Nowy, wysokowydajny model ran skóry owiec ex vivo do testowania nowych antybiotyków

Podsumowanie

Protokół opisuje krok po kroku metodę tworzenia ex vivo modelu zranionej skóry owcy zakażonej Staphylococcus aureus. Ten wysokowydajny model lepiej symuluje infekcje in vivo w porównaniu z konwencjonalnymi technikami mikrobiologicznymi i stanowi dla naukowców fizjologicznie istotną platformę do testowania skuteczności nowo pojawiających się środków przeciwdrobnoustrojowych.

Streszczenie

Rozwój środków przeciwdrobnoustrojowych jest kosztownym procesem o coraz niższych wskaźnikach sukcesu, co sprawia, że dalsze inwestowanie w badania nad badaniami nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi staje się mniej atrakcyjne. Odkrywanie leków przeciwdrobnoustrojowych, a następnie ich komercjalizacja mogą stać się bardziej lukratywne, jeśli podejście "szybko i tanio" zostanie wdrożone na etapach optymalizacji leadów, w których naukowcy mają większą kontrolę nad projektowaniem i formułowaniem leków. W tym artykule opisano konfigurację modelu skóry zranionej ex vivo owiec zakażonego Staphylococcus aureus, która jest prosta, opłacalna, wysokowydajna i powtarzalna. Fizjologia bakterii w modelu naśladuje tę podczas infekcji, ponieważ namnażanie się bakterii zależy od zdolności patogenu do uszkodzenia tkanki. Ustalenie się zakażenia rany jest weryfikowane przez wzrost liczby żywotnych bakterii w porównaniu z inokulum. Model ten może być wykorzystany jako platforma do testowania skuteczności pojawiających się środków przeciwdrobnoustrojowych na etapie optymalizacji ołowiu. Można twierdzić, że dostępność tego modelu zapewni naukowcom opracowującym środki przeciwdrobnoustrojowe model "szybki i tani w razie awarii", co pomoże zwiększyć wskaźniki sukcesu w kolejnych badaniach na zwierzętach. Model ten ułatwi również ograniczenie i udoskonalenie wykorzystywania zwierząt do celów badawczych, a ostatecznie umożliwi szybsze i bardziej opłacalne zastosowanie nowatorskich środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w zakażeniach skóry i tkanek miękkich w praktyce klinicznej.

Wprowadzenie

Infekcje skóry są poważnym globalnym problemem, z dużymi kosztami ekonomicznymi dla dostawców usług medycznych na całym świecie. Rozwój oporności wielolekowej i tworzenie biofilmu przez patogeny odgrywa kluczową rolę w występowaniu niegojących się ran^1,2,3,4. W związku z tym infekcje skóry i tkanek miękkich są jednym z najczęstszych powodów przedłużającej się hospitalizacji i późniejszej readmisji⁵. Opóźnienia w gojeniu się ran są kosztowne zarówno dla pacjenta, jak i pracowników służby zdrowia, a niektóre szacunki sugerują, że rocznie w USA dotyka ich około 6,5 miliona pacjentów. W Wielkiej Brytanii infekcje skóry i związane z nimi powikłania powodują około 75 000 zgonów rocznie^2,4,6.

Staphylococcus aureus (S. aureus) to groźny patogen ran, często izolowany z ran pacjenta^2,7. Tempo pojawiania się oporności wielolekowej drastycznie wzrosło w 2000 roku. W tym czasie około 60% ostrych bakteryjnych infekcji skóry i struktury skóry było dodatnich w posiewie na obecność opornego na metycylinę S. aureus¹. Rosnąca liczba szczepów wielolekoopornych wśród gronkowców, a także innych patogenów, w ciągu ostatnich 2 dekad wskazuje na pilną potrzebę szybkiego opracowania antybiotyków o nowych sposobach działania, które mogą przezwyciężyć oporność.

Jednak od początku 2000 roku, programy odkrywania antybiotyków były zdominowane przez dłuższy czas rozwoju i niskie wskaźniki sukcesu, a tylko 17% nowych antybiotyków wchodzących w fazę badań klinicznych w USA uzyskało aprobatę rynkową⁸. Sugeruje to rozbieżność między wynikami badań in vitro nowo pojawiających się antybiotyków a ich wynikami klinicznymi. Można twierdzić, że rozbieżność ta wynika w dużej mierze z różnic w fizjologii bakterii podczas zakażeń in vivo oraz podczas konwencjonalnych metod mikrobiologicznych podczas testowania skuteczności antybiotyków w fazie przedklinicznej in vitro. Dlatego potrzebne są nowatorskie metody laboratoryjne, które są bardziej reprezentatywne dla fizjologii bakterii podczas infekcji, aby poprawić wskaźniki sukcesu w programach odkrywania antybiotyków.

Obecne metody badania infekcji skóry obejmują badania na żywych zwierzętach (np. myszach), modelach skóry ex vivo (np. świniach) oraz modelach skóry 3D inżynierii tkankowej (np. ludzkiej)^9,10,11,12. Badania na żywych zwierzętach są ściśle regulowane i mają stosunkowo niską przepustowość. W modelach zwierzęcych zranienia i infekcje powodują znaczny stres u zwierząt i budzą obawy etyczne. Modele ludzkiej skóry, ex vivo lub inżynierii tkankowej, wymagają zatwierdzenia etycznego, zgodności z lokalnymi i globalnymi przepisami (Ustawa o tkankach ludzkich, Deklaracja Helsińska) i występują trudności w pozyskiwaniu tkanek, a niektóre żądania trwają latami, a spełnienie niektórych żądań trwa latami^13,14. Oba typy modeli są pracochłonne i wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej, aby zapewnić sukces eksperymentalny. Niektóre obecne modele zakażeń skóry ex vivo wymagają wstępnie zaszczepionych krążków i dodatków do łożyska rany, aby umożliwić infekcję; Chociaż modele te są niezwykle przydatne, istnieją ograniczenia w procesie infekcji, ponieważ dodatki ograniczają wykorzystanie łożyska rany jako źródła składników odżywczych^10,15,16,17. Model opisany w tym badaniu nie wykorzystuje żadnych dodatków do łożyska rany, co zapewnia, że patologia infekcji i liczba żywotnych komórek są wynikiem bezpośredniego wykorzystania łożyska rany jako jedynego źródła składników odżywczych.

Biorąc pod uwagę potrzebę nowych metod laboratoryjnych, opracowano nowy, wysokoprzepustowy model infekcji skóry owiec ex vivo do wykorzystania w ocenie skuteczności pojawiających się antybiotyków. Badania nad infekcjami skóry napotykają wiele wyzwań - wysokie koszty, obawy etyczne i modele, które nie pokazują pełnego obrazu^20,21. Modele ex vivo i modele 3D eksplantatów pozwalają na lepszą wizualizację procesu chorobowego i wpływu, jaki leczenie może mieć z bardziej istotnego klinicznie modelu. W tym miejscu opisano konfigurację nowatorskiego modelu skóry owczej, który jest prosty, powtarzalny i klinicznie istotny oraz ma wysoką przepustowość. Wybrano skórę owczą, ponieważ owce są jednym z dużych ssaków powszechnie wykorzystywanych do modelowania odpowiedzi na infekcje in vivo. Co więcej, są one łatwo dostępne w rzeźniach, co zapewnia stały dopływ skóry do badań, a ich tusze nie są parzone, co zapewnia dobrą jakość tkanek. W badaniu tym wykorzystano S. aureus jako przykładowy patogen; Jednak model dobrze współpracuje z innymi mikroorganizmami.

Protokół

Głowy jagniąt z rzeźni R.B Elliott and Son zostały użyte jako źródło próbek skóry w tym projekcie. Wszystkie jagnięta były zabijane w celu spożycia jako żywność. Zamiast wyrzucać głowy, zostały one ponownie wykorzystane do badań. Zgoda etyczna nie była wymagana, ponieważ tkanka pochodziła z odpadów wyrzuconych z rzeźni.

1. Sterylizacja

1. Zdezynfekuj kleszcze przed pobraniem głów, pobierając czyste kleszcze i wykonując sterylizację na sucho w piecu w temperaturze 200 °C przez 1 godzinę. Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie szklane naczynia w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
2. Wszystkie opisane prace należy wykonać w szafie mikrobiologicznej klasy 2. Przygotuj wszystkie odczynniki zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Pobieranie próbek

1. W rzeźni jagnięta Swaledale były zabijane przez ogłuszenie przy użyciu elektryczności lub pistoletu z bolcem i wykrwawiane. Głowy jagnięce zbierać nie później niż 4 godziny po uboju.

3. Przygotowanie głów

1. Zdezynfekować część czoła jagnięcia, wlewając około 100 ml roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 ppm na obszar próbki. Ogol czoło głowy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i umyj obszar 200 ml roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 ppm.
2. Przetrzyj obszar etanolem i niebieską rolką i przykryj obszar próbki kremem do depilacji przez 35 minut. Delikatnie zeskrob krem do depilacji za pomocą narzędzia do skrobania i oceń obszar próbki. Jeśli pozostała znaczna ilość włosów, powtórz proces usuwania włosów.
3. Użyj kolejnych 200 ml roztworu dwutlenku chloru, aby spłukać obszar, a następnie spłucz etanolem i przetrzyj niebieską rolką.
4. Za pomocą sterylnego dziurkacza do biopsji o średnicy 8 mm wytnij 8 mm próbki skóry z przygotowanego obszaru. Usuń próbki za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela z 15 ostrzami, upewniając się, że cały tłuszcz skórny został usunięty.
5. Umieść próbki w sterylnym słoiku o pojemności 0,5 l wypełnionym sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie przenieś je do sterylnych probówek o pojemności 50 ml z 50 ml roztworu 200 ppm dwutlenku chloru, dwukrotnie odwróć i pozostaw do sterylizacji na 30 minut.
6. Wyjąć próbki z roztworu dwutlenku chloru i umyć je, umieszczając je w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 40 ml sterylnego PBS. Po umyciu każdą pojedynczą próbkę skóry należy umieścić w oddzielnym dołku na 24-dołkowej płytce.
7. Dodać 350 μl wstępnie podgrzanej pożywki, utrzymując próbkę na granicy faz powietrze-ciecz. Skład pożywki jest następujący: pożywka MK (pożywka 199 z solami Hanksa, L-glutaminianem i 1,75 mg/ml wodorowęglanu sodu) oraz F12 Hama w stosunku 1:1, z dodatkiem FBS (10% v/v), EGF (10 ng/ml), insuliny (5 μg/ml), penicyliny-streptomycyny (100 U/ml) i amfoterycyny B (2,5 μg/ml).
8. Uszczelnić 24-dołkowe płytki płytką przepuszczającą gaz, uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkanek o stężeniu 5% CO_{2 przez} okres do 24 godzin.

4. Konserwacja próbek skóry

1. Po inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną i przepłukać próbki w 500 μl sterylnego PBS. Do każdej próbki dodać pożywkę wolną od antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkanek o stężeniu 5% CO_{2 przez} 24 godziny w celu usunięcia pozostałości antybiotyków z próbki.
2. Jeśli po 24 godzinach w pożywce wolnej od antybiotyków wystąpi zmętnienie lub infekcja grzybicza, należy wyrzucić próbkę.

5. Przygotowanie inokulum

1. Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z 10 ml sterylnego tryptycznego bulionu sojowego. Weź świeżą płytkę agarową S. aureus i za pomocą wacika przenieś kilka kolonii do bulionu. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C przy 150 obr./min.
2. Wirować przy 4 000 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml sterylnego PBS. Powtórz dwukrotnie, aby zapewnić odpowiednie umycie komórek.
3. Ustawić inokulum na 0,6 OD₆₀₀ w sterylnym PBS. Potwierdzić ładunek inokulum, przeprowadzając ręczne liczenie żywotnych płytek.

6. Zakażenie próbek skóry

1. Przygotuj świeżą 24-dołkową płytkę z 400 μl wstępnie podgrzanej pożywki wolnej od antybiotyków i dodaj 24-dołkowe wkładki za pomocą sterylnych kleszczyków.
2. Usunąć podłoże z próbek skóry, przemyć 500 μl sterylnego PBS i usunąć płyn do płukania. Użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie przytrzymać próbkę na dnie studzienki.
3. Użyj biopsji dziurkowania 4 mm, aby wykonać centralny płat rany, przebijając się na przybliżoną głębokość 1-2 mm. Następnie za pomocą skalpela z 15 ostrzami i sterylnych ząbkowanych kleszczyków tkankowych allis należy usunąć wierzchnią warstwę płata rany. Zmienność wymiarów rany może mieć wpływ na wynik zakażenia i końcowe jednostki tworzące kolonie (CFU).
4. Gdy wszystkie próbki zostaną zranione, przenieś je do wkładek 24-dołkowych za pomocą sterylnych kleszczy. Odpipetować 15 μl inokulum bakteryjnego do łożyska rany. Następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkankowym o stężeniu 5% CO_{2 .}
5. Jeśli konieczne są dłuższe okresy inkubacji, należy usunąć pożywkę i zastąpić ją nową pożywką co 24 godziny i inkubować w tych samych warunkach.

7. Określenie obciążenia bakteryjnego

1. Usuń media z dna studzienek. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś każdą próbkę do oddzielnej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 1 ml sterylnego PBS.
2. Użyj homogenizatora z cienką końcówką, aby homogenizować powierzchnię próbki. Należy upewnić się, że łożysko rany ma bezpośredni kontakt z końcówką homogenizatora.
3. Homogenizować każdą próbkę przez 35 s na średnim/wysokim. Homogenizator odrywa bakterie od powierzchni łożyska rany, aby umożliwić zliczenie ładunku bakteryjnego.
4. Po przetworzeniu wszystkich próbek, przed pipetowaniem należy kolejno zawirować każdą próbkę. Ma to na celu zapewnienie wymieszania homogenatu bakteryjnego.
5. Pobrać pipetą 20 μl homogenatu z wirem do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 180 μl sterylnego PBS.
6. Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę homogenatu do 1 x 10⁻⁷ i pipetować 10 μl rozcieńczonego homogenatu na tryptyczną płytkę agarową sojową w trzech powtórzeniach.
7. Inkubować płytkę agarową przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. Następnie policz liczbę kolonii, aby określić CFU dla każdej próbki.

Wyniki

Identyfikacja metody sterylizacji skóry przed przygotowaniem modelu infekcji rany była problematyczna. Wyzwanie polegało na przeprowadzeniu sterylizacji skóry bez uszkodzenia jej poszczególnych warstw, co w przeciwnym razie mogłoby doprowadzić do niezamierzonych skutków w przebiegu infekcji. W celu opracowania odpowiedniego schematu sterylizacji przetestowano różne metody przez zróżnicowany czas trwania, zgodnie z opisem w Tabela 1Kontaminację odnotowano jako pojawienie się zmętnienia po 48 h w pożywce M...

Dyskusja

Opracowanie środków przeciwdrobnoustrojowych jest ważnym, ale kosztownym przedsięwzięciem, które szacuje się na około 1 miliard dolarów, a jego ukończenie zajmie około 15 lat. Ponad 90% badań nad odkrywaniem leków przeciwdrobnoustrojowych i badaniami przedklinicznymi nad skutecznością leków przeciwdrobnoustrojowych jest przeprowadzanych przez naukowców akademickich oraz małe i średnie firmy zatrudniające zazwyczaj mniej niż 50 pracowników²². Zespoły te są bardzo ograniczone finansowo, co sprawia, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24-dołkowa płytka towarzysząca	SLS
Dziurkacz do biopsji 4 mm	Williams Medical	D7484
50 ml probówki wirówkowe	Fisher Scientific
Dziurkacz do biopsji 8 mm	Williams Medical	D7488
Amfoterycyna B, sterylny	Sigma	A2942
Bezprzewodowa maszynka do strzyżenia włosów Colour Pro Style	Wahl	9639-2117X	Maszynka do strzyżenia włosów
Inkubator z podwójnym	piekarnikiem SLS	OVe1020	Piec sterylizujący
Naskórkowy czynnik wzrostu	SLS	E5036-200UG
Etanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Surowica bydlęca płodu	Kleszcze Labtech International	CA-115/500
Fisher	Scientific	15307805
Krem do depilacji	Veet	Nie dotyczy
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Inkubator do hodowli tkankowych
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Homogenizator wirówkowy
220, ręczny	Fisher Scientific	15575809
220, stożki do mieszania tworzyw sztucznych	Fisher Scientific
Insert Individual 24-dołkowa membrana 0,4um	VWR International	353095
Insulina, rekombinowana ludzka	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, hodowla komórkowa Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Nie dotyczy	Inkubator bakteryjny
Tabletki PBS	Sigma	P4417-100TAB
Penicylina-Streptomycyna	SLS	P0781
Uszczelki płytowe	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego	Fisher Scientific	1284804
Ostrze skalpela numer 15	Skalpel Fisher Scientific	O305
Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761-1KG
Ząbkowane kleszczyki do tkanek Allis	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptyczny bulion sojowy	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tabletki	Quip Labs	VMTAB75BX

35350410788561 homogenizator 15585819 klasy II