Artykuł metodologiczny

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

DOI:

10.3791/64020

⸱

26 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoFCM Co., Ltd, 2School of Sport, Exercise and Health Sciences, Loughborough University, 3Biomolecular Sciences Research Centre, Sheffield Hallam University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka pojedynczych cząstek staje się coraz bardziej istotna dla badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, przechodząc od technik analizy masowej i analizy cząstek pierwszej generacji do kompleksowych pomiarów wieloparametrowych, takich jak cytometria nanoprzepływowa (nFCM). nFCM to forma cytometrii przepływowej, która wykorzystuje oprzyrządowanie specjalnie zaprojektowane do analizy nanocząstek, pozwalając na scharakteryzowanie tysięcy EV na minutę zarówno z zastosowaniem, jak i bez użycia technik barwienia. Detekcja rozproszenia bocznego o wysokiej rozdzielczości (SS) pozwala na określenie wielkości i stężenia dla wszystkich cząstek biologicznych większych niż 45 nm, podczas gdy jednoczesna detekcja fluorescencji (FL) identyfikuje obecność znakowanych markerów i celów będących przedmiotem zainteresowania. Oznaczone subpopulacje można następnie opisać w jednostkach ilościowych cząstek/ml lub jako procent całkowitych cząstek zidentyfikowanych przez rozproszenie boczne.

Tutaj EV pochodzące z kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych (CCM) są znakowane zarówno barwnikiem lipidowym, aby zidentyfikować cząsteczki z błoną, jak i przeciwciała specyficzne dla CD9, CD63 i CD81 jako wspólne markery EV. Pomiary materiału porównawczego, wzorca stężenia i wzorca wielkości nanosfer krzemionki, a także znakowanego materiału próbki są analizowane w analizie 1-minutowej. Oprogramowanie jest następnie wykorzystywane do pomiaru profilu koncentracji i rozkładu wielkości wszystkich cząstek, niezależnie od etykietowania, przed określeniem cząstek, które są dodatnie dla każdej z etykiet.

Jednoczesne wykrywanie SS i FL może być elastycznie wykorzystywane z wieloma różnymi źródłami EV i celami etykietowania, zarówno zewnętrznymi, jak i wewnętrznymi, opisując próbki EV w sposób kompleksowy i ilościowy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Co to są pojazdy elektryczne?
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to zbiorcze określenie szeregu błoniastych cząstek pochodzących z komórek, integralnych z wieloma normalnymi czynnościami komórkowymi i tkankowymi. Ich wpływ na szeroki zakres dziedzin nauki i ich potencjalne znaczenie kliniczne przyczyniły się do wzrostu badań nad pojazdami elektrycznymi i zainteresowania przemysłem1. Badania nad małymi EV (sEV) koncentrują się przede wszystkim na egzosomach, cząstkach o długości 40-100 nm, które zaczynają tworzyć się we wczesnych endosomach przed dojrzewaniem i uwalnianiem poprzez fuzję ciał wielopęcherzykowych (MVB) z błoną plazmatyczną, a także na mikropęcherzykach, które pączkują bezpośrednio z błony plazmatycznej, tworząc cząstki o długości 80-1000 nm2. Trzecia populacja EV to ciała apoptotyczne, cząstki o długości 50-1500 nm powstałe podczas śmierci komórki, co oznacza, że ich względna proporcja do innych EV może być bardzo zmienna3.

Ponieważ charakterystyka EV może reprezentować zmiany zachodzące w komórce/tkance, z której pochodzą, istnieje potencjał do ich wykorzystania w diagnostyce. Rozpoczęto różne analizy "omiczne" w celu zidentyfikowania markerów pochodzenia komórek i stanu choroby, co może pozwolić na nieinwazyjną ocenę pacjentów przy użyciu źródeł EV, takich jak osocze krwi/surowica, mocz, ślina i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF)4,5. Siłą napędową tych innowacji związanych z pojazdami elektrycznymi są nowe techniki charakteryzacji, które przezwyciężają wcześniejsze ograniczenia.

Potrzeba i wyzwania związane z charakteryzacją pojedynczego pojazdu elektrycznego
Charakterystyka pojedynczego EV staje się coraz ważniejsza zarówno dla walidacji, jak i opisu izolatów EV, a także dla wyjaśnienia kluczowych cech tych nanocząstek dla postępu terapii i diagnostyki opartej na EV6. W zależności od źródła EV i zamierzonego zastosowania, analiza czystości, często opisywana jako stosunek cząstek EV do cząstek innych niż EV lub jako EV do wolnego białka, może wymagać znacznych ilości danych z wielu analiz<sup class="xref">7.

Pomiary zliczania i wymiarowania cząstek w publikacjach EV wcześniej opierały się głównie na śledzeniu nanocząstek (NTA), rezystancyjnym wykrywaniu impulsów (RPS) i mikroskopii elektronowej (EM)2. Standardowe NTA i RPS nie są w stanie odróżnić EV od cząstek innych niż EV i mają swoje własne zastrzeżenia, takie jak niska przepustowość8 i nieodpowiednia dolna granica wykrywalności widoczna przy NTA9,10,11.

Tetraspaniny CD9, CD63 i CD81 były historycznie ważnymi identyfikatorami obecności EV w izolacjach/preparatach EV. Powszechnie stosuje się techniki western blotting (WB) i dot blotting w celu pokazania wzbogacenia tych białek w izolaty EV w porównaniu z lizatem komórkowym12. Jednak brak kwantyfikacji tych metod i niejednorodność tych markerów EV, zarówno w odniesieniu do wyświetlania w subpopulacjach EV, jak i zmienności związanej z komórkami, tkankami lub pacjentami, zachęca do zaawansowanych technik analitycznych, które ujednolicają charakterystykę fizyczną i fenotypową13.

Cytometria nanoprzepływowa jako kompleksowa technika analizy EV
Określenie rzeczywistych stężeń EV wymaga identyfikacji nienaruszonych cząstek i uniwersalnego markera, szczególnie w złożonych izolatach cząstek, z rozdzielczością zdolną do wykrycia wszystkich EV przy jednoczesnym odróżnieniu ich od cząstek innych niż EV14.

Nano-flow cytometry (nFCM) to technika, która pozwala na nieznakowaną analizę cząstek o rozmiarach od 45 do 1000 nm, jednocześnie wykorzystując fluorescencyjne znakowanie i detekcję do identyfikacji subpopulacji cząstek. Kluczową różnicą w stosunku do konwencjonalnej cytometrii przepływowej jest zastosowanie sprzętu dedykowanego do analizy nanocząstek, pozwalającego na uzyskanie najwyższej rozdzielczości15. Analiza EV, która wykorzystuje konwencjonalne oprzyrządowanie przepływowe przeznaczone do analizy małych cząstek, poprawia się, ale nadal ma trudności z osiągnięciem rozdzielczości umożliwiającej wykrywanie i analizowanie <100 nm EVs16,17. Cytometria przepływowa oparta na kulkach jest kolejną adaptacją często stosowaną do analizy EV, ale eliminuje to możliwość wykrywania pojedynczych cząstek i wprowadza odchylenia oparte na wychwytywaniu18.

Korzystając z dolnego limitu wykrywania ~45 nm w kanale bocznego rozproszenia (SS) do analizy EV, nFCM wykorzystuje wyzwalanie SS. Można to nazwać analizą "najpierw cząstka", ponieważ oznacza, że zdarzenia muszą dostarczyć sygnał SS, przekraczając ustalony próg przed analizą intensywności fluorescencji. Eliminuje to wyniki fałszywie dodatnie, takie jak zdegradowane agregacje membran i fluoroforów, i koncentruje analizę na nienaruszonych EVs15. Pomiary SS są również wykorzystywane do wymiarowania pojedynczych cząstek przez porównanie z czteromodalną nanosferą krzemionki standard<sup class="xref">19. Pomiary fluorescencji są wykonywane na dwóch kolejnych detektorach, co pozwala na trzy jednoczesne pomiary dla każdej cząstki w celu opisania stężenia cząstek, rozmiarów i obecności markerów lub innych celów zainteresowania w celu identyfikacji subpopulacji EVs20.

W poniższym eksperymencie, pomiary SS i fluorescencji (FL) są używane do pomiaru cząstek >45 nm, pokazują podzbiór dodatnich EV membranowych i identyfikują prezentację CD9, CD63, CD81 w subpopulacjach EV. Opisano zarówno stężenie tych subpopulacji, jak i ich stosunek do całkowitej liczby cząstek mierzonych za pomocą SS, a także ich profile wielkości.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja przyrządu nFCM i pomiary standardów nFCM

UWAGA: Trzy pomiary są wykonywane przed rozpoczęciem zbierania danych dla próbek, aby potwierdzić poprawność ustawienia instrumentu nFCM i zapewnić mocne porównanie między instrumentami. Są to wzorzec stężenia/kontrola jakości (QC), wzorzec rozmiaru i ślepa próba.

  1. Rozcieńczyć kulki QC w stosunku 1:100 w wodzie destylowanej w odpowiedniej probówce o pojemności 0,6 μl i umieścić w doku załadowczym.
  2. Z menu rozwijanego Sample Flow (Przepływ próbki) wybierz opcję Boosting (Zwiększanie jakości), aby wprowadzić próbkę kontroli jakości do systemu na 45 sekund w celu całkowitego zastąpienia poprzedniej próbki/roztworu czyszczącego.
    1. Podczas zwiększania należy ustawić moc lasera na wstępnie ustawiony szablon dla koralików QC "250 nm FL QC standard", np. 10/40 mW dla niebieskiego lasera, 20/50 mW dla czerwonego lasera, z 0,2% zanikiem SS.
  3. Wybierz Sampling pressure z tego samego menu w dół, aby zmniejszyć ciśnienie w układzie.
  4. Ustaw ciśnienie automatycznego próbkowania na 1,0 kPa, aby utrzymać stałe ciśnienie.
  5. Zainicjuj 1-minutową analizę, wybierając pozycję Czas do nagrania z kontrolek pozyskiwania. Dane zostaną wykreślone na wykresie kropkowym przedstawiającym skalę logarytmiczną intensywności SS i wybranej intensywności FL.
  6. Wstaw nazwę pliku i rozcieńczenie próbki przed zapisaniem pliku.
  7. Wybierz opcję rozładunku, aby wyjąć rurę z doku załadunkowego. Zastąp roztworem czyszczącym 150 μl i czyść przez >30 s, wybierając opcję Boosting, a następnie wyjmij roztwór czyszczący, wybierając opcję Rozładunek.
    1. Usuń nadmiar roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej za pomocą probówki zawierającej 150 μl wody.
  8. Rozcieńczyć kulki o standardowym rozmiarze 1:100 w wodzie i załadować 100 μl do doku załadowczego, przed zwiększaniem próbki przez 45 s.
  9. Ustaw moc lasera na wstępnie ustawiony szablon "S16 exo 68-155 nm". To ustawienie dotyczy zarówno wzorca rozmiaru, jak i próbek zawierających EV < 200 nm. Na przykład 15/40 mW dla niebieskiego lasera, 20/50 mW dla czerwonego lasera, z 0,2% zanikiem SS.
  10. Wybierz opcję Sampling (Próbkowanie) i kontynuuj nagrywanie próbki przez 1 minutę, tak jak poprzednio.
  11. Wykonaj trzeci pomiar za pomocą próbki wody lub PBS, aby utworzyć ślepy pomiar eluentu, identyfikując fałszywe alarmy do usunięcia przez oprogramowanie. Wprowadzanie pomiarów wzorcowych opisano w poniższym rozdziale.

2. Określanie stężenia cząstek w nieoznakowanej próbce i generowanie raportu PDF

  1. Rozcieńczyć nieznakowaną próbkę EV w PBS do odpowiedniego zakresu stężeń cząstek do analizy nFCM, 1 x 108-5 x 108 cząstek/ml. Załadować 10-100 μl rozcieńczonej próbki do doku załadowczego.
  2. Gdy stężenie cząstek nie jest znane, należy rozpocząć od rozcieńczenia próbki EV w stosunku 1:100. Stężenie próbki można szybko przybliżyć na podstawie rozmiaru plamki lasera w kamerze CCD podczas wzmacniania lub na podstawie obserwacji śladu impulsu zdarzenia podczas próbkowania.
  3. Zwiększ załadowaną próbkę na 45 s przed wybraniem opcji Sampling i nagrywaj przez 1 minutę, oszczędzając zgodnie z wcześniejszym opisem.
  4. Aby rozpocząć analizę tych danych, należy przejść z zakładki Akwizycja na kartę Analiza. Otwórz zapisane pliki nfa.
  5. Aby umożliwić dokładny pomiar próbki, należy użyć dwóch standardowych pomiarów wykonanych przed pomiarem próbki, aby ustawić wartości do porównania próbki, a także ślepej próby.
  6. Utwórz krzywą standardową rozmiaru do konwersji SS na średnicę, najpierw wybierając plik standardu rozmiaru i używając narzędzia do ustawiania progu (znanego również jako automatyczne progowanie). Próg, widoczny w śladzie serii zdarzenia, określa minimalne natężenie sygnału wymagane do uznania zdarzenia za znaczące.
  7. Po ustawieniu progu sprawdź, czy parametry x i y wykresu kropkowego to SS-H lub SS-A na osi x i FITC-A na osi y.
  8. Otwórz narzędzie do generowania krzywej standardowej i wybierz S16 exo 68-155 nm jako szablon rozmiaru. Kliknij Znajdź szczyty, aby zidentyfikować szczytowe intensywności SS jako cząstki o średnicy 68, 91, 113 lub 155 nm.
  9. Przed zamknięciem okna sprawdź, czy krzywa SS do średnicy została wygenerowana z wartością r bliską 1.
  10. Ustaw normę stężenia, wybierając zapisany plik i klikając Policz choroby przenoszone drogą płciową. Wprowadź stężenie cząstek w wzorcu.
  11. Po ustawieniu standardowych informacji wybierz przykładowy plik EV i ustaw próg.
  12. Wybierz pusty plik i kliknij przycisk Ustaw puste, aby określić liczbę wyników fałszywie dodatnich do usunięcia z liczby próbek. Należy to zrobić przy tym samym progu, co próbka. Wróć do przykładowego pliku EV.
  13. Otwórz narzędzie do generowania plików PDF i wybierz opcję Rozmiar i koncentracja. Wprowadzić rozcieńczenia próbki. Pokazane jest stężenie próbki i rozkład wielkości cząstek.

3. Przykładowe etykietowanie

UWAGA: Dwie strategie barwienia mogą być stosowane jednocześnie do kompleksowej analizy cząstek w zawiesinie. Protokoły znakowania często wymagają optymalizacji pod kątem nowych przeciwciał lub źródeł próbek.

  1. Rozcieńczyć część próbki EV do stężenia 1,25 x10 10 cząstek/ml w PBS. Inkubować 8 μl rozcieńczonej próbki EV z 1 μl przeciwciała i 1 μl barwnika dla stężenia cząstek 1 x10 10 cząstek/ml (całkowite cząstki będą 1 x 108 zawieszone w 10 μl). W tym przypadku stosunek inkubacji przeciwciała wynosi 1:50 (1 μl przeciwciała 1:5).
    1. Podczas optymalizacji należy użyć więcej niż trzech różnych stężeń przeciwciała lub barwnika, aby uzyskać dane wskazujące, że protokół pozwala na maksymalne wiązanie epitopów bez nadmiernego nasycenia wybranej etykiety, co może utrudnić identyfikację zdarzeń fluorescencyjnych o niskiej intensywności. Stężenie inkubacyjne barwnika membranowego wynosi 40 nM (1 μl z 400 nM).
  2. Wymieszać 10 μl próbki, wirując przez 5 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
    UWAGA: W dyskusji znajdują się zalecenia dotyczące kontroli.
  3. Po inkubacji pobrać 1 μl znakowanej próbki i rozcieńczyć w stosunku 1:50 w PBS w probówce o pojemności 0,6 ml.
  4. Załaduj próbkę do stanowiska załadowczego i stosuj ciśnienie doładowania przez 45 s. Upewnij się, że ustawienia lasera są prawidłowe i załadowane są odpowiednie soczewki.
  5. Przełącz się na ciśnienie próbkowania i wybierz Czas nagrywania. Po upływie 1 minuty pobierania nazwij plik danych i zapisz.
  6. Rozładować próbkę i zastąpić ją roztworem czyszczącym. Zwiększ to na >30 s przed załadowaniem następnej oznaczonej próbki.

4. Analiza nFCM-Generowanie PDF do analizy subpopulacji

  1. W przypadku generowania plików PDF zastosuj te same standardy, co poprzednio; tylko pusty pomiar zostanie ustawiony inaczej.
  2. Wybierz przykładowy plik i ustaw próg. Na wykresie kropkowym zmień oś y, aby pokazać pomiary FL z kanału zielonego lub czerwonego.
  3. Wybierz narzędzie do bramkowania kwadratowego i użyj lewego przycisku myszy, aby narysować kwadrat wokół populacji FL+.
  4. Otwórz pusty plik pomiarowy i kliknij Ustaw puste przed powrotem do przykładowego pliku.
  5. Otwórz narzędzie do generowania plików PDF jak poprzednio, a rozkład rozmiaru, stężenie i procent (w porównaniu ze wszystkimi zdarzeniami SS+) zostaną zidentyfikowane dla subpopulacji FL+.
    1. Powtórz te czynności dla każdej subpopulacji będącej przedmiotem zainteresowania oznaczonej jako "Ogółem, P1, P2 itd."

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentacja tetraspaniny na EV pochodnych SW620 i EVs pochodnych C2C12
Współczesna analiza obfitości kluczowych tetraspanin CD9, CD63 i CD81 w EV z różnych źródeł uwypukliła ekstremalną zmienność ich obecności, zarówno w analizach masowych, jak i podczas analizy ich prezentacji w subpopulacjach EVs21. Jest to prawdopodobnie związane z dostępnością różnych szlaków biogenezy, takich jak szlaki zależne i niezależne od ESCRT22.

CD9 został zaprezentowany na największym odsetku pojazdów elektrycznych C2C12 na poziomie ~50%, a prezentacja CD63 tylko na ~30%, w klasie Rysunek 1. Kiedy znakowanie przeprowadzono wszystkimi trzema anty-tetraspaninami w jednej inkubacji, wykazano, że ~ 70% cząstek wykazuje co najmniej jeden z markerów EV. Powtarzające się pomiary wykazały najniższe odchylenie standardowe dla oznakowania CD9/63/81 pojazdów elektrycznych C2C12 na poziomie ~3,8%, podczas gdy dla pojazdów elektrycznych C2C12 z oznaczeniem CD81 było to ~8,1%.

EV pochodzące z SW620 wykazywały inny profil tetraspaniny, ze znacznie większą różnicą między najczęściej prezentowanym CD9 na poziomie ~40% a najmniej prezentowanym CD63 na poziomie ~7%. Podobnie jak w przypadku C2C12 EV, CD9 był obecny w większości populacji tetraspaniny dodatniej, ponieważ połączone znakowanie CD9/63/81 zidentyfikowało ~ 42% cząstek jako posiadających co najmniej jeden z trzech markerów.

Większość cząstek pochodzących z C2C12, całkowita populacja SS+, miała rozmiar od 45 do 120 nm, z medianą średnicy ~65 nm. Profile wielkości dla każdej z pojedynczych subpopulacji EV oznaczonych tetraspaniną, pokazane na Rysunek 1, są do siebie podobne, pokazując większą medianę wielkości ~75-85 nm i mniej EV <65 nm w porównaniu z całkowitą populacją cząstek.

Cząstki pochodzące z SW620 mieściły się w zakresie 45-160 nm z medianą wielkości ~65 nm, wykazując skośny rozkład. EV znakowane tetraspaniną wykazują bardziej normalny rozkład i większą średnicę mediany w zakresie 90-110 nm, z podobnymi rozkładami między poszczególnymi subpopulacjami tetraspaniny dodatniej.

Chociaż najczęściej i najrzadziej prezentowane tetraspaniny są takie same dla tych dwóch linii komórkowych, ich proporcjonalna reprezentacja znacznie się różni i istnieje interesująca różnica między potencjalną współprezentacją tetraspanin obserwowaną na podstawie różnicy w dodatniej CD9 a dodatniej CD9/63/81.

Łączenie znakowania membrany EV z etykietowaniem przeciwciał
Dwuwarstwowa membrana EV zapewnia bardziej ogólny cel znakowania, który może pozwolić na odróżnienie od cząstek innych niż EV o podobnych rozmiarach, takich jak agregaty białkowe i niektóre formy LDL z monowarstwami lipidów23. Specyfika tego typu etykietowania musi zostać zweryfikowana, ponieważ wykazano, że niektóre popularne barwniki membranowe stosowane w badaniach nad EV wiążą się również z cząstkami innymi niż EV24.

Etykietowanie membran wielokrotnie wykazało ~80% pozytywności EV pochodzących z C2C12 i EV SW620. Intensywność SS (SS-H) wykazuje dobrą korelację z intensywnością FITC na wykresach punktowych zarówno wyników C2C12, jak i SW620 pokazanych na Rysunek 2. Jest to oczekiwane, ponieważ intensywność SS jest zależna od wielkości cząstek, a tym samym do powierzchni membrany.

Większość EV znakowanych przeciwciałami była również pozytywna dla znakowania błonowego, wykazując podwójnie dodatnie procenty (FITC+ i APC+), bardzo podobne do procentów dodatnich tetraspanin. Wykresy punktowe FITC vs APC wykazują niewielką korelację między znakowaniem błonowym i tetraspaninowym, przy czym znakowanie CD63 wydaje się wykazywać najsłabszą korelację z znakowaniem błonowym. Wykryto kilka zdarzeń, które były pozytywne dla znakowania przeciwciał, ale ujemne dla znakowania błony.

Odtwarzalność, wydajność podwójnego etykietowania i alternatywne wyjścia danych
Ważną kwestią przy projektowaniu eksperymentów z nFCM jest interaktywność fluoroforu lub znacznika. Rysunek 3a pokazuje, że powtarzanie znakowania przeciwciał z dodatkowym znakowaniem membranowym i bez niego prowadzi do bardzo podobnych pomiarów % pozytywności. W szczególności oznakowanie SW620 wykazuje bardzo małe różnice między tymi dwoma zestawami pomiarowymi. Pokazuje to ograniczoną interferencję między wiązaniem barwnika i przeciwciała, a także podkreśla dobrą odtwarzalność podczas powtarzania znakowania EV.

Pomiary intensywności, zarówno rozproszenie boczne, jak i fluorescencja, mogą być eksportowane do excela dla każdej mierzonej cząstki z osobna. Na tej podstawie możemy wygenerować pomiary średniej intensywności fluorescencji (MFI), aby zapewnić przybliżenia porównawcze obfitości naszego oznaczonego celu. MFI dla fluorescencyjnych populacji EV pochodzących z C2C12 sugeruje nieco niższą prezentację CD63 i CD81 z pomiarami MFI wynoszącymi odpowiednio ~550 i ~600, w porównaniu z ~850 MFI obserwowanymi dla EV CD9+. Jednostkami miary dla MIF w tym przypadku są FL-A i nie są one znormalizowane względem kalibracji fluorescencyjnej. Zastosowanie wszystkich trzech przeciwciał nie wywołuje znacznie większej fluorescencji niż samo znakowanie CD9. Różni się to bardzo od pomiarów SW620 MFI, które sugerują, że użycie koktajlu wszystkich trzech przeciwciał zapewnia większy sygnał fluorescencyjny dla znakowanych EV niż użycie jakiejkolwiek pojedynczej etykiety przeciwciała.

Histogramy rozkładu rozmiarów wytworzone przez oprogramowanie NanoFCM mogą być również wyeksportowane do Excela, co pozwala na nałożenie na siebie trzech zestawów danych. Profile rozkładów rozmiarów Rysunek 3 są podobne do tych z Rysunek 1, ale zawierają słupki błędów. Mediana wielkości EV subpopulacji tetraspaniny dodatniej w EV pochodzących z C2C12 wykazuje medianę około 70 nm, nieco większą niż średnia 60 nm dla wszystkich populacji cząstek. SW620 EV dodatnie dla markerów tetraspaniny są większe, wykazując szczyty przy ~100 nm.

figure-results-1
Rysunek 1: Subpopulacje CD9, CD63, CD81 z dodatnim wynikiem EV zidentyfikowane przez znakowanie przeciwciałami. (A) Wykres słupkowy przedstawiający procent oznaczonych EV w porównaniu do całkowitej liczby cząstek zaobserwowanych przez SS dla EV pochodzących z C2C12. (B) Wykres słupkowy przedstawiający procent oznaczonych EV w porównaniu z całkowitymi cząstkami zaobserwowanymi przez SS dla EV pochodzących z SW620. (C) Reprezentatywne profile rozkładu wielkości dla pojazdów elektrycznych pochodzących z C2C12. Każdy histogram jest pobierany z plików PDF wygenerowanych dla pierwszego pomiaru potrójnych zestawów danych. (D) Reprezentatywne profile rozkładu wielkości dla pojazdów elektrycznych pochodzących z SW620. Każdy histogram jest pobierany z plików PDF wygenerowanych dla pierwszego pomiaru potrójnych zestawów danych. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe trzech pomiarów tych samych oznaczonych próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Znakowanie membranowe i znakowanie przeciwciał CD9, CD63, CD81 przedstawiające subpopulacje EV. (A) Wykres słupkowy przedstawiający Membrane+%, tetraspanin+% i double+% dla EV C2C12. (B) Wykres słupkowy przedstawiający Membrane+ %, tetraspanin+ % i double+ % dla SW620 EV. (C) Reprezentatywne wykresy punktowe SS i FITC przedstawiające bramkowanie dla populacji dodatniej membrany. (D) Reprezentatywne wykresy punktowe FITC i APC przedstawiające bramkowanie dla podwójnie dodatniej populacji EV z C2C12. (E) Reprezentatywne wykresy punktowe FITC i APC przedstawiające bramkowanie dla podwójnie dodatniej populacji EV z SW620. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe trzech pomiarów tych samych oznaczonych próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ocena zmienności w powtarzanych pomiarach. (A) Wykresy słupkowe pokazujące % pozytywnych wyników znakowania przeciwciał z dodatkowym znakowaniem membranowym i bez niego. (B) Pomiary średniej intensywności fluorescencji dla bramkowanych podzbiorów EV. (C) Uśrednione histogramy rozkładu wielkości dla potrójnych zbiorów danych dla C2C12 EV. (D) Uśrednione histogramy rozkładu wielkości dla potrójnych zestawów danych dla SW620 EV. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe trzech pomiarów tych samych oznaczonych próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące próbki i odczynnika
Wybrano dwa izolaty EV z oddzielnych linii komórkowych do demonstracji znakowania fluorescencyjnego i późniejszej analizy nFCM. Oba zestawy EV zawieszono w PBS i przechowywano w temperaturze -80 °C przez <3 miesiące, ale większość innych warunków różniła się między izolatami. Mysia linia komórkowa mioblastów C2C12 stanowi embrionalny prekursor komórek mięśni szkieletowych i była hodowana w hodowli 2D, kondycjonując pożywkę wzrostową przez 72 godziny przed izolacją EV przez ultrawirowanie. SW620 to ludzka linia komórkowa gruczolakoraka jelita grubego i była hodowana w podstawowym bioreaktorze, wzbogacając pożywkę przez 7 tygodni, z izolacją EV przeprowadzoną metodą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) i frakcjami 7-9 eluowanymi z sefarozy kolumn CL-2B połączonych w jedną próbkę.

Podczas gdy EV wyizolowane i skoncentrowane z CCM są najłatwiejszymi typami próbek w obróbce, nFCM ma zastosowanie do większości izolatów EV, w tym płynów biologicznych, takich jak surowica, osocze, mocz i płyn mózgowo-rdzeniowy. Te analizy próbek korzystają z detekcji nFCM SS wszystkich cząstek, co pozwala na potwierdzenie z NTA, TRPS i innymi analizami cząstek, jednocześnie opisując fluorescencyjnie znakowane subpopulacje EV pod względem ilościowym, a także proporcji całości, w celu bezstronnego podejścia do wieloparametrowej analizy cząstek. Możliwa jest również analiza próbek o niskiej przetworzonej jakości, takich jak nieoczyszczony mocz i CCM wzbogacony w EV, z zastrzeżeniem, że wymaga białka o niskiej zawartości zanieczyszczeń.

Zastosowany tutaj barwnik błonowy ma na celu integrację z dwuwarstwą lipidową, z ugrupowaniem lipofilowym do obciążenia błony i barwnikiem hydrofilowym do pozostawania w błonie plazmatycznej25. Obecnie nie ma idealnego barwnika do etykietowania EV i przy wyborze należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów, w tym specyficzność dla EV, przydatność do utrwalania lub przepuszczalności oraz skuteczność etykietowania EV26.

Fluorescencyjne znakowanie przeciwciałami sprzężonymi epitopów eksponowanych powierzchniowo okazało się skuteczną metodą identyfikacji subpopulacji EV27. Kluczowym aspektem optymalizacji protokołu jest spełnienie, a nie przekroczenie, punktu nasycenia znakowania, aby związać się ze wszystkimi dostępnymi epitopami bez hamowania wykrywania cząstek o niskiej fluorescencji poprzez umożliwienie wypełnienia otaczającego buforu fluorescencyjnym niezwiązanym przeciwciałem28. Ponadto na dostępność odsłoniętych miejsc wiązania do znakowania przeciwciał może mieć wpływ kilka czynników. Wykazano, że warunki przechowywania EV wpływają na profile koncentracji i wielkości EV29 , przy czym obserwacje wskazują również na wpływ na znakowanie przeciwciał30. Obecność powierzchniowych białek koronowych, modyfikacje białek i wpływ technik izolacji mogą również mieć wpływ na znakowanie przeciwciał w niektórych przypadkach. Ostatecznie, w miarę jak stosowanie znakowania fluorescencyjnego staje się coraz bardziej powszechne w badaniach EV, projektowanie eksperymentalne i optymalizacja dla wielu technik analitycznych staną się bardziej wyrafinowane.

Aby zwiększyć dokładność wyników, można uwzględnić kilka kontroli, takich jak (1) kontrola barwnika PBS +, w celu oceny tworzenia się miceli lub agregatów w niektórych barwnikach, które mogą pojawiać się jako cząstki SS + w analizie nFCM, (2) kontrola przeciwciał PBS +, mogą wystąpić agregaty, choć często nie na tyle duże, aby rozproszyć wystarczająco dużo światła do wykrycia SS, (3) próbka EV + kontrola przeciwciał IgG, powszechne w cytometrii przepływowej i stosowane do identyfikacji wszelkich niespecyficznych wiązań, (4) próbka cząstek niebędących EV + kontrola przeciwciał/barwnika - szczególnie ważne w przypadku konieczności identyfikacji EV w złożonych próbkach cząstek, kontrole, takie jak oczyszczone cząsteczki lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) lub próbki zubożone/ablowane EV mogą działać jako kontrola negatywna w celu walidacji selektywnego znakowania, (5) kontrole pozytywne są trudne do zaprojektowania, ale walidacja przeciwciała na komórkach jest użytecznym włączeniem.

Prezentacja tetraspanin na pojazdach elektrycznych
Znakowanie przeciwciał i błon w tym eksperymencie pokazuje wysoki poziom danych ilościowych, które można uzyskać w krótkim czasie za pomocą analizy nFCM. Jednoczesny pomiar kluczowych atrybutów fizycznych średnicy/stężenia cząstek z pomiarami fenotypowymi obecności błony i/lub białka prowadzi do opisów subpopulacji na wysokim poziomie w izolacji cząstek.

Co ważne, w tych dwóch próbkach EV zidentyfikowano różne poziomy trzech "kluczowych" tetraspanin związanych z EV, CD9, CD63 i CD81. CD9 zaprezentowano w największym odsetku EV zarówno dla EV pochodzących z C2C12, jak i SW620, przy czym CD81 i CD63 były odpowiednio drugim i najrzadziej prezentowanym białkiem.

Pomimo pewnych podobieństw zaobserwowanych tutaj w profilach tetraspaniny EV z dwóch bardzo różnych źródeł komórkowych, poziomy CD9, CD63 i CD81 mogą być bardzo różne między EV pochodzącymi od linii komórkowych i pacjentów31.

Różnica w ekspresji CD63 między dwiema próbkami EV jest szczególnie istotna dla toczącej się dyskusji na temat kluczowych identyfikatorów "EV-ness". Podczas gdy prezentacja CD63 tylko w ~8% EV SW620 może być dla niektórych nieoczekiwana, CD63 został zasugerowany jako słaba identyfikacja różnych typów EV izolowanych przez rozmiar lub gęstość32, a tetraspaninowe ujemne EV zostały zidentyfikowane, nawet gdy są opisane jako egzosomypodobne 33.

Identyfikacja EV w złożonych izolacjach cząstek
Niejednorodność profili tetraspaniny EV, zarówno w EV pochodzących od pacjentów, zarówno w liniach komórkowych, jak i od pacjentów, ostrzega przed poleganiem na wychwytywaniu EV na bazie tetraspaniny i podkreśla przyszłe zapotrzebowanie na nowe metody identyfikacji EV31. Znakowanie EV niezależnie od określonych białek może okazać się bardzo korzystne dla identyfikacji EV od cząstek innych niż EV o podobnych rozmiarach, jeśli można udowodnić, że swoistość EV jest bardzo wysoka. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku izolatów EV z biopłynów, ponieważ sugeruje się, że stężenie EV w ludzkim osoczu krwi mieści się w zakresie10-10 cząstek/ml, podczas gdy lipoproteiny mierzy się na poziomie 10-16 na ml14,34. Nawet po wzbogaceniu EV, badania porównujące dodatnie cząstki dla markerów tetraspaniny i / lub markera LDL ApoB sugerują ~50-100 razy większą obfitość LDL w próbkach osocza bezpłytkowego (PFP) w porównaniu z EV35.

Zastosowana technika izolacji ma ogromny wpływ na zakres współizolowanych cząstek innych niż EV, takich jak lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoproteiny o średniej gęstości (IDL) i LDL36. Istnieją również opisy koizolatów lipoprotein związanych z EV, które, choć potencjalnie odgrywają ważną rolę biologiczną, sprawiają, że uzyskanie czystych próbek EV jest trudnym celem35.

W związku z tym można argumentować, że należy położyć większy nacisk na opis cząstek, które składają się na próbkę, a nie na osiągnięcie izolacji czystego, ale ograniczonego wyboru EV. Uzyskanie wyczerpującego opisu cząstek poprzez pomiar obfitości tetraspaniny w objętości i liczby cząstek oddzielnie może być niewystarczające do dokładnego określenia stężeń EV, szczególnie ze źródeł biopłynów36,37. Identyfikacja subpopulacji w podejściu opartym na poziomach, pokazująca całkowite cząstki, EV i EV prezentujące określone białka, jak wykazano w tym eksperymencie, może zapewnić solidne rozwiązanie w zakresie charakterystyki nanocząstek. Tak było w przypadku projektów obejmujących ładowanie pojazdów elektrycznych z projektami przyszłych zastosowań terapeutycznych20 oraz identyfikację pojazdów elektrycznych CD63+ z ładunkiem luminalnym, takim jak mitochondria38.

nFCM w repertuarze analityki EV
Mocną stroną analizy nFCM EV jest sposób, w jaki dane mogą potwierdzać i opierać się na najczęstszych analizach EV oraz tworzyć pomosty między zestawami danych fizycznych i fenotypowych. Opiera się to jednak na dokładnych protokołach etykietowania, które często muszą być zoptymalizowane pod kątem unikalnych odczynników do znakowania, takich jak barwniki i przeciwciała. Kluczowym kryterium dokładnej analizy jest zawieszenie znakowanych cząstek w buforze niefluorescencyjnym, co polega albo na usunięciu nadmiaru niezwiązanego fluoroforu, albo na udoskonaleniu protokołów, aby nie przekroczyć nasycenia epitopów.

Badania porównawcze wykazały, że wymiarowanie pojazdów elektrycznych nFCM dostarcza danych zgodnych z TRPS i cryo-TEM, technikami, które są opisywane jako dokładniejsze niż NTA do analizy wielkości EV10,39. Jednak, podobnie jak w przypadku każdej metody opartej na optyce, przy interpretacji danych należy wziąć pod uwagę wpływ heterogenicznych właściwości optycznych obserwowanych dla EV oraz różnice między właściwościami optycznymi materiału odniesienia i EV10.

Western blotting jest kluczową metodą oznaczania wzbogacenia EV poprzez identyfikację markerów EV40. Jednak chęć wykazania obecności takich markerów na cząstkach doprowadziła do postępów w analizach cytometrycznych przepływowych opartych na pojazdach elektrycznych17. Jednak rozdzielczości niezbędne do dostarczenia wiarygodnych danych są obecnie najlepiej osiągane za pomocą dedykowanego oprzyrządowania zarówno w odniesieniu do światła rozproszonego, jak i fluorescencyjnego19.

nFCM zapewnia bezstronne podejście polegające na wstępnym opisie wszystkich cząstek nieistotnych dla określonych markerów, za pomocą pomiaru rozproszenia bocznego, co pozwala na potwierdzenie z najczęstszymi technikami NTA, RPS i TEM1, przy jednoczesnym dodaniu pomiaru fenotypowego podobnego do WB lub Elisa w sposób ilościowy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.L., B.P., D.A., R.L, R.T są pracownikami NanoFCM, a ich wkład w ten artykuł został wniesiony w ramach ich zatrudnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować grupom Owena Daviesa i Nicka Peake'a za nieustanne dostarczanie materiałów i ekspertyzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało APC anty-CD81 (M38)abcamab233259Przeciwciało anty-ludzkie CD81 Przeciwciało skoniugowane APC
Przeciwciało APC anty-CD9 (EM-04)Abcamab82392Przeciwciało skoniugowane APC
APC
Przeciwciało anty-CD9 (MEM-61), wstępnie rozcieńczoneabcamab82389Przeciwciało skoniugowane anty-ludzkie CD9 APC
mysim CD63 APCbiolegend143905koniugowane anty-mysie CD63 APC
Przeciwciało sprzężone
APC przeciwko myszy/szczurowi Przeciwciałobiolegend104909Anti-Mouse CD81 Przeciwciało sprzężone APC
Przeciwciało monoklonalne CD63 (MEM-259), APCinvitrogen Via FisherscientificA15712Przeciwciało sprzężone Anti-Human CD63 APC
Bioreaktor Celline AD1000MerckZ688037-5EA
Roztwór czyszczącyNanoFCM17159Roztwór do czyszczenia w domu dla nanoanalizatorów
EV od C2C12GiftedMouse line
EVs od SW620GiftedHuman line
Memglow - Fluorogenic Membrane ProbeCytoszkieletMG01nietoksyczny barwnik błony komórkowej
NanoAnalyzer NanoFCMCytometr nanoprzepływowy do pomiaru pojedynczych cząstek
PBS, pH 7,2Gibco Via Fisherscientific12549079Roztwór soli do rozcieńczania próbek i przeciwciał
Mikroprobówki Snaplock, 0,60 mlAxygen Via Fisherscientific11371944Probówki wymagane do załadowania próbki do nanoanalizatora
Przeciwciało przeciw Przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144(2021).
  2. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  3. Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
  4. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325(2019).
  5. Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
  6. Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9(2019).
  7. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866(2016).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052(2021).
  11. Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
  12. Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7(2019).
  13. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
  14. Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
  15. Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
  16. Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  17. Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257(2020).
  18. Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271(2017).
  19. Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
  20. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130(2021).
  21. Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151(2013).
  22. Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505(2021).
  23. Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
  24. Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237(2019).
  25. Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
  26. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  27. Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028(2020).
  28. Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4(2019).
  29. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  30. Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
  31. Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250(2021).
  32. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  33. Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
  34. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  35. Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316(2016).
  36. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103(2020).
  37. Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269(2015).
  38. Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166(2021).
  39. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079(2021).
  40. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

P cherzyki zewn trzkom rkowecharakterystyka pojedynczych cz stekdetekcja rozpraszania bocznegodetekcja fluorescencyjnamarkery EVznakowanie b onznakowanie tetraspaninamirozk ad wielko ci

Powiązane artykuły