Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych

Dla kobiet w USA¹, rak piersi (BC) nadal jest najczęściej diagnozowanym typem raka i powoduje więcej zgonów niż jakikolwiek inny typ nowotworu, z wyjątkiem raka płuc. Prognozy na 2022 r. szacują, że u 51 400 kobiet zostanie zdiagnozowany rak in situ, a u 287 850 kobiet zostanie zdiagnozowany rak inwazyjny, a 43 600 kobiet umrze z powodu BC¹. Pomimo rozpowszechnienia i śmiertelności związanej z BC, dostępnych jest niewiele opcji prewencji pierwotnej i badań translacyjnych nad nowatorskimi interwencjami, ponieważ prewencja pierwotna nie jest traktowana priorytetowo przez agencje federalne². Profilaktyczna mastektomia jest najskuteczniejszą interwencją w profilaktyce pierwotnej. Jednak ta procedura jest zalecana tylko dla osób wysokiego ryzyka, ponieważ jest to poważna operacja o konsekwencjach zmieniających życie³. Operacja ta polega na całkowitym usunięciu komórek nabłonka sutka, z których rozwija się kancerogeneza, a także normalnej otaczającej tkanki. Osoby są często zniechęcane do stosowania tej procedury jako pierwszej opcji podstawowej interwencji ze względu na negatywny wpływ stresu fizycznego, psychicznego i społecznego. Z tych powodów nawet niektóre osoby z grupy wysokiego ryzyka decydują się nie poddawać tej procedurze i zamiast tego wybierają czujne oczekiwanie lub podobne strategie nadzoru³. W poprzedniej publikacji dostarczanie 70% etanolu (EtOH) bezpośrednio do drzewa przewodowego modeli mysich było skuteczne w chemicznej ablacji komórek nabłonka sutka z ograniczonym uszkodzeniem sąsiednich normalnych tkanek i w zapobieganiu powstawaniu guza piersi⁴. EtOH jest stosowany w wielu zastosowaniach klinicznych jako środek ablacyjny do miejscowego leczenia niektórych nowotworów lub środek stwardniający do miejscowego leczenia obrzęku tętniczo-żylnego i wad rozwojowych^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14}. Niska toksyczność i profil bezpieczeństwa EtOH jest dobrze znany, ponieważ w niektórych procedurach można podać do 50 ml 95% EtOH na sesję^5,10.

Całkowite usunięcie komórek nabłonka sutka, z których rozwija się BC, jest najważniejszym elementem zarówno profilaktycznej mastektomii, jak i miejscowego podania roztworu ablatywnego. Dlatego potwierdzenie całkowitego wypełnienia drzewa przewodowego jest konieczne, aby zagwarantować, że roztwór ablacyjny miał bezpośredni kontakt ze wszystkimi komórkami nabłonka sutka. Dostarczenie roztworu w obrębie drzewa przewodowego (drzew przewodowych) i jego wizualizacja za pomocą fluoroskopii lub duktografii sterowanej obrazem są możliwe dzięki już istniejącym procedurom klinicznym^15,16,17. W związku z tym możliwe będzie łatwe wdrożenie i ocena tej procedury w badaniach klinicznych. Kluczowym krokiem w ustaleniu skuteczności i wykonalności translacyjnej ablacji wewnątrzprzewodowej (ID) jako nowej interwencji w prewencji pierwotnej będzie wykazanie wykonalności tego podejścia do wizualizacji rentgenowskiej w modelach zwierzęcych o rosnącym rozmiarze i złożoności architektury drzewa przewodowego^4,18,19. Protokół, który skaluje tę procedurę ablacyjną z mouse²⁰ do modeli szczurzych, jest opisany tutaj. Podczas gdy drzewa kanałowe myszy i szczurów mają podobną strukturę liniową i wzór rozgałęzień, drzewo kanałowe szczura jest proporcjonalnie większe i otoczone znacznie gęstszym zrębem. Wdrożyliśmy w laboratorium metodę skutecznego wstrzykiwania każdego gruczołu sutkowego szczurowi w serii cotygodniowych sesji za pomocą roztworu ablacyjnego zawierającego środek kontrastowy. Odstępy między sesjami są konieczne, aby zapewnić, że zwierzęta mają minimalne skutki uboczne EtOH ( Rysunek 1 i Rysunek 2). Zabieg polega na wstrzyknięciu roztworu ablacyjnego bezpośrednio do otworu sutkowego szczura znieczulonego izofluranem za pomocą igły 33 G. Niektóre kluczowe ulepszenia procedury obejmują stosowanie rozszerzonego leczenia przeciwzapalnego, wstrzykiwanie większych objętości na drzewo kanałowe niż sugerowano²¹ oraz gazoszczelne strzykawki do cieczy i gazów. Czas leczenia karprofenem w dawce 5 mg/kg mc. (NLPZ) od 48 godzin przed wstrzyknięciem do 1 tygodnia po wstrzyknięciu ID jest porównywalny z protokołem przeciwzapalnym stosowanym w leczeniu stwardniającym malformacji żylnych w klinice. Zabieg jest wykonywany u pacjentów w znieczuleniu ogólnoustrojowym, po którym przez 2 dni stosuje się leki przeciwzapalne, takie jak NLPZ. Kuracja przeciwzapalna może zostać przedłużona o kilka kolejnych dni, aby zmniejszyć miejscowy stan zapalny i potencjalny ból¹³. Podobnie jak u myszy²⁰, dootrzewnowe wstrzyknięcie 5% roztworu sacharozy łagodzi krótkotrwałe skutki zatrucia alkoholem u szczurów. Szczurom można wstrzyknąć do 1 ml 70% EtOH (do 4 przewodów; 0,2 g/dl zawartości EtOH we krwi) podczas jednej sesji, gdy podaje się im ten roztwór sacharozy; zwierzęta w pełni wracają do zdrowia w ciągu 4 godzin po wstrzyknięciu dowodu tożsamości. Wykonujemy sesje sekwencyjne, aby zapewnić wystarczający czas na regenerację przy wstrzykiwaniu więcej niż 4 gruczołów i/lub wyższych stężeń EtOH. Zatrucie alkoholem u kobiet będzie znacznie mniej prawdopodobne, ponieważ wstrzyknięcie ID wszystkich drzew przewodowych w obu piersiach, przy założeniu, że 16 głównych przewodów^16,17i 2 ml na kanał^22,23, z 70% EtOH skutkowałoby mniej niż 0,1 g/dl zawartości EtOH we krwi i może powodować łagodne upośledzenie.

Obrazowanie rentgenowskie umożliwia określenie, jak skuteczne jest dostarczanie wewnątrzprzewodowe w każdym pojedynczym gruczole i czy całe drzewo kanałowe jest wypełnione (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3). Obrazowanie fluoroskopowe w czasie rzeczywistym w ramach przygotowań do badania mikrotomografią komputerową i/lub rekonstrukcji 3D danych z pliku DICOM może być wykorzystane do oceny zakresu dostarczania roztworu do drzewa kanałowego i ewentualnego wycieku do zrębu. Zastosowanie fluoroskopii może pomóc w ograniczeniu całkowitej dawki promieniowania nałożonej na zwierzę. Technika fluoroskopii jest bardziej zbliżona do zamierzonego zastosowania klinicznego w zakresie obrazowania tego zabiegu ablatywnego. Porównanie zatwierdzonych przez FDA nanocząstek Isovue zawierających jod z nanocząstkami tlenku tantalu (TaO_x) zostało przeprowadzone w celu dalszego udoskonalenia użyteczności roztworu ablatywnego^4,19. Stwierdzono, że TaO_x jest lepszym środkiem kontrastowym mikro-CT niż Isovue do wizualizacji początkowego wypełnienia drzewa przewodowego u myszy^4,19. Tutaj pokazujemy, że TaOx jest odpowiednim środkiem kontrastowym do wizualizacji początkowego wypełnienia drzewa przewodowego szczura (Rysunek 2 i Rysunek 3). Zarówno w badaniach translacyjnych, jak i w praktyce klinicznej, środek żelujący etyloceluloza (EC) został dodany do roztworu EtOH w celu zminimalizowania dyfuzji z zamierzonych regionów docelowych^{13,14,24,25,26,27,28,29}. Badania wykazały, że dodanie do 1,5% EC do roztworów ablacyjnych zawierających EtOH jest zgodne z obrazowaniem opartym na_TaO x(Rysunek 3). Te, jak również dalsze udoskonalenia roztworu ablacyjnego, mogą pomóc w gotowym przeprowadzeniu tej procedury pod kontrolą obrazu do kliniki.

Wszystkie opisane eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Michigan.

1. Rozszerzone leczenie przeciwzapalne

1. Przygotuj kubki z żelem sukralozowym jako doustne dawkowanie karprofenu. Zapewnij szczurom to leczenie przeciwzapalne od 2 dni przed otrzymaniem iniekcji ID 70% EtOH do 7 dni po zabiegu.
2. Rozcieńczyć roztwór roboczy karprofenu w sterylnym PBS do wstrzykiwań do kubka. Z roztworu podstawowego o stężeniu 50 mg/ml przygotować rozcieńczony roztwór o stężeniu 2 mg/ml zabarwiony 1% v/v sterylnym niebieskim barwnikiem spożywczym i wstrzyknąć 500 μl do każdej filiżanki. Dodanie barwnika pomaga w wizualizacji całkowitego wymieszania leku z sukralozą kubka.
3. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta, aby przygotować kubek na dodanie karprofenu. O ile sprzedawca nie wskaże inaczej, podgrzej kubek w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C przez 15 minut i wysusz po wyjęciu, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
   1. Wytrzyj pokrywkę kubka z sukralozą z 70% EtOH w tym miejscu i wprowadź igłę strzykawki zawierającej roztwór roboczy karprofenu. Dozować odpowiednią objętość (500 μL).
   2. Przykryj nakłucie naklejką. Potrząsaj filiżanką energicznie przez 15 s, a następnie umieść ją w wirze na dodatkowe 15 sekund. Oceń wizualnie jednorodne i kompletne wymieszanie przed przechowywaniem do późniejszego użycia. Zwróć uwagę na obecność ciemnoniebieskiego koloru.
      UWAGA: Pozwól, aby filiżanki osiągnęły temperaturę pokojową. W razie potrzeby przechowuj kubki w temperaturze pokojowej, ale zwróć uwagę na wskazówki producenta dotyczące skuteczności leku. Alternatywnie przechowuj kubki w temperaturze 4 °C i zużyj w ciągu miesiąca. Datowanie naklejki jest dobrą praktyką pozwalającą śledzić datę wstrzyknięcia bez ryzyka, że długopis lub ostry marker przebije wieczko.
4. Tuż przed użyciem przetrzyj zewnętrzną część kubka 70% EtOH. Zdejmij pokrywkę przed umieszczeniem kubka w klatce dla zwierząt. Wymieniaj kubki co drugi dzień lub gdy są puste. Codziennie sprawdzaj poziom żelu, aby zapewnić odpowiednią dawkę. Jedna filiżanka może dostarczyć karprofen maksymalnie dwóm szczurom przez okres do 2 dni; Jednak szczury mogą wcześniej spożyć całą filiżankę.

2. Przygotowanie przedoperacyjne

UWAGA: Upewnij się, że etap przygotowania zwierzęcia poprzedza procedurę wstrzyknięcia ID o 2-3 dni.

1. Włącz parownik izofluranu (2%-3% izofluranu, 1,5 l/min tlenu), aby znieczulić szczura. Przenieś zwierzę do stożka nosowego na podkładce rozgrzewającej. Nałóż smar do oczu na szczura, a następnie ułóż zwierzę na grzbiecie. Uważnie monitorować oddech zwierzęcia, aby upewnić się, że płaszczyzna znieczulenia jest utrzymywana na poziomie 1%-3% izofluranu.
   UWAGA: Elektryczna maszynka do golenia może być używana do usuwania nadmiaru sierści przed depilacją. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić sutków maszynką do golenia. Z tego powodu ten krok można pominąć. Szczury są bardziej wrażliwe na krem do depilacji niż myszy, dlatego usunięcie nadmiaru kremu jest bardzo ważne. Unikaj wstrzykiwania roztworu zawierającego etanol w obszar, na którym występuje już otarcie spowodowane depilacją. Niektóre kremy zawierają związki takie jak aloes i lanolina, które mogą pomóc zminimalizować prawdopodobieństwo otarć.
2. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby rozprowadzić dostępny bez recepty krem do depilacji na obszarze brodawek sutkowych. Za pomocą aplikatora wcieraj krem w obszar przez 10-30 s. Sprawdź, czy futro szybko się poluzowało.
   1. Pozostaw krem na szczurze na jak najkrótszy odstęp czasu i całkowicie usuń, aby uniknąć pieczenia skóry. Szczury są jeszcze bardziej wrażliwe na tę procedurę niż myszy.
3. Po 10-30 s od aplikacji zwilż gazę ciepłą wodą i użyj jej do spłukania kremu i rozluźnionej sierści zwierzęcia. Wykonaj co najmniej trzy płukania obszaru świeżo zwilżoną gazą i osusz suchą gazą po ostatnim spłukaniu. Upewnij się, że widoczność jest dobra i dostęp do obszaru sutka, z którego usuwane jest futro. W razie potrzeby powtórz procedurę depilacji.
4. Umieść szczura w czystej klatce na poduszce grzewczej i pozwól mu dojść do siebie. Sprawdź szczura, aby upewnić się, że jest w pełni wyleczony ze znieczulenia, zanim przyniesiesz go z powrotem do stałej klatki.
5. Umieścić jeden kubek z karprofenem (1 mg / filiżankę) sukralozy w żelu w klatce w celu leczenia przeciwzapalnego. Codziennie sprawdzaj zużycie żelu i w razie potrzeby wymień go na świeży kubek. Nie zostawiaj kubka na dłużej niż 2 dni. Zazwyczaj kubki będą musiały zostać wymienione po 1 dniu.

3. Iniekcja wewnątrzprzewodowa

1. Przygotować roztwór podstawowy TaO_x o stężeniu 333,3 mM zgodnie z opisem¹⁹ używając sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Podgrzej roztwór, jeśli proszek nie rozpuści się całkowicie. Delikatnie wymieszaj. Nie wirować ani energicznie nie wstrząsać, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
2. Wymieszaj trzy części 333,3 mM TaO_x z siedmioma częściami 100% EtOH, aby uzyskać końcowy roztwór 70% EtOH₁₀₀ mM/TaO x. Opcjonalnie dodaj odpowiednią ilość 0,5%-1,5% etylocelulozy (EC) jako środek żelujący, aby zmaksymalizować miejscową retencję roztworu ablacyjnego. Dodać 1% v/v niebieskiego barwnika spożywczego do roztworu ablacyjnego w celu wizualnego zbadania dostarczania do drzewa przewodowego podczas infuzji.
3. Przygotuj wolumin odpowiedni do potrzeb eksperymentalnych. Pary gruczołów 1 (szyjka macicy) i 6 (pachwinowa) można wypełnić do 100 μl roztworu, podczas gdy wszystkie pozostałe pary można wypełnić do 300 μl.
4. Znieczulij szczura jak w kroku 2.1 i przenieś szczura do stożka nosowego po pełnym znieczuleniu. Nałóż smar do oczu na oba oczy, a następnie połóż zwierzę na grzbiecie. W razie potrzeby zabezpiecz szczura pod stereoskopem za pomocą taśmy w pobliżu sutków, które zostaną wstrzyknięte. Waga szczura jest na ogół wystarczająca, aby nie poruszał się znacznie bez taśmy.
5. Aby przygotować brodawki sutkowe do wstrzyknięcia, należy usunąć martwy naskórek pokrywający otwór brodawki sutkowej cienkimi, spiczastymi kleszkami, jeśli to możliwe. Szczury często mają zatyczkę wystającą z otworu sutka, która może uniemożliwić pomyślną kaniulację brodawki, jeśli nie zostanie usunięta.
   UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że większe objętości roztworów ablacyjnych stosowane u szczurów mogą z większym prawdopodobieństwem spowodować powierzchowne rany skóry w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Z tego powodu wstrzykiwanie co drugiego sutka podczas jednej sesji jest mniej szkodliwe i drażniące dla zwierzęcia niż wstrzykiwanie sąsiednich sutków. Monitorowanie szczurów pod kątem jakichkolwiek otarć przez 7 dni po wstrzyknięciu pomaga zapewnić, że drapanie zwierzęcia nie ma poważnych skutków zdrowotnych wynikających z drapania zwierzęcia i wprowadzania możliwości zakażenia przez zanieczyszczenie resztkami podłogi klatki. Potrójna maść z antybiotykiem lub płukanie roztworem chlorheksydyny mogą być stosowane w leczeniu wszelkich objawów infekcji, która może wystąpić (Tabela 1).
6. Za pomocą strzykawki o pojemności 500 μl z igłą 33 G odessać 101-301 μl roztworu ablalacyjnego. Odessać dodatkowy 1 μl roztworu w celu ewentualnego niewielkiego wycieku podczas wyjmowania igły kaniulowanej.
   UWAGA: Są to zalecenia dotyczące objętości mających na celu pełne wypełnienie drzewa (drzew) przewodowych: do 100 μl w gruczołach szyjnych i pachwinowych oraz do 300 μl w pozostałych gruczołach. W przypadku innych zastosowań może być właściwe użycie mniejszych lub większych woluminów.
7. Użyj pęsety, aby delikatnie przytrzymać sutek i wprowadzić igłę do otworu smoczka. Delikatnie kontynuuj wkładanie igły, aż skos znajdzie się całkowicie wewnątrz smoczka. Aby umieścić igłę w smoczku, należy podnieść sutek w kierunku igły, zamiast wciskać igłę w sutek. (Tabela 1). Uważaj, aby podążać ścieżką otworu smoczka.
   UWAGA: Sutki szczurów są na ogół znacznie łatwiejsze do manipulowania i skutecznego kaniulowania niż te u myszy ze względu na większy rozmiar. Jednak zwiększona ilość tłuszczu otaczająca otwór sutka zwiększa również prawdopodobieństwo omyłkowego wstrzyknięcia poduszeczki tłuszczowej, jeśli igła odchyla się od głównego kanału.
8. Po całkowitym wprowadzeniu skosu igły należy powoli podawać roztwór ze stałą szybkością około 100 μl/min u szczurów. Nagłe zmiany szybkości infuzji mogą spowodować pęknięcie lub uszkodzenie drzewa przewodowego. Odczekać 30 s po zakończeniu infuzji przed wyjęciem igły z kaniulowanego drzewa z pomocą kleszczy; gwarantuje to, że wstrzyknięta objętość pozostaje w drzewie kanałowym (Rysunek 2) i zmniejsza prawdopodobieństwo wycieku.
9. Oczyść rozlany roztwór zwilżoną gazą lub chusteczką EtOH, aby uniknąć obcego roztworu kontrastowego na obrazach.
10. Wstrzyknąć dootrzewnowo PBS zawierający 5% sacharozy (10 ml/kg) w celu złagodzenia skutków zatrucia alkoholem, jeśli etanol znajduje się w roztworach do wstrzykiwań ID. Dawka ta może być podawana na początku i na końcu zabiegu.

4. Obrazowanie mikro-CT

1. Po wstrzyknięciu wszystkich pożądanych gruczołów należy szybko przenieść zwierzę do systemu mikro-CT i kontynuować utrzymywanie znieczulenia za pomocą dołączonego parownika izofluranu.
2. Wyprostuj kręgosłup zwierzęcia i przyklej każdą tylną nogę w wyprostowanej pozycji, tak aby kości nóg zwierzęcia znajdowały się dalej od dolnych gruczołów będących przedmiotem zainteresowania i nie zachodziły na obszar zainteresowania na zeskanowanym obrazie.
3. Przyklej taśmę w poprzek brzucha, aby zminimalizować zakłócenia oddychania podczas skanowania dolnych gruczołów.
   UWAGA: Zwierzęta mogą być obrazowane za pomocą różnych parametrów skanowania (np. wysokiej rozdzielczości, skany podłużne), jeśli zostanie zachowana ostrożność w celu określenia odpowiedniej dopuszczalnej dawki promieniowania w ciągu całego życia dla szczurów i upewnienia się, że dawka skumulowana nie przekracza tego poziomu. Narażenie na promieniowanie można dodatkowo zmniejszyć, pobierając zdjęcia i filmy z fluoroskopii bez wykonywania skanów (Rysunek 2).
4. Wykonaj obrazowanie TaO_x drzewa kanałowego szczura z dobrą rozdzielczością i możliwością powtórzenia standardowych (2 min) skanów akwizycyjnych przy użyciu następujących parametrów skanowania: 90 kVp/88 μA; pole widzenia (FOV), 72 mm; liczba warstw, 512; grubość warstwy, 72 μm; rozdzielczość wokseli, 72 μm3. Skany o wysokiej rozdzielczości przez dłuższy czas (4-14 minut) można również uzyskać u zwierząt, które nie będą skanowane wzdłużnie przy użyciu tych samych parametrów.
5. Po pobraniu danych ostrożnie odsuń szczura od stożka anestezjologicznego i umieść go w nowej, czystej klatce na poduszce grzewczej. Sprawdź szczura, aby upewnić się, że w pełni wyzdrowiał po znieczuleniu, zanim przyniesiesz go z powrotem do stałej klatki. Umieścić kubek z sukralozą zawierającą karprofen i odpowiednio wymienić, jak opisano w kroku 2.5, aby zapewnić, że zwierzęta będą nadal otrzymywać leczenie przeciwzapalne przez następne 7 dni.
6. Przetwarzaj zeskanowane obrazy na szybkie odwzorowania w oprogramowaniu mikro-CT, aby lepiej dostrzec wszelkie wycieki kontrastu, tylko częściowe wypełnienie lub przepełnienie (Rysunek 2).
7. Przejdź do następnej sekcji, aby przeprowadzić formalne przetwarzanie obrazu do publikacji lub szczegółowej analizy skanów, jeśli jest to pożądane (Rysunek 3).

5. Analiza obrazu

1. Użyj specjalistycznych pakietów oprogramowania, aby stworzyć renderingi wypełnionego drzewa kanałowego.
   UWAGA: Najlepiej jest podzielić poduszeczkę tłuszczową sutka, aby uzyskać najlepsze odwzorowanie wstrzykniętego drzewa przewodowego. Splajn Śledź ciemne granice poduszeczki tłuszczowej na całej grubości zwierzęcia, aby osiągnąć tę segmentację.
2. Aby podzielić poduszeczkę tłuszczową (w przeciwieństwie do myszy, granice tego przedziału nie są tak łatwe do odróżnienia od jamy otrzewnej, mięśni udowych i skóry ze względu na podobne jednostki Hounsfielda), w której znajduje się interesujące nas drzewo przewodowe, wybór opcji "ślad splajnu" z menu ręcznego jest pierwszym krokiem do stworzenia renderingu.
3. Splajn Śledź kontur poduszeczki tłuszczowej w co trzecim plasterku. Kliknij opcję Propaguj obiekty w menu półautomatycznym. Spowoduje to rozpowszechnienie i połączenie wszystkich plasterków w jeden podzielony na segmenty obiekt zainteresowania.
   UWAGA: Zmiana progu w podzielonym na segmenty obszarze umożliwia wizualizację sygnału tylko w pewnym zakresie jednostek Hounsfielda (HU); W przypadku innych środków kontrastowych lub parametrów obrazowania zakres ten może wymagać korekty. Pakiet oprogramowania lub analiza sztucznej inteligencji mogą być wykorzystane do wykonania innych pomiarów i obrazów, aby pokazać, jak bardzo drzewo kanałowe zostało wypełnione.
4. Ustaw wartości HU na najniższy punkt 300 i najwyższy punkt 3,000 w menu półautomatycznym pod zakładką głośności progowej. Pozwala to na stworzenie odwzorowania wyświetlającego tylko kontrast (TaO_x) w obrębie drzewa przewodowego.
5. Ustaw wersję jako podstawową za pomocą przycisku "widok". Spowoduje to zmianę wyświetlacza tak, aby pokazywał tylko odwzorowanie 3D drzewa kanałowego.
   UWAGA: Wykonaj rekonstrukcję drzewa kanałowego w celu dalszej analizy.

Każdy z 12 gruczołów sutkowych samicy szczura zawiera pojedyncze drzewo przewodowe, które otwiera się przy ujściu sutków. Pomimo różnic w wielkości między myszą a szczurem, czas rozwoju gruczołów sutkowych i czas, w którym zwierzęta te osiągają dorosłość, są bardzo podobne30,31. Przedstawiono krótki opis kluczowych etapów rozwoju gruczołu mlekowego u szczurów jako reprezentatywnych dla obu gatunków gryzoni. Pąki końcowe (TEB) to wysoce proliferacyjne struktury na końcach wydłużonego drzewa przewodowego, które kierują rozgałęzieniami przewodowymi30,31. Szczyt proliferacji i zagęszczenia TEB występuje w wieku 3-4 tygodni podczas fazy wydłużania drzewa przewodowego w okresie dojrzewania30. W wieku 9-10 tygodni pozostaje niewiele TEB, ponieważ drzewo kanałowe urosło i zajmuje całą długość poduszeczki tłuszczowej30. Następnie wzrost i ekspansja drzewa przewodowego jest proporcjonalna do wzrostu i rozrostu poduszeczki tłuszczowej i zwierzęcia32. Końcowe przewodowe jednostki zrazikowe (TDLU) w ludzkiej piersi pełnią podobną rolę jak TEB u gryzoni. TDLU są głównym źródłem inicjacji kancerogenezy i progresji do BC33,34. Możemy wstrzyknąć do 300 μl 70% roztworu EtOH, aby wypełnić całe drzewo przewodowe gruczołów piersiowych i brzusznych 9-tygodniowego szczura Sprague-Dawley (Rycina 1, Rycina 2, Rycina 3). W przeciwieństwie do myszy20, sutki gruczołów szyjnych i pachwinowych szczurów Sprague-Dawley są zazwyczaj odpowiednie do wstrzykiwań u ponad 80% zwierząt, a do wypełnienia całego drzewa przewodowego potrzeba do 100 μl 70% roztworu EtOH (Rysunek 2). Rutynowo wstrzykujemy do 10 gruczołów sutkowych badanemu roztworowi ablacyjnemu. Typowy projekt eksperymentalny składa się z dwóch niezależnych cotygodniowych sesji iniekcji ID, w których pięć naprzemiennych gruczołów jest podawanych roztworem ablacyjnym zawierającym rentgenowski środek kontrastowy i/lub EC jako środek żelujący (Ryc. 2). W przypadku roztworu ablacyjnego zawierającegoTaO x (50-200 mM) fluoroskopia i/lub mikrotomografia komputerowa są wykonywane po zakończeniu każdej sesji w celu określenia i zarejestrowania indywidualnego sukcesu infuzji każdego drzewa przewodowego częściową lub pełną ilością roztworu w infuzji (Rysunek 2). Natychmiastowe i podłużne obrazowanie po wstrzyknięciu umożliwia ocenę, w jaki sposób zmiany w składzie, zwłaszcza stężenie środka żelującego EC, wpływają i ograniczają dyfuzję roztworu ablacyjnego na zewnątrz w funkcji wstrzykniętej objętości (Rysunek 3). Ta analiza obrazowa dostarcza informacji pozwalających zrozumieć optymalne parametry w celu osiągnięcia maksymalnej ablacji przy minimalnym uszkodzeniu tkanek pobocznych.

Rysunek 1: Schematy procedury wstrzykiwania dokanałowego i analizy obrazu u szczurów. Przedstawiono procedurę krok po kroku iniekcji dokanałowej i analizę obrazu. Zobacz wideo, aby uzyskać więcej informacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykłady kaniulacji brodawek sutkowych i wyników dostarczania roztworu ablacyjnego do wielu gruczołów sutkowych. (A) Typowa prezentacja kształtów sutków u szczepu szczurów Sprague-Dawley. Długość brodawki sutkowej koreluje z prawdopodobieństwem udanej kaniulacji. Dłuższe sutki są łatwiejsze do kaniulacji niż krótkie sutki, podczas gdy zbyt krótkie lub szczątkowe sutki nie mogą być kaniulowane. Po kaniulacji roztworem można wstrzyknąć zarówno długie, jak i krótkie sutki, osiągając podobne wskaźniki powodzenia porodu. Niebieski barwnik spożywczy w wstrzykniętym roztworze może być stosowany jako dowód in vivo na udane wypełnienie i dostarczenie drzewa przewodowego (najbardziej widoczne, tworzenie kopuły, w przypadku nieudanego wstrzyknięcia poduszeczki tłuszczowej). Fluoroskopia w czasie rzeczywistym (B) i mikrotomografia komputerowa 3D generowana po pozyskaniu obrazu (C) dostarczają dowodów in vivo na powodzenie dostarczania i bardziej ilościową ocenę roztworu docierającego do TEB. (B) Każdy gruczoł sutkowy w jamie brzusznej pierwszej pary (#4, #10) otrzymał roztwór ablacyjny z 1% EC (pomarańczowy kontur) lub bez niego (zielony kontur) (C) Pomyślne dostarczenie (niebieski kontur) roztworu ablacyjnego w prawej szyjce macicy (#7), drugiej parze gruczołów piersiowych (#3, #9) i pierwszej parze gruczołów piersiowych (#4, #10) oraz nieudane wstrzyknięcie (przerywany biały kontur) w lewy gruczoł piersiowy (#1). Paski skali odpowiadają 1 mm na obrazach przy różnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Rekonstrukcja 3D i ocena napełniania i dyfuzji roztworu ablacyjnego. 70% nanocząstek EtOH/100 mMTaO x z 1% EC (na górze) lub bez EC (na dole) wstrzyknięto doprzewodowo do drugiej pary gruczołów sutkowych w jamie brzusznej (#4 i #10) i natychmiast zobrazowano za pomocą mikro-tomografii komputerowej. Każdy szczur Sprague-Dawley otrzymywał coraz większą ilość obu roztworów. Poszczególne drzewa kanałowe zostały zrekonstruowane przy użyciu pakietu oprogramowania do analizy obrazu (śledzenie splajnu + propagacja obiektu + odwzorowanie progu). Przy 1% EC można zauważyć, że roztwór dociera do końców końcowych. Wraz ze wzrostem dostarczanej objętości liczba wypełnionych TEB jest bardziej widoczna. Podziałka odpowiada 10 mm we wszystkich wersjach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Pomocne wskazówki i rozwiązywanie problemów

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.