwóch sond (kolor żółty) lub więcej niż dwóch sond (kolor pomarańczowy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy barwienia w różnych tkankach. (A) Gruczolakorak płuc. (B) Nerka nienowotworowa. (c) Migdałek. CD20 jest pokazany na żółto, Ki67 jest pokazany na niebiesko, CD3 jest pokazany na biało, CD11c jest pokazany na zielono, CD68 jest pokazany na czerwono, cytokeratyna jest pokazana na niebiesko, a dwuniciowe DNA (dsDNA) jest pokazane na niebiesko. Powiększenie, 200x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ta procedura barwienia jest bardzo podobna do standardowego barwienia immunohistochemicznego i występowała przez dwa kolejne dni. Pięć głównych etapów protokołu barwienia to: 1) usunięcie nadmiaru parafiny, 2) odzyskanie antygenu, 3) zablokowanie przeciwciał, 4) barwienie przeciwciał oraz 5) utrwalenie i odwodnienie (Rysunek 3). Podstawowym krokiem w procedurze barwienia jest podjęcie środków ostrożności w celu uniknięcia zanieczyszczenia próbek metalami, w tym stosowanie odczynników niezawierających metalu przechowywanych w plastikowych naczyniach i ostrożne obchodzenie się z próbkami w celu ograniczenia uszkodzeń mechanicznych. Zaleca się przygotowanie koktajlu przeciwciał bezpośrednio przed barwieniem. Zmniejsza to wymianę metalu. Po zakończeniu barwienia przechowywaliśmy szkiełka i skanowaliśmy je następnego dnia. Przed pozyskaniem obrazu niezbędnym krokiem jest konfiguracja slajdu za pomocą internetowej aplikacji do zarządzania obrazami (Rysunek 4).

Rysunek 3: Proces pozyskiwania obrazów i powiązany z nim slajd. (A) Podsumowanie procesu pozyskiwania obrazów. 1) Wycinek tkanki FFPE wybarwiony przeciwciałami sprzężonymi z metalami jest rasteryzowany za pomocą pierwszorzędowego pistoletu jonowego, uwalniając jony wtórne. 2) Spektrometr masowy czasu przelotu rozdziela i mierzy jony na podstawie ich masy na poziomie pikseli. 3) Kwantyfikacja jonów wtórnych w oparciu o piksele. Oś y odpowiada liczbie wykrytych jonów (pik), a oś x odpowiada masie każdego metalu. 4) Na podstawie piku każdego widma masowego rekonstruowane są obrazy wielowymiarowe. (B) Schemat suwaka użytego w tej procedurze. Aby uzyskać optymalne barwienie tkanki, sekcja musi być umieszczona co najmniej 5 mm od bocznej krawędzi szkiełka i 10 mm od jego dolnej krawędzi. Podczas rysowania bariery hydrofobowej wokół wycinka tkanki, musi ona być utrzymywana wewnątrz prostokąta w odległości co najmniej 1 mm od krawędzi szkiełka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ustawienia slajdów w internetowej aplikacji do zarządzania obrazami. Przed skanowaniem slajdów konieczne jest skonfigurowanie każdego slajdu. Wprowadź żądane szczegóły, które mogą pomóc w identyfikacji slajdów. Kliknij Dodaj sekcję (strzałka), aby dołączyć informacje o bloku i pozycji. Aby zapisać, kliknij przycisk Prześlij (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W dniu skanowania włącz instrument akwizycyjny za pomocą oprogramowania sterującego. Kliknięcie na Zamień Suwak otwierało drzwi instrumentu, umożliwiając załadowanie slajdu. Umieściliśmy suwak na gnieździe ładunkowej przodem do góry, z etykietą po prawej stronie. Jednocześnie można zeskanować tylko jeden slajd. Kolejnym krokiem było wybranie FOV i dostosowanie ostrości i stygmatyzacji zgodnie z krokami opisanymi w protokole. Obrazy uzyskaliśmy, klikając Start Run. Czas akwizycji różni się w zależności od rozmiaru pola widzenia i pożądanej rozdzielczości. Rozmiar pola widzenia waha się od 200 μm x 200 μm do 800 μm x 800 μm, co odpowiada zakresowi rozmiarów klatki od 128 x 128 pikseli do 2048 pikseli x 2048 pikseli. Dostępne są trzy standardowe rozdzielczości: zgrubna, dokładna i bardzo dokładna. Skanowanie większych pól widzenia w bardzo wysokiej rozdzielczości jest czasochłonne, a ostateczny czas akwizycji dla jednego pola widzenia wynosi od 25 s do 4,7 h (Rysunek 5).

Rysunek 5: Akwizycja obrazu za pomocą oprogramowania sterującego. Ustawienia akwizycji można dostosować zgodnie z potrzebami. Aby zmodyfikować rozdzielczość skanowania, kliknij menu rozwijane obok opcji Tryb obrazowania (strzałka). Aby zmodyfikować rozmiar pola widzenia, wprowadź liczbę w polu Rozmiar pola widzenia (μm) (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po zakończeniu skanowania, zestaw obrazów zawierający wszystkie pola widzenia został automatycznie przesłany do internetowej aplikacji do zarządzania obrazami. Oprócz przechowywania obrazów, aplikacja ta umożliwia wizualizację wszystkich kanałów razem lub osobno, regulację obrazu i pobieranie obrazów w celu dalszego przygotowania. Standardowy obraz wizualizowany jest zapisywany jako plik TIFF (Rysunek 6).

Rysunek 6: Wizualizacja obrazu za pomocą internetowej aplikacji do zarządzania obrazami. Pozyskane obrazy są przechowywane i wizualizowane za pomocą platformy internetowej. Możliwe jest dostosowanie parametrów wizualizacji oraz zmiana koloru każdego znacznika. Kliknij Dodaj kanał obrazu (biała strzałka), aby wyświetlić inne znaczniki. Powiększenie, 200x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zakłócenia metali są nieodłącznym elementem metod znakowania metali, pomimo stosowania strategii mających na celu ich zminimalizowanie. Aby usunąć nadmiar sygnałów tła z izotopu metalu sprzężonego z przeciwciałami i przygotować obrazy do analizy, użyliśmy odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz tabela materiałów). Procedura przygotowania obrazu składa się z dwóch etapów: 1) korekcji izobarycznej, która usuwa sygnały między kanałami, oraz 2) filtrowania, która usuwa sygnały spowodowane przez zagregowania na obrazie.

Aby rozpocząć korektę izobaryczną, plik zawierający zapisany obraz TIFF został wybrany, klikając na ikonę Plik w panelu wprowadzania. Oprogramowanie automatycznie wczytuje wszystkie zarchiwizowane obrazy TIFF do pliku, umożliwiając analizę wsadową. Następnie poprawiliśmy obraz, klikając ikonę Filtr w panelu wprowadzania. Automatycznie wygenerowano dwa pliki wynikowe z sufiksem -MassCorrected: jeden zarchiwizowany w formacie TIFF, a drugi zarchiwizowany w formacie JSON. Domyślnie powstałe archiwa zostały zapisane w tym samym pliku, z którego załadowano początkowy obraz (Rysunek 7).

Rysunek 7: Przygotowanie obrazu: krok korekty. Aby załadować obraz do przygotowania w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, kliknij ikonę Plik w panelu wprowadzania (strzałka) i wybierz obraz. Aby zastosować domyślną procedurę korekcji, kliknij ikonę Filtr w okienku wprowadzania (czerwona strzałka). Aby zapisać zaktualizowany, poprawiony obraz, kliknij ikonę dyskietki w panelu wyjściowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Drugim krokiem przygotowania obrazu jest filtrowanie, które można wybrać na górnej karcie w oprogramowaniu. Wybraliśmy poprawiony obraz w okienku wprowadzania. W tym kroku jako parametr filtrujący użyto automatycznej teselacji Woronoja. Kliknięcie ikony filtra w panelu wprowadzania automatycznie zastosowało wybrany filtr do wszystkich kanałów. W obu krokach przygotowania obrazu (korekcja i filtrowanie) obrazy każdego kanału przed i po przetworzeniu oraz różnice w sygnale są wyświetlane po prawej stronie ekranu.

Podobnie jak w kroku korekty izobarycznej, zostały wygenerowane dwa nowe archiwa, jedno w formacie TIFF i jedno w formacie JSON. W tym kroku sufiks następujący po nazwie pliku to -Filtered. W związku z tym ostateczny uzyskany obraz został nazwany MassCorrected-Filtered.tiff. Wykonując te kroki, przygotowaliśmy obraz do analizy za pomocą preferowanego oprogramowania do patologii cyfrowej (Rysunek 8 i Rysunek 9). Stosując tę technikę, byliśmy w stanie przeanalizować wszystkie 23 markery w panelu przeciwciał przy minimalnych zakłóceniach między kanałami na poziomie subkomórkowym w pojedynczym wycinku tkanki.

Rysunek 8: Przygotowanie obrazu: etap filtrowania. Wybierz opcję Filtrowanie w górnej karcie (strzałka) w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. W obszarze Parametry filtrowania wybierz żądaną metodę (zielona strzałka). W okienku danych wejściowych wybierz opcję MassCorrected image. Aby zastosować wybraną procedurę do obrazu, kliknij ikonę Filtr w okienku wprowadzania (czerwona strzałka). Aby zapisać zaktualizowany przefiltrowany obraz, kliknij ikonę dyskietki w okienku wyjściowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Reprezentatywne obrazy barwienia przed i po przygotowaniu obrazu. (A) Obraz wycinka tkanki migdałka wybarwionego tą techniką i uwidocznionego za pomocą oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu innej firmy przed filtrowaniem i korekcją. (B) Obraz tej samej sekcji w tych samych warunkach po wykonaniu etapów filtrowania i korekty. CD20 jest pokazany na żółto, Ki67 jest pokazany na niebiesko, CD3 jest pokazany na biało, CD11c jest pokazany na zielono, cytokeratyna jest pokazana na niebiesko, a dwuniciowe DNA (dsDNA) jest pokazane na niebiesko. Powiększenie, 200x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Lista paneli przeciwciał. Każde przeciwciało zostało sprzężone z określonym izotopem metalu o innej masie, jak wymieniono. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.