Method Article

Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną procedurę testową dla testów resorpcyjnych z użyciem płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dojrzałe osteoklasty to wielojądrowe komórki, które mogą rozkładać kości poprzez wydzielanie kwasów i enzymów. Odgrywają one kluczową rolę w różnych chorobach (np. osteoporozie i raku kości) i dlatego są ważnymi obiektami badań. In vitro ich aktywność można analizować poprzez tworzenie się dołów resorpcyjnych. W tym protokole opisujemy prostą metodę oznaczania wgłębień przy użyciu płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia (CaP), które można łatwo zwizualizować i określić ilościowo. Prekursory osteoklastów pochodzące z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) hodowano na powlekanych płytkach w obecności bodźców osteoklastogennych. Po 9 dniach inkubacji osteoklasty utrwalono i wybarwiono do obrazowania fluorescencyjnego, podczas gdy powłokę CaP przeciwbarwiono kalceiną. Aby określić ilościowo obszar resorbcji, powłokę CaP na płytkach wybarwiono 5% AgNO3 i uwidoczniono za pomocą obrazowania w jasnym polu. Obszar dołu resorpcyjnego określono ilościowo za pomocą ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoklasty (OC) to specyficzne tkankowo makrofagi pochodzące z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), odgrywające kluczową rolę w przebudowie kości wraz z osteoblastami1. Zaburzenia kości wywołane hormonami płciowymi, immunologiczne i złośliwe, które niszczą kość ogólnoustrojowo lub miejscowo, są spowodowane nadmierną aktywnością osteoklastyczną, w tym osteoporozą związaną z menopauzą2, reumatoidalne zapalenie stawów3, choroba przyzębia4, choroba szpiczaka kostnego5 i osteolityczne przerzuty do kości6. W przeciwieństwie do tego, defekty w tworzeniu i funkcjonowaniu OC mogą również powodować osteopetrozę7. HSC ulegają różnicowaniu w komórki progenitorowe OC pod wpływem stymulacji czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF, symbol genu ACP5). W obecności zarówno M-CSF, jak i aktywatora receptora liganda NF-κB (RANKL, symbol genu TNFSF11), progenitorzy OC różnicują się dalej w jednojądrzaste OC, a następnie łączą się, tworząc wielojądrowe OCs8,9,10. Obie cytokiny M-CSF i RANKL są niezbędne i wystarczające do indukcji markerów osteoklastycznych, takich jak receptor kalcytoniny (CT), aktywator receptora czynnika jądrowego κ B (RANK), V-ATPaza pompy protonowej, podjednostka alfa kanału chlorkowego 7 (CIC-7), integryna β3, fosfataza kwasowa odporna na winian (TRAP, symbol genu ACP5), katepsyna K proteazy cysteinowej lizosomalnej (CTSK) i metallopeptydaza macierzy 9 (MMP9). Aktywowane OC tworzą strefę uszczelniającą na powierzchni kości poprzez tworzenie pierścienia aktynowego z pofałdowaną obwódką11,12. W strefie uszczelniającej OC pośredniczą w resorpcji poprzez wydzielanie protonów przez pompę protonową V-ATPase12,13, MMP914 i CTSK15, co prowadzi do powstania luk.

Do eksperymentów in vitro, progenitory OC można uzyskać poprzez ekspansję makrofagów szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej myszy16,17, a także poprzez izolację ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) z próbek krwi i buffy coats18,19,20lub różnicując unieśmiertelnione mysie komórki monocytowe RAW 264.721,22.

W niniejszym protokole opisujemy test resorpcji osteoklastycznej na płytkach do hodowli komórkowych pokrytych CaP przy użyciu OC pochodzących z pierwotnych PBMC. Zastosowana tutaj metoda hodowli komórkowych powlekanych CaP została przyjęta i udoskonalona z metody opisanej wcześniej przez Patntirapong et al.17 i Maria et al.21. Aby uzyskać prekursory OC, PBMC są izolowane przez wirowanie w gradiencie gęstości i ekspandowane zgodnie z wcześniejszym opisem20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez lokalną komisję etyki (numer zatwierdzenia 287/2020B02).

1. Przygotowanie płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia

  1. Przygotowanie roztworu podstawowego wapnia (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 M NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O w buforze Tris)
    1. Przygotować 50 mM bufor Tris i dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl.
    2. Ustawić szklaną zlewkę na mieszadle magnetycznym i dodać 100 ml 50 mM buforu Tris.
    3. Odważyć 0,368 g CaCl2·2H2O, 8,0 g NaCl i 0,305 g MgCl2·6H2O i rozpuścić kolejno w buforze Tris.
    4. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotowanie podstawowego roztworu fosforanowego (11,1 mM Na2HPO4, 42 mM NaHCO3 w buforze Tris)
    1. Ustawić szklaną zlewkę na mieszadle magnetycznym i dodać 100 ml 50 mM buforu Tris.
    2. Odważyć 0,158 g Na2HPO4 i 0,353 gNaHCO3 i rozpuścić kolejno w buforze Tris.
    3. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Wstępne zwapnienie 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych
    1. Przygotować 30 ml roztworu roboczego, mieszając 15 ml 50 ml buforu Tris, 7,5 ml roztworu podstawowego wapnia (krok 1.1.4) i 7,5 ml podstawowego roztworu fosforanu (krok 1.2.3). Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm.
    2. Przygotuj 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z płaskim dnem. Pobrać pipetą 300 μl roztworu fosforanu wapnia (krok 1.3.1.) do każdego dołka. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
  4. Przygotowanie roztworu fosforanu wapnia (2,25 mM Na2HPO4, 4 mM CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 mM zasada Tris w ddH2O)
    1. Dodać 2 ml 1 M HCl do 40 ml dejonizowanej wody w zlewce z magnetycznym kulką mieszającą i rozpuścić kolejno 0,016 g Na2HPO4, 0,0295 g CaCl2·2H2O, 0,409 g NaCl i 0,303 g zasady Tris.
    2. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl. Dodaj wodę dejonizowaną, aby wypełnić objętość do 50 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm.
  5. Zwapnienie 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych
    1. Odessać roztwór do wstępnego zwapnienia z wstępnie zwapniałych 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych i dodać 300 μl roztworu fosforanu wapnia (etap 1.4.2) do każdego dołka. Przykryć płytki pokrywką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 dzień.
    2. Odwróć płytkę, aby wylać roztwór i dokładnie umyj płytkę trzykrotnie wodą dejonizowaną. Płytkę należy natychmiast wysuszyć za pomocą suszarki do włosów lub sprężonego gazu CO2 lub N2, aby zachować jednolitą powierzchnię.
    3. Powlekaną płytkę sterylizować promieniowaniem UV w czystym stole przez 1 godzinę. Pokrytą płytkę należy natychmiast zużyć lub uszczelnić płytkę parafilmem i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Izolacja PBMC od ludzkiej krwi obwodowej

  1. Pobrać 15 ml krwi z żyły po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody dawcy krwi (głosowanie etyczne: 287/2020B02).
  2. Rozcieńczyć 15 ml świeżej krwi równą objętością PBS i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę lub wciągając i wyjmując mieszaninę z pipety.
  3. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 15 ml roztworu gradientu gęstości (np. Ficoll, tabela materiałów) na probówkę. Przechylić probówkę i ostrożnie nałożyć 30 ml rozcieńczonej próbki krwi na 15 ml roztworu gradientu gęstości (rozcieńczona próbka krwi: roztwór gradientu gęstości, stosunek 1:0,5-1).
    UWAGA: Podczas nakładania próbki należy zwrócić uwagę, aby nie mieszać roztworu gradientu gęstości z rozcieńczoną próbką krwi.
  4. Wirować przy 810 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C w wirniku z wahliwym kubełkiem bez hamulca.
  5. Odessać górną warstwę, pozostawiając jednojądrzastą warstwę komórek (limfocyty, monocyty i trombocyty) niezakłóconą na interfazie.
  6. Ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Napełnij probówkę PBS, wymieszaj i odwiruj w stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C (od tego etapu można używać hamulca).
  8. Ostrożnie całkowicie usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 50 ml PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Ostrożnie usunąć całkowicie sklarowany osad.
  9. W celu usunięcia płytek krwi zawiesić osad komórkowy w 50 ml PBS i odwirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Ostrożnie usunąć całkowicie sklarowany szwadron.
  10. Przenieś zawieszone komórki do kolb hodowli komórkowych w celu ekspansji komórek progenitorowych OC.

3. Ekspansja przodków OC

  1. Zawiesić PBMC w pełnym α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% amfoterycyna B) zawierającym 20 ng/mL M-CSF. Nasiona PBMC o gęstości 2,5 x 105 komórek/cm2. Zwykle komórki wyizolowane z 15-20 ml świeżej krwi można wysiać w jednej kolbie o długości 75cm2 (1,5-2 x 107 komórek).
  2. Karmić komórki świeżym, kompletnym α-MEM zawierającym 20 ng/mL M-CSF co trzeci dzień, aż przyłączone komórki osiągną pożądane zbieganie. Typowa wydajność to 1,5-2 x 106 komórek/kolbę, gdy komórki są w 95% zlewne. Zazwyczaj okres ekspansji trwa 6 dni.
    UWAGA: Potencjał osteoklastogenny prekursorów może zmniejszać się wraz z wydłużeniem czasu uprawy.

4. Indukcja osteoklastogenezy w płytkach pokrytych CaP

  1. Aby ułatwić adhezję komórek, należy inkubować płytki pokryte CaP z 50 μl FBS przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  2. W celu odłączenia prekursorów OC należy dwukrotnie przemyć kolbę PBS w celu usunięcia martwych lub nieprzylegających komórek. Dodać 4 ml trypsyny (tabela materiałów) na 75 cm2 kolbę, przez 30 minut.
    1. Dodać 4 ml kompletnego α-MEM, aby zatrzymać trawienie, ostrożnie odłączyć komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml.
    2. Określ całkowitą liczbę komórek za pomocą komory Neubauera lub podobnej.
  3. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 7 minut przy 350 x g. Zawiesić osad w wystarczającej ilości kompletnego α-MEM zawierającego 20 ng/mL M-CSF i 20 ng/mL RANKL, aby uzyskać stężenie 1 x10,6 komórek/ml.
  4. Odessać roztwór FBS z 96-dołkowej płytki pokrytej CaP i odpipetować 200 μl zawiesiny komórek na dołek (2 x 10 5 komórek/dołek).
  5. Inkubować prekursory OC przez pożądany okres czasu lub z użyciem pożądanych odczynników istotnych dla projektu doświadczalnego. Zazwyczaj dużą liczbę dużych i wielojądrowych OC można zaobserwować po 6 dniach i gdy tworzą się doły resorpcyjne. Karmić komórki świeżą, kompletną pożywką α-MEM zawierającą 20 ng/mL M-CSF i 20 ng/ml RANKL co trzeci dzień.
  6. Pod koniec inkubacji dwukrotnie przemyć komórki PBS, utrwalić 4% paraformaldehydem przez 10 minut i ponownie przemyć PBS.
  7. Utrwalone OC należy stosować bezpośrednio do barwienia fluorescencyjnego lub przechowywać w temperaturze 4 °C.

5. Barwienie fluorescencyjne OC i powłoka CaP

  1. Inkubować utrwalone komórki z buforem permeabilacyjnym (0,1% Tryton w PBS) przez 5 minut.
  2. Zabarwić filamenty aktynowe 100 μl roztworu falloidyny znakowanego AlexaFluor 546 w PBS przez 30 minut i odessać roztwór barwiący. Dodać 100 μl roztworu barwiącego Hoechst 33342 (10 μg/ml w PBS) przez 10 minut, aby wybarwić jądra. Można również użyć DAPI.
  3. Zabarwić powłokę CaP 100 μL 10 μM kalceiny w PBS przez 10 minut. Umyć trzykrotnie PBS i zrobić zdjęcia.
  4. Po obrazowaniu fluorescencyjnym te same płytki można wykorzystać do ilościowego określenia powierzchni wgłębienia resorpcyjnego za pomocą barwienia Von Kossa. W tym celu dwukrotnie umyj płytki wodą dejonizowaną.

6. Kwantyfikacja całkowitej powierzchni dołu resorpcyjnego

  1. Aby zabarwić powłokę CaP barwnikiem Von Kossa, należy inkubować z 50 μl 5% AgNO3 w wodzie dejonizowanej na studzienkę pod promieniowaniem UV przez 1 godzinę, aż powłoka na dnie studzienek zmieni kolor na brązowy.
  2. Umyj płytkę trzykrotnie wodą dejonizowaną i wykonaj zdjęcia w jasnym polu. Obiektyw o małym powiększeniu, taki jak obiektyw 1,25x, może być użyty do uchwycenia całości na jednym obrazie. Ułatwia to późniejszą analizę obrazu. Można zastosować alternatywne metody uchwycenia całego obszaru studni.
  3. Otwórz plik obrazu za pomocą ImageJ: Plik | Otwórz | Obraz | Rodzaj | 8-bitowy. Sprawdź jednostkę skali w prawym dolnym rogu obrazu za pomocą opcji Linia prosta | Analizowanie | Ustaw skalę. Wprowadź długość w polu "znana odległość", wprowadź nową jednostkę skali w polu Jednostka długości i zaznacz pole Globalne.
  4. Lista parametrów pomiarowych do analizy: Punkt menu Analiza | Ustaw wymiary. W oknie Ustaw miary zaznacz pola Obszar i Ogranicz do progu.
  5. Zmierz powierzchnię dołów: Obraz | Dostosuj | Próg. W oknie Próg zaznacz pole wyboru Ciemne tło i kliknij przycisk Auto. Obszar dołów zmieni kolor na czerwony. Zamknij okno Próg i wybierz pozycję Analizuj | Miara. Zapisz plik wynikowy: Plik | Zapisz jako.

7. Kwantyfikacja liczby i wielkości OC oraz znormalizowany obszar dołu resorpcyjnego

  1. Otwórz obraz fluorescencyjny osteoklastów za pomocą ImageJ i sprawdź jednostkę skali (patrz krok 6.3).
  2. Lista parametrów pomiarowych do analizy: Punkt menu Analiza | Ustaw wymiary. W oknie Ustaw miary zaznacz pole Obszar.
  3. Określ OC za pomocą Menedżera ROI i wyborów wielokątów: Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. Kliknij Wybory wielokątów w zestawie narzędzi, obrysuj jeden OC (komórki z pierścieniem aktynowym i ≥ trzema jądrami) i kliknij Dodaj [t] w oknie Menedżer ROI. Powtarzaj konspekt, aż wszystkie OC zostaną uwzględnione.
  4. Zmierz liczbę i rozmiar OC: Zaznacz wszystkie elementy w Menedżerze ROI i kliknij Zmierz. Zapisz plik wynikowy: Plik | Zapisz jako (Rysunek 3E).
  5. Zmierz obszar wgłębień obrazów fluorescencyjnych. Otwórz obraz fluorescencyjny powłoki skorelowany z obrazem w kroku 7.3 i sprawdź jednostkę skali (patrz krok 6.3).
    1. Wymień parametry pomiarowe, które mają być analizowane (patrz krok 6.4). Wybierz punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg. W oknie Próg odznacz wszystkie pola i kliknij przycisk Auto. Obszar dołów zmieni kolor na czerwony. Zamknij okno Próg i wybierz pozycję Analizuj | Miara. Zapisz plik wynikowy.
  6. Oblicz znormalizowaną powierzchnię dołu według liczby OC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powłoka fosforanu wapnia na spodzie płytek do hodowli komórkowych została wykonana w dwóch etapach powlekania, składających się z 3-dniowego etapu wstępnego zwapnienia i 1-dniowego etapu zwapnienia. Jak pokazano na Rysunek 1, równomiernie rozprowadzony fosforan wapnia został uzyskany na dnie 96-dołkowych płytek. Powłoka bardzo dobrze przylegała do dna po wykonanych etapach mycia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę testu resorpcji osteoklastycznej przy użyciu OC pochodzących i ekspandowanych in vitro z PBMC. Stosowane płytki do hodowli komórkowych z powłoką CaP można łatwo przygotować i zobrazować przy użyciu materiałów dostępnych w laboratorium. Oprócz niesortowanych PBMC przyjętych w tym protokole, OC wygenerowane z mysich komórek monocytowych21 i komórek makrofagów szpiku kostnego17 również zostały wyhodowane na podobnych ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Chińską Radę Stypendialną [CSC nr 201808440394]. W.C. była finansowana przez CSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110Azotan srebra
a-MEMGibco32561-029MEM alfa, GlutaMAX, bez nukleozydów
amfoterycyna BBiochrom03-028-1BAmfoterycyna B Roztwór
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50GChlorek wapnia dwuwodny
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524płodowa surowica bydlęca
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Bufor utrwalającyBiolegend420801Paraformaldehyd
HClMerk1.09057.1000Kwas solny
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25Rekombinowany ludzki M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6Chlorek magnezu
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- Wodorofosforan sodu bezwodny
NaClMerkS7653-250Gchlorek sodu
NaHCO3MerkK15322429Wodorowęglan sody
PBSLonza17-512FSól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (1X), DBPS bez wapnia i magnezu
Pen-StrepLonzaDE17-602EMieszanina penicyliny i streptomycyny
Phalloidin-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidyna
RANKLPeproTech310-01Rekombinowany ludzki ligand sRANK (pochodna E.coli)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(hydroksymetylo)aminometan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Glikol alkilofenylopolietylenowy
TrypLE ExpressGibco12605010Rekombinowane enzymy dysocjacji komórek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8(2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578(2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles