Artykuł metodologiczny

Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64025

⸱

2 czerwca 2022

 ,  , 
1Umeå Centre for Molecular Medicine, Umeå University, 2Department of Histology and Embryology, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Test CAM-Delam do oceny zdolności przerzutowej komórek nowotworowych jest stosunkowo szybki, łatwy i tani. Metoda ta może być stosowana do odkrywania mechanizmów molekularnych regulujących powstawanie przerzutów oraz do badań przesiewowych leków. Zoptymalizowany test do analizy próbek ludzkich nowotworów może być metodą kliniczną spersonalizowanego leczenia raka.

Streszczenie

Główną przyczyną zgonów związanych z rakiem jest tworzenie przerzutów (tj. gdy komórki rakowe rozprzestrzeniają się z guza pierwotnego do odległych organów i tworzą guzy wtórne). Delaminacja, zdefiniowana jako degradacja blaszki podstawnej i błony podstawnej, jest początkowym procesem, który ułatwia transmigrację i rozprzestrzenianie się komórek rakowych do innych tkanek i narządów. Ocena zdolności delaminacyjnej komórek nowotworowych wskazywałaby na potencjał przerzutowy tych komórek.

Opracowaliśmy ustandaryzowaną metodę, test ex ovo CAM-Delam, do wizualizacji i ilościowego określenia zdolności komórek rakowych do rozwarstwiania i inwazji, dzięki czemu jesteśmy w stanie ocenić agresywność przerzutów. Krótko mówiąc, metoda CAM-Delam obejmuje wysiewanie komórek rakowych w silikonowych pierścieniach na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) piskląt w 10. dniu embrionalnym, a następnie inkubację trwającą od kilku godzin do kilku dni. Test CAM-Delam obejmuje użycie wewnętrznej wilgotnej komory podczas inkubacji zarodków piskląt. To nowatorskie podejście zwiększyło przeżywalność zarodków z 10%-50% do 80%-90%, co rozwiązało wcześniejsze problemy techniczne związane z niskimi wskaźnikami przeżywalności zarodków w różnych testach CAM.

Następnie, próbki CAM z powiązanymi klastrami komórek rakowych zostały odizolowane, naprawione i zamrożone. Na koniec próbki wycięte kriostatem zwizualizowano i przeanalizowano pod kątem uszkodzenia błony podstawnej i inwazji komórek rakowych przy użyciu immunohistochemii. Oceniając różne znane linie komórek nowotworowych z przerzutami i bez przerzutów, zaprojektowane do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP), wyniki ilościowe CAM-Delam wykazały, że wzorce zdolności delaminacji odzwierciedlają agresywność przerzutów i można je podzielić na cztery kategorie. Przyszłe zastosowanie tego testu, oprócz ilościowego określenia zdolności delaminacji jako wskaźnika agresywności przerzutowej, ma na celu rozwikłanie mechanizmów molekularnych kontrolujących delaminację, inwazję, tworzenie mikroprzerzutów i zmiany w mikrośrodowisku guza.

Wprowadzenie

Około 90% śmiertelności u pacjentów z rakiem jest spowodowane konsekwencjami przerzutów nowotworowych, które są powstawaniem wtórnych guzów w innych częściach ciała, z których rak pierwotnie pochodził1. Dlatego tak ważne jest zidentyfikowanie mechanizmów związanych z przerzutami, aby znaleźć potencjalne cele hamujące powstawanie przerzutów nowotworowych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na systemy modelowe, w których można ocenić proces przerzutowy.

Podczas przerzutów, komórki rakowe przechodzą przejście z nabłonka do mezenchymalnego (EMT), normalny proces komórkowy, w którym komórki nabłonkowe tracą swoje właściwości przylegania i polaryzacji, a zamiast tego nabierają inwazyjnego charakteru mezenchymalnego2. Delaminacja jest częścią procesu EMT i polega na degradacji lamininy w błonie podstawnej, co jest warunkiem wstępnym, aby komórki rakowe opuściły guz pierwotny i zaatakowały inne tkanki. Główne czynniki, które są regulowane w górę podczas tworzenia przerzutów, obejmują metaloproteinazy macierzy (MMP), ADAM (disinterginę i metaloproteinazę), ADAMTS (ADAM z motywami trombospondyny) i MMP typu błonowego (MT-MMPs) 3,4. Czynniki te degradują cząsteczki, takie jak laminina, która ulega ekspresji we wszystkich błonach podstawnych, aby ułatwić migrację i inwazję komórek.

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) zapłodnionego jaja pisklęcia jest rodzajem błony podstawnej. Zapłodnione jaja piskląt zostały wykorzystane jako modele przerzutowe, w których komórki rakowe zostały wysiane na pozaembrionalnym CAM, a następnie zaobserwowano przerzuty w zarodkach piskląt5. Ponadto często stosuje się mysie modele przerzutowe in vivo, w których komórki rakowe są wszczepiane myszom i analizowane są przerzuty w różnych narządach6. Takie podejście jest czasochłonne, kosztowne i może powodować dyskomfort u zwierząt. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy test CAM-Delam, szybszy i tańszy model do oceny agresywności przerzutowej komórek nowotworowych. W tym modelu zdolność komórek rakowych do degradacji CAM pisklęcia (np. zdolność delaminacji) jest łączona z potencjalną inwazją komórek rakowych do mezenchymy i wykorzystywana jako miara agresywności przerzutów.

Obecny artykuł, oparty na poprzedniej publikacji7, szczegółowo opisuje test CAM-Delam, od obchodzenia się z zapłodnionymi jajami piskląt, hodowli i wysiewu komórek rakowych, sekcji i analiz próbek CAM, aż po ocenę zdolności delaminacji komórek rakowych do czterech kategorii: nienaruszone, zmienione, uszkodzone i inwazjowane. Podajemy również przykłady, w jaki sposób można wykorzystać ten test do określenia mechanizmów molekularnych regulujących proces delaminacji.

Protokół

W skrócie, Rysunek 1 podsumowuje ogólne etapy testu CAM-Delam. Poniższy protokół opiera się na 30 hodowanych zapłodnionych jajach kurzych i wykorzystaniu dwóch różnych linii komórek rakowych wysianych oddzielnie w trzech pierścieniach / jajo i analizowanych w czterech punktach czasowych.

1. Inkubacja jaj

  1. Używaj zapłodnionych jaj piskląt z lokalnej wylęgarni, które gwarantują ponad 90% zapłodnienia
    UWAGA: Jaja nie powinny być przechowywane dłużej niż 4 dni w temperaturze pokojowej (RT). W Szwecji etyczna zgoda na eksperymentalne wykorzystanie zarodków kurcząt jest wymagana dopiero od 14 dnia embrionalnego (E) i później.
  2. W razie potrzeby ostrożnie zetrzyj mechanicznie wszelkie zabrudzenia lub pióra z jaj za pomocą suchego ręcznika papierowego lub zwilżonego w wodzie.
  3. Przed użyciem wyczyść i wysterylizuj inkubator jaj 70% etanolem (za każdym razem).
  4. Umieść żądaną liczbę jaj w tackach na jajka i wysiaduj jaja piskląt poziomo w inkubatorze do jaj w temperaturze 37,5-38 °C przy wilgotności 70%. Potraktuj to jako dzień inkubacji 0 (Rysunek 1A).

2. Przygotowanie łodzi do ważenia, plastikowych pudełek i narzędzi do preparacji

  1. Użyj 70% etanolu do sterylizacji 30 łódek wagowych i 30 małych plastikowych pudełek (~0,4 l) z przezroczystymi nakrętkami.
  2. Wysuszyć łódki wagowe i pudełka w okapie laminarnym przez noc (ON) i przechowywać w zamkniętym plastikowym pudełku do czasu dalszego użycia w 3. dniu inkubacji.
  3. Wysterylizuj 2 l destylowanego lub dejonizowanegoH2Ona 30 inkubowanych jaj.
  4. Wysterylizuj dwie pary nożyczek i trzy pary kleszczy, rozpylając 70% etanolu. Wysuszyć narzędzia na powietrzu, a następnie przechowywać je w wysterylizowanym pudełku do dnia inkubacji 3,
    UWAGA: Te czynności (kroki 2.1-2.4) można wykonać dowolny dzień przed 3. dniem inkubacji. Używaj rękawiczek, aby uniknąć zanieczyszczenia.

3. Otwieranie jaj i przenoszenie do wewnętrznej komory nawilżania

UWAGA: Używaj rękawiczek i maski na twarz, aby uniknąć zakażenia.

  1. Dodaj około 50 ml wysterylizowanegoH2Odo wysterylizowanych plastikowych pudełek. Pudełka wypełnione wodą należy przechowywać z zamkniętymi pokrywkami, aby uniknąć zanieczyszczenia, w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
  2. W 3 dniu inkubacji rozbij skorupkę jajka za pomocą ostrej części nożyczek i wytnij prosty otwór w skorupce.
  3. Ręcznie rozbij skorupkę jajka nad łodzią do ważenia i zbierz białko jaja, żółtko i dołączony do niego zdrowy zarodek w łodzi do ważenia (Rysunek 1B). Poszukaj nienaruszonego zarodka z bijącym sercem, nienaruszonym żółtkiem i rozwiniętymi naczyniami krwionośnymi do eksperymentu (>95% inkubowanych jaj). Wyrzuć jaja ze zniekształconym zarodkiem, zarodkiem bez bijącego serca, pękniętym żółtkiem jaja lub uszkodzonymi naczyniami krwionośnymi żółtka.
  4. Delikatnie przenieść łódkę ważącą do wewnętrznej komory nawilżanej.
    UWAGA: W przypadku kroków 3.2.-3.4. pracuj tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zanieczyszczenia, a jeśli to możliwe, użyj okapu laminarnego.
  5. Inkubuj wewnętrzną wilgotną komorę w inkubatorze do jaj (Rysunek 1C).
  6. Jaja bez skorupek należy hodować od 3 do 10 dnia w inkubatorze przed użyciem (patrz krok 3.6), a w razie potrzeby dodać wodę do inkubatora, aby utrzymać wilgotność 70%.
  7. Codziennie sprawdzaj wewnętrzne wilgotne komory przez przezroczystą plastikową pokrywę pod kątem martwych zarodków lub zanieczyszczonych jaj bez skorupek i wyjmij je z inkubatora.

4. Przygotowanie pierścieni silikonowych

  1. Aby przygotować silikonowe pierścienie, należy wyciąć silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej i zewnętrznej odpowiednio 4 mm i 5 mm o grubości ~1 mm, najlepiej za pomocą gilotyny do papieru (Rysunek 1D).
  2. Przenieś silikonowe pierścienie do małych szklanych butelek (Rysunek 1D), przykryj folią metalową i wysterylizuj je za pomocą autoklawu lub podobnego.
    UWAGA: Unikaj wielokrotnego autoklawowania nieużywanych pierścieni silikonowych, które mogą być zanieczyszczone, ponieważ takie traktowanie zmniejsza zdolność silikonowych pierścieni do przyczepiania się do membrany, a następnie wycieku roztworu komórki rakowej/kolagenu/RPMI na zewnątrz pierścieni.
  3. Przechowuj sterylne silikonowe pierścienie w RT.
    UWAGA: Ten krok można wykonać dowolny dzień przed 10 dniem inkubacji.

5. Przygotowanie komórek rakowych

UWAGA: Roztwory takie jak pożywka do hodowli komórkowych, trypsyna i 1x PBS są przechowywane w temperaturze 4 °C i powinny być podgrzane do 37 °C w łaźni wodnej przed dodaniem do komórek. Po podgrzaniu wypłucz butelki w 70% etanolu i wysusz przed użyciem.

  1. Hodowlę interesujących linii komórek nowotworowych w odpowiedniej pożywce hodowlanej w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w obecności 5% (v/v) CO2,
    UWAGA: W tym przypadku glejaka U251-GFP i komórki raka prostaty PC-3U-GFP hodowano w kompletnym pożywce RPMI z dodatkiem 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (PS).
  2. Zaplanuj hodowlę komórek nowotworowych tak, aby około 50 × 106 komórek rakowych było gotowych do pobrania w 10. dniu inkubacji testu CAM-Delam.
  3. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co 2-3 dni lub gdy kolor podłoża zmieni się z różowego na pomarańczowy/żółty.
  4. Opcjonalnie: Wywołaj niedotlenienie, traktując komórki rakowe CoCl2 w celu zbadania mechanistycznego wpływu molekularnego na delaminację 1 dzień przed pobraniem komórek.
    UWAGA: CoCl2 ma umiarkowaną toksyczność. Z wyciągiem należy obchodzić się ostrożnie i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Przygotować świeży roztwór podstawowy 20 mM CoCl2, rozpuszczając 0,0258 g w 10 ml sterylizowanego destylowanego H20 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
    2. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj 250 μl roztworu podstawowego 20 mM CoCl2 w 25 ml pożywki RPMI uzupełnionej 1% (v/v) PS (ale bez FBS) na naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm. Wiruj delikatnie.
    3. Usuń całą pożywkę RPMI z naczyń do hodowli komórkowych.
    4. Umyj komórki wysterylizowanym 1x PBS 2x.
    5. Dodać 25 ml pożywki RPMI z 200 μM trypsynizacjąkomórek CoCl 2 (patrz krok 5.6).
  5. W 10 dniu inkubacji jaj przygotuj 1 ml mieszanki kolagen/RPMI (stosunek 1:3), zawierającej 250 μl kolagenu typu I (5 mg/ml) i 750 μl pożywki RPMI do hodowli komórkowych uzupełnionej 10% FBS i 1% (v/v) PS. Trzymaj mieszankę kolagenu/RPMI na lodzie.
  6. Trypsynizuj komórki rakowe, aby wyizolować komórki, najpierw usuwając pożywkę do hodowli komórkowych i przemyj 2x 1x PBS.
  7. Dodać 3 ml roztworu trypsyny (0,05%) na naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm i inkubować przez 2-3 minuty w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż komórki się odłączą. Użyj stołowego, odwróconego mikroskopu, aby zobaczyć oderwane komórki. W razie potrzeby delikatnie postukać w bok kolby, aby usunąć pozostałe skupione lub przyczepione komórki.
  8. Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml kompletnej pożywki RPMI do każdej szalki do hodowli komórkowej i zbierz zawiesinę komórkową ze wszystkich szalek do hodowli komórkowych do probówki o pojemności 50 ml.
  9. Policz komórki rakowe metodą wykluczenia błękitu trypanowego, aby odróżnić żywe komórki od martwych za pomocą licznika komórek. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do 10 μl 0,4% barwienia błękitem trypanowym. Wymieszać próbkę, pipetując kilka razy w górę i w dół, a następnie załadować 10 μl mieszaniny komórek na komorę do szkiełka próbki w liczniku celi. Powtórz liczenie komórek 3 razy, aby zweryfikować numer komórki/ml.
  10. Obliczyć i odwirować zawiesinę do hodowli komórek o odpowiedniej objętości zawierającą 50 x10 6 żywych komórek rakowych w probówce o pojemności 50 ml przy 500 × g przez 5 minut.
  11. Odrzucić supernatant i wymieszać osad komórkowy z 1 ml mieszanki kolagen/RPMI. Ponieważ kolagen jest materiałem galaretowate, należy bardzo powoli i ostrożnie mieszać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby uniknąć utraty komórek w tworzeniu pęcherzyków.
  12. Przygotowaną zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie i przenieść do miejsca pracy z jajami.
    UWAGA: Unikaj zbyt długiego trzymania przygotowanych komórek rakowych na lodzie. Przygotowane komórki nowotworowe należy umieścić na CAM w ciągu 15-25 minut.

6. Wysiewanie komórek rakowych na CAM

UWAGA: Używaj rękawiczek i maski na twarz, aby uniknąć zakażenia.

  1. W 10 dniu inkubacji wyjmij z inkubatora wewnętrzne wilgotne komory z inkubowanymi jajami bez skorupek.
    UWAGA: Można wykorzystać około 90% początkowej liczby jaj z inkubacji; zobacz Rysunek 2.
  2. Otwórz wewnętrzną komorę nawilżania i umieść do sześciu silikonowych pierścieni na CAM za pomocą wysterylizowanych kleszczy.
    UWAGA: Unikaj umieszczania silikonowych pierścieni blisko siebie lub w pobliżu większych naczyń krwionośnych.
  3. Wymieszaj zawiesinę komórek rakowych przez pipetowanie, aby uzyskać równomierny rozkład komórek rakowych, i dodaj 20 μl (1 × 106 komórek) przygotowanej zawiesiny komórek rakowych do silikonowego pierścienia (Rysunek 1E). Podczas dodawania komórek trzymaj końcówkę pipety nad CAM, aby upewnić się, że membrana nie została uszkodzona.
    UWAGA: Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami7, różne komórki rakowe mogą być rozsiewane w oddzielnych pierścieniach na tym samym CAM.
  4. Zamknij wewnętrzną wilgotną komorę i umieść ją w inkubatorze do jaj.

7. Izolacja CAM wraz z powiązanymi komórkami nowotworowymi

  1. Po 14 godzinach, 1,5 dnia, 2,5 dnia i 3,5 dniu inkubacji wyjmij około siedmiu wewnętrznych nawilżonych komór i otwieraj pokrywy pojedynczo.
  2. Za pomocą nożyczek wypreparuj wyhodowane komórki rakowe przyczepione do CAM (tzw. próbki CAM-Delam), wycinając na zewnątrz silikonowy pierścień (Rysunek 1F).
  3. Natychmiast przenieść wyizolowaną próbkę CAM-Delam za pomocą kleszczy do 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) na szalce Petriego w celu utrwalenia tkanki. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez 1 h.
    UWAGA: Przechowywać 4% roztwór PFA w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 5 dni. UWAGA: PFA jest toksyczny. Podczas obchodzenia się z proszkiem PFA i roztworami PFA należy używać dygestorium oraz nosić maskę na twarz i rękawiczki. Unikaj wdychania oparów proszku lub roztworu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Odetnij głowę zarodkom kurczaka i wyrzuć je jako odpady biologiczne do specjalnych pojemników.
  5. Usunąć 4% roztwór PFA i dodać 30% sacharozy w 0,1 M PB do próbek CAM-Delam i równoważyć w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  6. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie zdejmij silikonowy pierścień za pomocą kleszczy. Za pomocą nożyczek wytnij próbkę CAM-Delam w kształcie prostokąta z komórkami rakowymi pośrodku (Ryc. 1G).
  7. Za pomocą kleszczy przenieść próbki CAM-Delam na zamrożoną pożywkę sekcyjną na szalce Petriego w celu usunięcia nadmiaru sacharozy, a następnie do zatopienia form w zamrożonym podłożu sekcyjnym.
  8. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść próbkę CAM-Delam w kształcie litery U w kierunku pionowym w formach do osadzania za pomocą dowolnego instrumentu przypominającego igłę (Rysunek 1G).
  9. Próbki CAM-Delam należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Cięcie próbek CAM-Delam

  1. Zamrożone próbki CAM-Delam należy podzielić na 10 μm na 5-6 kolejnych szkiełkach za pomocą kriosekcji.
  2. Szkiełka z sekcjami należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub stosować bezpośrednio do barwienia immunohistochemicznego.

9. Barwienie immunohistochemiczne

  1. Doprowadzić szkiełka z temperatury −80 °C do RT przez 5 minut przed rozpoczęciem immunoprotokołu.
  2. Wykonaj linię markerem hydrofobowym na slajdach w miejscu, w którym kończą się sekcje. Pozostaw je do wyschnięcia na kilka minut.
  3. Umieścić szkiełka w nawilżonej (H2O) komorze i przykryć skrawki ~200-500 μL roztworu blokującego (10% płodowej surowicy cielęcej i 0,1% azydku sodu w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% Triton X-100 [TBST]) i inkubować przez 15-30 min.
    UWAGA: Począwszy od tego kroku, nigdy nie pozwól, aby szkiełka wyschły.
  4. Odlać roztwór blokujący i zastąpić go 100-150 μl pierwszorzędowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubować ON w temperaturze 4 °C. Najlepiej użyć króliczego przeciwciała anty-lamininy-111 do zdefiniowania blaszki podstawowej wraz z markerem komórek rakowych, jeśli nie używa się GFP lub innych znakowanych fluorescencyjnie linii komórek rakowych.
    UWAGA: W tym przypadku króliczy czynnik anty-von Willebranda został również użyty do wykrywania naczyń krwionośnych w CAM.
  5. Przygotuj trzy szklane kuwety wypełnione buforem TBST.
  6. Odlewać roztwór przeciwciała pierwotnego, przenosić szkiełka do szklanych kuwet i myć co najmniej 3 razy przez 5 minut każda w TBST.
  7. Usuń nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej za pomocą miękkiej chusteczki papierowej.
  8. Przykryć szkiełko 100-150 μl odpowiedniego drugorzędowego przeciwciała fluorescencyjnego rozcieńczonego w roztworze blokującym w połączeniu z dichlorowodorkiem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  9. Odlewać roztwór przeciwciał wtórnych, przenosić szkiełka do szklanych kuwet i myć co najmniej 3x przez 5 minut każda w TBST.
  10. Usuń nadmiar TBST ze szkiełka i z obszaru bariery hydrofobowej za pomocą miękkiej chusteczki papierowej.
  11. Zamontuj szkiełka, umieszczając na szkiełku 1-2 krople fluorescencyjnego medium montażowego i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza.
  12. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C przed analizą i przechowywać je w temperaturze 4 °C.

10. Obrazowanie mikroskopowe i ocena delaminacji

  1. Sfotografuj przekroje za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w aparat cyfrowy, najlepiej w 10-krotnym powiększeniu (Rysunek 1H).
  2. Przeanalizuj sekcje przy użyciu następujących kategorii punktacji CAM-Delam (Rysunek 3):
    1. Poszukaj nienaruszonej blaszki podstawy bez widocznych zmian.
    2. Poszukaj zmienionej, ale nieuszkodzonej blaszki podstawnej.
    3. Poszukaj uszkodzonej blaszki podstawnej bez inwazji komórek.
    4. Poszukaj uszkodzonej blaszki podstawnej z inwazją komórek.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia kluczowe etapy testu CAM-Delam7. Zastosowanie wewnętrznych komór nawilżających (Rycina 1C) znacząco poprawiło przeżywalność zarodków kurzych z poziomu <50% do 90% w 10. dniu inkubacji oraz z ~15% do 80% w 13. dniu inkubacji (Rycina 2).

Inkubacja hodowli zarodków, sekcja i analiza tkankowa z wykorzystaniem mikroskopii i obrazowania fluorescencyjnego.
Rysunek 1: Kluczowe etapy testu CAM-Delam. (A) Inkubuj zapłodnione jaja kurze w pozycji poziomej bez obracania. (B,C) W 3. dniu inkubacji rozbij jaja i umieść je w sterylnych łódkach wagowych (B), a następnie ustaw łódki w wewnętrznej komorze nawilżonej do dalszej inkubacji (C). (D) Przygotuj pierścienie silikonowe. (E) W 10. dniu inkubacji umieść pierścienie silikonowe na błonie CAM i za pomocą pipety nanieś 1 x 106 komórek nowotworowych do wnętrza pierścieni. (F,G) W różnych punktach czasowych (od godzin do dni) wykonaj sekcję CAM z przytwierdzonymi komórkami nowotworowymi, (F) utrwal w PFA, poddaj działaniu sacharozy, umieść w medium do mrożenia sekcji, (G) i zamroź w −80 °C. (H) Przykład przekroju CAM z powiązanymi komórkami nowotworowymi GFP+ (kolor zielony) i barwieniem immunohistochemicznym lamininy (kolor czerwony). Paski skali = 2 mm (E,F), 1 mm (G) i 100 µm (H). Rysunek pochodzi z pracy Palaniappan et al.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; PFA = paraformaldehyd; GFP = zielone fluorescencyjne białko. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie przeżywalności zarodków na wykresach słupkowych; analiza statystyczna z poziomami istotności, E10-E13.
Rysunek 2: Przeżywalność zarodków kurzych w zależności od metody inkubacji. (A,B) W 10. dniu inkubacji przeżywalność zarodków kurzych w wewnętrznych HC była dwukrotnie wyższa (wartość średnia 89,33; N = 105) w porównaniu z inkubacją w szalkach Petriego (A; wartość średnia 40; N = 64) i w komorach niewilgotnionych (B; wartość średnia 48,67; N = 46). (C,D) W 13. dniu inkubacji nadal obserwowano wysoką przeżywalność przy użyciu HC (wartość średnia 81,67; N = 105), podczas gdy znaczny spadek przeżywalności zarodków odnotowano przy użyciu PD (C; wartość średnia 11,33; N = 64) oraz N-HC (D; wartość średnia 18,33; N = 46). Istotność statystyczną badano za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Palaniappan i wsp.7. Skróty: HC = komora wilgotniona; PD = szalki Petriego; N-HC = komora niewilgotniona; E X = dzień inkubacji X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analizy różnych linii komórek nowotworowych wykazujących ekspresję GFP (glioblastoma U251, prostaty PC-3U, jelita grubego SW620 i płuc A549) z wykorzystaniem tego protokołu zostały opisane wcześniej przez Palaniappana i wsp.7. Wyniki testu CAM-Delam obejmują różnice w morfologii błony podstawnej, wykryte za pomocą lamininy, oraz inwazję komórek nowotworowych, definiowaną jako komórki, które przeniknęły przez warstwę błony podstawnej kurczaka do warstwy mezo-dermalnej kurczaka (Rycina 3). Wyniki te pokazują, że zdolność komórek nowotworowych do degradacji błony podstawnej i inwazji w tkankę mezenchymalną można zakwalifikować do jednej z czterech kategorii: 1) nienaruszona błona podstawna bez widocznych zmian (Rycina 3B), 2) zmieniona, ale nieuszkodzona błona podstawna (Rycina 3C), 3) uszkodzona błona podstawna bez inwazji komórkowej (Rycina 3D) oraz 4) uszkodzona błona podstawna z inwazją komórkową (Rycina 3E). Inną obserwacją było to, że w przypadku, gdy komórki nowotworowe powodowały zmianę lub uszkodzenie błony podstawnej, błona CAM ulegała również pogrubieniu wraz ze zwiększeniem formowania naczyń krwionośnych, co określono za pomocą barwienia przeciwciałami przeciwko czynnikowi von Willebranda, który jest syntetyzowany w naczyniach krwionośnych8 (Rycina 4C-H). Te dwa fenotypy, pogrubiona błona CAM i zwiększone formowanie naczyń krwionośnych, nie były obserwowane, gdy błona CAM była nienaruszona (Rycina 4A,B).

Seria obrazów z mikroskopii konfokalnej lamininy/GFP pokazująca stadia tkanki: kontrolna, nienaruszona, zmieniona, uszkodzona, inwazja.
Rysunek 3: Punktacja CAM-Delam. (A-E) Przykład punktacji CAM-Delam w oparciu o integralność błony podstawnej błony chorioallantoicznej (CAM), wizualizowaną za pomocą przeciwciał anty-laminina (czerwony), oraz potencjalną inwazję komórek nowotworowych wykazujących ekspresję GFP (zielony). (A) Kontrolna błona CAM bez komórek nowotworowych. (B-E) W odpowiedziach na komórki nowotworowe można ocenić cztery kategorie opisujące morfologię błony podstawnej: (B) nienaruszona laminina, (C) zmieniona, ale nieuszkodzona laminina (oznaczona gwiazdką), (D) uszkodzona laminina, ale bez inwazji komórek nowotworowych (strzałki), uszkodzona laminina z inwazją komórkową (groty strzałek). Pasek skali = 100 µm (A-E). Rysunek pochodzi z pracy Palaniappan et al.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza histologiczna, Laminina/DAPI i vWF, stany tkanek, obrazy mikroskopii fluorescencyjnej.
Rycina 4: Ocena pogrubienia błony CAM i formowania naczyń krwionośnych. (A-H) Przykład wizualizacji pogrubienia CAM i formowania naczyń krwionośnych, wykrytego za pomocą przeciwciał przeciwko czynnikowi Von Willebranda (kolor czerwony), w odpowiedzi na blaszkę z różnymi typami komórek nowotworowych. (A,B) Kontrolna błona CAM bez komórek nowotworowych. (C,D) W odpowiedzi na linię komórek nowotworowych niemetastatycznych (sklasyfikowaną jako Intact) nie stwierdzono wyraźnego pogrubienia mezenchymy ani zwiększonego formowania naczyń krwionośnych. (E-H) W odpowiedzi na metastatyczne komórki nowotworowe, prowadzące do zmienionej lub uszkodzonej lamininy, zaobserwowano pogrubienie mezenchymy (oznaczone podwójnymi grotami strzałek) oraz zwiększone formowanie naczyń krwionośnych (oznaczone strzałkami). Pasek skali = 100 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Palaniappan i wsp.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Komórki glejaka U251 i komórki raka prostaty PC-3U są dwoma przykładami linii komórkowych raka o całkowicie różnych zdolnościach do delaminacji (Rysunek 5). Komórki PC-3U wywołały uszkodzenie lamininy po 1,5 dniach, a wyraźna inwazja wystąpiła po 2,5 dniach (Rysunek 5A). W przeciwieństwie do nich, komórki U251 wywołały jedynie niewielkie zmiany lamininy po 1,5–3,5 dniach, lecz nigdy nie spowodowały żadnych widocznych uszkodzeń lamininy (Rysunek 5B).

Mikroskopia inwazji lamininy/GFP pokazująca wzrost komórek PC-3U/U251 w czasie wraz z analizą wykresu danych.
Rycina 5: Wizualizacja zdolności do delaminacji komórek raka prostaty (PC-3U) i glejaka (U251). (A) Komórki PC-3U wywołały niewielkie zmiany lamininy po 14 h, uszkodzenie lamininy po 1,5 dnia (strzałka) oraz początek inwazji po 2,5 dnia, która nasiliła się po 3,5 dniach (groty strzałek). (B) Komórki U251 spowodowały niewielkie zmiany lamininy po 1,5-3,5 dniach. Prawe panele przedstawiają wykresy obrazujące ocenę CAM-Delam. Oś y wskazuje liczbę próbek, a oś x wskazuje punkty czasowe hodowli. Pasek skali = 100 µm (A,B). Ta rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Palaniappan i wsp.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Test CAM-Delam może być wykorzystany do określenia mechanizmów molekularnych regulujących proces delaminacji. Przykładem jest zastosowanie CoCl2 w celu indukcji hipoksji, z jednoczesnym lub bez inhibitowania metaloproteinaz macierzy (MMP) przy użyciu nieswoistego inhibitora MMP GM6001 (Rysunek 6). Po traktowaniu CoCl2 niemetastatyczne komórki nowotworowe U251 nabyły zdolności do indukowania delaminacji i tworzenia komórek inwazyjnych, co zostało zahamowane, gdy traktowanie CoCl2 połączono z inhibitorem MMP GM6001 (Rysunek 6). Zatem test CAM-Delam może być przydatny przy określaniu cząsteczek i szlaków molekularnych wpływających na proces delaminacji.

Mikroskopia fluorescencyjna lamininy/GFP komórek U251 po traktowaniu CoCl2, 3,5 dnia, analiza komórkowa.
Rysunek 6: Wzorce delaminacji w odpowiedzi na ekspozycję komórek U251 na sam CoCl2 lub w połączeniu z inhibitorem MMP. (A-C) Komórki U251 hodowane przez 3,5 dnia na CAM w różnych warunkach. (A) Hodowane osobno komórki U251 nie wywołały żadnych uszkodzeń lamininy. (B) Hodowane komórki U251 poddane uprzedniej ekspozycji na CoCl2 (24 h) przed przemyciem i wysianiem komórek na CAM wywołały uszkodzenie lamininy i inwazję komórek. (C) Wstępne traktowanie inhibitorem MMP o szerokim spektrum GM6001 (przez 1 h), a następnie ekspozycja na CoCl2 (24 h) przed przemyciem i wysianiem komórek U251 na CAM, zahamowało efekt traktowania CoCl2; nie stwierdzono wyraźnych uszkodzeń lamininy ani inwazji komórek nowotworowych. Pasek skali = 100 µm (A-C). Panele (B) i (C) pochodzą z pracy Palaniappan et al.7. Skróty: CAM = błona chorioallantoiczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne; CoCl2 = chlorek kobaltu; MMP = metaloproteinaza macierzy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W artykule opisano test CAM-Delam do oceny agresywności przerzutowej komórek nowotworowych, określonej przez ocenę modulacji blaszki podstawowej i potencjalnej inwazji komórek do mezenchymy w ciągu kilku godzin do kilku dni. Wcześniejszym problemem technicznym dla różnych testów CAM była niska przeżywalność zarodków piskląt. Problem ten został rozwiązany poprzez wprowadzenie stosowania wewnętrznej wilgotnościowej komory podczas inkubacji zarodków, co zwiększyło przeżywalność zarodków z 10%-50% do 80%-90%7. Zastosowanie wewnętrznej komory nawilżanej może być zatem cenne w testach CAM w ogóle, jak również w innych eksperymentach ex ovo na pisklętach.

Przedstawione punkty czasowe punktacji po 14 godzinach, 1,5 dnia, 2,5 dnia i 3,5 dnia po wysianiu 1 x 106 komórek nowotworowych na CAM opierają się na rygorystycznym opracowaniu metody z wykorzystaniem sześciu różnych linii komórek nowotworowych i są wystarczające do rozróżnienia zakresu od zdolności nierozwarstwiających się do rozwarstwiających z inwazją linii komórek rakowych. Sugeruje się użycie co najmniej czterech jaj z trzema pierścieniami w każdym punkcie czasowym i na linię komórkową, przy czym należy to powtórzyć co najmniej raz lub zgodnie z planami doświadczalnymi i wymogami statystycznymi. Jedną z zalet testu CAM-Delam jest uzyskanie w ciągu kilku dni pouczających wyników dotyczących zdolności komórek nowotworowych do delaminacji w celu oszacowania agresywności komórek nowotworowych i potencjalnego ryzyka powstania przerzutów. Szybkie dostarczanie wyników jest ułatwione dzięki monitorowaniu degradacji blaszki podstawnej spowodowanej inwazją komórek rakowych i późniejszymi mikroguzami/zawiązkami nowotworowymi i przerzutami do narządów. Tradycyjnie, modele CAM były wykorzystywane do analizy powstawania przerzutów do narządów, których określenie trwa około 2 tygodni9. Używając siedmiu różnych linii komórek rakowych, wcześniej zweryfikowaliśmy7, że ocena delaminacji jest związana ze zdolnością komórek rakowych do tworzenia przerzutów w modelach gryzoni 10,11,12,13,14, co potwierdza wartość predykcyjną testu CAM-Delam. Co więcej, modele mysie wymagają jeszcze dłuższego czasu, od kilku tygodni do miesięcy, zanim będzie można zbadać przerzuty15,16. Krótko mówiąc, ten opracowany test CAM-Delam, skoncentrowany na ocenie zdolności delaminacji, a nie na badaniu późniejszego powstawania guza w zarodku pisklęcia, jest zatem dobrym uzupełnieniem istniejących modeli inwazji CAM kurczaków i nowotworów myszy.

Ograniczeniem w teście CAM-Delam może być niejasna wizualizacja blaszki podstawnej, jeśli same komórki rakowe wyrażają lamininę. Jeśli tak,można użyć innych markerów wskazujących blaszkę podstawną, takich jak E-kadheryna7. Inne badania inwazji CAM wykorzystywały kolagen typu IV do wizualizacji CAM oraz pan-cytokeratyny i wimentyny w celu identyfikacji atakujących komórek rakowych i tworzenia mikroguzów / pąków nowotworowych17,18.

Delaminacja jest normalnym procesem komórkowym, zarówno podczas rozwoju, jak i w późniejszym życiu, który umożliwia komórkom opuszczenie nabłonka i migrację do innych tkanek. Przykładami rozwarstwiających się komórek podczas rozwoju są pionierskie neurony grzebienia nerwowego i węchu19,20; W późniejszym życiu gojenie się ran zależy od rozwarstwienia21. Podczas raka proces ten jest regulowany w górę w niewłaściwych komórkach i/lub w niewłaściwym czasie. W związku z tym metoda CAM-Delam może być przydatna do rozwikłania mechanizmów molekularnych regulujących delaminację, co miałoby znaczenie zarówno dla podstawowej wiedzy biologicznej, jak i chorobowej. Takie badania delaminacji obejmowałyby dodawanie interesujących czynników do komórek rakowych wysiewanych na CAM lub badanie genetycznie zmodyfikowanych komórek rakowych. Jednym z przedstawionych tutaj przykładów jest wstępne traktowanie CoCl2 nieprzerzutowej linii komórkowej U251 w celu wywołania niedotlenienia, co prowadzi do indukcji agresywnej zdolności przerzutowej, która może zostać stłumiona przez inhibitor MMP o szerokim spektrum działania. Tak więc znalezienie kluczowych cząsteczek kontrolujących delaminację zwiększa możliwość zaprojektowania inhibitorów hamujących ten proces. W związku z tym, innym potencjalnym zastosowaniem protokołu CAM-Delam jest badanie przesiewowe leków w celu zahamowania delaminacji i inwazji komórek. Ponadto w klinice ocena ciężkości raka jest kluczowym elementem diagnozy, planowania leczenia i opieki. Obecnie system oceny stopnia zaawansowania TNM (T, wielkość guza; N, węzeł - czy rak rozprzestrzenił się na węzły chłonne; M, przerzuty odległe) służy do oceny ciężkości nowotworu22. Test CAM-Delam definiuje innowacyjne podejście do oceny agresywności komórek nowotworowych i potencjalnego ryzyka powstawania przerzutów i może być użytecznym uzupełnieniem systemu oceny stopnia zaawansowania TNM. Warto zauważyć, że ocena stopnia zaawansowania TNM opiera się na analizach utrwalonych próbek tkanek, podczas gdy potencjalne kliniczne podejście CAM-Delam badałoby świeże lub świeżo zamrożone tkanki w połączeniu z technikami ożywiania zamrożonych komórek23.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Dziękujemy następującym badaczom z Uniwersytetu w Umeå za pomoc w opracowaniu odpowiednich linii komórek nowotworowych i przeciwciał: L. Carlsson (przeciwciało czynnika von Willebranda), J. Gilthorpe (U251) i M. Landström (PC-3U). Dziękujemy również firmie Hauke Holthusen z laboratorium Gilthorpe za stworzenie stabilnej linii komórkowej HEK293-TLR-AAVS1. Prace w laboratorium Gunhaga były wspierane przez Szwedzką Fundację Walki z Rakiem (18 0463), Inkubator Biotechnologiczny w Umeå, Norrlands Cancerforskningsfond, Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (2017-01430) oraz Wydział Medyczny Uniwersytetu w Umeå.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SPRZĘT
WirówkaRotanta 480 R, Hettich zentrifugen
Countess II FL Automatyczny licznik komórekInvitrogen
KriostatHM 505 E, Microm
Aparat cyfrowyNikon DS-Ri1
Mikroskop preparacyjnyLeica M10Do rozwarstwiania próbek CAM i umieszczania ich w formach
Inkubator do jajFiemDostępnych jest wiele innych źródeł. Przed każdym użyciem należy go oczyścić i wysterylizować 70% etanolem
Mikroskop epifluorescencyjnyNikon Eclipse, E800Wyposażony w aparat cyfrowy, do oceny rozwarstwienia i inwazji komórek.
Drobne kleszczejest wiele źródełNależy wysterylizować przed użyciem
Zamrażarka -80 & deg; CThermo Fisher Scientific8600 SeriesModel 817CV
Mikroskop odwróconyNikon Eclipse TS100Do prac z hodowlą komórkową
Nożyczki (małe)DostępnychPrzed użyciem należy wysterylizować
MATERIAŁY
anti-Laminin-111Sigma-AldrichL9393Primary przeciwciało anty-królicze (1:400)
anty-królik Cy3Jackson Immuno Research111-165-003Przeciwciało drugorzędowe (1:400)
czynnik anty-von WillebrandaDAKOP0226Przeciwciało pierwszorzędowe (1:100)

Chlorek kobaltu(II)		Sigma-Aldrich232696-5GUWAGA: substancja chemiczna o umiarkowanej toksyczności. Z urządzeniem należy obchodzić się ostrożnie tylko w dygestorium. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta
DAPISigma-AldrichD9542-10MG4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek (1:400)
Zapłodnione jaja kurzeStrö mbä cks & Auml; gg, Vä nnä s, SzwecjaKażdy lokalny dostawca jaj
Surowica bydlęcaLife Technologies10500-064
Fluorescencyjne medium montażoweAllent TechnologieS302380-2Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas montażu. Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze +4 stopni; C
Szklane komory na pierścienie silikonowejest wiele źródełUżyliśmy szklanych komór o pojemności 15 ml. W jednej komorze mieści się około 20 silikonowych pierścieni. Unikaj stłoczenia, ponieważ pierścienie mogą się sklejać i utrudniać pracę.
Szkiełka nakrywkowe szklaneVWR International631-0165
GM6001 Inhibitor MMPSigma-AldrichCC1010
Szkiełka mikroskopowe do immunohistochemiiFisher Scientific10149870
NEG-50 podłoże mrożoneCellab6506
ParaformaldehydSigma-Aldrich30525-89-4UWAGA: silnie toksyczny. Z wyciągiem należy obchodzić się ostrożnie, postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Używaj całej odzieży ochronnej.

Formy do osadzania Peel-A-Way		Polysciences18985
Penicylina– streptomycynaGibco15070063
szalki PetriegoSarstedt83.3903Średnica 15 cm do hodowli komórkowych
Plastikowe pudełkoEsclain
PureCol EZ GelCollagen Cellsystems5074-35ML5 mg / mL. Galaretowaty materiał. Pipetować bardzo powoli i ostrożnie, aby uniknąć utraty komórek w formacjach pęcherzykowych.
RPMI mediumThermo Fisher Scientific21875034
Pierścienie silikonoweVWR International228-1580Średnica wewnętrzna/zewnętrzna: 4/5 mm. Przed użyciem należy je wysterylizować. Unikaj wielokrotnego autoklawowania nieużywanych pierścieni.
Trypan niebieskiFisher ScientificT10282
TrypsinLife Technologi15400054 0,50%
Łodzie wagoweVWR International611-0094
SOLUTIONS
Collagen-RPMI mieszanina pożywek (1 ml)Compelete RPMI Media
750 µ L
         PureCol EZ Żel Kolagen
250 &mikro; L
         Wymieszaj i natychmiast użyj
Kompletne nośniki RPMI (500 ml)Nośniki RPMI
445 ml
         FBS
50 ml
         Penicylina– streptomycyna
5mL
         Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
PB (0,2 M; 1 000 mL)Na2HPO4 (MW 141,76)
21,9 g
         NaH2PO4 (MW 137,99)
6,4 g
         Dodaj wodę dejonizowaną do końcowej objętości 1000 ml
         Przechowuj w RT
PFA (4 %) w 0,1 M PB (100 ml)Woda dejonizowana
50 ml
         0,2 mln PB
50 ml
         Paraformaldehyd (PFA)
4g
         podgrzać do 60 stopni Celsjusza; C w kąpieli wodnej
         dodać 5 M NaOH
25 &mikro; L
         Wymieszaj, aby rozpuścić proszek PFA
         Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
TBST (1 000 mL)50mM Tris pH 7,4
50 mL
         150 mM NaCI
30 ml
         0,1% Triton X-100
10 ml
         H2O (MQ)
900 ml
Trypsyna (0,05 %; 10 ml)1x PBS
9 mL
         10x Trypsyna (0,5 %)
1 ml
         Łącznie 10 ml, przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z
Dostępnych jest wiele źródeł płodu Dostępnych

Bibliografia

  1. Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514(2021).
  2. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
  3. Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
  4. Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
  5. Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
  6. MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
  7. Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472(2020).
  8. Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P. Zebrafish von Willebrand factor. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (4), 326-333 (2010).
  9. Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
  10. Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
  11. Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
  12. Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
  13. Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
  14. Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
  15. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  16. Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
  17. Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
  18. Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895(2019).
  19. Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
  20. Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
  21. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
  22. Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
  23. Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inwazja kom rek nowotworowychzdolno do delaminacjib ona chorioallantoicznauszkadzanie b ony podstawnejimmunohistochemiamodel zarodka kurczakawysiewanie w pier cieniu silikonowymmikroskopia epifluorescencyjna
Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.