Artykuł metodologiczny

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

DOI:

10.3791/64050

⸱

23 czerwca 2022

 , 
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alfa-synukleina (aSyn) jest wewnętrznie nieuporządkowanym białkiem, którego fibrylarne agregaty są obfite w ciała Lewy'ego i neuryty, które są cechami charakterystycznymi choroby Parkinsona. Jednak znaczna część jego aktywności biologicznej, jak również jego agregacji, obejmuje centralnie rozpuszczalną formę monomeru białka. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych biologii i patofizjologii aSyn wymaga metod o wysokiej rozdzielczości strukturalnie i jest wrażliwe na warunki biologiczne. Jego natywnie rozwinięte, metastabilne struktury sprawiają, że monomeryczny aSyn jest trudny do opanowania przez wiele technik biologii strukturalnej. W tym miejscu opisano zastosowanie jednego z takich podejść: spektrometria mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) w milisekundowej skali czasowej do badania białek o niskiej stabilności termodynamicznej i słabych współczynnikach ochronnych, takich jak aSyn. W milisekundowej skali czasowej dane HDX-MS zawierają informacje o dostępności rozpuszczalnika i strukturze wiązań wodorowych aSyn, które są tracone przy dłuższych czasach znakowania, ostatecznie uzyskując rozdzielczość strukturalną aż do poziomu aminokwasów. W związku z tym HDX-MS może dostarczać informacji w wysokich rozdzielczościach strukturalnych i czasowych na temat dynamiki konformacyjnej i termodynamiki, interakcji wewnątrz- i międzycząsteczkowych oraz strukturalnego wpływu mutacji lub zmian w warunkach środowiskowych. Chociaż ma szerokie zastosowanie, pokazano, jak pozyskiwać, analizować i interpretować milisekundowe pomiary HDX-MS w monomerycznym aSyn.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest chorobą neurodegeneracyjną dotykającą miliony ludzi na całym świecie1. Charakteryzuje się tworzeniem inkluzji cytoplazmatycznych znanych jako ciała Lewy'ego i neuryty Lewy'ego w regionie istoty czarnej pars compacta mózgu. Stwierdzono, że te inkluzje cytoplazmatyczne zawierają agregaty wewnętrznie nieuporządkowanego białka aSyn2. W PD i innych synukleinopatiach aSyn przekształca się z rozpuszczalnego stanu nieuporządkowanego w nierozpuszczalny, wysoce ustrukturyzowany stan chorobowy. W swojej natywnej formie, monomeryczny aSyn przyjmuje szeroki zakres konformacji stabilizowanych przez oddziaływania elektrostatyczne dalekiego zasięgu między jego końcami N i C oraz oddziaływania hydrofobowe między jego końcem C a regionem nieamyloidowego składnika beta (NAC)3,4,5,6. Wszelkie zakłócenia w tych stabilizujących interakcjach, takie jak mutacje, modyfikacje potranslacyjne i zmiany w środowisku lokalnym, mogą prowadzić do nieprawidłowego fałdowania monomeru, uruchamiając w ten sposób proces agregacji7.

Chociaż istnieje ogromna ilość badań nad oligomerycznymi i fibrylarnymi formami aSyn8,9,10,11, istnieje kluczowa potrzeba zbadania monomerycznej formy białka i lepszego zrozumienia, które konformery są funkcjonalne (i jak), a które są podatne na agregację8,9,10,11. Będąc wewnętrznie nieuporządkowanym, o wielkości zaledwie 14 kDa i trudnym do krystalizacji, monomer aSyn nie jest podatny na większość technik biologii strukturalnej. Jednak jedną z technik zdolnych do pomiaru dynamiki konformacyjnej monomerycznego aSyn jest milisekundowy HDX-MS, który ostatnio wygenerował ważne obserwacje strukturalne, które byłyby trudne lub niemożliwe do uzyskania w inny sposób12,13,14. Milisekundowy HDX-MS z czułością mierzy średnią zespołu konformacyjnego białek poprzez monitorowanie wymiany izotopowej w wodorach amidowych, wskazując dostępność rozpuszczalnika i udział sieci wiązań wodorowych określonego regionu białka w milisekundowej skali czasowej. Konieczne jest podkreślenie aspektu milisekundowego HDX-MS, ponieważ ze względu na swoją natywnie rozwiniętą, metastabilną naturę, aSyn wykazuje bardzo szybką kinetykę wymiany wodoru, która manifestuje się znacznie poniżej dolnej granicy konwencjonalnych systemów HDX-MS. Na przykład większość cząsteczki aSyn całkowicie wymieniła wodór na deuter w warunkach wewnątrzkomórkowych w czasie krótszym niż 1 s. Kilka laboratoriów zbudowało już oprzyrządowanie do szybkiego miksowania; w tym przypadku używany jest prototypowy przyrząd do szybkiego mieszania, zdolny do wykonywania HDX-MS z czasem martwym 50 ms i rozdzielczością czasową 1 ms15. Podczas gdy milisekundowy HDX-MS stał się ostatnio niezwykle ważny w badaniach nad aSyn, może być cenny w badaniu wewnętrznie nieuporządkowanych białek/regionów w szerszym zakresie i dużej liczby białek z pętlami/regionami, które są tylko słabo stabilne. Na przykład leki peptydowe (np. insulina; GLP-1/glukagon; tirzepatyd) i białka fuzyjne peptydów (np. inhibitor HIV FN3-L35-T1144) są głównymi formatami leków, w których informacje o strukturze i stabilności fazy roztworu mogą być krytycznym wkładem przy podejmowaniu decyzji dotyczących rozwoju leku, a jednak ugrupowanie peptydowe jest często tylko słabo stabilne i trudne do opanowania przez HDX-MS w skali sekundowej sup16,17,18,19,20. Wykazano, że pojawiające się metody HDX-MS z etykietowaniem w domenach sekund/minut uzyskują informacje strukturalne dla G-kwadrupleksów DNA, ale powinno być możliwe rozszerzenie tego na bardziej zróżnicowane struktury oligonukleotydowe poprzez zastosowanie milisekundowego HDX-MS21.

Eksperymenty HDX-MS mogą być przeprowadzane na trzech różnych poziomach: (1) bottom-up (gdzie znakowane białko jest trawione proteolitycznie), (2) middle-down (gdzie znakowane białko jest trawione proteolitycznie, a powstałe peptydy są dalej fragmentowane przez techniki miękkiej fragmentacji), oraz (3) top-down (gdzie techniki miękkiej fragmentacji bezpośrednio fragmentują znakowane białko)22. W związku z tym submolekularne dane HDX-MS pozwalają nam zlokalizować zachowanie wymiany w określonych regionach białka, co sprawia, że kluczowe znaczenie ma odpowiednie pokrycie sekwencji dla takich eksperymentów. Rozdzielczość strukturalna każdego eksperymentu HDX-MS zależy od liczby peptydów proteolitycznych lub fragmentów pochodzących z białka odpowiednio podczas trawienia lub miękkiej fragmentacji. W każdym z trzech typów eksperymentów opisanych powyżej, zmiana wymiany amidu w każdym peptydzie/fragmencie jest odwzorowywana z powrotem na pierwszorzędową strukturę białka, aby wskazać zachowanie zlokalizowanych regionów białka. Podczas gdy najwyższą rozdzielczość strukturalną osiąga się poprzez miękką fragmentację, opis tych eksperymentów wykracza poza zakres obecnego badania, które koncentruje się na pomiarze konformacji monomeru aSyn. Doskonałe wyniki można uzyskać dzięki powszechnie stosowanemu "oddolnemu" przepływowi pracy opisanemu tutaj.

Tutaj podane są procedury dotyczące (1) jak przygotować i obchodzić się z próbkami aSyn i HDX-MS, (2) jak przeprowadzić mapowanie peptydów dla oddolnego eksperymentu HDX-MS, (3) jak pozyskać dane HDX-MS na monomerycznym aSyn w warunkach fizjologicznych, szczególnie w dziedzinie czasu milisekundowego (przy użyciu specjalnie skonstruowanego instrumentu; alternatywne instrumenty do znakowania milisekundowego również zostały opisane), oraz (4) sposób przetwarzania i analizowania danych HDX-MS. Przedstawiono tu przykłady metod wykorzystujących monomeryczny aSyn przy fizjologicznym pH (7,40) w dwóch warunkach roztworu. Chociaż są one niezwykle przydatne w badaniach nad aSyn, procedury te mogą być stosowane do dowolnego białka i nie ograniczają się do białek wewnętrznie nieuporządkowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja białka i oczyszczanie aSyn

  1. Przygotuj aSyn zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem9.
  2. Dializować do bezpiecznego buforu do przechowywania (np. Tris, pH 7,2 ).
  3. W razie potrzeby zagęścić próbkę (np. probówki do mikrowirówek z filtrem wirowym przy użyciu 3 kDa MWCO, 14 000 x g przez około 10-30 minut, patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Zaleca się, aby nie koncentrować się nadmiernie. Integralność zespołu monomerów nie została zweryfikowana w zakresie powyżej 25 μM.
  4. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C
    UWAGA: Białko monomeru aSyn jest stabilne przez okres do 1 roku w tych warunkach przechowywania.

2. Przygotowanie bufora HDX

UWAGA: Ponieważ Tris ma wysoki współczynnik temperatury, pomiar pH musi być dostosowany do temperatury, w której będzie przeprowadzana reakcja HDX, która w tym protokole wynosi 20 °C.

  1. Przygotować bufor równowagi dla stanu A i stanu B, ważąc 0,002 mola Tris w 100 ml wody klasy LC-MS. Dla stanu B dodać 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 i 836 mg NaCl do buforu Tris. Dostosuj pH do 7,40 ± 0,05,
    UWAGA: Bufor równowagi musi zawierać warunki, w których aSyn ma być badany. W tym przypadku jest to 20 mM Tris przy pH 7,4 +/- sole.
  2. Przygotuj bufor do etykietowania dla stanu A i stanu B, ważąc 0,002 mola Tris w 100 ml deuterowanej wody. Dla stanu B dodać 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 i 836 mg NaCl do buforu znakującego Tris. PD buforu do znakowania odpowiada pH buforu równowagi. Ponieważ pH = pD - 0,41, dostosuj tak, aby pH-metr wskazywał 6,99 ± 0,0523,24,
    UWAGA: Bufor do etykietowania musi mieć te same składniki, co bufor równowagi, z wyjątkiem tego, że jest przygotowywany przy użyciu wody deuterowanej.
  3. Przygotować bufor hartowniczy przez odważenie 0,010 mola Tris i 0,050 mola mocznika i uzupełnić do 100 ml wodą klasy LC-MS. Dostosuj pH do 2,50 ± 0,05 przy 0,5 °C.
    UWAGA: Przed eksperymentami z HDX należy przeprowadzić badanie przesiewowe buforu wygaszającego w celu zidentyfikowania najlepszego buforu wygaszającego dla interesującego białka. Różne stężenia i kombinacje denaturantów (np. mocznika i chlorowodorku guanidyny) oraz środków redukujących (np. tris(2-karboksyetylo)fosfiny) są badane pod kątem parametrów fizycznych, takich jak objętość i temperatura wychwytywania, aby skutecznie rozwinąć i strawić stłumione białko. Bufor hartowniczy składający się ze 100 mM Tris i 0,5 M mocznika o pH 2,50 jest optymalny dla niniejszego badania.
  4. Przygotować bufor do płukania kolumny wytrawiającej, ważąc 0,125 mola chlorowodorku guanidyny do szklanej butelki Duran. Dodać 25 ml metanolu i 250 μl kwasu mrówkowego. Uzupełnić do 250 ml wodą klasy LC-MS.
    UWAGA: W przypadku kolumny z enzymatyczną pepsyną BEH (patrz tabela materiałów) należy użyć buforu do przemywania kolumny zawierającego 0,5 M chlorowodorku guanidyny, 10% (v/v) metanolu i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego.
  5. Przygotować strzykawkę do płukania przez pipetowanie 0,5 μl kwasu mrówkowego do 249,5 ml wody klasy LC-MS.
  6. Przygotować strzykawkę do mocnego płukania, mieszając równe części wody klasy LC-MS, metanolu, acetonitrylu i izopropanolu. Dodać kwas mrówkowy do końcowego stężenia 2% (v/v).
    UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między różnymi a białkiem oraz aby umożliwić czyszczenie portu iniekcyjnego, bardzo ważne jest, aby przygotować roztwory do płukania strzykawek i aby ścieżka przepływu do zaworu (często nazywana "wkładką płuczącą") była całkowicie zalana cieczą. Kwas mrówkowy jest opcjonalny w przypadku słabego mycia strzykawki.

3. Procedura mapowania peptydów

  1. Przygotuj próbkę, wykonując poniższe czynności.
    1. Przefiltrować rozmrożony wywar białkowy aSyn z zamrażarki w temperaturze −80 °C za pomocą filtrów strzykawkowych 0,22 μm. Zmierzyć absorbancję przefiltrowanego białka podstawowego przy długości fali 280 nm, aby określić stężenie zgodnie z prawem Beera-Lamberta. Rozcieńczyć białko do stężenia 5 μM w buforze równowagi (etap 2.1).
      UWAGA: Prawo Beera-Lamberta: A = εcl, gdzie A to absorbancja, ε to współczynnik ekstynkcji białka na mierzonej długości fali (tutaj 280 nm) w jednostkach M−1cm−1, c to stężenie białka w M, a l to długość drogi w cm. Dla typu dzikiego aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Skonfiguruj metodę chromatografii cieczowej.
    1. Utwórz plik wlotowy o czasie ładowania/wychwytywania wynoszącym 3 minuty pod ciśnieniem 7000-9000 psi, po którym następuje gradient od 5% acetonitrylu do 40% acetonitrylu w ciągu 7 minut, a następnie powtarzane etapy mycia 5%-95% acetonitrylu w wodzie przez 10 minut.
    2. Upewnij się, że spray zamka (np. enkefalina leucyny, patrz Tabela materiałów) przepływa pod ciśnieniem 2000 psi i jest podłączony do sondy rozpylającej blokadę źródła spektrometru masowego.
  3. Skonfiguruj metody spektrometrii mas MSE.
    UWAGA:MS E to szerokopasmowa metoda akwizycji niezależna od danych, bez prekursorowej izolacji masy. W związku z tym wszystkie jony w wybranym zakresie m/z są dalej fragmentowane za pomocą dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID)27.
    1. W pliku metody MS wybierz MSE Continuum i ustaw czas akwizycji w zakresie 2-10 min, źródło elektronatrysku i tryb dodatniej rozdzielczości. Zdobądź MSE powyżej 50-2000 Da, skanując co 0,3 s.
    2. Dla funkcji 1 (niska energia) ustaw pułapkę i przenieś energię zderzenia na 4 V. Dla funkcji 2 (wysoka energia) należy ustawić energię zderzenia przeniesienia rampy tak, aby była stała na poziomie 4 V, a energia zderzenia pułapki była taka, jak podano w tabeli 1 dla każdego poziomu energii mapowania.
      UWAGA: Można również stosować metody MSE z ruchliwością jonową. Alternatywne metody mapowania (np. akwizycja zależna od danych lub atrybucja danych) mogą być stosowane według uznania użytkownika.
  4. Skonfiguruj robota z automatycznym podajnikiem próbek (patrz Tabela materiałów).
    1. Dodać 50 μl białka 5 μM do fiolki z całkowitym odzyskiem. Umieścić fiolkę w pozycji próbki w prawej komorze HDX. Upewnij się, że ta komora ma temperaturę 0.5 °C.
    2. Dodaj jedną fiolkę z odczynnikiem z buforem równowagi i dwie fiolki z odczynnikiem z buforem do znakowania do pozycji odczynnika pierwszej, drugiej i trzeciej w lewej komorze HDX. Upewnij się, że ta komora ma temperaturę 20 °C, ustawiając regulator temperatury Peltiera (patrz Tabela materiałów). Dodaj jedną fiolkę z odczynnikiem z buforem hartowniczym do pozycji odczynnika w prawej komorze HDX.
    3. Dodać osiem fiolek całkowitego odzysku w pozycjach reakcyjnych lewej komory HDX i osiem fiolek maksymalnego odzysku w pozycjach reakcyjnych prawej komory HDX.
      UWAGA: Aby zapewnić pełne czyszczenie i maksymalną powtarzalność dozowanych objętości, zaleca się wykonanie mycia strzykawek i mycia zalewowego strzykawek z automatycznym podajnikiem próbek. Na przykład, przed rozpoczęciem eksperymentów z mapowaniem należy wykonać sekwencję (1) słabego prania, (2) silnego prania, (3) słabego prania. Sekwencję tę można powtarzać w dużym stopniu i zaleca się wykonywanie jej do 20 razy lub do momentu, gdy strzykawka zostanie całkowicie zwilżona.
    4. Skonfiguruj przykładową listę z odpowiednimi metodami LC i MS w oprogramowaniu do planowania i uruchom harmonogram.
      UWAGA: W niniejszym badaniu Chronos jest używany jako oprogramowanie do planowania (patrz Spis materiałów).
  5. Przetwarzanie danych mapowania.
    1. Zidentyfikuj peptydy z plików eksperymentu mapowania za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
    2. Zaimportuj dane identyfikacyjne peptydów do DynamX (patrz tabela materiałów) przy użyciu następujących parametrów progu peptydowego: minimalna intensywność = 5000, minimalna długość sekwencji = 0, maksymalna długość sekwencji = 40, minimalna liczba produktów = 1, minimalna ilość produktów na aminokwas = 0,25, minimalna sekwencja produktów = 2, minimalna suma intensywności dla produktów = 0, minimalny wynik = 0 i maksymalny błąd MH+ (ppm) = 0,
      UWAGA: Alternatywnie, optymalizuj ustawienia zgodnie z zalecanym przepływem pracy28.
    3. Wybierz Dane z menu i kliknij Importuj wyniki PLGS. Kliknij przycisk Dodaj, aby wybrać odpowiednie pliki danych do przypisania spektralnego. Gdy wszystkie zostaną dodane, kliknij Dalej i wprowadź powyższe ustawienia filtra. Następnie kliknij Zakończ.
    4. Ręcznie dobieraj przypisania izotopów, aby uzyskać ostateczną mapę pokrycia peptydów aSyn w DynamX.

4. Badanie milisekundowej wymiany wodoru i deuteru

  1. Wyczyść prototyp przyrządu FastHDX (patrz Tabela materiałów) przed rozpoczęciem eksperymentów HDX.
    1. Otwórz kompatybilny graficzny interfejs użytkownika oprogramowania HDX i poczekaj na inicjalizację systemu.
    2. Wprowadzić temperaturę w komorze próbki na 20 °C, a w komorze hartowania na 0,5 °C. Kliknij Ustaw, aby zastosować nowe temperatury.
    3. Ustaw probówki wirówkowe z wodą klasy LC-MS na wszystkich wlotach.
    4. Na karcie Zasilanie titratora sprawdź zarówno lewą, jak i prawą strzykawkę, a następnie kliknij przycisk Prime, aby usunąć wszelkie ukryte pęcherzyki powietrza z probówek. Powtarzaj, aż wszystkie bąbelki znikną.
    5. W zakładce Makra zaznacz wszystkie pola dotyczące strzykawek. Kliknij na Kalibruj pozycję początkową strzykawek. Kliknij pętlę ładowania strzykawki do mycia. Kliknij Umyj wszystkie objętości pętli mieszania.
    6. Powtórz krok 4.1.5. 1x więcej.
    7. Jeśli w strzykawkach buforowych pojawią się jakiekolwiek pęcherzyki, należy odgazować strzykawkę, odłączając strzykawkę i wyrzucając pęcherzyk pionowo. Wymienić strzykawkę i ponownie skalibrować do pozycji zerowej.
  2. Skonfiguruj prototyp instrumentu FastHDX do eksperymentów HDX.
    1. Dodać 500 μL przefiltrowanego 5 μM aSyn do fiolki z całkowitym odzyskiem i umieścić w lodówce stołowej, aby zapobiec oligomeryzacji i agregacji wywołanej temperaturą.
    2. Dodać 50 ml równowagi, znakowania i gaszenia do każdego buforu (2. Kroki przygotowania bufora HDX 1-3) wlot w lewej i prawej komorze.
    3. Dodać 50 ml buforu do przemywania kolumn (2. Przygotowanie buforu HDX etap 4) do wlotu do płukania pepsyny.
    4. Aby zalać przewody do płukania białek i kolumn 1x, sprawdź zarówno lewą, jak i prawą strzykawkę w zakładce Dostarczanie hydrauliczne titratora i kliknij raz Zalej.
      UWAGA: Każde kolejne kliknięcie na Prime spowoduje dodatkowe powtórzenia procesu prime, co spowoduje zużycie dużych ilości próbki białka. Zaleca się ostrożność, aby tego uniknąć, nawet jeśli po próbie kliknięcia przycisku wystąpi opóźnienie w oprogramowaniu.
    5. Powtórz kroki 4.1.5. 1x.
    6. Na karcie Manual Quench Flow (Ręczny przepływ wygaszania) wprowadź wymagane ustawienia, opisane w krokach 4.2.7.-4.2.10.
    7. W przypadku eksperymentu z przebiegiem czasu wprowadź czasy w milisekundach za pomocą przycisku Kropki symboliczne. Jeśli wymagane są powtórzenia, należy dodać ten sam punkt czasowy wiele razy, np. w przypadku trzykrotności 50 ms należy wprowadzić 50 50 50. Przykładowa lista w oprogramowaniu spektrometru mas (tutaj używany jest MassLynx, patrz Tabela materiałów) musi dokładnie pasować do tych punktów czasowych.
      UWAGA: Nazwy plików listy próbek spektrometru mas i/lub tekst próbki powinny być używane w celu zapewnienia trwałego zapisu czasów etykietowania HDX odpowiadających czasom wprowadzonym w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania FastHDX. Czasy etykietowania dla każdej serii próbnej nie będą przechowywane nigdzie indziej.
    8. Ustaw Czas pułapki (w minutach) jako długość czasu zalewkowania. Tutaj jest godzina 3.00.
    9. Ustaw oczekiwanie na HPLC (min) = (czas pułapki + czas pracy + 1,5 min).
      UWAGA: Na przykład w przypadku eksperymentu z 3-minutowym zalewkowaniem i 17-minutowym gradientem będzie to 21,50 min.
    10. Kliknij pole Uruchom puste tylko w przypadku uruchamiania pustych eksperymentów między przykładowymi przebiegami. Jeśli tak, upewnij się, że po każdym przebiegu próbnym znajduje się wpis (tj. prawidłowy wiersz na liście próbek) w oprogramowaniu dla ślepej próby.
    11. Gdy lista próbek jest gotowa w oprogramowaniu, zaznacz odpowiednie wpisy i rozpocznij przebieg w oprogramowaniu, klikając przycisk Odtwórz i FastHDX w oprogramowaniu.
      UWAGA: Ze względu na szyfrowanie wodoru/deuteru, metody oparte wyłącznie na MS lub techniki miękkiej fragmentacji (dysocjacja transferu elektronów, dysocjacja wychwytu elektronów i fotodysocjacja w ultrafiolecie) mogą być używane tylko wtedy29. Dla aSyn przy fizjologicznym pH 7,40 najbardziej odpowiednie są punkty czasowe od 50 ms do 300 s, ponieważ obejmują one całą krzywą absorpcji deuteru8.

5. Przetwarzanie danych

  1. Załaduj plik z peptydami przypisanymi spektralnie z eksperymentów mapowania peptydów. Otwórz menu Plik i kliknij Otwórz w oprogramowaniu DynamX (patrz Spis materiałów).
  2. Zaimportuj surowe pliki do preferowanego oprogramowania do pomiaru masy (np. DynamX, HDExaminer itp.). Otwórz menu "Dane" i kliknij MS Files. Kliknij Nowy stan, aby utworzyć stany dla każdego badanego stanu białka.
    1. Kliknij opcję Nowa ekspozycja, aby dodać każdy punkt czasowy HDX. Kliknij Nowy RAW, aby zaimportować .raw pliki. Przeciągnij każdy plik .raw do właściwej pozycji. Kliknij OK po zakończeniu.
  3. Najpierw automatycznie przypisz izotopy (jest to automatyczne po kroku 5.2 powyżej), a następnie ręcznie wybierz przypisanie izotopów, aby zapewnić wysoką jakość danych.
  4. Wyeksportuj dane klastra do pliku .csv z kolumnami w następującej kolejności: nazwa białka, numer początkowy sekwencji, numer końcowy sekwencji, sekwencja, modyfikacja, fragment, maksymalny możliwy wychwyt, masa gatunków monoizotopowych, nazwa stanu, czas ekspozycji, nazwa pliku, ładunek, czas retencji, intensywność i środek ciężkości.
  5. Otwórz menu Dane w oprogramowaniu do pomiaru masy i kliknij Eksportuj dane klastra.

6. Analiza danych

  1. Załaduj wyeksportowane dane klastra do preferowanego oprogramowania do analizy HDX. Tutaj używany jest HDfleX30 (patrz Tabela materiałów).
  2. Dopasuj dane eksperymentalne dla wszystkich peptydów i stanów, wybierając odpowiednie metody korekcji wymiany zwrotnej, aby uzyskać obserwowane stałe szybkości dla reakcji HDX.
  3. Oblicz globalny próg istotności za pomocą preferowanej metody (HDfleX obsługuje kilka opcji w tym zakresie) i wykonaj hybrydowe testy istotności, aby określić istotne różnice między porównywanymi stanami31,32.
    UWAGA: Jeśli zaobserwowana różnica jest większa niż próg globalny, a wartość p jest mniejsza niż wybrany poziom ufności (np. 95%), różnicę uznaje się za znaczącą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na jego wewnętrznie nieuporządkowaną naturę, trudno jest uchwycić skomplikowane zmiany strukturalne w aSyn przy fizjologicznym pH. HDX-MS monitoruje wymianę izotopową w wodorach amidowych w szkielecie, badając dynamikę konformacji i interakcje białek. Jest to jedna z niewielu technik pozyskiwania tych informacji w wysokich rozdzielczościach strukturalnych i czasowych. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do szerokiego zakresu białek i warunków buforowych, czego przykładem jest pomiar kinetyki wymiany aSyn w d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisano następujące procedury: (1) przeprowadzanie eksperymentów mapowania peptydów na monomerycznym aSyn w celu uzyskania najwyższego pokrycia sekwencji, (2) pozyskiwanie milisekundowych danych HDX-MS na monomerycznym aSyn w warunkach fizjologicznych oraz (3) przeprowadzanie analizy i interpretacji otrzymanych danych HDX-MS. Dostarczone procedury są na ogół proste do wykonania, każdy eksperyment etykietowania trwa zwykle tylko około 8 godzin dla trzech powtórzeń i ośmiu punktów czasowych, a ekspery...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NS jest finansowany przez Stypendium Diamentowego Jubileuszu Rady Uniwersyteckiej. JJP jest wspierane przez UKRI Future Leaders Fellowship [numer grantu: MR/T02223X/1].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 & razy; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μ m Kolumna C18 Waters Corporation186002346Kolumna analityczna
Acetonitryl klasy HPLC >99,9% HiPerSolvVWR20060.420Do faz ruchomych LC
CaCl2Sigma AldrichC5670Sól do HDX
ChronosAxel Semrau (zakupiona od Waters Corporation)667006090Oprogramowanie do planowania umożliwiające automatyczne wstrzykiwanie wielu próbek HDX-MS. Alternatywne oprogramowanie jest dostępne u innych dostawców, np. HDXDirector lub LEAP Shell
Chlorek deuteruGoss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-2-50Do do znakowania HDX
Tlenek deuteru (99,9% D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-4Woda deuterowana
DynamX 3.0Waters Corporation176016027Przypisanie izotopów i obliczanie inkorporacji deuteru
Enzymat BEH Pepsin ColumnWaters Corporation186007233Kolumna do wytrawiania pepsyny
Kwas mrówkowy, 99,0% LC / MS GradeFisher Scientific10596814Do faz ruchomych LC
Chlorowodorek guanidynySigma AldrichRDD001-500GChaotrop/Denaturant
HDfleXUniwersytet w ExeterNiehttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911Sól do HDX
LEAP HDX-2 CTC Robot do pobierania próbek PALWaters Corporation725000637Robot Autosampler
Leucine enkephalinWaters Corporation 186006013Do kalibracji lockspray spektrometrii mas.
MassLynxWaters Corporation667004007Oprogramowanie sterujące metodami wlotu i spektrometrem masowym
Fiolki o maksymalnym odzyskuWaters Corporation600000670CV100 opakowanie wraz z nakrętkami - używane do tacki hartowniczej w LEAP HDX-2
MgCl2SigmaAldrich M8266Sól do HDX
Milipore 0,22 i mikro; m filtry strzykawkoweMilliporeN9CA7069BFiltry strzykawkowe
ms2minApplied Photophysics LtdN/Afast-mix quench-flow milisekundowy instrument hdx
NaClSigma AldrichS9888Sól do HDX
Regulator temperatury PeltieraLEAP Technologies Inc.Sterownik HP115-COOL/DPeltiera do precyzyjnego ustawiania temperatury komór w robocie LEAP.
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030oprogramowanie do identyfikacji peptydów. Alternatywne oprogramowanie jest dostępne u innych dostawców.
Nasadki do odczynnikówWaters Corporation186004632opakowanie 100
Pojemniki na odczynniki do LEAP HDX-2Waters Corporation186001420opakowanie 100 bez nakrętek - używane do w LEAP HDX-2
Deuterotlenek sodu (99,5% w D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-57Do do znakowania HDX
Probówki do mikrowirówek z filtrem wirowym (3 kDa MWCO)Amicon (Merck Sigma Aldrich)UFC5003Mikroprobówki wirówkowe do zagęszczania białka. Ułatwia to wymianę i dokładne ładowanie próbek do eksperymentów HDX-MS.
Spektrometr masowy Synapt G2-SiWaters Corporation176850035Spektrometr masowy
Fiolki całkowitego odzyskuWaters Corporation600000671CV100 opakowanie wraz z nakrętkami - służy do etykietowania tacki w LEAP HDX-2
Tris-HClSigma AldrichT3253-250GBufor
Trizmabaza Sigma AldrichT60040-B2005Bufor
MocznikSigma AldrichU5378-1KGChaotrope/Denaturant
VanGuard 2,1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 kolumna Waters Corporation186004623Kolumna odsalająca pułapki
dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 1 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820(2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712(2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424(2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. New York. 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka wewn trznie nieuporz dkowanemapowanie peptydoweagregacja bia ekdynamika konformacyjnapobieranie deuterutestowanie istotno ci statystycznej

Powiązane artykuły