Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach w Finlandii. Dorosłe króliki nowozelandzkie białe (NZW) o wadze 3,0-4,0 kg wykorzystano do modelu królika miażdżycowego. W badaniu wieńcowym u świń zwierzęta ważyły 30-40 kg na początku eksperymentu. Osobno opisano protokół dla modelu miażdżycowego królika i modelu tętnicy wieńcowej świni, a następnie opisano, w jaki sposób można wykonać histologię dla nieulegających degradacji stentów wieńcowych, niezależnie od zastosowanego modelu in vivo.
1. Model miażdżycowy królika
UWAGA: Aby wywołać szybkie zmiany miażdżycowe w aorcie, zwierzęta są karmione dietą o wysokiej zawartości cholesterolu, a aorty są poddawane deendotelializacji przed implantacją stentu. Stentowanie i obrazowanie wykonuje się przez tętnice szyjne, a stenty są przetwarzane pod kątem histologii, jak opisano poniżej. Ultrasonografia wewnątrznaczyniowa (IVUS) jest bardziej odpowiednia niż optyczna koherentna tomografia (OCT) w przypadku aorty królika, ponieważ nie ma potrzeby przepłukiwania tętnic.
- Dieta wysokocholesterolowa (ryc. 1)
- Zamień zwykłą karmę dla królików w karmę o wysokim poziomie cholesterolu, dodając cholesterol. Wymieszaj cholesterol z jedną częścią etanolu i jedną częścią eteru dietylowego (250 g cholesterolu na 2 l 96% EtOH i 2 l eteru dietylowego) na mieszadle magnetycznym w dużej zlewce.
- Gdy cholesterol się rozpuści, wlej mieszaninę na 25 kg karmy dla królików do dużej miski wewnątrz okapu. Mieszaj paszę kilka razy dziennie przez 3-4 dni, aż mieszanina wyschnie.
- W ten sposób wytworzy się 1% paszy cholesterolowej. Aby wytworzyć 0,025% paszy cholesterolowej, 1% paszy cholesterolowej miesza się ze zwykłą karmą dla królików w stosunku 1:40.
- Balonowa denudacja aorty królika
- Wymieszaj aspirynę z wodą pitną dla królika, zaczynając 3 dni przed uszkodzeniem denudacji i kontynuuj do końca eksperymentu (100 mg aspiryny na 1 l wody pitnej). Woda podawana jest ad libitum.
- Znieczulenie królików 0,3 mg/kg medetomidyny i 20 mg/kg ketaminy podskórnie (s.c.). Usuń sierść z okolicy pachwinowej i wewnętrznej strony ud prawej tylnej nogi za pomocą maszynki do strzyżenia i wysterylizuj skórę środkiem dezynfekującym na bazie etanolu.
- Podać okołooperacyjny antybiotyk profilaktyczny (125 mg cefuroksymu s.c.).
- Zastosuj znieczulenie miejscowe przed nacięciami skóry z 10 mg/ml lidokainy s.c. wzdłuż wewnętrznej strony uda wzdłuż rowka, który utrzymuje główne naczynia krwionośne i nerwy w okolicy kości udowej.
- Wykonaj nacięcie skóry i ostrożnie przechodź przez tkankę podskórną i mięśnie nóg za pomocą nożyczek operacyjnych i nożyczek preparacyjnych.
- Odsłoń tętnicę udową i oddziel od otaczających tkanek oraz żyły i nerwu.
- Przełóż niewchłanialny szew chirurgiczny 5-0 dwukrotnie pod tętnicą w bliższej tętnicy udowej. Ostrożnie podnieś tętnicę za pomocą linii szwów (nie wykonuje się podwiązki, raczej szew chirurgiczny jest trzymany za pomocą igieł lub kleszczy do komarów). Linia ta służy do tymczasowego zatrzymania przepływu krwi do tętnicy udowej.
- Przełóż niewchłanialną linię szwu 5-0 dwukrotnie pod dystalną częścią tętnicy udowej i bezpiecznie zawiąż ligaturę, aby zamknąć dystalną tętnicę udową (na przykład za pomocą węzła Millera).
- Wykonaj małe nacięcie 1-2 mm lub arteriotomię w tętnicy za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych lub cienkiego skalpela, podczas gdy tętnica jest podtrzymywana i utrzymywana na miejscu od bliższych i dalszych linii chirurgicznych przez asystenta.
- Wprowadzić cewnik balonowy do embolektomii Fogarty 3F do tętnicy kierującej się proksymalnie w kierunku tętnicy biodrowej. Przed włożeniem należy przygotować cewnik do embolektomii, podłączając go do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 0,6 ml powietrza (można również użyć soli fizjologicznej, ale bardziej zgodny jest balon wypełniony powietrzem). Proksymalna linia chirurgiczna jest obniżona, aby umożliwić przejście cewnika do embolektomii.
UWAGA: Do zabiegu używa się cewnika do embolektomii Fogarty'ego bez światła przewodu prowadzącego.
- Przełóż cewnik do embolektomii 30 cm do tętnicy (zgodnie z oznaczeniami na trzonie cewnika). Napompuj strzykawką i pociągnij napompowany cewnik, aż osiągnie co najmniej rozwidlenie biodrowe, w którym to momencie wyczuwalny jest opór na cewniku.
- Opróżnij cewnik embolektomii i ponownie wprowadź go do aorty. Powtórz cofanie w sumie trzy razy.
- Po zakończeniu denudacji należy wycofać cewnik do embolektomii i zamknąć tętnicę udową linią szwu proksymalnego. Tętnica udowa zostanie więc niedrożna po zabiegu. Jednak ze względu na dobre krążenie boczne w tylnej kończynie królika, rzadko występują jakiekolwiek problemy zdrowotne związane z niedokrwieniem.
- Podwiązać mięsień pokrywający tętnicę udową za pomocą szwów resorbowalnych 4-0, a skórę szwem śródskórnym za pomocą wchłanialnej linii szwów 4-0.
- Zwierzęta są monitorowane, dopóki się nie obudzą, nie będą czujne, nie piją lub nie karmią. Ułatwiają rekonwalescencję królików za pomocą podgrzewanej komory z dostępem do wody i siana.
- Karprofen należy podawać po zabiegach chirurgicznych przez 1-3 dni lub dłużej, jeśli to konieczne (2 mg/kg mc., raz dziennie) w celu znieczulenia.
- Sttentowanie aorty królika
- Klopidogrel należy rozpocząć w dniu stentowania od dawki nasycającej 30 mg i kontynuować z dawką 15 mg na dobę do końca doświadczenia. Zmielone tabletki klopidogrelu w moździerzu, wymieszać z wodą z kranu (5 ml wody na jedną tabletkę klopidogrelu 75 mg; dawka nasycająca wynosi 2 ml, a następnie 1 ml na dobę) i podawać przez sondę żołądkową.
UWAGA: Klopidogrel nie rozpuszcza się całkowicie w wodzie z kranu; Codziennie przytrzymuj nową dawkę przed podaniem królikom leku. W tym momencie upewnij się, że króliki są codziennie podawane aspirynę po urazie denudacji.
- Znieczulić króliki 0,3 mg/kg medetomidyny i 20 mg/kg ketaminy s.c.
- Podać profilaktyczny antybiotyk okołooperacyjny (125 mg cefuroksymu s.c.).
- Usuń włosy z przedniej strony szyi za pomocą maszynki do golenia i wysterylizuj skórę środkiem dezynfekującym na bazie etanolu.
- Nałóż lidokainę jako środek znieczulający miejscowo wzdłuż linii środkowej szyi (3-5 ml) i wykonaj podłużne 4-5 cm nacięcie przez skórę.
- Otwórz platysmę, przecinając nożyczkami do preparowania wzdłuż. Koagulować małe tętniczki krwawiące, ściskając je pęsetą chirurgiczną lub koagulując za pomocą jednobiegunowego lub dwubiegunowego urządzenia do koagulacji.
- W mięśniach szyi identyfikuje się naturalny rowek, między którym znajduje się tętnica szyjna wraz z nerwem błędnym (między mięśniami mostkowo-sutkowymi i mostkowo-gnykowymi) (ryc. 2A). Ostrożnie wypreparuj tętnicę i oddziel ją od innych tkanek. Preferowana jest prawa tętnica szyjna, ponieważ zapewnia bardziej bezpośrednią linię dostępu do aorty zstępującej.
- Przełóż niewchłanialną linię szwów 5-0 dwa razy pod dystalną częścią tętnicy szyjnej i bezpiecznie podwiąż tętnicę. Przytrzymaj linię chirurgiczną do góry, aby podnieść dystalną część tętnicy szyjnej.
- Przełóż niewchłanialną linię chirurgiczną 5-0 dwa razy pod bliższą częścią tętnicy szyjnej. Nie wykonując podwiązania, użyj bliższej linii chirurgicznej, aby podnieść tętnicę szyjną, aby tymczasowo zablokować przepływ krwi do tętnicy szyjnej w obszarze operacyjnym.
- Wykonaj małą arteriotomię 1-2 mm w tętnicy szyjnej między liniami chirurgicznymi za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych.
- Włóż w pełni przygotowaną osłonę wprowadzającą 5F lub 6F w kierunku proksymalnym.
- Przepłukać osłonkę solą fizjologiczną, włożyć rozszerzacz do osłonki i przepłukać przed włożeniem osłonki do tętnicy. Dodatkowo, aby ułatwić przesuwanie osłony, należy przeciągnąć krótki drut doprowadzający przez rozszerzacz, aby wykonać zwężającą się końcówkę osłony.
- Gdy końcówka pochewki (a raczej rozszerzacza) znajdzie się wewnątrz tętnicy szyjnej, opuść bliższą linię chirurgiczną, aby umożliwić przejście osłonki do tętnicy.
- Przesuń osłonę o 2-3 cm do tętnicy szyjnej.
- Wyjmij zasłonę i drut z osłony wprowadzającego.
- Potwierdź umieszczenie osłonki w tętnicy, otwierając zastawkę osłonki i wypuszczając niewielką ilość (1-2 ml) krwi z osłonki.
- Przepłucz osłonkę heparynizowaną solą fizjologiczną (5000 IU na 1000 ml, 0,9% NaCl) i zszyj, aby przymocować ją do zasłon chirurgicznych lub skóry królika. Heparynizować królika, podając heparynę niefrakcjonowaną przez osłonkę (150 j.m./kg).
- Przenieś zwierzę na stół cewnikowania, jeśli operacja nie została wykonana na stole pracowni cewnikowania.
- Przełóż cienki przewód prowadzący naczynia wieńcowe (0,014 cala) przez osłonę wprowadzającą i wprowadź go do aorty zstępującej pod wpływem fluoroskopii. Przesuń cewnik prowadzący 5F nad prowadnikiem.
UWAGA: Cewnik prowadzący z zagięciem może być użyty, jeśli ma się problemy z nawigacją z tętnicy szyjnej do aorty zstępującej.
- Jeśli do uzyskania dostępu do aorty zstępującej użyto cewnika prowadzącego z zakrzywioną końcówką, zmień go na prosty cewnik prowadzący nad drutem prowadzącym, aby dostarczyć stenty lub cewniki obrazowe.
- Uzyskaj obraz angiograficzny aorty brzusznej przez wstrzyknięcie kontrastu przez cewnik prowadzący ze środkiem kontrastowym na bazie jodu (250-350 mgI/ml).
- Wybierz odpowiedni odcinek między tętnicami lędźwiowymi w aorcie podnerkowej do założenia stentu. Wprowadzić stent w stosunku 1,1:1 (stent jest nieco przewymiarowany w stosunku do tętnicy, aby zapobiec przesuwaniu się stentu po wyjęciu cewnika balonowego) do aorty za pomocą indeflatora zgodnie z instrukcjami producenta stentu (wszystkie stenty zamontowane na cewnikach balonowych będą miały tabelę rozmiarów dostarczoną ze stentem). Opróżnij balon i wyjmij cewnik do stentu (ryc. 2B).
- Wykonaj powtórną angiografię ze środkiem kontrastowym, aby potwierdzić umieszczenie stentu.
- Usuń osłonkę wprowadzającą po stentowaniu i obrazowaniu. Zamknij tętnicę za pomocą bliższej linii szwu w tętnicy szyjnej. Spowoduje to całkowite zamknięcie tętnicy szyjnej.
- Zamknij warstwy mięśniowe szyi (zwykle dwie warstwy szwów) za pomocą szwów resorbowalnych 4-0, a skórę za pomocą wchłanialnych szwów śródskórnych 4-0.
- Monitorować powrót zwierzęcia do zdrowia i podawać leki przeciwbólowe zgodnie z opisem w operacji denudacji balonowej (kroki 1.2.15-1.2.16).
- Obrazowanie aorty królika za pomocą IVUS
- Uzyskaj dostęp naczyniowy i umieść prosty cewnik prowadzący w aorcie zstępującej, zgodnie z opisem operacji stentowania aorty królika.
UWAGA: Obrazowanie wykonuje się w momencie stentowania przez ten sam dostęp naczyniowy. Drugi punkt czasowy obrazowania można utworzyć, wykorzystując lewą tętnicę szyjną.
- Przesunąć cewnik obrazowy przez drut prowadnik do dystalnej aorty poza segment stentowany (lub w miejscu, w którym zostanie umieszczony stent, jeśli wykonywane jest obrazowanie przed stentowaniem).
- Wykonaj odciąganie ręcznie, gdy dane IVUS są rejestrowane, lub rozpocznij automatyczne odciąganie (patrz instrukcja systemu IVUS). Podczas odciągania unit obrazowania przesuwa się nad obszarem docelowym automatycznie, jeśli jest to włączone przez system obrazowania lub ręcznie, przeciągając cewnik obrazowania nad obszarem zainteresowania (stentem) podczas rejestrowania danych obrazowania.
- Zapisz dane obrazowania i wyjmij cewnik do obrazowania, przewód prowadnikowy i cewnik prowadzący.
- Zdjąć osłonkę i zamknąć ranę pooperacyjną zgodnie z opisem procedury stentowania (krok 1.3).
- Monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia zgodnie z wcześniejszym opisem. Podawać leki przeciwbólowe zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 1.2.15-1.2.16).
- Perfuzja i utrwalenie tkanek (model królika)
- Uśmierc zwierzęta w znieczuleniu ketaminowo-medetomidynowym za pomocą 20-30 ml dożylnego wstrzyknięcia nasyconego siarczanu magnezu (MgSO4).
- Ukrwić solą fizjologiczną lub w przypadku pobierania próbek tylko do histologii za pomocą 1% mieszaniny paraformaldehydu, za pomocą dedykowanej pompy.
- Wykonaj perfuzję aorty królika, wprowadzając system perfuzyjny za pomocą igły lub kaniuli bezpośrednio do aorty zstępującej powyżej poziomu tętnicy nerkowej lub wprowadzając igłę przez lewą komorę serca do aorty (która spowoduje perfuzję całego zwierzęcia).
- Nałożyć zacisk na aortę w miejscu, w którym znajduje się końcówka igły lub kaniuli, aby zabezpieczyć ją w aorcie podczas zabiegu perfuzji.
- Wykonać fuzję z 1000 ml (z aorty zstępującej) lub 1500 ml (z aorty wstępującej przez lewą komorę) soli fizjologicznej lub 1% PFA.
- Pobrać stentowany odcinek aorty, ostrożnie wycinając go z otaczających tkanek.
UWAGA: Rozważ pobranie bliższych i dalszych odcinków aorty do badania histologicznego. Zbierz również wszelkie niezbędne chusteczki ochronne.
- Pobrane tkanki przeznaczone do analizy histologicznej umieścić w 4% paraformaldehydzie na 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub na noc w temperaturze 4 °C.
- W celu dalszego przechowywania przenieść do 50% EtOH w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, a następnie do 70% EtOH w temperaturze 4 °C, aż do przygotowania do badania histologicznego.
2. Model tętnicy wieńcowej świni
UWAGA: Serce świni anatomicznie i fizjologicznie przypomina serce ludzkie. Tętnice wieńcowe są również podobne - biegną nasierdziowo i tworzą trzy główne gałęzie wieńcowe (prawą tętnicę wieńcową (RCA) i lewą tętnicę wieńcową (LCA), która dalej dzieli się na lewą wstępującą tętnicę wieńcową (LAD) i lewą tętnicę obwodową (LCX)). Oto model z stentowaniem wykonanym na natywnych tętnicach wieńcowych świń i obrazowaniem wewnątrznaczyniowym wykonanym za pomocą OCT. Świnie są poszczone przez noc przed znieczuleniem.
- Znieczulenie i dostęp naczyniowy do stentowania naczyń wieńcowych świń i obrazowania
- Uspokoić zwierzęta azaperonem (8 mg/kg domięśniowo) i atropiną (0,05 mg/kg domięśniowo), a następnie wywołać i kontynuować znieczulenie propofolem (15 mg/kg/h) i fentanylem (10 μg/kg/h). Zaintubuj zwierzęta i utrzymuj je podłączone do respiratora przez cały czas trwania zabiegów.
- Dostęp naczyniowy pozyskiwany jest przez prawą tętnicę udową. Zlokalizuj tętnicę udową za pomocą przetwornika ultrasonograficznego (tętnicę można odróżnić od żyły na podstawie pulsacji tętniczej i ucisku za pomocą głowicy).
- Pod kontrolą USG wprowadzić igłę angiograficzną do tętnicy udowej.
- Po wejściu do tętnicy przez igłę przejdzie silny pulsujący przepływ krwi. Wsuń prowadnik do tętnicy i wyjmij igłę.
- Wsuń zmontowany i przepłukany wprowadzacz o odpowiednim rozmiarze (zwykle 5F lub 6F) do tętnicy przez przewód.
UWAGA: Uważaj, aby drut był widoczny przez cały czas, aby nie zgubił się w tętnicy.
- Wyjmij rozszerzacz i drut z osłony wprowadzającego.
- Przepłukać osłonkę heparynizowaną solą fizjologiczną (5 j.m./ml).
- Podawać 1 mg/kg enoksaparyny dożylnie po uzyskaniu dostępu naczyniowego.
- Do każdego zabiegu inwazyjnego należy podawać profilaktyczny antybiotyk (500 mg cefuroksymu domięśniowo).
- Angiografia i stentowanie tętnic wieńcowych świń
- Leczenie przeciwzakrzepowe należy rozpocząć w dniu wszczepienia stentu od dawki nasycającej 300 mg aspiryny na os (po) i dawki nasycającej 600 mg klopidogrelu po. Kontynuuj przyjmowanie aspiryny (100 mg na dobę) i klopidogrelu (75 mg na dobę) do końca eksperymentu.
- Przesuń drut prowadnikowy z końcówką J pod fluoroskopią do aorty wstępującej.
- Przesuń cewnik prowadzący pod odpowiednim kątem nad drutem J i włącz prawą i lewą tętnicę wieńcową (zwykle AR1 dla prawej tętnicy wieńcowej i AR2 dla lewej tętnicy wieńcowej).
UWAGA: Cewnik prowadzący jest podłączony do adaptera Y i kolektora z przewodem co najmniej środka kontrastowego, aby zminimalizować ryzyko przedostania się powietrza do systemu obrazowania.
- Wykonać koronarografię, wstrzykując środek kontrastowy do tętnicy wieńcowej.
UWAGA: Obrazowanie powinno być wykonywane pod co najmniej dwoma różnymi kątami dla każdej tętnicy wieńcowej. Przed obrazowaniem należy również podać dowieńcowy azotan (50-300 μL).
- Przeprowadź przewód doprowadzający naczynia wieńcowe (0.014 cala) do odpowiedniego segmentu naczyń wieńcowych. Umieścić stent w RCA i LCX lub rozwartej tętnicy brzeżnej wychodzącej z LCX.
UWAGA: LAD ma często zwężający się kształt, a stent może łatwo pozostać nadmiernie rozszerzony w części dystalnej lub niedostatecznie rozszerzony na bliższej krawędzi. Należy dokładnie rozważyć, które tętnice wieńcowe są używane. Skorzystaj z oprogramowania do analizy zwężeń w aparacie rentgenowskim lub obrazowaniu wewnątrznaczyniowym, aby wybrać dobry odcinek tętnicy i dopasować rozmiar stentu.
- Przesunąć stent nad drutem prowadzącym i rozmieścić za pomocą indeflatora zgodnie z instrukcjami producenta do stosunku stentu do tętnicy 1,1:1, nieznacznie przewymiarowując stent w porównaniu ze średnicą odniesienia tętnicy.
- W razie potrzeby wykonaj powtórną angiografię i obrazowanie wewnątrznaczyniowe.
- Usuń sprzęt do cewnikowania.
- Zdjąć osłonkę wprowadzającą i przycisnąć miejsce wkłucia ręcznie lub za pomocą urządzenia uciskającego kość udową.
UWAGA: Urządzenia do zamykania naczyń na ogół nie działają dobrze u świń ze względu na różnice w anatomii tylnej nogi świni w porównaniu z człowiekiem i stosunkowo mały rozmiar tętnicy udowej.
- Obrazowanie OCT tętnic wieńcowych
- Wykonaj obrazowanie OCT przed i po wszczepieniu stentu oraz podczas obserwacji. Aby rozpocząć obrazowanie OCT, uzyskaj dostęp naczyniowy, zaangażuj docelową tętnicę wieńcową za pomocą cewnika prowadzącego i przesuń przewód prowadzący naczyń wieńcowych dystalnie w tętnicy docelowej.
- Podłącz cewnik do obrazowania OCT do stacji dokującej systemu obrazowania.
UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami systemu obrazowania, ponieważ różnią się one w zależności od producenta, a także między różnymi generacjami cewników do obrazowania.
- Utwórz nowego Pacjenta do nagrania z wybranym kodem identyfikacyjnym.
- Przepłukać światło cewnika obrazowego środkiem kontrastowym.
UWAGA: Obrazowanie można wykonać z płukaniem solą fizjologiczną, ale może wymagać zmiany ustawień obrazu w systemie w celu uzyskania dokładnych wyników.
- Wprowadzić system jednoszynowy cewnika do obrazowania przez przewód doprowadzający i przesunąć znaczniki obrazowania cewnika do żądanego miejsca obrazowania.
UWAGA: Zawsze upewnij się, że przewód doprowadzający sięga wystarczająco głęboko w tętnicę; Nie pozwól, aby cewniki (obrazowanie, balon, stent) wychodziły poza końcówkę przewodu prowadzącego.
- Wykonaj obrazowanie. Uwzględnij cały stent, a także dystalne i proksymalne naczynia referencyjne w odciągu.
- Przepłukać światło cewnika obrazowego środkiem kontrastowym.
- Rozpocznij sekwencję automatycznego wycofywania.
- Przepłukać tętnicę wieńcową dużym bolusem środka kontrastowego przez cewnik prowadzący (250-350 mgI/ml).
- Perfuzja i utrwalenie tkanek (model świni)
- W znieczuleniu świnia jest uśmiercana za pomocą 50-100 ml bolusa dożylnego nasyconego chlorku potasu (KCl).
- Ukrwić solą fizjologiczną lub w przypadku pobierania próbek tylko do histologii za pomocą 1% mieszaniny paraformaldehydu, za pomocą dedykowanej pompy.
- Perfuzję całego serca świni, umieszczając luźno kaniulę lub igłę przymocowaną do pompy perfuzyjnej w aorcie wstępującej.
- Umieść zacisk na zewnątrz aorty, aby zamknąć aortę wokół igły/kaniuli.
UWAGA: Upewnij się, że guzki zastawki aortalnej są otwarte, aby umożliwić przepływ płynu perfuzyjnego do tętnic wieńcowych.
- Ukrwić z 750-1000 ml wybranego płynu perfuzyjnego.
- Pobrać stentowane segmenty tętnicy wieńcowej, ostrożnie wycinając je z otaczających tkanek.
UWAGA: Rozważ pobranie bliższych i dalszych odcinków tętnicy wieńcowej do badania histologicznego. Ponadto należy zebrać wszelkie niezbędne chusteczki ochronne.
- Pobrane tkanki przeznaczone do analizy histologicznej umieścić w 4% paraformaldehydzie na 4 godziny w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.
- W celu dalszego przechowywania przenieść do 50% EtOH w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, a następnie do 70% EtOH w temperaturze 4 °C, aż do przygotowania do badania histologicznego.
3. Histologia stentu
UWAGA: Histologia stentu z niedegradowalnych metalowych stentów wymaga użycia plastikowego systemu zatapiania i cięcia próbek za pomocą specjalistycznego mikrotomu. System osadzania jest dostępny na rynku, ale aby umożliwić immunohistologię opartą na przeciwciałach, należy wprowadzić kilka modyfikacji do protokołu. Protokół osadzania jest taki sam dla wszystkich próbek, niezależnie od użytego modelu zwierzęcego. Do procesu zatapiania należy używać plastikowego systemu zatapiania. Pracuj wewnątrz kaptura do wszystkich procedur osadzania i histologicznych.
- Odwodnić próbki z roztworu EtOH do ksylenu.
- Postępuj zgodnie z protokołem systemu osadzania, z wyjątkiem korzystania ze zdestabilizowanego rozwiązania podstawowego, zaczynając od drugiego kroku przed infiltracją.
UWAGA: Roztwór zasadowy ulega destabilizacji przez przepuszczenie przez tlenek amonu.
- Połącz płyny polimeryzacyjne w plastikowych słoikach na próbki z segmentami ze stentami.
UWAGA: Tętnice ze stentami można zamocować na miejscu, wprowadzając małą igłę przez zewnętrzną część pojemnika.
- Na próbki należy stosować próżnię przez 10-15 minut i pozostawić do polimeryzacji w temperaturze 4 °C przez co najmniej 48 godzin.
- Odetnij krawędzie plastikowego bloku (zwłaszcza jeśli używasz cylindrycznej formy), aby uzyskać proste powierzchnie. Pozwoli to na bezpieczne przymocowanie do mikrotomu.
- Pokrój za pomocą dedykowanego mikrotomu na odcinki 5-7 μm.
- Pozostawić świeżo pokrojone odcinki w 50% EtOH na 5-10 minut.
- Pobrać skrawki z EtOH na standardowe szkiełka mikroskopowe (dwie lub trzy sekcje na szkiełko).
- Przykryj dwiema lub trzema kroplami roztworu Haupta i przykryj folią z tworzywa sztucznego. Umieść warstwę papieru na plastikowej folii i umieść puste szklane szkiełko przygotowawcze na wierzchu papieru.
- Wywierać nacisk na szkiełko przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 42 °C, umieszczając szkiełka w małym imadle stołowym, wyściełanym warstwami papieru.
- Przechowuj slajdy w RT.
- Przed barwieniem histologicznym należy usunąć żywicę na bazie tworzywa sztucznego, inkubując szkiełka w metakrylanie metylu przez 24-48 godzin.
- Klarowny w ksylenie (inkubacja 2 x 10 min) przed standardową procedurą histologiczną lub immunohistologiczną7,8.