Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Budowa wektorów adenowirusowych z wykorzystaniem technologii składania DNA

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64033

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 2Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, 3Henan Chemical Technician College, 4Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu stworzono zakaźny klon ludzkiego adenowirusa typu 7 (HAdV-7), a poprzez modyfikację zakaźnego klonu stworzono system wektorowy HAdV-7 z delecją E3. Tę zastosowaną tutaj strategię można uogólnić w celu uzyskania wektorów transferu genów z innych adenowirusów typu dzikiego.

Streszczenie

Wektory adenowirusowe są używane jako narzędzie do transferu genów w terapii genowej od ponad trzech dekad. Tutaj wprowadzamy protokół konstruowania wektora adenowirusowego poprzez manipulowanie genomowym DNA HAdV-7 typu dzikiego przy użyciu metody składania DNA. Po pierwsze, zakaźny klon HAdV-7, pKan-Ad7, został wygenerowany przez fuzję genomowego DNA wirusa z produktem PCR ze szkieletu plazmidowego, składającego się z genu oporności na kanamycynę i początku replikacji (Kan-Ori), poprzez składanie DNA. Dokonano tego poprzez zaprojektowanie pary starterów PCR, które zawierały ~ 25 nukleotydów końcowej sekwencji powtórzeń odwróconego terminala HAdV-7 (ITR) na końcu 5', miejsce enzymu restrykcyjnego bez noża dla genomu HAdV-7 w środku i sekwencję specyficzną dla matrycy do primingu PCR na końcu 3'. Po drugie, zastosowano strategię opartą na pośrednim plazmidzie, aby zastąpić region E3 elementami wyrażającymi transgen w zakaźnym klonie w celu wygenerowania wektora adenowirusowego. Krótko mówiąc, pKan-Ad7 został strawiony enzymem restrykcyjnym Hpa I z podwójnym nożem, a fragment zawierający region E3 został zligowany do innego produktu PCR szkieletu plazmidowego przez montaż Gibsona w celu skonstruowania pośredniego plazmidu pKan-Ad7HpaI. Dla wygody, do wyznaczenia metody klonowania plazmidu polegającej na połączonym trawieniu i składaniu restrykcji zastosowano montaż restrykcyjny. Za pomocą montażu restrykcyjnego geny E3 w pKan-Ad7HpaI zastąpiono kasetą ekspresyjną białka zielonej fluorescencji (GFP), a zmodyfikowany region E3 został uwolniony z plazmidu pośredniego i przywrócony do zakaźnego klonu w celu wytworzenia plazmidu adenowirusowego pKAd7-E3GFP. Wreszcie, pKAd7-E3GFP został zlinearyzowany przez trawienie Pme I i wykorzystany do transfekcji komórek pakujących HEK293 w celu uratowania rekombinowanego wirusa HAdV-7. Podsumowując, wprowadzono tutaj strategię opartą na składaniu DNA w celu konstruowania wektorów adenowirusowych w ogólnych laboratoriach biologii molekularnej bez potrzeby stosowania specjalistycznych materiałów i instrumentów.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich trzech dekad, rekombinowane wektory adenowirusowe były szeroko stosowane w opracowywaniu szczepionek i terapii genowej1,2,3,4 jak również w badaniach podstawowych ze względu na ich wyjątkowe właściwości biologiczne, takie jak wysoka wydajność transdukcji genów, brak integracji z genomem gospodarza, manipulacyjny genom wirusa i łatwość produkcji na dużą skalę.

Obecnie, najczęściej używane wektory adenowirusowe są konstruowane na podstawie ludzkiego adenowirusa 5 (HAdV-5)5,6. Chociaż transdukcja za pośrednictwem wektora HAdV-5 daje zachęcające wyniki, zastosowania przedkliniczne i kliniczne ujawniły kilka wad (np. wysoką istniejącą wcześniej odporność antywektorową w populacji ludzkiej i niską wydajność transdukcji w komórkach pozbawionych wirusa Coxsackie i receptora adenowirusa (CAR)). Aby obejść te problemy, dużym zainteresowaniem wzbudziło konstruowanie wektorów na podstawie innych typów adenowirusów u ludzi lub ssaków3,7,8.

Do tej pory najpopularniejszą metodą konstruowania wektora adenowirusowego jest rekombinacja homologiczna u bakterii5. Takie szczepy bakteryjne muszą wykazywać ekspresję rekombinaz, co może wpływać na stabilność lub amplifikację przenoszonych przez nie plazmidów. Niektóre szczepy są nawet niedostępne na rynku. Ostatnio metody oparte na innych zasadach, w tym sztuczne chromosomy bakteryjne, bezpośrednie klonowanie lub bezpośrednie składanie DNA, zostały zastosowane do generowania zakaźnych klonów adenowirusa lub rekombinowanych wektorów adenowirusowych9,10,11,12. Metody te są jednak nieco nieprzyjazne dla badaczy z niewielkim doświadczeniem w tej dziedzinie.

W 2018 roku proces konstruowania zakaźnego klonu adenowirusa został uproszczony w laboratorium poprzez bezpośrednie ligowanie genomu wirusa produktem PCR przenoszącym szkielet plazmidu przez Gibson assembly13. Następnie metody trawienia restrykcyjnego i montażu Gibsona są łączone ze sobą w celu załadowania transgenów do istniejących plazmidów adenowirusowych14,15,16,17,18. Dla wygody, montaż restrykcyjny jest używany w dalszej części w odniesieniu do metody połączonego trawienia enzymu restrykcyjnego i składania Gibsona. Rozwinięto dalsze strategie konstruowania wektorów adenowirusowych z zakaźnych klonów przy użyciu restriction-assembly19. Istotą składania restrykcyjnego jest włączenie fragmentów wyciętych z plazmidów w jak największym stopniu w reakcji składania DNA, podczas gdy krótkie produkty PCR służą jako łączniki lub łatki do modyfikacji plazmidu. Jednocześnie liczba dołączonych fragmentów jest utrzymywana na jak najniższym poziomie. Takie wysiłki odzwierciedlają opłacalność; można zminimalizować możliwość wystąpienia niepożądanych mutacji spowodowanych PCR lub składaniem DNA, a także poprawić wskaźnik sukcesu. Podsumowując, w laboratorium skonfigurowano potok od adenowirusa typu dzikiego do wektora adenowirusowego13,14,15,16,17,18,19.

Tutaj próbujemy wprowadzić te metody, podając przykłady konstruowania zakaźnego klonu HAdV-7 i wektora HAdV-7 z delecją delecyjną E3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Adenowirusy są klasyfikowane jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2); wszystkie kroki do użycia wirusów zostały przeprowadzone w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. HAdV-7 typu dzikiego został wyizolowany w 2017 roku z próbki aspiratu nosowo-gardłowego 10-miesięcznego niemowlęcia, które było hospitalizowane z powodu ostrej infekcji dróg oddechowych w Szpitalu Dziecięcym w Pekinie20. Zapasy wirusa przechowywano w temperaturze -80 °C.

1. Ekstrakcja genomowego DNA HAdV-7

  1. Wysiew 2,0 x 106 komórek HEK293 w jednej kolbie T-25 zawierającej 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i hodowlę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze uzupełnionej 5% CO2 . Komórki powinny być zlewane w 80%-90% i gotowe do infekcji w ciągu 18-24 godzin.
  2. Zaszczepić komórki HAdV-7 typu dzikiego przez 2 godziny. Usunąć pożywkę zawierającą wirusa przez aspirację i dodać do komórek 5 ml świeżego DMEM zawierającego 2% FBS.
  3. Ekstrakcja genomowego DNA wirusa za pomocą zmodyfikowanej metody Hirta21
    1. W ciągu 2 lub 3 dni po zakażeniu, gdy efekt cytopatyczny (CPE) obserwuje się na 50%-90% komórek, należy wyrzucić supernatant hodowli i raz przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
      UWAGA: Efekt cytopatyczny (CPE) definiuje się jako zjawisko, w którym komórki zakażone wirusem zaokrąglają się, pęcznieją i luźno przyczepiają się lub odłączają od kolby hodowlanej w grona przypominające winogrona22.
    2. Lizować komórki w kolbie w 1,0 ml buforu do lizy zawierającego 25 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, 50 μg/ml proteazy K i 0,8% SDS (pH 7,6) przez 5 minut na lodzie. Przenieść lizat do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C przez 30 minut.
    3. Dodać 120 μl buforu strącającego do probówki. Umieść probówkę na lodzie na kolejne 30 minut po delikatnym wymieszaniu.
      UWAGA: Bufor opadowy składa się z 3 M CsCl, 1 M octanu potasu i 0,67 M kwasu octowego. Pomoże to wytrącić szczątki komórkowe i DNA chromosomów komórkowych po odwirowaniu, jednocześnie utrzymując genom wirusa w supernatancie.
    4. Odwirować probówkę przez 25 minut w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść supernatant (około 1,1 ml) do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    5. Dodaj 2,2 ml lodowatego absolutnego etanolu do probówki. Delikatnie wymieszaj i odstaw probówkę na lód na 15 minut. Wirować przez 5 minut przy 2000 x g w temperaturze pokojowej.
    6. Ostrożnie odessać supernatant i przepłukać osad (genomowe DNA wirusa) jednorazowo 800 μl 70% etanolu. Wirować probówkę przez 6 minut przy 15 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i wysuszyć na powietrzu osad DNA na dnie. Nie należy przesuszać osadu DNA, ponieważ może to spowodować trudności w ponownym rozpuszczeniu.
    7. Rozpuścić osad w 200 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA), dodać 1 μl RNazy A (10 mg/ml) i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Oczyść rozpuszczone DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia i koncentratora genomowego DNA (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Oceń ilościowo genomowe DNA wirusa za pomocą powszechnie stosowanej metody w laboratorium. Ogólnie rzecz biorąc, 1-5 μg genomowego DNA można uzyskać w kolbie T-25 komórek HEK293 zakażonych adenowirusem.

2. Budowa zakaźnego klonu HAdV-7 przez złożenie DNA

  1. Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji szkieletu plazmidu (Rysunek 1). Dodaj nakładające się sekwencje, które są potrzebne do złożenia DNA, do końców 5' starterów PCR. Ponadto należy uwzględnić miejsca restrykcyjne inne niż cutter (np. miejsce Pme I) na obu końcach genomu HAdV-7, aby pomóc uwolnić genom wirusa z zakaźnego klonu.
    UWAGA: Szkielet plazmidowy zawierający gen oporności na antybiotyki i pochodzenie replikacji jest amplifikowany metodą PCR i łączony z genomem HAdV-7. Adenowirusy można uratować przed pakowaniem komórek z większą skutecznością, gdy zamiast kolistego plazmidu adenowirusowego stosuje się linearyzowany genom wirusa. Po uwzględnieniu wyżej wymienionych czynników, startery są projektowane tak, jak pokazano na Rysunek 1.
  2. Przeprowadzić PCR w celu amplifikacji fragmentu (Kan-Ori) zawierającego gen oporności na kanamycynę (Kan) i pochodzenie pBR322 (Ori) przy użyciu pShuttle-CMV jako matrycy ze starterami Ad7KanF1 i Ad7KanR1 (Tabela S1). Ustawić reakcję PCR w następujący sposób: jeden cykl w temperaturze 98 °C przez 30 s, następnie pięć cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 8 s, wyżarzanie w temperaturze 68 °C przez 30 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 90 s i na koniec 25 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 8 s, wyżarzanie i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 2 min.
  3. Uruchom produkt PCR w 1% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy i oczyść fragment za pomocą komercyjnego zestawu do odzyskiwania żelu DNA.
  4. Dodaj odzyskane Kan-Ori i wirusowe genomowe DNA HAdV-7 do komercyjnego DNA Assembly Master Mix. Ustaw reakcję składania w całkowitej objętości 20 μl i stosunku molowym wektora do genomowego DNA wirusa wynoszącym 1:2. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 h.
    UWAGA: Ustaw reakcję w całkowitej objętości 20 μl z 1-3 μl wektora, 7-9 μl wirusowego genomowego DNA i 10 μl DNA Assembly Master Mix.
  5. Przekształć chemicznie kompetentne komórki TOP10 szczepu E. coli za pomocą 10 μl produktu montażowego za pomocą szoku cieplnego. Rozprowadzić mieszaninę transformacyjną na płytkach zawierających kanamycynę (50 μg/ml) Luria-Bertani (LB-Kan). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 12 godzin.
  6. Zaszczepić co najmniej trzy klony każdy w 5 ml pożywki LB-Kan w temperaturze 37 °C przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając (200-250 obr./min). Wyodrębnij DNA plazmidu za pomocą komercyjnego zestawu Plasmid Miniprep Kit.
  7. Trawić plazmid za pomocą endonukleazy restrykcyjnej, a następnie sprawdzić wielkość fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Figura 2A). Ponadto potwierdź miejsca fuzji przez sekwencjonowanie. Prawidłowy plazmid montażowy nosi nazwę pKan-Ad7.
  8. Wyhoduj 100 ml kultury bakterii z odpowiedniego klonu. Ekstrahuj preparat maxi-plazmidu za pomocą dostępnego w handlu zestawu Plasmid Maxprep Kit.

3. Budowa in silico i modyfikacja plazmidu pośredniego

UWAGA: Generalnie, plazmid pośredni powinien być skonstruowany, a jak skonstruować idealny plazmid pośredni jest kluczowym krokiem. Do zaprojektowania plazmidu pośredniego potrzebne jest oprogramowanie do analizy DNA z modułem enzymu restrykcyjnego, takie jak pDRAW32 (bezpłatne oprogramowanie dostępne na stronie www.acaclone.com).

  1. Zaimportuj sekwencję DNA pKan-Ad7 do pDRAW32, aby narysować mapę plazmidu. Dodaj adnotacje do interesujących regionów na mapie. Dla regionów pKan-Ad7, E1, E3 i szkieletu plazmidowego (Kan-Ori) oznaczono adnotacje.
  2. Uruchomić program pDRAW32. Najpierw kliknij Ustawienia > Wybór enzymu, a następnie kliknij Minimalne/Maksymalne cięcia. Wprowadź 1 w polu Min i wprowadź 2 w polu Max i zaznacz pole przed w całej sekwencji. Na koniec kliknij OK, aby wyświetlić na mapie unikalne i podwójne miejsca enzymów ograniczających noże.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wybierane są tylko enzymy restrykcyjne, które rozpoznają sekwencję 6 pz lub dłuższą. Jak pokazano na Rysunek 3A, 17 enzymów spełnia kryteria wyboru enzymów.
  3. Weźmy pod uwagę pierwsze miejsce objęte ograniczeniami, które otacza region E3 od czasu, gdy E3 ma zostać zmodyfikowane. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I i Spe I spełniły wymóg.
    UWAGA: Do tego eksperymentu wybrano Hpa I, ponieważ trawienie z nim pKan-Ad7 wygenerowałoby najkrótszy fragment przenoszący region E3, a mniejszy plazmid pośredni ułatwiłby przyszłą modyfikację. Wybór miejsc Sal I ma również zalety - taki plazmid pośredni jest odpowiedni do modyfikacji zarówno regionów E1, jak i E3 (ryc. S1).
  4. Utwórz plik sekwencji końcowej wyświetlający obie nici DNA plazmidu pośredniego pKan-Ad7HpaI. Ta wirtualna sekwencja może być używana jako szablon do projektowania nakładających się podkładów.
    1. Skopiuj sekwencję między dwoma miejscami ograniczeń Hpa I, w tym regionem E3. Do późniejszego montażu konieczne jest skopiowanie każdej sekwencji ~20 pz (Tm równej lub większej niż 48°C) poza miejscem ograniczenia Hpa I (Rysunek 3C, nakładanie się - Finał 1 i nakładanie się - Finał2).
    2. Dodaj sekwencję rozpoznawania Pme I (Rysunek 3C, gtttaaac) na obu końcach powyższej sekwencji.
    3. Dodaj sekwencję plazmidu szkieletowego zawierającego gen oporności na antybiotyki i pochodzenie replikacji (Rysunek 3C, Kan-Ori) poza miejscem restrykcji Pme I.
    4. Zaimportuj końcową sekwencję do pDRAW32, aby narysować mapę plazmidu. Dodaj adnotacje do regionu E3 na mapie.
    5. Uruchomić program pDRAW32. Najpierw kliknij Ustawienia > Wybór enzymu, a następnie kliknij Minimalne/Maksymalne cięcia. Wprowadź 1 zarówno w polu Min, jak i Max, a następnie zaznacz pole przed w całej sekwencji. Kliknij OK na końcu, aby wyświetlić unikalne miejsca enzymów restrykcyjnych na mapie. Można zauważyć, że dostępnych jest wiele unikalnych frezów do modyfikacji E3.
      UWAGA: W tym eksperymencie BstZ17 I i Mlu I są wybierane do zastąpienia częściowego E3. Przydatny może być również podwójny nóż. Na przykład podwójny nóż Ssp I wraz z unikalnym nożem BssH II można wybrać do wymiany całego regionu E3 za pomocą PCR z przedłużeniem na zakładkę.
  5. Zaprojektuj startery, wykorzystując sekwencję wirtualną jako szablon do budowy plazmidu pośredniego (Rysunek 3C).
    UWAGA: Aby skrócić długość każdego podkładu, zaprojektowano cztery podkłady. Produkt PCR, który jest amplifikowany starterami Ad7HpaIF1 i Ad7HpaIR1, zostanie użyty jako matryca do uzyskania końcowego fragmentu PCR ze starterami Ad7HpaIF2 i Ad7HpaIR2 (Figura 3C).

4. Na ratunek zakaźnemu rekombinowanemu adenowirusowi w komórkach HEK293

UWAGA: Wszystkie trzy adenowirusy wygenerowane w tym artykule są ratowane zgodnie z następującym protokołem.

  1. Trawić 10 μg rekombinowanego plazmidu adenowirusowego z 2 μl Pme I przez 5 godzin w temperaturze 37 °C w całkowitej objętości 100 μl w celu linearyzacji plazmidu. Sprawdź 1 μl strawionego DNA na 0,8% żelu agarozowym. Trawienie powinno dać ~34 kb fragment genomu adenowirusowego i ~2,5 kb plazmidowy szkielet Kan-Ori.
  2. Oczyść pozostałość zlinearyzowanego plazmidu adenowirusowego za pomocą zestawu do czyszczenia i koncentratora genomowego DNA.
  3. Hodowla komórek HEK293 w DMEM plus 10% FBS. Nasiona komórek HEK293 (2 x 106 komórek) w kolbie T-25 na 1 dzień przed transfekcją, tak aby następnego dnia osiągnęły 70%-80% konfluencji. Użyj 5 μg plazmidu adenowirusowego strawionego przez Pme I do transfekcji komórek HEK293 przy użyciu dostępnych na rynku odczynników do transfekcji.
    UWAGA: Pożywkę transfekowanych komórek należy wymieniać co 3 dni.
  4. Sprawdzaj komórki codziennie, zbieraj komórki i hoduj pożywkę w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, gdy utworzą się ogniska komety (Rysunek 2B, wskazujący na replikację wirusa).
  5. Poddaj komórki lizie w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania. Po odwirowaniu przez 12 minut w temperaturze 1200 x g w temperaturze pokojowej zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze -80 °C w celu późniejszego namnażania wirusa.
    UWAGA: Gdy rekombinowany adenowirus wykazuje ekspresję GFP lub innych białek fluorescencyjnych, łatwiej jest określić, czy wirus został pomyślnie uratowany, ponieważ ogniska utworzone przez fluorescencyjne komórki białko-dodatnie można intuicyjnie obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.

5. Budowa plazmidu genomu HAdV-7 z delecją E3

UWAGA: Genom HAdV-7 ma długość 35 239 pz, a region E3 znajduje się między 27 354 pz a 31 057 pz genomu. Aby skonstruować plazmid pośredni, znajdź endonukleazę z dwoma miejscami cięcia na zakaźnym plazmidzie klonu lub dwie endonukleazy z pojedynczym miejscem cięcia na plazmidzie. Dostępne są Hpa I, Sal I lub Avr II i Mlu I. Sekwencję między BstZ17 I (28 312 pz) a Mlu I (30 757 pz) należy skreślić i zastąpić kasetą CMV-GFP-PA lub kasetą CMV-mCherry-PA.

  1. Trawić 600 ng pKan-Ad7 za pomocą Hpa I. Oczyść odpowiednio duży fragment pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) i mały fragment pKAd7-HpaI-FS (~7 kb), używając zestawu do odzyskiwania żelu DNA po elektroforezie żelowej. Przechowywać pKAd7-HpaI-FL w temperaturze -20 °C.
  2. Amplifikować fragment zawierający Kan i Ori za pomocą pShuttle-CMV jako matrycy ze starterami Ad7HpaIF1 i Ad7HpaIR1 (Tabela S1) metodą PCR. Odzyskać i rozcieńczyć produkt PCR (2541 pz), który ma być użyty jako matryca do drugiej rundy reakcji PCR w celu amplifikacji Kan-Ori2 starterami Ad7HpaIF2 i Ad7HpaIR2.
    1. Oczyść produkt PCR (2584 pz) po rozpuszczeniu w 1% żelu agarozowym przez elektroforezę. Ustawić reakcję PCR w następujący sposób: jeden cykl w temperaturze 98 °C przez 30 s, następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 8 s, wyżarzanie i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 2 min.
      UWAGA: Centralną częścią Kan-Ori2 jest fragment zawierający Kan i Ori, po którym następują sekwencje unikalnej endonukleazy restrykcyjnej, która nie występuje w małym fragmencie pKAd7-HpaI-FS (np. Pme I), oraz region nakładający się na duży fragment pKAd7-HpaI-FL; najbardziej zewnętrzne sekwencje to nakładający się obszar z małym fragmentem pKAd7-HpaI-FS.
  3. Dodaj produkt PCR Kan-Ori2 i odzyskany pKAd7-HpaI-FS w kroku 5.1 do DNA Assembly Master Mix. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę. Wykonaj kroki 2.4-2.6. Prawidłowy plazmid nosi nazwę pKan-Ad7HpaI (~10 kb).
  4. Wzmocnij fragment CMV-GFP-PA (~1,7 kb) zawierający promotor CMV, GFP CDS i sygnał poliA SV40 (PA) za pomocą pShuttle-GFP23 jako szablon ze starterami Ad7E3GFPF1 i Ad7E3GFPR1 (tabela S1). Oczyścić produkt PCR (1650 pz) po rozpuszczeniu w 1% żelu agarozowym przez elektroforezę.
    UWAGA: Nakładające się regiony, które mogą być złożone za pomocą BstZ17 I i Mlu I strawionych pKan-Ad7HpaI, powinny być zawarte w starterach, a unikalne miejsce restrykcyjne (np. Sbf I), które nie istnieje w plazmidzie pKan-Ad7, jest dodawane do starterów w celu dalszego składania restrykcji.
  5. Trawić 300 ng pKan-Ad7HpaI za pomocą BstZ17 I i Mlu I. Oczyść fragment 7,3 kb (większość regionów E3 jest usunięta) po rozpuszczeniu w 1% żelu agarozowym przez elektroforezę. Dodaj odzyskany fragment o wielkości 7,3 kb i odzyskany fragment CMV-GFP-PA (~1,6 kb) do DNA Assembly Master Mix. Wykonaj kroki 2.4-2.6. Prawidłowy plazmid nosi nazwę pKAd7-E3GFP (~9 kb).
    UWAGA: Wszystkie sekwencje pomiędzy BstZ17 I i Mlu I należą do regionu E3.
  6. Trawić 300 ng pKAd7-HE3GFP za pomocą Pme I. Oczyść duży fragment (~6,4 kb) za pomocą zestawu do odzyskiwania żelu DNA po elektroforezie żelu. Dodaj oczyszczony fragment i pKAd7-HpaI-FL odzyskany w kroku 5.1 do DNA Assembly Master Mix. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę. Wykonaj kroki 2.4-2.6. Prawidłowy plazmid nosi nazwę pKAd7-E3GFP.
  7. Transfekcyjne komórki HEK293 z Pme I-linearyzowanym pKAd7-E3GFP, jak opisano w sekcji 3. Uratowany adenowirus nosi nazwę Ad7-E3GFP.
  8. Wzmocnij fragment CMV-mCherry-PA (~1,6 kb) zawierający promotor CMV, mCherry CDS i sygnał poliA SV40 przy użyciu pKFAV4-CX19A jako matrycy ze starterami Ad7E3CHEF1 i Ad7E3CHER1. Oczyść produkt PCR po rozpuszczeniu w 1% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy.
  9. Trawić 600 ng pKAd7-E3GFP za pomocą Sbf I i oczyszczać fragment z ~35 kb. Dodaj fragment o wielkości 35 kb i odzyskany fragment CMV-mCherry-PA do DNA Assembly Master Mix. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę. Wykonaj kroki 2.4-2.6. Prawidłowy plazmid nosi nazwę pKAd7-E3CHE.
  10. Transfekcyjne komórki HEK293 z Pme I-linearyzowanym pKAd7-E3CHE zgodnie z opisem w punkcie 3. Uratowany adenowirus nosi nazwę Ad7-E3CHE.

6. Amplifikacja i oczyszczanie rekombinowanego adenowirusa w komórkach HEK293

  1. Zaszczepij adenowirusem 80%-90% zlewającą się monowarstwę komórek HEK293 wyhodowanych na ośmiu szalkach hodowlanych o średnicy 150 mm poddanych działaniu TC. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny przy łagodnym mieszaniu. Zastąp supernatant 25 ml DMEM zawierającym 2% FBS.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-3 dni.
    1. Odrzucić większość supernatantu z ośmiu szalek o średnicy 150 mm, gdy CPE wpływa na większość komórek. Zbierz zainfekowane komórki za pomocą podnośników komórkowych z końcową objętością elucji ~ 6,0 ml do probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml.
    2. Zarąb komórki przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby uwolnić wirusa. Oczyścić lizat przez odwirowanie przez 12 minut w temperaturze 1200 x g w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant zawierający wirusa.
  3. Dodać MgCl2 (0,1 mM) i nukleazę benzonazy (50 U/ml) do supernatantu. Delikatnie wirować przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Dodać NaCl (600 mM) do supernatantu i delikatnie wirować przez kolejne 40 minut w temperaturze 37 °C. Wirować przez 12 minut przy 1200 x g w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant zawierający wirusa w celu oczyszczenia.
  4. Przygotuj chlorek cezu (CsCl) o różnych stężeniach 1,35 g/ml, 1,30 g/ml i 1,25 g/ml z 10 mM Tris-HCl.
    1. Dodaj 0,8 ml roztworu CsCl o stężeniu 1,35 g/ml na dno probówki Ultra-Clear o pojemności 5,1 ml za pomocą pipety, a następnie powoli dodaj kolejno 0,8 ml roztworu CsCl o stężeniu 1,30 g/ml i 0,8 ml roztworu CsCl o stężeniu 1,25 g/ml na wierzchu pierwszego roztworu.
    2. Na koniec ostrożnie nałożyć ~2,5 ml supernatantu zebranego w kroku 6.3 na wierzch roztworu CsCl o stężeniu 1,25 g/ml i napełnić probówkę do 2-3 mm od góry za pomocą 10 mM Tris-HCl.
  5. Wirować przez 2 godziny przy 200 000 x g i temperaturze 8 °C w wirniku z wahliwym kubełkiem z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem w celu oddzielenia nienaruszonych cząstek wirusa od wadliwych cząstek wirusa.
    UWAGA: Po odwirowaniu w roztworze CsCl wyraźnie widać kilka białych pasków.
  6. Ostrożnie usunąć pasma pustych cząstek i warstwę resztek komórkowych za pomocą pipety, a następnie zebrać najniższy prążek zawierający dojrzałego wirusa za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml.
  7. Przenieść zebraną zawiesinę wirusa do kasety dializacyjnej 20 K MWCO i dializować w buforze dializacyjnym zawierającym 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 i 2% glicerolu (pH 8,0) przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. Następnego dnia należy wymienić bufor dializacyjny zawierający 10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 i 5% glicerolu (pH 8,0) i dializować przez 5 godzin w temperaturze 4 °C.
    2. Zebrać dializowane cząsteczki wirusa za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml. Przygotować wiele porcji o pożądanych małych objętościach (20-200 μl) i przechowywać oczyszczony wirus w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Miano cząstek oczyszczonego wirusa można oznaczyć, mierząc zawartość genomowego DNA, a miano zakaźności można określić na komórkach HEK293, zliczając komórki GFP-dodatnie za pomocą testu rozcieńczenia granicznego.

7. Identyfikacja rekombinowanego genomu adenowirusa przez trawienie enzymem restrykcyjnym

  1. Zainfekuj 80%-90% zlewającą się monowarstwę komórek HEK293 hodowanych w jednej kolbie T-25 rekombinowanym adenowirusem. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Zastąpić pożywkę hodowlaną świeżym DMEM zawierającym 2% FBS.
  2. Usunąć supernatant hodowli i wyekstrahować genomowe DNA wirusa zmodyfikowaną metodą Hirta opisaną w kroku 1.3, gdy CPE występuje w ciągu 2-3 dni.
  3. Strawić genomowe DNA rekombinowanego adenowirusa ze wskazanymi enzymami i przeanalizować na elektroforezie w żelu agarozowym. Rekombinowany plazmid adenowirusowy służył jako kontrola.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Strategia konstrukcji klonu infekcyjnego HAdV-7 została przedstawiona na Rysunku 1 i Rysunku 2. Dwa plazmidy klonu infekcyjnego wybrano losowo i zidentyfikowano odpowiednio za pomocą enzymów BstZ17 I, BamH I oraz EcoR V. Wyniki wykazały, że fragmenty były zgodne z oczekiwanym rozmiarem (Rysunek 2A), co wskazuje na prawidłową konstrukcję plazmidów. Ogniska komety (comet-foci) były widoczne w komórkach 12 dni po transfekcji komórek HE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Różne adenowirusy mają różne tropizmy tkankowe, a częstość występowania istniejącej wcześniej odporności gospodarza przeciwko różnym adenowirusom może ulegać intensywnym wahaniom u ludzi24, co przyciąga zainteresowanie konstruowaniem nowych wektorów adenowirusowych do terapii genowej lub opracowywania szczepionek. Jednak ustanowienie nowego systemu wektorów adenowirusowych pozostaje kłopotliwe dla ogólnych laboratoriów biologii molekularnej.

Tutaj wprowadziliśmy protokó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Beijing Natural Science Foundation (7204258), National Natural Science Foundation of China (82161138001, 82072266), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026), a badania i zastosowanie w śledzeniu molekularnym niezbędnych patogenów układu oddechowego w Pekinie, przez Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml mikrowirówka polipropylenowa ProbówkaAxygenMCT-150-CPrzechowywanie wirusa
15 ml polipropylenowe probówki wirówkoweCorning430790Przechowywanie wirusa
150 mm Naczynia hodowlane poddane działaniu TCCorning430599Wzrost komórek HEK29E
Kaseta dializacyjna 20 K MWCOThermoFisher Scientific66005Dializa wirusa
Kwas octowyAmresco714Ekstrakcja DNA
Afl IINEBR0520Trawienie
AgarozaTakara5260Elektroforeza
Wiek INEBR0552Trawienie
Asc INEBR0558Trawienie
BamH INEBR0136Trawienie
Nukleaza benzonazySigmaE8263-25KUOczyszczanie wirusa
BsrG INEBR0575Trawienie
Podnośnik komórekCorning3008Zeskrobać komórki 
CsClSigmaC3032Zestaw
do oczyszczania żelu DNAwirusa ZymoD4045Odzyskiwanie DNA
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 komórki
podłoże E.coli TOP10 kompetentne komórkiTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD.CB-104Transformacja produktu montażowego
EcoR VNEBR3195Trawienie
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Ekstrakcja DNA
Surowica bydlęca płodu (FBS)CytivaSV30208.02Hodowla komórek HEK293
Zestaw do czyszczenia i koncentratora genomowego DNAZymoD4065Oczyszczanie DNA
GlicerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dializa komórek
wirusa HEK293ATCCCRL-1573Amplifikacja wirusa
Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Trawienie
Siarczan kanamycynyAmresco408Wybór plazmidu
Kpn INEBR3142
Trawienie Marker DNA Lambda/HindIIITakara3403Elektroforeza
LB bulionBD240230LB płytka do bakterii
LB podłożeSolarbio Life ScienceL1010Pożywka dla bakterii
MgCl2Sigma63068Dializa wirusa
MikrowirówkaThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21REkstrakcja DNA
NaClSigmaS5886Dializa wirusa
Nde INEBR0111Trawienie
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621Składanie DNA
Nhe INEBR0131Trawienie
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemCytivaSH30256.01Mycie komórek
PipetaThermo Fisher ScientificMatrixZasysanie podłoża
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Zestaw
do miniprepu plazmiduTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD.DP103Ekstrakcja DNA
Pme INEBR0560Trawienie
Octan potasuAmresco698Ekstrakcja DNA
Proteaza KThermo Fisher ScientificAM2542Ekstrakcja DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR Matryca
RNazaBeyotimeD7089Ekstrakcja DNA
Sal INEBR0138Trawienie
Sbf INEBR3642Trawienie
SDSAmresco227Ekstrakcja DNA
Wirnik z wahliwym kubełkiemHITACHIS52STOczyszczanie wirusa
Kolba komórkowa T-25Corning430639Wzrost komórek HEK29E
Kolba komórkowa T-75Corning430641Wzrost komórek HEK29E
Odczynnik do transfekcjiPolyplus-transfekcja114-15Transfekcja
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEITECNAI 12Obsevation wirusa
Tris-HClAmresco234Dializa wirusa
UltrawirówkaHITACHIHimac CS120GXIIOczyszczanie wirusa
DNA

Bibliografia

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

transfer gen wgenom HAdV 7klon infekcyjnyprimery PCRszkielet plazmidowymonta Gibsonatrawienie restrykcyjnekom rki HEK293
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.