Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Regeneracja nabłonka jelit w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64028

⸱

27 lipca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

W tym artykule

Podsumowanie

Przewód pokarmowy jest jednym z najbardziej wrażliwych organów na uszkodzenia podczas radioterapeutycznego leczenia raka. Jest to jednocześnie układ narządów o jednej z najwyższych zdolności regeneracyjnych po takich zniewagach. Przedstawiony protokół opisuje skuteczną metodę badania zdolności regeneracyjnych nabłonka jelitowego.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy składa się z pojedynczej warstwy komórek, ale zawiera wiele typów komórek ostatecznie zróżnicowanych, które są generowane przez aktywną proliferację jelitowych komórek macierzystych znajdujących się na dnie krypt jelitowych. Jednak w przypadku ostrego uszkodzenia jelit te aktywne jelitowe komórki macierzyste ulegają śmierci komórkowej. Napromienianie promieniami gamma jest szeroko stosowaną metodą leczenia raka jelita grubego, która, choć skuteczna terapeutycznie, ma efekt uboczny w postaci wyczerpania aktywnej puli komórek macierzystych. Rzeczywiście, pacjenci często doświadczają zespołu promieniowania żołądkowo-jelitowego podczas radioterapii, częściowo z powodu aktywnego wyczerpania komórek macierzystych. Utrata aktywnych jelitowych komórek macierzystych w kryptach jelitowych aktywuje pulę typowo spoczynkowych rezerwowych jelitowych komórek macierzystych i indukuje odróżnicowanie komórek wydzielniczych i prekursorowych enterocytów. Gdyby nie te komórki, nabłonek jelitowy nie byłby w stanie zregenerować się po radioterapii i innych tego typu poważnych uszkodzeniach tkanek. Nowe postępy w technologiach śledzenia linii umożliwiają śledzenie aktywacji, różnicowania i migracji komórek podczas regeneracji i zostały z powodzeniem wykorzystane do badania tego zjawiska w jelitach. Badanie to ma na celu przedstawienie metody analizy komórek w nabłonku jelitowym myszy po urazie popromiennym.

Wprowadzenie

Nabłonek ludzkiego jelita pokryłby w przybliżeniu powierzchnię połowy boiska do badmintona, gdyby był całkowicie płaski1. Zamiast tego ta pojedyncza warstwa komórek oddzielająca ludzi od zawartości ich jelit jest zagęszczona w serię przypominających palce wypustek, kosmków i wgłębień, krypt, które maksymalizują powierzchnię jelit. Komórki nabłonka różnicują się wzdłuż osi krypta-kosmki. Biopsy składają się głównie z enterocytów wchłaniających składniki odżywcze, komórek kubkowych wydzielających śluz i komórek enteroendokrynnych wytwarzających hormony, podczas gdy krypty składają się głównie z komórek Panetha wytwarzających defensynę, aktywnych i rezerwowych komórek macierzystych oraz komórek progenitorowych2,3,4,5. Co więcej, dwukierunkowa komunikacja, jaką te komórki mają z komórkami zrębu i komórkami odpornościowymi leżącego poniżej przedziału mezenchymalnego i mikrobiotą światła, generuje złożoną sieć interakcji, która utrzymuje homeostazę jelit i ma kluczowe znaczenie dla powrotu do zdrowia po urazie6,7,8.

Nabłonek jelitowy jest najszybciej samoodnawiającą się tkanką w ludzkim ciele, z szybkością wymiany 2-6 dni9,10,11. Podczas homeostazy aktywne komórki macierzyste u podstawy krypt jelitowych (komórki kolumnowe podstawy krypty), oznaczone ekspresją receptora 5 sprzężonego z białkiem G bogatym w leucynę (LGR5), szybko się dzielą i dostarczają komórki progenitorowe, które różnicują się we wszystkie inne linie nabłonka jelitowego. Jednak ze względu na wysoki współczynnik mitotyki, aktywne komórki macierzyste i ich bezpośredni przodkowie są szczególnie wrażliwe na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem gamma i ulegają apoptozie po napromieniowaniu5,12,13,14. Po ich utracie, rezerwowe komórki macierzyste i komórki niemacierzyste (subpopulacja komórek progenitorowych i niektóre kończnie zróżnicowane komórki) w kryptach jelitowych ulegają aktywacji i uzupełniają podstawowy przedział krypty, który może następnie odtworzyć populacje komórek kosmków, a tym samym zregenerować nabłonek jelitowy15. Korzystając z technik śledzenia linii, wiele grup badawczych wykazało, że rezerwowe (spoczynkowe) komórki macierzyste są zdolne do wspierania regeneracji po utracie aktywnych komórek macierzystych13,16,17,18,19,20,21,22. Komórki te charakteryzują się obecnością onkogenu białka 1 kompleksu polycomb (Bmi1), genu odwrotnej transkryptazy telomerazy myszy (mTert), homeoboxu chmielu (Hopx) i bogatego w leucynę genu białka powtórzeń 1 (Lrig1). Ponadto wykazano, że komórki inne niż komórki macierzyste są zdolne do uzupełniania krypt jelitowych po urazie23,24,25,26,27,28,29,30,31. W szczególności wykazano, że komórki progenitorowe komórek wydzielniczych i enterocytów ulegają oddyferencjonowaniu po urazie, powracają do komórek macierzystych i wspomagają regenerację nabłonka jelitowego. Ostatnie badania zidentyfikowały komórki wykazujące ekspresję wielu markerów, które mają zdolność nabywania cech podobnych do łodygi po urazie (takich jak DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Co zaskakujące, Yu i wsp. wykazali, że nawet dojrzałe komórki Panetha (LYZ+) mogą przyczyniać się do regeneracji jelit37. Ponadto, oprócz wywołania apoptozy komórek nabłonka jelitowego i zakłócenia funkcji bariery nabłonkowej, napromieniowanie powoduje dysbiozę flory jelitowej, aktywację komórek odpornościowych i zainicjowanie odpowiedzi prozapalnej oraz aktywację komórek mezenchymalnych i zrębowych38,39.

Promieniowanie gamma jest cennym narzędziem terapeutycznym w leczeniu raka, szczególnie w przypadku guzów jelita grubego40. Jednak napromienianie znacząco wpływa na homeostazę jelit poprzez indukowanie uszkodzenia komórek, co prowadzi do apoptozy. Narażenie na promieniowanie powoduje liczne zaburzenia, które spowalniają powrót pacjenta do zdrowia i objawiają się uszkodzeniem błony śluzowej i stanem zapalnym w ostrej fazie oraz biegunką, nietrzymaniem moczu, krwawieniem i długotrwałym bólem brzucha. Ten wachlarz objawów jest określany jako toksyczność promieniowania żołądkowo-jelitowego. Dodatkowo, progresja zwłóknienia przezściennego i/lub stwardnienia naczyniowego wywołana promieniowaniem może objawić się dopiero po latach od leczenia38,41. Równocześnie z samym urazem, promieniowanie indukuje odpowiedź naprawczą w komórkach jelitowych, która aktywuje szlaki sygnałowe odpowiedzialne za inicjowanie i koordynowanie regeneracji42. Choroba jelita cienkiego wywołana promieniowaniem może pochodzić z radioterapii miednicy lub jamy brzusznej dostarczanej innym narządom (takim jak szyjka macicy, prostata, trzustka, odbytnica)41,43,44,45,46. Uszkodzenie jelit spowodowane napromienianiem jest zatem poważnym problemem klinicznym, a lepsze zrozumienie wynikającej z tego patofizjologii prawdopodobnie przyczyni się do rozwoju interwencji mających na celu złagodzenie powikłań żołądkowo-jelitowych związanych z radioterapią. Istnieją inne techniki, które pozwalają na zbadanie regeneracji nabłonka jelitowego poza promieniowaniem. Opracowano transgeniczne i chemiczne modele myszy do badania stanu zapalnego i jego późniejszej regeneracji47. Siarczan sodu dekstranu (DSS) wywołuje stan zapalny w jelicie i prowadzi do rozwoju cech podobnych do nieswoistych zapaleń jelit48. Połączenie leczenia DSS z prorakotwórczym związkiem azoksymetanu (AOM) może spowodować rozwój raka związanego z zapaleniem jelita grubego48,49. Uraz wywołany reperfuzją niedokrwienną jest kolejną metodą stosowaną do badania potencjału regeneracyjnego nabłonka jelitowego. Ta technika wymaga doświadczenia i wiedzy chirurgicznej50. Co więcej, wyżej wymienione techniki powodują inne rodzaje urazów niż promieniowanie i mogą prowadzić do zaangażowania różnych mechanizmów regeneracji. Ponadto modele te są czasochłonne, a technika promieniowania jest dość krótka. Ostatnio metody in vitro wykorzystujące enteroidy i kolonoidy generowane z jelita grubego i okrężnicy są stosowane w połączeniu z uszkodzeniem popromiennym do badania mechanizmów regeneracji jelit51,52. Jednak techniki te nie oddają w pełni modelowanego przez nie narządu53,54.

Przedstawiony protokół zawiera opis mysiego modelu uszkodzenia spowodowanego promieniowaniem gamma w połączeniu z modelem genetycznym, który po leczeniu tamoksyfenem pozwala na śledzenie linii pochodzących z populacji rezerwowych komórek macierzystych (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Model ten wykorzystuje napromieniowanie całego ciała 12 Gy, które indukuje wystarczająco znaczące uszkodzenie jelit, aby aktywować rezerwowe komórki macierzyste, jednocześnie umożliwiając późniejsze badanie zdolności regeneracyjnych jelit w ciągu 7 dni od urazu55.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie myszy były trzymane w Wydziale Laboratoryjnych Zasobów Zwierzęcych (DLAR) na Uniwersytecie Stony Brook. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stony Brook (IACUC) zatwierdził wszystkie badania i procedury z udziałem zwierząt. Eksperymenty z udziałem zwierząt przeprowadzono ściśle według zatwierdzonego protokołu postępowania ze zwierzętami (IACUC #245094).

UWAGA: Szczepy myszy B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-CreER) i B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) uzyskano komercyjnie (patrz tabela materiałów) i skrzyżowano w celu uzyskania Bmi1-CreER; Myszy Rosa26eYFP (Bmi1 ctrl), zgodnie z wcześniejszym opisem56,57,58.

1. Obudowa Bmi1-Cre ER; Myszy Rosa26 eYFP

  1. Trzymaj myszy w pomieszczeniu dla zwierząt w temperaturze w zakresie 68-72 ° F i wilgotności w zakresie 30-70%, w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności, z wodą i normalną karmą ad libitum.
  2. Przed eksperymentami potwierdź genotypy myszy za pomocą standardowej techniki genotypowania PCR57,58.

2. Przygotowanie zwierząt i materiałów

  1. Przenieś myszy do pomieszczenia eksperymentalnego co najmniej 7 dni przed jakimkolwiek eksperymentem, aby umożliwić myszom aklimatyzację.
  2. Dopasuj zwierzęta doświadczalne i kontrolne według płci i wieku.
  3. Poddać zwierzęta kontrolne rekombinacji za pośrednictwem tamoksyfenu za pośrednictwem Cre, ale nie napromienianiu (leczenie pozorowane, 0 Gy), upewniając się, że zwierzęta doświadczalne otrzymały wstrzyknięcie tamoksyfenu i były narażone na promieniowanie gamma.
  4. Przygotować roztwór tamoksyfenu. Zawiesić tamoksyfen w proszku w sterylnym oleju kukurydzianym o stężeniu 30 mg/ml. Sonikuj przez 3 minuty w cyklach 30 s ON i 30 s OFF z amplitudą 60%, a następnie obracaj w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Roztwór tamoksyfenu można zamrozić w temperaturze -20 °C, ale nie należy go zamrażać/rozmrażać więcej niż jeden raz. Najlepiej za każdym razem przygotowywać świeży roztwór i nie przechowywać go.
    UWAGA: Tamoksyfen jest wrażliwy na światło. Owiń go folią aluminiową podczas obrotu w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Tamoksyfen jest substancją potencjalnie niebezpieczną: Zagrożenie dla zdrowia (GHS08) i dla środowiska (GHS09).
  5. Przygotować roztwór podstawowy 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU). Ponownie zawiesić proszek EdU w 1/5 całkowitej objętości sterylnego sulfotlenku dimetylu (DMSO) i powoli dodawać pozostałe 4/5 całkowitej objętości sterylnej ultraczystej wody. Po całkowitym rozpuszczeniu podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU) i dimetylosulfotlenek (DMSO) są substancjami potencjalnie niebezpiecznymi: Zagrożenie dla zdrowia (odpowiednio H340 i H631 oraz H227, H315 i H319). EdU może powodować wady genetyczne i podejrzewa się, że działa szkodliwie na płodność lub nienarodzone dzieci, a DMSO może powodować podrażnienie skóry i oczu.
  6. Przygotować odczynniki do pobrania i utrwalenia tkanek: rozcieńczyć etanol, aby przygotować 70% roztwór wodny, schłodzić DPBS do 4 °C i przygotować zmodyfikowany bufor utrwalający Bouina (50% etanolu i 5% kwasu octowego w destylowanymH2O) oraz 10% buforowaną formalinę.
    UWAGA: Alkohol etylowy jest substancją potencjalnie niebezpieczną: stanowi zagrożenie dla zdrowia (H225-H319), jest łatwopalny (GHS02) i powoduje ostrą toksyczność (GHS07). Kwas octowy jest substancją potencjalnie niebezpieczną: zagrażającą zdrowiu (H226-H314), łatwopalną (GHS02) i (GHS05). Formalina jest substancją potencjalnie niebezpieczną: Zagrożenie dla zdrowia (H350, H315, H317, H318, H370) i. Formalina może powodować raka, podrażnienie skóry i oczu, uszkodzenie narządów i alergiczne reakcje skórne.
  7. Przygotuj sprzęt niezbędny do eutanazji zgodnie z zatwierdzoną metodą (na przykład komoraCO2), zestaw do preparacji myszy (nożyczki, kleszcze), szalki Petriego, igłę 16 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 10 ml do płukania jelit oraz kasety histologiczne.

3. Napromienianie promieniowaniem gamma całego ciała (TBI) i pobieranie tkanek

  1. Dwa dni przed ekspozycją na promieniowanie gamma należy wstrzyknąć zwierzętom doświadczalnym pojedynczą dawkę tamoksyfenu w celu wywołania rekombinacji za pośrednictwem Cre i śledzenia linii komórkowej BMI1/EYFP+. Zważyć każde zwierzę i obliczyć dawkę 40 mg/kg masy ciała tamoksyfenu zawieszonego w oleju kukurydzianym. Zdezynfekować okolice brzucha 70% etanolem i podać tamoksyfen dootrzewnowo za pomocą igły 27G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
  2. Obserwować zwierzęta przez następne 48 godzin, aby wykluczyć potencjalną toksyczność tamoksyfenu.
  3. Przenieś myszy do pomieszczenia do napromieniania zgodnie z zaleceniami lokalnej instytucji.
  4. Obliczyć czas ekspozycji na promieniowanie uwalniane przez źródło 137Cs zgodnie z aktualną szybkością dawki eksaktora. Na przykład, jeśli aktualna moc dawki wynosi 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), czas ekspozycji w minutach oblicza się jako żądaną dawkę/0,759. Aby napromieniować zwierzęta do dawki 12 Gy TBI, czas ekspozycji wynosi ~15,81 min (15 min i 48 s).
  5. Zdezynfekować komorę na próbkę w promienniku promieniowania gamma 70% roztworem etanolu; umieścić matę chłonną i zwierzęta w komorze na próbkę.
    UWAGA: Zwierzęta poddane pozorowaniu powinny być umieszczane w pomieszczeniu do napromieniania, ale nie powinny być narażone na promieniowanie gamma.
  6. Umieść pokrywę i zamknij komorę.
  7. Zaprogramuj promiennik gamma tak, aby wystawiał zwierzęta na działanie 12 Gy TBI.
    1. Włącz maszynę, przekręcając kluczyk do pozycji START.
    2. Wprowadź numer operatora za pomocą klawiatury numerycznej i potwierdź, naciskając ENTER.
    3. Wprowadź numer PIN za pomocą klawiatury numerycznej i potwierdź, naciskając ENTER.
    4. Naciśnij 1, aby wyświetlić opcje.
    5. Naciśnij 1, aby ustawić timer.
    6. Naciśnij 1, aby wyświetlić czas naświetlania.
    7. Wprowadź ustawienie timera na następny cykl za pomocą klawiatury numerycznej (format gg:mm:ss) i potwierdź, naciskając ENTER.
    8. Potwierdź ustawienia jeszcze raz, naciskając ENTER.
    9. Wróć do menu głównego, naciskając CLEAR 2x.
    10. Naciśnij START, aby rozpocząć ekspozycję.
  8. Opuść pomieszczenie na czas aktywnej ekspozycji. Maszyna zatrzyma się automatycznie po upływie ustawionego czasu i zacznie emitować sygnał dźwiękowy.
    UWAGA: Cez-137 (137Cs) jest śmiertelnie niebezpieczną substancją (zagrożenie dla zdrowia: H314). Zewnętrzne narażenie na duże ilości 137C może spowodować oparzenia, ostrą chorobę popromienną, a nawet śmierć.
  9. Wyłącz maszynę, przekręcając kluczyk do pozycji STOP.
  10. Otwórz komorę na próbki, zdejmij pokrywę, przenieś zwierzęta z powrotem do klatki i zdezynfekuj komorę na próbki 70% roztworem etanolu.
  11. Przenieś zwierzęta z powrotem do konwencjonalnego pomieszczenia inwentarskiego i obserwuj ich stan po leczeniu.
  12. Codziennie monitoruj masę ciała zwierząt i poddaj je eutanazji natychmiast (pomimo zaplanowanego punktu czasowego), jeśli zaobserwuje się jakiekolwiek objawy zmienionego samopoczucia, stresu lub utraty masy ciała przekraczającej 15% wyjściowej masy ciała.
  13. Na trzy godziny przed planowaną eutanazją należy zdezynfekować okolice brzucha i za pomocą strzykawki insulinowej 28G wstrzyknąć myszom 100 μl roztworu podstawowego EdU (podawanego dootrzewnowo).
  14. Jelita proksymalne pobierać po 0 godzinach, 3 godzinach, 6 godzinach, 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach, 96 godzinach i 168 godzinach po napromieniowaniu.
    1. Przeprowadzić eutanazję CO2 zgodnie ze standardami instytucji macierzystej.
      UWAGA: Dwutlenek węgla jest substancją niebezpieczną (H280). Zawiera gaz pod ciśnieniem; może eksplodować po podgrzaniu. Może wypierać tlen i powodować szybkie uduszenie.
    2. Następnie należy wypreparować proksymalną część jelita cienkiego, usunąć przyczepione tkanki, przepłukać zimnym DPBS za pomocą prostej igły do karmienia 16 G dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml, naprawić zmodyfikowanym buforem utrwalającym Bouina za pomocą prostej igły do karmienia 16 G dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml, rozciąć wzdłużnie i zwinąć proksymalne jelita za pomocą techniki swiss-roll, jak opisano wcześniej59.
  15. Umieść tkanki w kasecie histologicznej i pozostaw na 24-48 godzin w temperaturze pokojowej w pojemniku z 10% buforowaną formaliną. Objętość formaliny powinna być wystarczająca do całkowitego pokrycia kaset histologicznych. Po upływie czasu inkubacji za pomocą kleszczy przenieś kasety histologiczne do pojemnika wypełnionego 70% etanolem. Następnie przystąp do zatapiania parafiny tkankowej.
    UWAGA: Osadzanie parafiny tkankowej zostało przeprowadzone przez Research Histology Core Laboratory na Uniwersytecie Stony Brook. W tym miejscu można zatrzymać procedurę, a bloki parafiny można przechowywać w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Formalina jest substancją potencjalnie niebezpieczną: zagrażającą zdrowiu (H350, H315, H317, H318, H370) i. Formalina może powodować raka, podrażnienie skóry i oczu, uszkodzenie narządów i alergiczne reakcje skórne.

4. Analiza histologiczna

  1. Schłodzić kasety histologiczne zawierające próbki tkanek zatopionych w parafinie, umieszczając je na lodzie na co najmniej 1 godzinę. Za pomocą mikrotomu przygotować skrawki o grubości 5 μm do barwienia. Każdą tkankę należy pokroić poziomo, aby pokryć cały zwinięty próbk.
    1. Po przecięciu bloku parafinowego należy przenieść skrawki tkanek do łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 45 °C i umieścić skrawki na naładowanych szkiełkach. Pozostaw szkiełka na noc na stojaku w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
      UWAGA: W tym miejscu procedurę można zatrzymać, a szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Umieść szkiełka w uchwycie na szkiełka i piecz w piekarniku o temperaturze 65 °C przez noc. Zjeżdżalnie można piec krócej, 1-2 godziny. Nie jest to jednak zalecane w przypadku świeżo (poniżej 1 miesiąca) ciętych szkiełków.
    UWAGA: Umieść ręczny zestaw do barwienia szkiełek pod kapturem chemicznym i wykonaj inkubacje z ksylenem, etanolem i hematoksyliną pod kapturem chemicznym.
  3. Następnego dnia schłodzić szkiełka, umieszczając je w uchwycie na szkiełka pod kapturem chemicznym na 10 minut.
  4. Odparafinować tkanki, umieszczając uchwyt szkiełka w pojemniku wypełnionym 100% ksylenem na 3 minuty. Powtórzyć inkubację przy użyciu świeżego 100% ksylenu.
    UWAGA: Od tego momentu upewnij się, że próbki są przez cały czas mokre.
    UWAGA: Ksylen jest substancją potencjalnie niebezpieczną: łatwopalną (GHS02), powodującą ostrą toksyczność (GHS07) i stanowiącą zagrożenie dla zdrowia (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Potencjalne niebezpieczne skutki polegają na tym, że jest śmiertelny w przypadku połknięcia lub dostania się do dróg oddechowych i może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Dodatkowo może wpływać na funkcje motoryczne, powodując senność lub zawroty głowy oraz powodować uszkodzenie narządów w przypadku długotrwałego lub powtarzającego się narażenia.
  5. Uwodnić sekcje w gradiencie etanolu, umieszczając kolejno uchwyt szkiełka w pojemnikach wypełnionych następującymi roztworami: 100% etanol, 2 min; 95% etanol, 2 min; 70% etanol, 2 min.
  6. Przenieś uchwyt szkiełka do pojemnika wypełnionego wodą destylowaną i płucz pod bieżącą wodą destylowaną przez 2 minuty.
  7. Umieść uchwyt szkiełka w pojemniku wypełnionym roztworem hematoksyliny i plamić przez 5 minut (pod kapturem chemicznym).
  8. Przenieś uchwyt szkiełka do pojemnika wypełnionego wodą z kranu i spłucz pod bieżącą wodą z kranu, aż zabarwienie hematoksyliną zmieni kolor na niebieskawy, zwykle po 2 minutach.
  9. Przenieść uchwyt szkiełka do pojemnika wypełnionego 5% (w/v) roztworem węglanu litu. Zanurzenie 10x.
    UWAGA: Węglan litu jest substancją potencjalnie niebezpieczną: powodującą ostrą toksyczność (GHS07) i zagrożenie dla zdrowia (H302 - H319). Jest szkodliwy po połknięciu, działa szkodliwie w kontakcie ze skórą i powoduje poważne podrażnienie oczu.
  10. Przenieś uchwyt szkiełka do pojemnika wypełnionego wodą destylowaną i płucz pod bieżącą wodą destylowaną przez 2 minuty.
  11. Umieść uchwyt szkiełka w pojemniku wypełnionym eozyną i plamą na 5 minut.
  12. Przenieś uchwyt szkiełka do pojemnika wypełnionego 70% etanolem i krótko spłucz (10 s).
  13. Odwodnić sekcje, umieszczając kolejno uchwyt szkiełka w pojemnikach wypełnionych gradientowymi roztworami etanolu: 95% etanolu, 5 zanurzeń; 100% etanolu, 5 zanurzeń.
  14. Wyczyść szkiełka, umieszczając uchwyt szkiełek w pojemniku wypełnionym 100% ksylenem na 3 minuty. Powtórz inkubację przy użyciu świeżego 100% ksylenu.
  15. Wyjmij szkiełko ze stojaka, osusz obszar wokół chusteczek za pomocą ręcznika papierowego i w zależności od wielkości próbki dodaj jedną lub dwie krople podłoża mocującego na bazie ksylenu na powierzchnię próbki. Zamontuj, delikatnie umieszczając szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku (uważaj, aby nie pozostawić pęcherzyków powietrza). W razie potrzeby delikatnie dociśnij. Cała powierzchnia szkła powinna być pokryta i uszczelniona.
  16. Wysuszyć szkiełka, pozostawiając je na noc pod maską chemiczną. Zazwyczaj podłoże montażowe krzepnie w czasie krótszym niż 24 godziny. Aby upewnić się, że szkiełka są suche, można wykonać próbkę szkiełka. Za pomocą pustego szkiełka umieść kroplę podłoża montażowego i pozostaw na noc pod maską chemiczną. Następnego dnia dotknij kropli i sprawdź, czy jest zastygła.
  17. Gdy szkiełka wyschną, przeanalizuj histologię tkanek za pomocą mikroskopu świetlnego lub bardziej zaawansowanego mikroskopu z kanałem jasnego pola.
    1. Umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku, przesuwaj, aż próbka znajdzie się w środku pola widzenia, wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła ostrości i użyj soczewki obiektywowej o powiększeniu 10x i/lub 20x, aby przeanalizować histologię w porównaniu z tkankami kontrolnymi (napromieniowane pozorowane).
    2. Jeśli mikroskop jest wyposażony w kamerę, rób również zdjęcia.
      UWAGA: W tym miejscu procedurę można zatrzymać; Preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej i później analizować. Nie przechowuj szkiełek dłużej niż 30 dni, ponieważ plamy powoli zanikają.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Ostudzić kasety histologiczne zawierające próbki tkanek zatopionych w parafinie, umieszczając je na lodzie na co najmniej 1 godzinę. Za pomocą mikrotomu przygotować skrawki o grubości 5 μm do barwienia. Każdą tkankę należy pokroić poziomo, aby pokryć cały zwinięty próbk.
    1. Po przecięciu bloku parafinowego należy przenieść skrawki tkanek do łaźni wodnej ogrzanej do 45 °C i umieścić skrawki na naładowanych szkiełkach. Pozostaw szkiełka na noc na stojaku w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
      UWAGA: W tym miejscu procedurę można zatrzymać, a szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Umieść szkiełka w uchwycie na szkiełka i piecz w piekarniku o temperaturze 65 °C przez noc. Zjeżdżalnie można piec krócej, 1-2 godziny. Nie jest to jednak wskazane w przypadku świeżo (mniej niż 1 miesiąc temu) ciętych szkiełków.
    UWAGA: Umieść ręczny zestaw do barwienia szkiełek pod kapturem chemicznym i wykonaj inkubacje z ksylenem, etanolem iH2O2/metanolem pod kapturem chemicznym.
  3. Następnego dnia schłodzić szkiełka, umieszczając je w uchwycie na szkiełka pod kapturem chemicznym na 10 minut.
  4. Odparafinować tkanki, umieszczając uchwyt szkiełka w pojemniku wypełnionym 100% ksylenem na 3 minuty. Powtórzyć inkubację przy użyciu świeżego 100% ksylenu.
    UWAGA: Od tego momentu upewnij się, że próbki są przez cały czas mokre.
  5. Ugasić endogenną peroksydazę przez inkubację szkiełek przez 30 minut w pojemniku wypełnionym 2% roztworem nadtlenku wodoru w metanolu pod maską chemiczną.
    UWAGA: Alkohol metylowy jest substancją potencjalnie niebezpieczną: Zagrożenie dla zdrowia (H225-H301, H311, H331-H370), łatwopalny (GHS02) i powodujący ostrą toksyczność (doustna, skórna, wdychanie) (GHS08). Nadtlenek wodoru jest substancją potencjalnie niebezpieczną: (GHS05) i powodującą ostrą toksyczność (GHS07).
  6. Ponownie uwodnić sekcje w gradiencie etanolu, umieszczając kolejno uchwyt szkiełka w pojemnikach wypełnionych następującymi roztworami: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  7. Przenieś uchwyt szkiełka do pojemnika wypełnionego wodą destylowaną i płucz pod bieżącą wodą destylowaną przez 2 minuty.
  8. W celu pobrania antygenów należy przenieść uchwyt szkiełka do pojemnika z 250 ml roztworu buforowego cytrynianu (10 mM cytrynianu sodu, 0,05% Tween-20, pH 6,0) i gotować w temperaturze 110 °C przez 10 minut, używając komory do demaskowania.
  9. Przenieść cały pojemnik do komory chłodniczej i pozostawić do stopniowego ostygnięcia w ciągu 30 minut.
  10. Po 30 minutach zastąp roztwór buforowy cytrynianu wodą destylowaną i spłucz pod bieżącą wodą destylowaną, aż wszystkie pływające kawałki parafiny zostaną usunięte.
  11. Wyjmij szkiełka z uchwytu (pojedynczo), postukaj w ręcznik papierowy i ostrożnie osusz obszar wokół próbki ręcznikiem papierowym. Narysuj zamknięty kształt wokół próbki za pomocą pisaka, który zapewnia barierę hydrofobową (pisak PAP). Umieść w wilgotnej komorze.
  12. Zablokować 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w TBS-Tween poprzez dodanie 200 μl roztworu na powierzchnię próbki. Upewnij się, że nie ma wycieków. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 30 minut.
  13. Usuń roztwór blokujący, stukając szkiełkiem w ręcznik papierowy. Umieść z powrotem w wilgotnej komorze. Dodać 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych o odpowiednim stężeniu zawieszonych w buforze blokującym i inkubować w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc przez noc. W przypadku BMI1/EYFP należy stosować anty-GFP kurczaka (rozcieńczenie 1:500); dla Ki-67 należy użyć królika anty-Ki-67 (rozcieńczenie 1:200).
  14. Usunąć roztwór przeciwciała, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy; umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka i przenieść do pojemnika wypełnionego TBS-Tween. Myć szkiełka potrząsając przez 5 min. Powtórzyć 3 razy. Za każdym razem należy użyć nowej porcji bufora TBS-Tween.
  15. Wyjmij szkiełka z uchwytu (pojedynczo), usuń nadmiar roztworu myjącego, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy i umieść w wilgotnej komorze. Dodać 100 μl przeciwciał drugorzędowych o odpowiednim stężeniu zawieszonych w buforze blokującym i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przeciwciała drugorzędowe należy sprzężać z fluoroforem. W przypadku BMI1/EYFP należy użyć środka przeciw kurczakom Alexa Fluor 647 (rozcieńczenie 1:500); dla Ki-67 użyj koziego anty-królika Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:500).
  16. Usunąć roztwór przeciwciała, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy; umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka i przenieść do pojemnika wypełnionego TBS-Tween. Myć szkiełka potrząsając przez 5 min. Powtórzyć 3 razy. Za każdym razem należy użyć nowej porcji bufora TBS-Tween.
  17. Wyjmij szkiełka z uchwytu (pojedynczo), usuń nadmiar roztworu myjącego, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy i umieść w wilgotnej komorze. Dodać 100 μL roztworu barwiącego EdU przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta i przy użyciu fluoroforu Alexa Fluor 555.
  18. Usunąć roztwór EdU, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy; umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka i przenieść do pojemnika wypełnionego TBS-Tween. Myć szkiełka potrząsając przez 5 min. Powtórzyć 2x. Za każdym razem należy użyć nowej porcji bufora TBS-Tween.
  19. Wyjmij szkiełka z uchwytu (pojedynczo); usuń nadmiar roztworu myjącego, stukając szkiełkiem w ręcznik papierowy i umieść w wilgotnej komorze. Barwienie przeciwstawne Hoechst 33258 należy przeprowadzić, dodając 100 μl roztworu Hoechst 33258 (rozcieńczenie 1:1000 w TBS-Tween) na powierzchnię próbki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  20. Usunąć roztwór Hoechst 33258, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy; umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka i przenieść do pojemnika wypełnionego TBS-Tween. Myć szkiełka potrząsając przez 5 minut.
  21. Wyjmij szkiełko z uchwytu szkiełka, osusz obszar wokół tkanek ręcznikiem papierowym i, w zależności od wielkości próbki, dodaj jedną lub dwie krople podłoża mocującego na bazie wody na powierzchnię próbki. Zamontuj, delikatnie umieszczając szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku (uważaj, aby nie pozostawić pęcherzyków powietrza). W razie potrzeby delikatnie dociśnij. Cała powierzchnia szkła powinna być pokryta i uszczelniona.
  22. Wysuszyć szkiełka, pozostawiając je na noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj media montażowe krzepną w czasie krótszym niż 24 godziny. Aby upewnić się, że szkiełka są suche, można wykonać próbkę szkiełka. Użyj pustego slajdu; Umieść kroplę podłoża montażowego i pozostaw na noc pod maską chemiczną. Następnego dnia dotknij kropli i sprawdź, czy jest zastygła.
  23. Po wyschnięciu szkiełek barwione tkanki można analizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry długości fal emisyjnych umożliwiające wizualizację barwienia Ki-67, EdU i BMI1/EYFP (odpowiednio 535 nm, 646 nm i 700 nm).
  24. Umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku, przesuwaj, aż próbka znajdzie się w środku pola widzenia, wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła ostrości i użyj soczewki obiektywowej o powiększeniu 10x i/lub 20x, aby przeanalizować barwienie w porównaniu z tkankami kontrolnymi (napromieniowane pozorowane). Jeśli mikroskop jest wyposażony w kamerę, można również wykonywać zdjęcia. Rób zdjęcia dla każdego kanału osobno i scalaj je później.
    UWAGA: W tym miejscu procedurę można zatrzymać; Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C i analizować później. Nie przechowuj szkiełek dłużej niż 14 dni, ponieważ plamy powoli zanikają.

6. Barwienie TUNEL

  1. Ostudzić kasety histologiczne zawierające próbki tkanek zatopionych w parafinie, umieszczając je na lodzie na co najmniej 1 godzinę. Za pomocą mikrotomu przygotować skrawki o grubości 5 μm do barwienia. Każdą tkankę należy pokroić poziomo, aby pokryć cały zwinięty próbk.
    1. Po przecięciu bloku parafinowego należy przenieść skrawki tkanek do łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 45 °C i umieścić skrawki na naładowanych szkiełkach. Pozostaw szkiełka na noc na stojaku w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
      UWAGA: W tym miejscu procedurę można zatrzymać, a szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Umieść szkiełka w uchwycie na szkiełka i piecz w piekarniku o temperaturze 65 °C przez noc.
    UWAGA: Szkiełka można piec krócej, 1-2 godziny. Nie jest to jednak wskazane w przypadku świeżo (mniej niż 1 miesiąc temu) ciętych szkiełków. Umieść ręczny zestaw do barwienia szkiełkowego pod kapturem chemicznym i wykonaj inkubację z ksylenem i etanolem pod kapturem chemicznym.
  3. Następnego dnia schłodzić szkiełka, umieszczając je w uchwycie na szkiełka pod kapturem chemicznym na 10 minut.
  4. Odparafinować tkanki, umieszczając uchwyt na szkiełka w pojemniku wypełnionym 100% ksylenem na 3 minuty. Powtórzyć inkubację przy użyciu świeżego 100% ksylenu.
    UWAGA: Od tego momentu upewnij się, że próbki są przez cały czas mokre.
  5. Ponownie uwodnić sekcje w gradiencie etanolu, umieszczając kolejno uchwyt szkiełek w pojemnikach wypełnionych następującymi roztworami: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 90% etanolu, 3 min; 80% etanolu, 3 min; 70% etanolu, 3 min.
  6. Przenieś uchwyt szkiełka do pojemnika wypełnionego wodą destylowaną i płucz pod bieżącą wodą destylowaną przez 1 minutę.
  7. Wyjmij szkiełka z uchwytu (pojedynczo), postukaj w ręcznik papierowy i ostrożnie osusz obszar wokół próbki ręcznikiem papierowym. Narysuj zamknięty kształt wokół próbki za pomocą pisaka, który zapewnia barierę hydrofobową (pisak PAP). Umieść w wilgotnej komorze.
  8. Inkubować z proteinazą K wolną od DNazy. Dodać 100 μl roztworu proteinazy K bez DNaz (rozcieńczenie 1:25 w DPBS) na powierzchnię próbki w obrębie bariery hydrofobowej. Inkubować w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 15 min.
    UWAGA: Proteinaza K jest substancją potencjalnie niebezpieczną: Zagrożenie dla zdrowia (H315 - H319 - H334).
  9. Usunąć roztwór proteinazy K, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy; umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka i przenieść do pojemnika wypełnionego DPBS. Myć szkiełka potrząsając przez 5 min. Powtórzyć 2x. Za każdym razem należy użyć świeżej porcji DPBS.
  10. Przygotować mieszaninę reakcyjną TUNEL: Wymieszać roztwór na etykiecie (1x) z roztworem enzymu (10x). Dobrze odpipetować.
  11. Wyjmij szkiełka z uchwytu (pojedynczo); usuń nadmiar roztworu myjącego, stukając szkiełkiem w ręcznik papierowy i umieść w wilgotnej komorze. Dodać 50 μl mieszaniny reakcyjnej TUNEL na powierzchnię próbki i inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 60 minut. W przypadku kontroli ujemnej należy stosować wyłącznie roztwór etykietowy (bez TdT).
  12. Wyjąć roztwór TUNEL, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy; umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka i przenieść do pojemnika wypełnionego DPBS. Myć szkiełka potrząsając przez 5 min. Powtórzyć 2x. Za każdym razem należy użyć świeżej porcji DPBS.
  13. Wyjmij szkiełka z uchwytu (pojedynczo); usuń nadmiar roztworu myjącego, stukając szkiełkiem w ręcznik papierowy i umieść w wilgotnej komorze. Barwienie przeciwstawne Hoechst 33258 należy przeprowadzić, dodając 100 μl roztworu Hoechst 33258 (rozcieńczenie 1:1000 w TBS-Tween) na powierzchnię próbki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  14. Usunąć roztwór Hoechst 33258, stukając szkiełkiem o ręcznik papierowy; umieścić szkiełka w uchwycie na szkiełka i przenieść do pojemnika wypełnionego DPBS. Myć szkiełka potrząsając przez 5 minut.
  15. Wyjąć szkiełko z uchwytu na szkiełko; osuszyć obszar wokół tkanek za pomocą ręcznika papierowego i w zależności od wielkości próbki dodać jedną lub dwie krople podłoża mocującego na bazie wody na powierzchnię próbki. Zamontuj, delikatnie umieszczając szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku (uważaj, aby nie pozostawić pęcherzyków powietrza). W razie potrzeby delikatnie dociśnij. Cała powierzchnia szkła powinna być pokryta i uszczelniona.
  16. Wysuszyć szkiełka, pozostawiając je na noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj podłoże montażowe krzepnie w czasie krótszym niż 24 godziny. Aby upewnić się, że szkiełka są suche, można wykonać próbkę szkiełka. Umieść kroplę podłoża montażowego i pozostaw na noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnego dnia dotknij kropli i sprawdź, czy jest zastygła.
  17. Po wyschnięciu szkiełek wybarwione tkanki można analizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry długości fal emisyjnych pozwalające na wizualizację barwienia TUNEL (535 nm).
  18. Umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku, przesuwaj, aż próbka znajdzie się w środku pola widzenia, wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła ostrości i użyj soczewki obiektywowej o powiększeniu 10x i/lub 20x, aby przeanalizować barwienie w porównaniu z tkankami kontrolnymi (napromieniowane pozorowane). Jeśli mikroskop jest wyposażony w kamerę, można również wykonywać zdjęcia. Rób zdjęcia dla każdego kanału osobno i scalaj je później.
    UWAGA: W tym miejscu procedurę można zatrzymać; Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C i analizować później. Nie przechowuj szkiełek dłużej niż 14 dni, ponieważ plamy powoli zanikają.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie całkowitego naświetlania ciała (TBI) dawką 12 Gy w połączeniu z mysią genetyczną analizą śledzenia linii komórkowych pozwala na dokładną analizę skutków uszkodzeń radiacyjnych w jelitach. Na początku myszy Bmi1-CreER;Rosa26eYFP otrzymały pojedynczy wtrysk tamoksyfenu, który indukuje ekspresję wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (EYFP) w populacji rezerwowych komórek macierzystych Bmi1+. Dwa dni po wtrysku tamoksyfenu myszy poddano naświetlaniu lub procedurz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje solidny i powtarzalny model obrażeń popromiennych. Pozwala na precyzyjną analizę zmian w nabłonku jelitowym w ciągu 7 dni po urazie. Co ważne, wybrane punkty czasowe odzwierciedlają kluczowe etapy urazu i charakteryzują się wyraźnymi zmianami w jelicie (faza urazu, apoptozy, regeneracji i normalizacji)60. Ten model napromieniania został ustalony i dokładnie oceniony, wykazując odpowiedni przejaw uszkodzenia naśladującego ten, którego doświadczają pacjenci poddawani radioterapi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Stony Brook Cancer Center Histology Research Core za fachową pomoc w przygotowaniu próbek tkanek oraz Division of Laboratory Animal Resources na Uniwersytecie Stony Brook za pomoc w opiece nad zwierzętami i obchodzeniu się z nimi. Praca ta została wsparta grantami z National Institutes of Health DK124342 przyznanymi Agnieszce B. Białkowskiej oraz DK052230 dr. Vincentowi W. Yangowi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBD
309659-16G Igły wielokrotnego użytku do karmienia małych zwierząt: ProstaVWR20068-630-27G
x 1/2"BD
305109-28G x 1/2" Monoject 1mL strzykawka insulinowaCovidien
′-deoksyurydyna (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/ml w sterylnym DMSO: woda (1:4 v/v), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20& deg; C
Azer Naukowy  10% neutralna buforowana formalinaFisher Scientific22-026-213-B6.129X1-GT
(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JSzczep laboratoryjny Jackson#:006148
B6; 129-BMI1tm1(cre/ERT)Mrc/JSzczep laboratoryjny Jackson#:010531
Albumina surowicy bydlęcej frakcja V, szok termicznyMillipore-Sigma3116956001
Kurczak anty-GFPAvesGFP-1020
Zestaw do obrazowania Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-Olej
kukurydzianyMillipore-SigmaC8267-Komora
demaskatorskaBiocare MedicalDC2012-Dimetylosulfotlenek
(DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100światłoczuła
proteinaza bez DNaz KInvitrogenC10618Hrozcieńczony 25x w DPBS
Osioł anty-kurczak AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-Eosin
Fisher Scientific MikroskopS176
Nikon Eclipse 90i Jasne i fluorescencyjne światło, z obiektywami: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aqueous Mounting MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0,759 Gy min-1
Goat anty-królik AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Roztwór hematoksyliny, skrzela nr 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Mikrotom rotacyjny firmy Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrat (bis-benzymid)Thermo Fisher ScientificH3569Rozcieńczenie 1:1000
Roztwór nadtlenku wodoru, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-In
situ Zestaw do wykrywania śmierci komórek, Fluoresceina (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Węglan litu (proszek/certyfikowany ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000,5 g/1 l dH2O
Luer-Lok Strzykawka sterylna, jednorazowa, 10 mlVWR89215-218-metanol
VWRBDH1135-4LP
Pharmco Products  Alkohol etylowy, 200 PROOFFisher Scientific
NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Kwas octowy klasy ACSCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-Królik
anty-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Medium montażoweFisher Scientific22-050-262
Inkubator-Genie firmy Scientific Industries do pieczenia szkiełek pod kątem 65 stopniFisher Scientific50-728-103
Dwuwodny cytrynian soduFisher ScientificS279-500
MikroprowadniceVWR25640-002
Superfrost Plus [rozmiar: 25 x 75 x 1 mm]VWR  48311-703
TamoksyfenMillipore-SigmaT564830 mg/ml w sterylnym oleju kukurydzianym, najlepiej świeży lub krótkotrwały do przechowywania w temperaturze -20° C, światłoczułe
uchwyty Tissue-Tek 24-Slide z odłączanym uchwytemSakura4465
Tissue-Tek  Krawędź akumulatora  Ostrza niskoprofiloweSakura4689
Tissue-Tek  Ręczny zestaw do barwienia szkiełekSakura4451
Naczynie do barwienia Tissue-Tek, zielone z pokrywkąSakura4456
Naczynie do barwienia Tissue-Tek, białe z pokrywkąSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Kasety do obróbki UnisetteVWR87002-292-VWR
Okulary Micro CoverVWR48393-081
KsylenFisher ScientificX5P-1GAL
igła 1188128012-5-etynylo-2 fluorescencyjny Zestaw preparacyjny ze stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63(2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300(2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984(2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667(2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387(2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208(2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855(2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186(2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29(2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649(2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740(2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421(2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952(2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308(2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965(2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783(2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja jelitnapromieniowanie gammajelitowe kom rki macierzysteledzenie linii kom rkowychmodel uszkodzenia radiacyjnegorezerwowe kom rki macierzystekrypty jelitowebarwienie EdUbarwienie TUNELsekwencjonowanie pojedynczych kom rek
Regeneracja nabłonka jelit w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.