Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie organoidów siatkówki pochodzących z iPSC w celu modelowania barwnikowego zwyrodnienia siatkówki

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64045

⸱

16 czerwca 2022

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole wygenerowano organoidy siatkówki 3D pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) wywołane przez pacjenta z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki. Organoidy te z powodzeniem podsumowały niektóre kliniczne fenotypy choroby barwnikowego zwyrodnienia siatkówki.

Streszczenie

Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) jest rzadką i dziedziczną chorobą zwyrodnieniową siatkówki, występującą u około 1/4 000 osób na całym świecie. Większość pacjentów z RP ma postępujące zwyrodnienie fotoreceptorów prowadzące do utraty widzenia peryferyjnego, ślepoty nocnej, a w końcu całkowitej ślepoty. Do tej pory zgłoszono tysiące mutacji w ponad 90 genach związanych z RP. Obecnie dostępnych jest niewiele modeli zwierzęcych dla wszystkich dotkniętych chorobą genów i różnych typów mutacji, co w znacznym stopniu utrudnia rozszyfrowanie mechanizmów leżących u podstaw patologii genów/mutacji oraz ogranicza leczenie i opracowywanie leków. Organoidy 3D siatkówki (RO) pochodzące z indukowanych przez pacjentów pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zapewniły lepszy system do modelowania wczesnej choroby u ludzi niż komórki i zwierzęta. W celu zbadania RP, te organoidy siatkówki 3D pochodzące od pacjenta zostały wykorzystane do podsumowania klinicznych fenotypów RP. W RO pochodzących od pacjentów RP wyraźnie wykazano błędną lokalizację rodopsyny. W porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, modele organoidów siatkówki pochodzące z iPSC lepiej odwzorowują cechy RP i stanowią idealne podejście do badania patogenezy choroby i opracowywania leków.

Wprowadzenie

Choroby siatkówki ludzkiej, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, są słabo poznane z powodu braku odpowiednich modeli eksperymentalnych1,2. Chociaż siatkówka myszy jest bardzo podobna do siatkówki ludzkiej i jest potężnym narzędziem do badania etiologii zwyrodnienia siatkówki, istnieją ogromne różnice gatunkowe między myszami a ludźmi3,4. Na przykład architektura jądrowa komórek fotoreceptorów u myszy i ludzi jest inna, a siatkówka myszy nie posiada plamki żółtej 5,6. Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) umożliwia nam przywrócenie wyspecjalizowanych komórek organizmów do początkowego stanu pluripotencjalnego poprzez procesy "przeprogramowania" przez kombinacje czynników transkrypcyjnych i/lub związków7,8,9,10. Te iPSC mają prawie nieograniczoną zdolność podziału i proliferacji i mogą przekształcać się w różne typy komórek. Ostatnio opracowano organoidy siatkówki 3D pochodzące z iPSC w celu modelowania wczesnych zdarzeń rozwoju siatkówki u człowieka i określenia patofizjologii chorób siatkówki u ludzi11,12,13,14,15. Organoidy siatkówki mają wiele zalet: (1) mogą być używane do rekapitulacji rozwoju siatkówki in vivo i patogenezy choroby; (2) mogą być wykorzystywane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i badań przedklinicznych terapii genowej; oraz (3) mogą być wykorzystywane jako przedkliniczne oceny możliwości leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki16,17.

Jednym z celów tego projektu było zbadanie patogenezy barwnika siatkówki (RP), choroby nieuleczalnej ze względu na swoją ekstremalną niejednorodność18. Do tej pory zidentyfikowano ponad 90 genów związanych z RP19,20. Gen RPGR, który jest uważany za jeden z najbardziej rozpowszechnionych genów wywołujących RP15, stanowi około 16% wszystkich RP4,21,22. Komórki iPS niosące mutację z przesunięciem ramki odczytu w genie RPGR zostały pomyślnie wygenerowane i zróżnicowane w zorganizowane i warstwowe organoidy siatkówki 3D14. Wykorzystując te organoidy, zaobserwowano nieprawidłową morfologię warstwy fotoreceptorów i przemieszczenie opsyn w fotoreceptorach.

Podsumowując, szczegółowo opisano tutaj szczegółowy i krok po kroku protokół, jak generować organoidy siatkówki 3D pochodzące od pacjenta23,24. Te organoidy z powodzeniem podsumowały niektóre kliniczne fenotypy choroby. Stanowi to zachęcający model do badania rozwoju siatkówki i mechanizmów chorobowych, do badań przesiewowych w celach terapeutycznych oraz do oceny przyszłej przedklinicznej terapii genowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach Stołecznego Uniwersytetu Medycznego.

1. Hodowla komórkowa i wytwarzanie iPSC

  1. Do tego badania należy wybrać pacjentów z RPGR. W tym przypadku wykorzystano trzech pacjentów, jednego rodzinnego nosiciela i trzech zdrowych członków grupy kontrolnej. Pacjent 1 posiadał mutację c.1685_1686delAT w eksonie 14 genu RPGR, pacjent 2 był nosicielem mutacji c.2234_2235delGA w eksonie 15 genu RPGR, a pacjent 3 miał mutację c.2403_2404delAG w eksonie 15 genu RPGR. Wybierz trzech zdrowych ochotników jako grupę kontrolną14. Pobrać obwodowe próbki krwi pełnej od pacjentów i zdrowych osób z grupy kontrolnej z nakłuciem żyły i umieścić je w probówkach do pobierania krwi (tabela materiałów).
  2. Wyizoluj jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przez wirowanie w gradionym gradiencie gęstości za pomocą medium o gradiencie gęstości25. Rozwiń PBMC CD34 + aktywowane cytokiną w 8 ml pożywki wzmacniającej wzrost (Tabela 1) na szalce Petriego.
  3. Po 1 tygodniu należy elektroporować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej CD34-dodatniej za pomocą systemu transfekcji (tabela materiałów) i wybrać komórki CD34-dodatnie oraz wbudowany program T-01 bez żadnych modyfikacji. Transfekcja koktajlu plazmidów przeprogramowujących (2 μg), które mogą wytwarzać ludzkie białka OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC i KLF4.
  4. Wysiewaj transfekowane komórki na sześciodołkowych płytkach pokrytych ludzkim rekombinowanym białkiem z witronektyną w 2 ml DMEM / F12 uzupełnionym B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 ng / ml), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) i hLIF (1000 U / ml), aby utrzymać wzrost iPSC.
  5. 3 tygodnie po transdukcji należy ręcznie pobrać kolonie iPSC, a następnie przenieść je na płytki sześciodołkowe i przechowywać w odczynniku B (Tabela materiałów) w celu ekspansji.
    UWAGA: Płytki sześciodołkowe powinny być pokryte ludzkim rekombinowanym białkiem witronektyny. Rozcieńczyć roztwór witronektyny w DPBS do uzyskania końcowego stężenia 10 μg/ml. Dodać rozcieńczoną witronektynę do sześciodołkowych płytek poddanych kulturze tkankowej. Zamieszaj naczynia hodowlane, aby równomiernie rozprowadzić roztwór witronektyny na powierzchni płytek sześciodołkowych. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  6. Upewnij się, że komórki są zdezagregowane za pomocą 0,5 mM EDTA, gdy iPSC osiągną zbieg około 80%-90%, a współczynnik podziału wynosi 1:8 lub 1:10. W dniu przejścia dodać blebbistatynę (2,5 μM) do odczynnika B (Tabela 1).
    UWAGA: Blebbistatyna była stosowana w celu promowania adhezji komórek i żywotności komórek macierzystych oraz zapobiegania apoptozie komórek macierzystych. 18 godzin później podłoże należy odświeżyć odczynnikiem B.

2. Generowanie ludzkich RO

UWAGA: iPSC muszą być rozdzielone, gdy osiągną około 80%-90% zbieżności.

  1. Dysocjuj ludzkie kolonie iPSC (hiPSC) za pomocą 0,5 mM EDTA w temperaturze 37 ◦C przez 5 minut.
  2. Podzielić zbrylenia hiPSC na pojedyncze komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Policz komórki do konserwacji i hoduj je w odczynniku B (Tabela 1).
  3. W dniu 0 wysiewaj 12 000 komórek / studzienkę w 96 stożkowych studzienkach z dnem w kształcie litery V w celu reagregacji komórek w 100 μl pożywki różnicującej (Tabela 1).
  4. W dniu 6 ostrożnie odessać pożywkę do hodowli komórkowej i dodać 100 μl pożywki różnicującej zawierającej 20 μM Y 27632 i 1,5 nM (55 ng/ml) hBMP4.
  5. W dniu 9 należy wymienić połowę pożywki różnicującej, aby utrzymać stężenie hBMP4 na poziomie około 0,75 nM.
  6. Pobrać 60 μl pożywki różnicującej z każdej studzienki i dodać 60 μl świeżej pożywki różnicującej zawierającej 20 μM Y-27632 do każdej studzienki.
  7. W dniu 12 zastąp połowę pożywki różnicującej świeżą pożywką różnicującą, aby uzyskać 0,375 nM hBMP4.
  8. W dniu 18 przenieś agregaty na nową szalkę Petriego z końcówkami o pojemności 10 ml i pokrój każde agregat na 2-4 części nożem mikrochirurgicznym pod odwróconym mikroskopem, aby wytworzyć więcej organoidów.
  9. Przenieść agregaty z tej samej grupy do jednej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Gdy agregaty osiądą na dnie probówek, należy zassać supernatant.
  10. Ponownie zawiesić agregaty 1 ml pożywki nerwowej siatkówki (DMEM/F12, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% suplementu N-2, 0,5 μM kwasu retinowego, 0,1 mM tauryny, 1% penicyliny-streptomycyny) i przenieść je na nieprzywierające szalki Petriego z 15 ml pożywki nerwowej siatkówki. Umieść 10-15 organoidów siatkówki na jednej szalce Petriego.
  11. Odświeżaj pożywkę co 5 dni. Utrzymuj kulturę w ciemności, ponieważ kwas retinowy jest wrażliwy na światło (Rysunek 1) i sprawdź formowanie się samoorganizującej się ludzkiej tkanki siatkówki za pomocą odwróconego mikroskopu26,27,28,29.

3. Analiza organoidów siatkówki

  1. Barwienie immunofluorescencyjne siatkówk 3D pochodzących z hiPSC
    1. Utrwalić siatkówkę 3D w 1 ml świeżego 4% paraformaldehydu w DPBS przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przepłukać organoidy 1 ml buforu DPBS.
    2. Odmierz 0,5 g agarozy (tabela materiałów) i wymieszaj proszek agarozy ze 100 ml DPBS w kolbie kuchennej mikrofalowej. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę przez 1-3 minuty, aż całkowicie się rozpuści. Pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do temperatury około 40 °C.
    3. Osadź je w 2% w DPBS.
    4. Pokrój próbki na sekcje o grubości 50 μm za pomocą wibratomu. Umieść pokrojone skrawki na szkiełkach mikroskopu adhezyjnego (tabela materiałów) i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
    5. Rozmrażaj plastry przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Plastry myć DPBS przez 5 minut i powtórzyć 3x.
    7. Użyj 0,5% Triton X-100 w roztworze DPBS, aby przepuszczalnie plastry przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Usuń roztwór przepuszczalny, umyj plastry DPBS przez 5 minut i powtórz 3x.
    9. Inkubować plastry z 1% BSA i 0,5% Triton X-100 w DPBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Inkubować plastry z przeciwciałem anty-rodopsyny (1:1000) i przeciwciałem anty-L/M opsyny (1:1000) rozcieńczonymi w 1% BSA i 0,1% Triton X-100 przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
    11. Plastry myć DPBS przez 5 minut i powtórzyć 3x.
    12. Inkubować plastry z drugorzędowym przeciwciałem przeciwko myszom i królikom (1:500) rozcieńczonym w 1% BSA i 0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    13. Dodać 30 nM 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w DPBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia jądrowego.
    14. Plastry myć DPBS przez 5 minut i powtórzyć 5x.
    15. Zamontuj plastry z podłożem do zatapiania (Tabela materiałów) i przykryj szkiełka (Tabela materiałów). Przechowywać w ciemnym pudełku i przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.
  2. Ekstrakcja i sekwencjonowanie RNA
    1. Zbierz 1-3 (w zależności od rozmiarów) siatkówki 3D pochodzące od każdej grupy kontrolnej i pacjenta w tych samych punktach czasowych różnicowania (dzień 0, dzień 47, dzień 91, dzień 121 i dzień 151) w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA (tabela materiałów) na lodzie.
    2. Za pomocą homogenizatora (Tabela materiałów) należy rozbić próbki, 1 min WŁ., 30 s WYŁ., przez trzy cykle i sprawdzić, czy próbka nie jest rozerwana.
    3. Zatrzymaj homogenizację, gdy próbki są całkowicie zhomogenizowane i energicznie wiruj probówkę przez 30 sekund.
    4. Próbki inkubować na lodzie przez 15 minut.
    5. Odwirować próbki o masie 13 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml wolnej od RNaz.
    6. Dodać 0,4 ml chloroformu do probówki, wirować i wirować przy 13 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Ostrożnie przenieś część (około 2/3) bezbarwnej górnej fazy do nowej probówki wolnej od RNaz. Nie zasysaj ani nie naruszaj białego interfejsu zawierającego DNA.
    8. Dodać 0,5 ml zimnego izopropanolu, wirować przez 30 s i wirować przy 13 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Z boku dna rurki tworzy się granulka.
    9. Ostrożnie odessać supernatant końcówką pipety i zachować osad.
      UWAGA: Osad RNA jest galaretowaty i przezroczysty, gdy czystość jest bardzo wysoka.
    10. Dodać 1 ml zimnego 70% etanolu, energicznie wirować próbki przez 30 s i odwirować przy 13 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Ostrożnie odessać supernatant końcówką pipety i wysuszyć granulkę na powietrzu w kapturze w temperaturze RT przez 5-10 minut. Nie przesuszaj pelletu.
    12. Dodać 20-50 μl wody wolnej od RNaz i ostrożnie zawiesić granulki, pipetując w górę iw dół.
    13. Nanieść 1 μl RNA na spektrofotometr (tabela materiałów). W sumie około 10 μg RNA odpowiednio od osób kontrolnych i pacjentów wykorzystano do przygotowania biblioteki Illumina30.
    14. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny rysunek przedstawia procedury różnicowania służące do generowania zdrowych i pacjenckich organoidów siatkówki pochodzących z iPSC (Rysunek 1). Na etapie przejścia od iPSC do RO mogą wystąpić różnice wynikające z kilku czynników. Stan iPSC jest krokiem determinującym generowanie RO. Ponadto badaczom wysoce zaleca się zapisywanie każdego kroku, numeru katalogowego oraz numeru partii wszystkich pożywek, aby wszystkie eksperymenty były możliwe do prześledzenia. Na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Organoidy siatkówki są 3D, laminowanymi strukturami pochodzącymi z hiPSC lub embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i stanowią bardzo obiecujący model do naśladowania przestrzennych i czasowych wzorców rozwoju siatkówki człowieka31,32. RO składają się z różnych typów komórek siatkówki, w tym fotoreceptorów, komórek dwubiegunowych, komórek zwojowych, komórek amakrynowych, komórek poziomych i gleju Müllera33. Hodowla 2D nie może dokładnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy M.S. Yan-ping Li i Zhuo-lin Liu za ich wsparcie techniczne i pomocne komentarze dotyczące manuskryptu. Prace te były częściowo wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Miejską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (Z200014, 82125007) oraz Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFA0105300).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 Studzienki stożkowe z dnem w kształcie litery VSumitomo BakelitMS-9096VZ
A-83– 01R& D Systems2939/10
Szkiełka mikroskopowe adhezyjneCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b UrządzenieLonzaAAB-1001System transfekcji
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR& D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Probówka do pobierania krwiBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Szkiełka podstawoweCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham' s F12Gibco10565-042
Osioł anty-myszy 488InvitrogenA-21202
Osioł anty-królik 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Podłoże do zatapianiaFluorSaveTM Odczynnik345789
EX-CYTE pożywka wzmacniająca wzrostSigma811292Pożywka wzmacniająca wzrost
Surowica bydlęcapłodu Gibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Gradient gęstości średni
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061Suplement L-glutaminy
HA-100STEMCELL Technologies72482
Szynka" s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogenizatorEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove' s Zmodyfikowana wymiana surowicy Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut - Multi-SpeciesGibcoA3181502Zamiennik surowicy
L/M-opsinMilliporeab5405
MonotioglycerolSigmaM6145
N-2 suplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpektrofotometrThermo Fisher ScientificND2000Spektrofotometr
ncEpic 125x SuplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Suplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc medium
ncLaminin511 ludzkie rekombinowane białkoNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicylina-streptomycynaGibco15140-122
Rekombinowany ludzki BMP4R& D Systems314-BP
Kwas retinowySigmaR2625
RodopsynaSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologie09600
TaurineSigmaT8691
Odczynnik TrizolInvitrogen15596026
VitronectinNóż Nuwacell BiotechnologiesRP01002
V-LanceAlcon Surgical8065912001

Bibliografia

  1. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  2. Lin, Q., et al. Generation of nonhuman primate model of cone dysfunction through in situ AAV-mediated CNGB3 ablation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 869-879 (2020).
  3. Zhou, M., Liu, Y., Ma, C. Distinct nuclear architecture of photoreceptors and light-induced behaviors in different strains of mice. Translational Vision Science & Technology. 10 (2), 37(2021).
  4. Zito, I., et al. RPGR mutation associated with retinitis pigmentosa, impaired hearing, and sinorespiratory infections. Journal of Medical Genetics. 40 (8), 609-615 (2003).
  5. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  6. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A Comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), 0125631(2015).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  8. Han, J. W., Yoon, Y. S. Induced pluripotent stem cells: Emerging techniques for nuclear reprogramming. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (7), 1799-1820 (2011).
  9. Kim, J. S., Choi, H. W., Choi, S., Do, J. T. Reprogrammed pluripotent stem cells from somatic cells. International Journal of Stem Cells. 4 (1), 1-8 (2011).
  10. Li, Y. P., Liu, H., Jin, Z. B. Generation of three human iPSC lines from a retinitis pigmentosa family with SLC7A14 mutation. Stem Cell Research. 49, 102075(2020).
  11. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  12. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 366(2020).
  13. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  14. Deng, W. L., et al. Gene correction reverses ciliopathy and photoreceptor loss in iPSC-derived retinal organoids from retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  15. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  16. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  17. Aasen, D. M., Vergara, M. N. New drug discovery paradigms for retinal diseases: A focus on retinal organoids. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 36 (1), 18-24 (2020).
  18. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  19. Anasagasti, A., Irigoyen, C., Barandika, O., Lopez de Munain, A., Ruiz-Ederra, J. Current mutation discovery approaches in Retinitis Pigmentosa. Vision Research. 75, 117-129 (2012).
  20. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Genes and mutations causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (10), 017129(2014).
  21. Kortum, F., et al. X-linked retinitis pigmentosa caused by non-canonical splice site variants in RPGR. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 850(2021).
  22. Megaw, R. D., Soares, D. C., Wright, A. F. RPGR: Its role in photoreceptor physiology, human disease, and future therapies. Experimental Eye Research. 138, 32-41 (2015).
  23. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).
  24. Liu, H., Hua, Z. Q., Jin, Z. B. Modeling human retinoblastoma using embryonic stem cell-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100444(2021).
  25. Zhang, X. H., Xie, Y., Xu, K., Li, Y. Generation of an induced pluripotent stem cell line BIOi002-A from a patient with autosomal dominant optic atrophy. Stem Cell Research. 53, 102278(2021).
  26. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286(2015).
  28. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  29. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  30. Kumar, R., et al. A high-throughput method for illumina RNA-seq library preparation. Frontiers in Plant Science. 3, 202(2012).
  31. Fligor, C. M., et al. Three-dimensional retinal organoids facilitate the investigation of retinal ganglion cell development, organization and neurite outgrowth from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 8 (1), 14520(2018).
  32. Morizur, L., Herardot, E., Monville, C., Ben M'Barek, K. Human pluripotent stem cells: A toolbox to understand and treat retinal degeneration. Molecular and Cellular Neurosciences. 107, 103523(2020).
  33. Bhatt, L., Groeger, G., McDermott, K., Cotter, T. G. Rod and cone photoreceptor cells produce ROS in response to stress in a live retinal explant system. Molecular Vision. 16, 283-293 (2010).
  34. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  35. Xue, Y., et al. Retinal organoids long-term functional characterization using two-photon fluorescence lifetime and hyperspectral microscopy. Frontiers in Cellular Neurosciences. 15, 796903(2021).
  36. Colombo, L., et al. Comparison of 5-year progression of retinitis pigmentosa involving the posterior pole among siblings by means of SD-OCT: A retrospective study. BMC Ophthalmology. 18 (1), 153(2018).
  37. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: Genes and disease mechanisms. Current Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  38. Shintani, K., Shechtman, D. L., Gurwood, A. S. Review and update: Current treatment trends for patients with retinitis pigmentosa. Optometry. 80 (7), 384-401 (2009).
  39. Wang, A. L., Knight, D. K., Vu, T. T., Mehta, M. C. Retinitis pigmentosa: Review of current treatment. International Ophthalmology Clinics. 59 (1), 263-280 (2019).
  40. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  41. Parfitt, D. A., et al. Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell Stem Cell. 18 (6), 769-781 (2016).
  42. Shimada, H., et al. In vitro modeling using ciliopathy-patient-derived cells reveals distinct cilia dysfunctions caused by CEP290 mutations. Cell Reports. 20 (2), 384-396 (2017).
  43. Deretic, D., Wang, J. Molecular assemblies that control rhodopsin transport to the cilia. Vision Research. 75, 5-10 (2012).
  44. Rao, K. N., Li, L., Anand, M., Khanna, H. Ablation of retinal ciliopathy protein RPGR results in altered photoreceptor ciliary composition. Scientific Reports. 5, 11137(2015).
  45. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33(2021).
  46. Zhang, X. H., Jin, Z. B. Patient iPSC-derived retinal organoids: Observable retinal diseases in-a-dish. Histology and Histopathology. 36 (7), 705-710 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystedegeneracja fotoreceptor worganoidy pochodz ce od pacjent wb dna lokalizacja rodopsynydegeneracja siatk wkimodelowanie chor bopracowywanie lek wmutacja genu
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.