Artykuł metodologiczny

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

DOI:

10.3791/64023

⸱

18 listopada 2022

1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biochemia wizualna to potężna technika obserwacji stochastycznych właściwości pojedynczych enzymów lub kompleksów enzymatycznych, które są niewidoczne w uśrednianiu, które ma miejsce w badaniach fazy masowej. Aby uzyskać wizualizację, podwójna pęseta optyczna, z której jedna pułapka jest nieruchoma, a druga ruchoma, jest skupiana w jednym kanale wielostrumieniowej komory mikroprzepływowej umieszczonej na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Pęseta optyczna wychwytuje pojedyncze cząsteczki znakowanego fluorescencyjnie DNA, a płyn przepływa przez komorę i mija uwięzione kulki, rozciąga DNA do formy B (pod minimalną siłą, tj. 0 pN), przy czym kwas nukleinowy jest obserwowany jako biały sznurek na czarnym tle. Cząsteczki DNA są przenoszone z jednego strumienia do drugiego, poprzez przesunięcie etapu prostopadłego do przepływu, aby umożliwić zainicjowanie reakcji w kontrolowany sposób. Aby osiągnąć sukces, urządzenia mikroprzepływowe z optycznie przezroczystymi kanałami są łączone ze szklanymi strzykawkami utrzymywanymi na miejscu w pompie strzykawkowej. Optymalne wyniki zapewniają złącza na stałe połączone z komorą przepływową, rurki, które są sztywne mechanicznie i odporne chemicznie, a które są połączone z zaworami przełączającymi, które eliminują pęcherzyki uniemożliwiające przepływ laminarny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość wizualizacji interakcji białko-DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki i w czasie rzeczywistym dostarczyła znaczącego wglądu w stabilność genomu1,2. Oprócz pracy z pojedynczymi cząsteczkami DNA pojedynczo, możliwość przeglądania transakcji między poszczególnymi cząsteczkami w pobliżu zapewnia dodatkowy wgląd3,4,5. Manipulowanie dodatkowymi cząsteczkami DNA wymaga zarówno dodatkowych pułapek optycznych, jak i wysokiej jakości, wielokanałowych, mikroprzepływowych komórek przepływowych6.

Istnieje kilka metod generowania więcej niż jednej pułapki optycznej. Należą do nich zwierciadła skanujące galwanometryczne, akustyczne modulatory optyczne i optyka dyfrakcyjna, które generują holograficzną pęsetę optyczną4,7,8,9. Często lustra skanujące i akustyczne modulatory optyczne wytwarzają pułapki, które dzielą się w czasie. W opisanej tutaj konfiguracji, wiązka pojedynczego lasera Nd:YAG jest rozdzielana na polaryzację, a następnie lustra skanujące laserem galwanometrycznym kontrolują położenie tego, co nazywa się pułapką ruchomą (Rysunek 1)4. Aby ułatwić pozycjonowanie luster i filtrów w celu skierowania wiązki pułapki na tylną aperturę obiektywu mikroskopu, stosuje się laser HeNe. Ułatwia to ogólne wyrównanie, ponieważ wiązka HeNe jest widoczna gołym okiem, podczas gdy wiązki podczerwieni nie. Belka HeNe jest również bezpieczniejsza w pracy, dzięki czemu pozycjonowanie luster i innych elementów jest mniej stresujące. Początkowo ścieżka wiązki dla tego lasera jest oddzielona od wiązki 1064 nm, ale jest wprowadzana na tę samą ścieżkę wiązki, a następnie do obiektywu mikroskopu. Po osiągnięciu fizycznego wyrównania następuje pozycjonowanie wiązki 1064 nm na górze wiązki HeNe, co jest ułatwione dzięki zastosowaniu przeglądarki podczerwieni i różnych narzędzi do obrazowania wiązki w celu wizualizacji położenia i jakości wiązki. Następnie wprowadzany jest ekspander wiązki, a powstała w ten sposób rozszerzona wiązka podczerwieni jest wyrównywana na tylnej aperturze obiektywu. Na koniec obiektyw jest usuwany, a moc w każdej spolaryzowanej wiązce jest mierzona i regulowana za pomocą płytek falowych λ/2, aby były równe (Rysunek 1C). Pomiary mocy są również wykonywane po zwróceniu obiektywu i zazwyczaj występuje 53% strata mocy. Jest jednak wystarczająca moc, aby utworzyć stabilne, stałe i ruchome pułapki optyczne w płaszczyźnie ogniskowej (Rysunek 1D).

Do obrazowania transakcji DNA, mikroprzepływowe komórki odgrywają kluczową rolę, ponieważ umożliwiają kontrolowane pomiary na poziomie pojedynczej cząsteczki z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową (Rysunek 2). Termin mikroprzepływowy odnosi się do zdolności do manipulowania płynami w jednym lub kilku kanałach o wymiarach w zakresie od 5 do 500 μm10,11. Termin strumień odnosi się do rzeczywistego płynu w kanale, a kanał odnosi się do fizycznego kanału, w którym porusza się strumień lub strumienie płynu. Jednokanałowa konstrukcja komory przepływowej ma wspólny, fizyczny kanał, w którym obserwuje się reakcje i zwykle występuje tylko jeden strumień płynu. W związku z tym konstrukcje te są znane jako jednostrumieniowe komórki przepływowe. W przeciwieństwie do tego, wielostrumieniowe komórki przepływowe są definiowane jako urządzenie mikroprzepływowe, w którym dwa lub więcej kanałów wejściowych zbiega się w jeden, wspólny, fizyczny kanał (Rysunek 2A). We wspólnym kanale strumienie płynów, które pochodzą z poszczególnych kanałów, płyną równolegle do siebie i pozostają oddzielone, a tylko minimalne mieszanie między nimi następuje z powodu dyfuzji (Rysunek 2B). W większości konfiguracji eksperymentalnych pojedyncza pompa wpycha płyny do każdego kanału z tą samą prędkością. W przeciwieństwie do tego, gdy stosowane jest sterowanie graniczne, trzy lub więcej niezależnie sterowanych pomp przepycha płyny przez kanały. Jednak każda pompa pracuje z inną prędkością, ale natężenie przepływu netto we wspólnym kanale jest stałe12. Pozwala to na szybką wymianę elementów kanału głównego po prostu poprzez zmianę prędkości obrotowej pompy.

Oprócz przepływu laminarnego, kolejnym krytycznym czynnikiem jest paraboliczny profil prędkości w strumieniu płynu laminarnego. Największa prędkość przepływu występuje w środku strumienia, a najwolniejsza występuje przy powierzchniach (Rysunek 2C)13. Profil ten musi być brany pod uwagę, aby w pełni rozciągnąć cząsteczkę DNA, która jest przyłączona do kulki trzymanej w strumieniu, w celu precyzyjnej wizualizacji fluorescencyjnego DNA i dokładnych analiz pojedynczych cząsteczek. Tutaj DNA jest rozciągane do formy B i jest utrzymywane w miejscu pod presją siły 0 pN. Aby to osiągnąć, ogniskowanie pozycji pułapki optycznej powinno znajdować się w pozycji 10-20 μm od dolnej powierzchni szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2D). Należy zachować ostrożność, aby cząsteczka DNA nie została rozciągnięta poza formę B, ponieważ może to hamować reakcje enzymatyczne. W typowych warunkach buforowych 1 μm = 3 000 pz DNA14. Ponadto, poprzez uwięzienie 10-20 μm od szkiełka nakrywkowego, kompleks DNA jest umieszczany daleko od powierzchni, minimalizując w ten sposób oddziaływania powierzchniowe.

Do stworzenia kanałów urządzeń mikroprzepływowych użyto wielu metod, które można wykonać w laboratorium lub można zakupić komórki przepływowe z komercyjnych źródeł6,15,16,17. Optymalne materiały użyte do budowy komór przepływowych muszą być mechaniczne sztywne, optycznie przezroczyste o niskiej fluorescencji i nieprzepuszczalne dla rozpuszczalników organicznych6. Często stosuje się borokrzemianowe szkło float lub stopioną krzemionkę, aby zapewnić stabilne środowisko przepływu przez dłuższy czas, które jest odpowiednie do pułapkowania optycznego, wizualizacji i wykrywania siły. Materiały te pozwalają również na stosowanie rozpuszczalników niewodnych (np. metanolu klasy spektrofotometrycznej) w celu uproszczenia zwilżania powierzchni i usuwania pęcherzyków powietrza oraz denaturantów (np. chlorowodorku guanidyny 6M) lub detergentów do czyszczenia komory przepływowej. Wreszcie, metody stosowane do wprowadzania płynów do komórek przepływowych różnią się od złożonych systemów pomp próżniowych po pompy jednostrzykawkowe14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. W opisanym tutaj podejściu stosuje się pompę strzykawkową, która może pomieścić do 10 strzykawek (Rysunek 3A). Zapewnia to elastyczność w stosowaniu jednokanałowych komórek przepływowych lub komórek przepływowych z wieloma kanałami wlotowymi. W tym przypadku stosuje się trzykanałową komórkę przepływową, która jest połączona ze strzykawkami utrzymywanymi na miejscu na pompie strzykawkowej za pomocą rurki z poli-eteroeteroketonu (PEEK) (Rysunek 3A-C). Przepływ płynów jest kontrolowany przez czterodrogowe zawory przełączające, co służy do zminimalizowania wprowadzania pęcherzyków do komory przepływowej ( Rysunek 3A,D). Ponadto zalecane są gazoszczelne strzykawki Hamilton, które mają sztywne szklane ścianki i tłoki pokryte politetrafluoroetylenem (PTFE), ponieważ zapewniają wyjątkowo płynny ruch tłoka, który jest niezbędny do uzyskania płynnego przepływu14,27.

W opisanym systemie eksperymentalnym użyto komórek przepływowych z dwoma do pięciu kanałami wlotowymi. Liczba kanałów dolotowych jest podyktowana wykonywanym eksperymentem. Do badania RecBCD i Hop2-Mnd1 wystarczyły dwa kanały strumieniowe14,28. W przypadku helikazy enzym został związany z wolnym końcem DNA i poddany translacji do strumienia zawierającego magnez i ATP, aby zainicjować translokację i odwijanie. W przypadku Hop2-Mnd1 optycznie uwięzione DNA uległo translacji do sąsiedniego strumienia płynu zawierającego białka i bufor ± jonów metali dwuwartościowych. Zastosowanie komórek przepływowych z trzema kanałami umożliwia uwięzienie DNA w strumieniu 1, translację DNA w strumień 2, aby umożliwić wiązanie białka, a następnie strumień 3, w którym obecne jest ATP, na przykład w celu zainicjowania reakcji. Wariacją na temat powyższego jest użycie białka znakowanego fluorescencyjnie w kanale 2, co powoduje, że strumień płynu jest całkowicie biały i uniemożliwia wizualizację DNA. Kiedy ta cząsteczka jest translowana do strumienia 3, zarówno białka, jak i DNA są teraz widoczne po zainicjowaniu reakcji.

Użycie czterodrogowych zaworów przełączających do kontroli przepływu płynów jest kluczowym elementem systemu eliminującego pęcherzyki w komórkach przepływowych. Pęcherzyki są szkodliwe dla stabilnego przepływu płynu, ponieważ kurczą się i rozszerzają w nieprzewidywalny sposób, co powoduje gwałtowne zmiany prędkości przepływu i wprowadzenie turbulencji. Gdy zawory są umieszczone między strzykawkami a rurką wlotową, ścieżka przepływu jest rozłączana poprzez zmianę położenia zaworu podczas wymiany strzykawek. Po umieszczeniu nowej strzykawki na miejscu, tłok można ręcznie wcisnąć, aby wyrzucić >6 μl (martwa objętość zaworu), co prawie całkowicie eliminuje pęcherzyki.

Dołączanie łączników do komórek przepływowych jest często krokiem ograniczającym szybkość użytkowania komór przepływowych. Opisujemy zastosowanie dwóch rodzajów złączy: wymiennych zwanych wciskanymi i stałych (zespoły nanoportów). Zdejmowane złącza są łatwe do przyklejenia do komory przepływowej, a różne rodzaje elastycznych rurek oprócz zalecanego PTFE mogą być testowane za pomocą tych złączy. Jest to szybki i ekonomiczny sposób testowania przewodów i złączy bez poświęcania droższych szklanych komórek przepływowych. W przeciwieństwie do tego, zespoły nanoportów są przymocowane na stałe, wytrzymują ciśnienie do 1,000 psi, a w naszych rękach ich zastosowanie jest ograniczone do rurek PEEK o różnych średnicach. Nie jest to wada, ponieważ preferowane jest stosowanie rurek PEEK. Pojedyncza szklana cela przepływowa z przymocowanymi stałymi zespołami może być ponownie używana przez ponad 1 rok przy ostrożnym użytkowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Laserowe wyrównywanie pułapek i testowanie za pomocą kulek polistyrenowych

UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji, zapoznaj się z Rysunek 1A,B.

UWAGA: Eksperymentator powinien nosić odpowiednie okulary ochronne lub okulary ochronne podczas ustawiania wiązki laserowej. Ponieważ opisany tutaj system pęsety optycznej wykorzystuje zarówno wiązki HeNe, jak i IR, wymagane są dwa oddzielne zestawy laserowego szkła bezpiecznego.

  1. Wyrównanie wiązki HeNe
    1. Umieść wszystkie elementy optyczne na płytce stykowej. Ustaw płytkę stykową tak, aby znajdowała się jak najbliżej kąta 90° w stosunku do mikroskopu.
    2. Przymocuj pasującą rurkę zawierającą obiektyw i soczewkę telan do mikroskopu (Rysunek 1A-11,12).
      UWAGA: Soczewka telan to system soczewek, który służy do ustawiania ostrości obrazu na pośredniej płaszczyźnie obrazu w okularach.
    3. Włącz laser HeNe i otwórz migawkę (Rysunek 1A-18). Wiązka powinna padać na filtr (Rys. 1A-3) na wysokości 54 mm odbijając 50% światła na lustro 5 (Rys. 1A-5). Pozostałe 50% wiązki pada na lustro 4 (Rysunek 1A-4) na tej samej wysokości co lustro 3.
    4. Wyreguluj lustro 4 (Rysunek 1A-4) tak, aby wiązka padała na lustro 6 (Rysunek 1A-6) na wysokości 51 mm.
    5. Wyreguluj lustro 6 (Rysunek 1A-6) tak, aby wiązka była skierowana na dolne lustro galwaniczne na wysokości 51 mm. Promień wychodzący z górnego zwierciadła galwanicznego będzie miał wysokość 57,5 mm.
    6. Ustaw lustro 3 (Rysunek 1A-3) tak, aby ta wiązka padała na lustro 5 (Rysunek 1A-5) na wysokości 57,5 mm. Po odbiciu od lustra 5 wiązka powinna uderzyć w lustro 9 (Rysunek 1A-9) na tej samej wysokości. Promień jest efektywnie rekombinowany w zwierciadle 9, przechodzi przez obiektyw, a system soczewek telanowych na zwierciadło 21 (Rysunek 1A-21), który odbija go do obiektywu.
    7. Umieść czyste szkiełko mikroskopowe na stoliku mikroskopu. Włącz kamerę i zobrazuj wiązki stałe i skanujące pojedynczo na ekranie. Zaczynając od lustra 3, następnie 5 i 9, a na końcu 21, wykonaj małe korekty, aby ustawić stałą wiązkę na środku ekranu.
    8. Aby upewnić się, że kąt wiązki wychodzącej ze zwierciadła 21 wynosi 90°, zmień wysokość Z mikroskopu i umieść obrazowaną wiązkę na górnej i dolnej powierzchni szkiełka. Gdy są identyczne, belka znajduje się we właściwej pozycji, która jest prostopadła do stolika. Migawkę tej wiązki należy uruchomić za pomocą migawki 19 (Rysunek 1A-19).
    9. Począwszy od lusterek 4 i 6, wykonaj małe korekty, aby ustawić stałą wiązkę na środku ekranu. Przesłona tej wiązki.
  2. Wyrównanie wiązki podczerwieni (IR)
    UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa wykonuj wszystkie czynności przy niskiej mocy lasera.
    1. Dostosuj płytę falową 14 (Rysunek 1A-14), aby dostosować stosunek przekazywanych i odbitych wiązek rozdzielanych w rozdzielaczu wiązki 2 (Rysunek 1A-2). Rozdzielacz wiązki 2 odbija składową s wiązki laserowej i przesyła składową p.
    2. Wiązka przechodząca przez 2 uderza w zwierciadło 7 (Rysunek 1A-7), które odchyla wiązkę na dolne zwierciadło galwaniczne. Powinien podążać za ścieżką wiązki HeNe na zwierciadło 21. Wykonaj małe ruchy lustra 7, aby osiągnąć to położenie.
    3. Wyreguluj lustro 2 tak, aby wiązka odbita przez lustro 2 padała na lustro 10 (Rysunek 1A-10) na wysokości 57,5 mm.
    4. Wiązka odbijana jest od zwierciadła 10 do zwierciadła 8 (Rysunek 1A-8) na wysokości 57,5 mm. Kolejna wiązka powinna padać na lustro 9 na tej samej wysokości. Jeśli nie, w razie potrzeby dokonaj niewielkich regulacji lusterek 10 i 8.
    5. Zdejmij obiektyw i umieść głowicę miernika mocy nad portem w wieżyczce obiektywu.
    6. Użyj tablic 14, 15 i 16 (Rysunek 1A-14,15,16), aby dostosować moc każdej wiązki laserowej tak, aby były równe, jak pokazano na Rysunek 1C.
    7. Umieść ekspander wiązki 1 (Rysunek 1A-1) na miejscu. Dostosuj rozszerzoną wiązkę lasera tak, aby była okrągła, bez śpiączki lub astygmatyzmu.
    8. Aby przetestować pułapki optyczne, przygotuj roztwór kulek polistyrenowych o wielkości 1 μm zawieszonych w wodzie. Następnie umieść 10 μl tego roztworu na szkiełku mikroskopowym, umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i zaklej lakierem do paznokci. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i przetestuj pułapki optyczne, chwytając te kulki 1 μm. Upewnij się, że koraliki są zassane do pułapek i stabilnie trzymane, gdy stolik jest przesuwany. Zalewkowanie powinno odbywać się jednakowo skutecznie ze wszystkich stron pułapki.

2. Przygotowanie komory mikroprzepływowej

  1. Jeśli cela przepływowa jest komercyjnie skonstruowanym urządzeniem wykonanym z polidimetylosiloksanu (PDMS) na szkiełku nakrywkowym, przejdź do kroku 3. Jeśli jest to szklane urządzenie z dołączonymi złączami, przejdź do kroku 4.
  2. Jeśli komora przepływowa nie ma dołączonych złączy, najpierw przymocuj je do otworów wejściowych w szkiełku mikroskopu. Zobacz krok 3, aby zapoznać się z krokami podłączania złączy.

3. Połączenia komórek przepływowych za pomocą komory przepływowej PDMS

UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji, zapoznaj się z Rysunek 2D.

  1. Umieść kuwetę przepływową na czystej, płaskiej powierzchni. Przytrzymaj rurkę PTFE w odległości 3 mm od wolnego końca za pomocą kleszczy. Wsuń rurkę do wstępnie uformowanego portu (port może wytrzymać ciśnienie w przewodzie 2 bary).
  2. Powtórz tę procedurę dla każdego z pozostałych portów. Podłącz porty wlotowe do pompy strzykawkowej, a wylot do butelki na odpady (Rysunek 4A,B).
  3. Napełnij każdą szklaną strzykawkę 1 ml spektrofotometrycznego metanolu. Podłączyć każdą strzykawkę do zaworu przełączającego. Upewnij się, że zawór ma wylot skierowany do odpadów i oczyść każdy przewód 50 μl metanolu (Rysunek 4C, pozycja zamknięta).
  4. Przełącz pozycję wylotu na komórkę przepływową (Rysunek 4C, pozycja otwarta). Przepompuj 800 μl metanolu przez komorę przepływową z natężeniem przepływu 100 μl/h, aby zwilżyć powierzchnie i wyeliminować pęcherzyki.
  5. Następnego dnia powtórz ten proces, używając 800 μl ultraczystej wody. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia.

4. Mocowanie złączy rurowych wciskanych

UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji, zapoznaj się z Rysunek 2F.

  1. Jeśli mają być używane złącza rurek wciskane, ostrożnie usuń taśmę samoprzylepną z jednej strony złącza i umieść ją nad otworem w szkiełku mikroskopu. Naciśnij i przytrzymaj przez kilka sekund. Powtórz ten proces dla pozostałych łączników.
  2. Umieść kuwetę przepływową na czystej, płaskiej powierzchni. Przytrzymaj rurkę PTFE w odległości 3 mm od wolnego końca za pomocą kleszczy. Wsuń rurkę do wstępnie uformowanego otworu w porcie i powtórz tę procedurę dla każdego z pozostałych portów.
  3. Podłącz rurki od wlotów do zaworów przełączających. Przejdź do kroku 7.

5. Dołączanie stałych zespołów

UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji, zapoznaj się z Rysunek 2A-C.

  1. Wykonaj mocowanie na czystej, płaskiej powierzchni lub na specjalnie zbudowanym kolektorze, aby utrzymać komórkę przepływową i złącza na miejscu podczas klejenia.
  2. Umieść celę przepływową na czystej, płaskiej powierzchni lub we wgłębionej części kolektora ( Rysunek 2B). Umieść niewielką ilość kleju do szkła na spodzie zespołu i włóż uszczelkę.
  3. Umieść nanoport nad jednym z otworów wejściowych w szkiełku mikroskopu. Delikatnie dociśnij i przytrzymaj w miejscu, bez ruchu bocznego. Powtórz ten proces dla pozostałych portów.
  4. Pozostawić do wyschnięcia lub clamp na miejscu w kolektorze. Delikatnie wyjmij celę przepływową z kolektora i upewnij się, że zespoły są dobrze wyrównane z otworami wejściowymi w komorze przepływowej. Przejdź do kroku 7, gdy będziesz gotowy.

6. Połączenia i przygotowanie komór przepływowych

UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji, zapoznaj się z Rysunek 4A,B.

  1. Umieść komórkę przepływową na stoliku mikroskopu. Przymocuj rurkę za pomocą złączy dokręcanych palcami.
  2. Napełnij każdą szklaną strzykawkę 1 ml spektrofotometrycznego metanolu. Podłączyć każdą strzykawkę do zaworu przełączającego. Upewnij się, że zawór ma wylot skierowany do odpadów i oczyść każdy przewód 50 μl metanolu (Rysunek 4C, pozycja zamknięta).
  3. Przełącz pozycję wylotu na komórkę przepływową (Rysunek 4C, pozycja otwarta). Przepompuj 800 μl metanolu przez komorę przepływową z natężeniem przepływu 100 μl/h, aby zwilżyć powierzchnie i wyeliminować pęcherzyki.
  4. Następnego dnia powtórz ten proces, używając 800 μl ultraczystej wody. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia.

7. Kontrola przepływu płynu

  1. Przekręć zawory przełączające do pozycji zamkniętej (Rysunek 4C). Wyjąć strzykawki, wylać pozostałą wodę i napełnić strzykawki roztworami doświadczalnymi, na przykład kulkami DNA; enzym; oraz ATP. Włożyć strzykawki z powrotem do pompy i podłączyć je do zaworów przełączających.
  2. W tej pozycji należy ręcznie wcisnąć tłoki o 5-10 μl, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Zmień pozycję zaworu przełączającego na Otwarty.
  3. Użyj schematu natężenia przepływu, aby uzyskać optymalną prędkość przepływu płynu do wychwytywania i wizualizacji, jak opisano w Tabeli 1. Optymalny przepływ płynu do pułapkowania optycznego powinien umożliwiać stabilne uwięzienie kulek, a po rozciągnięciu DNA powinno mieć formę B (~3,000 bp/μm).

8. Pułapkowanie kulek polistyrenowych z dołączonymi pojedynczymi cząsteczkami DNA

  1. Przy 10-krotnym powiększeniu zlokalizuj granicę między strumieniami płynu w pobliżu punktów wejścia do kanału. Dodaj olej do obiektywu 100x i przełącz na większe powiększenie.
  2. Otwórz przesłony pułapek optycznych (obu lub pojedynczo). Skupione wiązki laserowe powinny zatrzymywać koraliki, a DNA powinno natychmiast się rozciągać.
  3. Gdy kompleks zostanie uwięziony, przełóż scenę prostopadle do przepływu (Rysunek 3A,C, wstawka). Spowoduje to przeniesienie uwięzionego kompleksu z roztworu kulek DNA do strumienia 2. Dalsza translacja przeniesie kompleks do strumienia 3.

9. Czyszczenie komory przepływowej

UWAGA: Wykonuj to codziennie.

  1. Wyłącz pompę po zakończeniu eksperymentu. Przekręć zawory przełączające do pozycji zamkniętej (Rysunek 4C).
  2. Wyjąć strzykawki i opróżnić je. Spłucz trzykrotnie przefiltrowaną wodą destylowaną.
  3. Napełnić strzykawki roztworem czyszczącym. Umieścić strzykawki w pompie i podłączyć do zaworów przełączających.
  4. Przedmuchnąć zawory przełączające i zmienić pozycję na otwarte. Przepompować 800 μl roztworu czyszczącego z natężeniem przepływu 100 μl/h, zwykle przez noc.
  5. Następnego dnia zamknij zawory przełączające, a następnie wyjmij i spłucz strzykawki wodą. Przepłukać komorę przepływową i przewody 4-800 μl wody o natężeniu przepływu 400-800 μl/h. Jeżeli wymagane jest bardziej intensywne czyszczenie komór przepływowych, należy zastąpić roztwór czyszczący 6 M chlorowodorkiem guanidu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstępne testy wyrównania i wytrzymałości pułapki są wykonywane za pomocą 1 μm, niefluorescencyjnych kulek polistyrenowych. Ponieważ większość badań przeprowadzonych w laboratorium wykorzystuje fluorescencję, dodatkowo testujemy wytrzymałość pułapki za pomocą 1 μm, kulek polistyrenowych Dragon green (Rysunek 1D, E). Następnie prace przechodzą do optycznego pułapkowania kompleksów DNA-kulek, w których DNA jest barwione barwnikiem interkalacyjnym bis-interkalacyjnym YOYO-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staranny montaż systemu przepływu ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego wyniku eksperymentów 4,6. Jednym z najtrudniejszych aspektów protokołu jest przymocowanie złączy do powierzchni szkła. W tym celu stosujemy następujące dwa podejścia: złącza rurowe pasowane na wcisk i zespoły nanoportów. Złącza wciskane łatwo przylegają do szkła, a następnie wciskają rurki PTFE do wstępnie uformowanych otworów za pomocą kleszczyków. Gdy wymagane jest bardziej stabilne mocowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor deklaruje brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w laboratorium Bianco są wspierane przez granty NIH GM100156 i GM144414 dla P.R.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100-krotny obiektywLeica506318 lub 506038 Oil soczewkiimmersyjne; Tylko obrazowanie i pułapkowanie optyczne; Plan Obiektywy APO zoptymalizowane pod kątem obrazowania fluorescencyjnego
10X ObiektywLeica506263Służy do lokalizowania plamek wiązek laserowych podczas wyrównywania; do znajdowania ostrości i pozycji X-Y w komorze przepływowej
Koraliki fluorescencyjne 1 mmBangsLabs FSDG004Służy do pomiaru wydajności gwintownika, określania pozycji ogniskowej
Koraliki polistyrenowe 1 mmBangsLabs CPO1004Służy do oceny działania pułapki i wiązania z biotynylowanymi cząsteczkami
63xLeica506081Służy do lokalizowania plamek wiązek laserowych podczas wyrównywania oraz do znajdowania ostrości i pozycji X-y w komórce przepływowej; może być używany do pułapkowania optycznego, ponieważ ma identyczną średnicę tylnej apertury jak 100X; soczewka olejowa
Laser wyrównującyLumentum1100 seriesLaser HeNe o mocy 10 mW, który jest widoczny gołym okiem, który służy do pozycjonowania optyki
Kamera do ustawiania wiązkiAmscopeMU303Prosta, niedroga i sterowana programowo kamera do obrazowania pozycji wiązki
Oprogramowanie do sterowania kamerą i przechwytywania obrazuHamamatsuHCImageKoordynuje działania Lambda DG4 z kamerą, aby ułatwić szybkie przełączanie długości fali
Kamera; Lampa błyskowa Orca 4Hamamatsuc13440-20cuKamera CCD do obrazowania eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami
Mocowanie C do kamery do ustawiania wiązkiRozwiązania do obrazowania punktowegoDE50CMTZapewnia optymalne ustawienie kamery do obrazowania wiązek laserowych podczas wyrównywania
Mocowanie C do kameryOrca Flash 4Posiada pierścień ustalający do przytrzymywania filtra blokującego podczerwień na miejscu. Eliminuje to odbitą wiązkę podczerwieni od pułapek optycznych i ułatwia wyraźniejsze obrazowanie uwięzionych obiektów.
Cy5  kostka filtra fluorescencyjnegoSemrockcy5-404a-lsc-zeroUżywany w połączeniu z Lambda DG4 do obrazowania tylko Cy5
Fitc-Txred  kostka filtra fluorescencyjnegoSemrockfitc/txred-2x-b-000Używany w połączeniu z Lambda DG4 do obrazowania węży FITC i TXRed
FluidicsGrace Bio46004Rurki PTFE jako alternatywa dla PEEK; Działa dobrze na niektórych komórkach przepływowych. Może być używany z komórkami przepływowymi PDMS lub szklanymi komórkami przepływowymi, gdy używane są złącza rurowe Grace Bio fit
Kostka filtra fluorescencyjnego GFPSemrockgfp-3035b-lsc-zeroUżywany w połączeniu z Lambda DG4 do obrazowania tylko
GFP Szklane komory przepływoweTranslumeCustomClear Flow do obrazowania (rys. 2E)
Klej do szkłaLoctite233841Bezpiecznie i łatwo łączy zespoły Nanoport ze szklanymi komórkami przepływowymi
Szklane/PDMS wielowarstwowe kuwety przepływoweCIDRA Precision ServicesIndywidualny projektKomory przepływowe zbudowane zgodnie z Twoimi specyfikacjami; kanały obrazowania są czyste (rys. 2C)
Hamilton Roztwór czyszczącyHamilton18311Delikatny, ale skuteczny roztwór czyszczący do szklanych komórek przepływowych; nie bąbelkuje przy ostrożnym użytkowaniu
System oświetleniaSutter InstrumentLamda DG4Wycofane więc polecam Lambda 721
System oświetleniaSutter InstrumentLamda DG4Wycofane tak polecam Lambda 721
Oprogramowanie do analizy obrazuCybernetyka mediówImage Pro PremiereAnaliza obrazów i śledzenie pojedynczych cząsteczek
Oprogramowanie do analizy obrazuFidżi/NIH Image/Image JSharewareAnaliza obrazów i śledzenie pojedynczych cząsteczek
Obraz karta wyświetlaczaMelles Griot06 DLA 001Alternatywny produkt od Thorlabs: VRC5
Olejek immersyjnyZeiss444960Immersol 518 F bez fluorescencji
Narzędzia do wyrównywania wiązki laserowejThor labsFMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 Służy do zapewnienia, że belki są poziome i znajdują się na odpowiedniej wysokości
Przeglądarka wiązki laserowejCanadian Photonics labsIR 3150Służy do obrazowania plamek wiązki IR na lustrach i  celach
Miernik mocy laseraThor labsPomiar mocy lasera oraz siły pułapki
Laserowe okulary ochronne (HeNe)Thor labsLG7 lub 8bloków >3 jednostki OD światła o długości fali >600 nm
Laserowe okulary ochronne (IR)Thor labsLG11Bloki >7 jednostek OD światła o długościach fal ³ 1000 nm
Mcherry  kostka filtra fluorescencyjnegoSemrockmcherry-a-lsc-zeroUżywany w połączeniu z Lambda DG4 do obrazowania tylko mcherry
UsuniętoLeicaDMIRE2DIC, aby dostosować go do dichroicznego lustra do wychwytywania/wyrównywania
Oprogramowanie sterujące mikroskopem UCSF/sharewareuManagerSteruje mikroskopem, umożliwia ogniskowe ustawienie obiektywów, a także kontrolę etapu
Zespół nanoportIDEXN333Złącza, które są połączone z komórkami przepływowymi
Obsługa stołu optycznegoThor LabsPA52502Obsługa aktywnego stołu izolacyjnego
Optyka i soczewkiSolar TIIRóżneZwierciadła interferencyjne, teleskopy i soczewki zaprojektowane specjalnie dla systemu
Komory przepływowe PDMSufluidixCustomKomory przepływowe zbudowane zgodnie z Twoimi specyfikacjami; kanały obrazowania są czyste (rys. 2B i D)Rurki
PEEKIDEX1532Zapewnia doskonałe połączenie z komórkami przepływowymi i zaworami przełączającymi
Kostka filtra fluorescencyjnego PinkelSemrocklf488/543/635-3x-a-000Używany w połączeniu z Lambda DG4 do szybkiego obrazowania wielu fluoroforów
Złącza rurkowe wciskaneGraceBio46003Przezroczyste złącze silikonowe z klejem, który dobrze wiąże się ze szkłem
Lusterka skanująceGSI LumonicsVM500Służy do zapewnienia kontroli drugiej pułapki optycznej. GSI Lumonics już nie istnieje. Podobne lustra można kupić w Cambridge Scientific
StageLeica
StageMikroskopia elektronowa Sciences68042-08Zapewnia linijkę ekranową do pozycjonowania wiązki i kalibracji systemu
Zawory przełączająceIDEXV-101TKontroluj kierunek przepływu płynu i eliminuj wprowadzanie pęcherzyków do komór przepływowych
Strzykawka i wyspa zaworowaWarsztat mechanicznyBrakZbudowana na zamówienie
pompa strzykawkowaAparat HarvardPHD 2000Kontroluje przepływ płynu przez komory przepływowe
Oprogramowanie pompy strzykawkowejKontrola przepływu Harvard Apparatus70-6000Flow control zapewnia płynną, programowalną kontrolę przepływu płynu
StrzykawkiHamilton81320Gazoszczelne, PTFE Luer Lock, szklane beczki z Tłoki pokryte teflonem
Blat stołuThor LabsT36HOpcjonalny blat stołu lub płytka stykowa
Laser pułapkującyNewport/Spectra PhysicsJ-series; BL106CNd:YAG laser; 1064 nm; laser 5W
obiektyw port DIC Mikrometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491(2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704(2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810(2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069(2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483(2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenia mikroprzep ywowebiochemia wizualnamikroskopia fluorescencyjnaprzep yw laminarnyprzygotowanie komory przep ywowejpompa strzykawkowarozci ganie DNApu apkowanie optyczne

Powiązane artykuły