DiI dye-filling jako proste i niedrogie narzędzie do wizualizacji rzęskowych neuronów czuciowych u C. elegans

Podsumowanie

Wypełnianie barwnikiem DiI jest metodą powszechnie stosowaną u C. elegans do wizualizacji podzbioru orzęsionych neuronów czuciowych, co pozwala na identyfikację mutacji genetycznych, które zmieniają strukturę lub funkcję neuronu czuciowego.

Streszczenie

C. elegans od dawna jest używany jako prosty i dostępny model do badania struktury neuronalnej i wielu funkcji układu nerwowego. Spośród 302 neuronów w dorosłym hermafrodytowym układzie nerwowym, 60 jest klasyfikowanych jako orzęsione neurony czuciowe. Neurony te mają kluczowe znaczenie dla wielu zachowań C. elegans, w tym między innymi chemo-, mechano- i osmosensingu, kojarzenia samców i tworzenia dauer. Już od kilkudziesięciu lat członkowie społeczności C. elegans używają czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI do wizualizacji podzbioru rzęskowych neuronów czuciowych, które są bezpośrednio wystawione na działanie środowiska zewnętrznego. Barwnik ten dostaje się do rzęskowych końców neuronów i rozprowadza się w stosunkowo jednolitym wzorze w dendrytach, ciałach komórkowych i aksonach. Ta prosta i skuteczna metoda jest doskonałym narzędziem pierwszego przejścia do identyfikacji mutantów genetycznych, które powodują strukturalne lub funkcjonalne defekty w rzęskowych neuronach czuciowych. Tutaj przedstawiamy uproszczoną wersję tej metody barwienia, aby uwidocznić osiem par amphidów i dwie pary neuronów phasmid, które są narażone na działanie środowiska u C. elegans. Omawiamy wskazówki dotyczące stosowania tej niedrogiej metody obrazowania wzorów wypełniania barwnikiem komórkowym u znieczulonych zwierząt.

Wprowadzenie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) są łatwe do manipulowania, mają szybki czas generacji i są tanie w utrzymaniu. Ze względu na te i wiele innych zalet, C. elegans służył jako preferowany organizm modelowy do badania wielu procesów biologicznych, zwłaszcza rozwoju i funkcji układu nerwowego. Cały numer w Journal of Neurogenetics został niedawno poświęcony historycznym wpływom badań na ten konkretny temat¹. Są one szczególnie przydatne do badania funkcji rzęsek pierwotnych, które biorą udział w wykrywaniu chemicznych i fizycznych warunków środowiskowych².

Dorosłe hermafrodyty C. elegans mają w sumie 302 neurony, z których 60 posiada pierwotne rzęski na końcu swoich procesów dendrytycznych³. Te 60 orzęsionych neuronów jest klasyfikowanych jako neurony czuciowe i bierze udział w wielu zachowaniach C. elegans, w tym między innymi w chemo-, mechano- i osmosensing, kojarzeniu samców i tworzeniu dauer^3,4. Istnieją dwa podzbiory rzęskowych neuronów czuciowych, które są wystawione na działanie środowiska zewnętrznego, które obejmują szesnaście neuronów amfidowych (8 par) w głowie i cztery neurony phasmid (2 pary) w ogonie^3,5.

Przez kilka dziesięcioleci badacze ze społeczności C. elegans używali barwników lipofilowych, takich jak czerwony fluorescencyjny nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyaniny (DiI), do wizualizacji wielu różnych tkanek u żywych zwierząt^6,7,8,9. Kiedy zwierzęta są wystawione na działanie DiI, barwnik łatwo i szybko interkaluje w błonę dendrytów, aksonów i ciał komórkowych 20 zewnętrznie wystawionych neuronów amfidowych i famidowych w stosunkowo równomiernym rozmieszczeniu. Kiedy zwierzęta typu dzikiego są wystawione na działanie DiI, barwnik można uwidocznić w tych neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w stosunkowo szerokim oknie czasowym. Jeśli w rzęskach pierwotnych występują jakiekolwiek nieprawidłowości morfologiczne lub funkcjonalne, barwnik może nie wypełniać prawidłowo neuronów, a zatem sygnał może wydawać się słabszy w niektórych lub wszystkich komórkach lub może być całkowicie nieobecny^6,7,10,11. Każdy z tych wyników może informować o deficytach strukturalnych lub funkcjonalnych, które mogą być obecne w rzęskowych neuronach czuciowych wariantów genetycznych.

Ten manuskrypt ma na celu zademonstrowanie łatwości, z jaką można zastosować wypełnianie barwnikiem u C. elegans do wizualizacji struktury rzęskowych neuronów czuciowych (Rysunek 1). Zastosowaliśmy tę technikę u zwierząt typu dzikiego i zmutowanego, aby pokazać, w jaki sposób różne tła genetyczne mogą wykazywać różne wyniki wypełniania barwnikiem, często związane ze strukturalną lub funkcjonalną integralnością ich rzęskowych neuronów czuciowych. Pokazujemy barwienie po 30 minutach, 24 godzinach i 48 godzinach po wypełnieniu barwnikiem u zwierząt w różnym wieku, aby pomóc w określeniu optymalnego przebiegu czasu dla obrazowania na żywo. Podajemy również przykłady trudności, które mogą pojawić się podczas barwienia i obrazowania, oraz wskazówki, jak uniknąć tych punktów problemowych. Dzięki zastosowaniu tej metody, naukowcy z instytucji dowolnej wielkości mogą zacząć budować na podstawach biologii rzęskowych neuronów czuciowych u C. elegans. Napełnianie barwnikiem jest na tyle proste i opłacalne, że można je włączyć do zajęć laboratoryjnych ze studentami, aby umożliwić im pracę z C. elegans i mikroskopią fluorescencyjną przy minimalnej wcześniejszej wiedzy technicznej. Ponadto istnieje znaczna ochrona genów zaangażowanych w pierwotną biologię rzęsek i, szerzej, funkcję neuronów czuciowych między ludźmi a C. elegans¹². Dalsze badania nad funkcjami genów rzęsek i interakcjami genetycznymi u C. elegans mogą ostatecznie dostarczyć lepszego wglądu w złożoność ludzkich ciliopatii¹³.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj roztwór wybielacza. Połącz 2 ml wybielacza, 500 μl 10 M NaOH i 7,5 ml dH₂O w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Roztwór wybielacza pozostaje stabilny do 1 tygodnia, jeśli jest przechowywany w temperaturze pokojowej (RT).
2. Przygotuj bufor M9. Połącz 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄ i 5 g NaCl w 1 l sterylnej wody i autoklawie w celu sterylizacji. Po całkowitym schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 1 ml sterylnego 1 M_MgSO4.
3. Przygotować roztwór podstawowy DiI. Dodać 10 mg DiI do 5 ml dimetyloformamidu (DMF), aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/ml DiI w DMF. DiI jest światłoczuły, dlatego zawsze przykrywaj roztwory folią aluminiową. DiI w DMF może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez wiele lat i nie wymaga rozmrażania między użyciami.
   UWAGA: DMF jest zarówno łatwopalny, jak i szkodliwy w kontakcie ze skórą lub wdychania. Pracuj z tym roztworem pod maską chemiczną, z dala od otwartego ognia i nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).

2. Izolacja zsynchronizowanych populacji za pomocą preparatu wybielającego

UWAGA: Zbierz wszystkie niezbędne urządzenia i rozwiązania na wszystkich etapach procesu przed jego rozpoczęciem. Preparaty wybielające są bardzo wrażliwe na czas, więc posiadanie niezbędnych materiałów przed rozpoczęciem procesu zapewnia sukces protokołu.

1. Niezagłodzone, graitujące dorosłe zwierzęta zmyć z talerzy za pomocą 1 ml buforu M9. Pozwól zwierzętom zebrać się przy jednej krawędzi talerza, lekko przechylając talerz.
   UWAGA: Zazwyczaj staraj się zebrać ~ 50-100 niezagłodzonych, ciężarnych dorosłych zwierząt, aby uzyskać niezawodny plon jaj. Jednak preparat wybielający można wykonać na prawie każdej liczbie dorosłych zwierząt. Liczba dorosłych zwierząt grawitacyjnych dostępnych do odbioru może się znacznie różnić w zależności od tła genetycznego zwierząt. Większa liczba zebranych zwierząt zwykle daje większą liczbę jaj.
2. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zebrać i przenieść zwierzęta z buforu M9 do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
3. Odwirować zwierzęta przy 350 g przez 30 s. Ta prędkość jest wystarczająco niska, aby zebrać żywe zwierzęta na dnie tuby, nie powodując żadnych szkód.
4. Zdekantuj większość nadmiaru bufora M9, pozostawiając zebrane robaki na dnie rurki w spokoju.
5. Dodać 1 ml przygotowanego roztworu wybielacza i pozwolić zwierzętom unosić się w roztworze, aż zaczną się rozpadać, regularnie odwracając probówkę, aby przyspieszyć rozpad tkanek. Obserwuj rozkład tkanek i uwalnianie komórek jajowych, okresowo sprawdzając probówkę pod mikroskopem preparacyjnym. Proces ten trwa zwykle od 5 minut do 10 minut.
6. Gdy probówka zawiera w większości uwolnione jaja, z których pozostało tylko kilka widocznych tkanek zwierzęcych, wiruj z maksymalną prędkością dla standardowej mikrowirówki stołowej (zwykle od 15 000 do 21 000 g) przez 30 sekund, aby zebrać jaja na dnie.
7. Zdekantuj jak najwięcej roztworu wybielacza za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie naruszyć granulowanych jaj. Dodać 1 ml buforu M9, aby zatrzymać rozkład jaj przez pozostały roztwór wybielacza.
   UWAGA: Kroki 2.6 i 2.7 należy wykonać szybko. Opóźnienia w wirowaniu, usuwaniu roztworu wybielacza i myciu buforem M9 mogą skutkować niską wydajnością jaj z powodu degradacji.
8. Ponownie odwirować probówkę przy 21 000 g przez 30 s. Zdekantować supernatant bez naruszania granulowanych jaj.
9. Umyć jeszcze dwukrotnie 1 ml buforu M9, dekantując płyn między każdym myciem, nie naruszając granulowanych jaj.
10. Po ostatnim umyciu zdekantuj większość bufora M9, a następnie ponownie zawieś jaja w pozostałym płynie, przesuwając probówkę lub energicznie potrząsając.
11. Za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieś kroplę roztworu zawierającego jaja na powierzchnię świeżej płytki NGM z E. coli. Staraj się umieścić kroplę obok E. coli i dodaj około 100 jaj na talerz. Jaja te są w przybliżeniu zsynchronizowane pod względem wieku.
    UWAGA: W przypadkach, gdy wydajność jaj jest na tyle wysoka, że uzyskanie 100 jaj na kroplę jest trudne, do probówki zawierającej jaja można dodać dodatkowy bufor M9 w celu rozcieńczenia ich stężenia.

3. Procedura wypełniania barwnikiem

1. Oznacz tyle probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, ile jest potrzebne do liczby szczepów napełnianych barwnikiem. Utwórz foliowe osłony dla każdej probówki, aby chronić wrażliwy na światło roztwór DiI po dodaniu.
2. Umyj zwierzęta w pożądanym stadium rozwojowym z płytek NGM zsynchronizowanych z wiekiem przy użyciu około 1 ml buforu M9. Upewnij się, że każda płytka zawiera około 100 zwierząt wyklutych ze 100 jaj umieszczonych na talerzu podczas synchronizacji wybielacza. Zbierz zwierzęta do odpowiednio oznakowanych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Wypełnianie barwnikiem sprawdza się na wielu różnych etapach rozwoju. Badanie to wykazało wypełnianie barwnikiem u zwierząt w stadium od stadium larwalnego 3 (L3) do dorosłych (48 godzin po L3).
3. Odwiruj zwierzęta w temperaturze 350 g przez 30 sekund, aby zebrać je na dnie probówki.
4. Zdekantować bufor M9 bez naruszania zwierząt zebranych na dnie probówki.
5. Przemyć jeszcze dwukrotnie 1 ml buforu M9, dekantując płyn między każdym myciem, nie przeszkadzając zebranym zwierzętom. W ostatniej rundzie płukania zdekantować tak, aby w probówce pozostało 200 μl buforu M9.
6. Przykryj wszystkie probówki folią aluminiową w celu ochrony przed ekspozycją na światło i dodaj 1 μl DiI w DMF bezpośrednio do bufora M9 w każdej probówce.
   UWAGA: W przypadku zmiany ilości bufora M9 i DiI należy pamiętać o zachowaniu stosunku DiI w buforze M9 wynoszącym 1:200.
7. Kołysz lub potrząsaj wszystkimi rurkami w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
8. Wirować probówki o masie 350 g przez 30 s, aby zebrać zwierzęta na dnie probówek.
9. Zdekantować ciecz zawierającą DiI z probówek do mikrowirówek. Umyć trzykrotnie buforem M9, dekantując płyn między każdym praniem.
10. Po dekantacji z ostatniego mycia przenieść zwierzęta w małej (~50 μL) objętości buforu M9 na świeże płytki NGM z E. coli.
11. Pozwól zwierzętom dojść do siebie po barwieniu na świeżych płytkach NGM przez co najmniej 30 minut. Przykryj płytki folią aluminiową do czasu obserwacji, aby zachować plamę DiI. Obserwuj zwierzęta do 24 godzin po napełnieniu barwnikiem bez znaczącej utraty sygnału fluorescencyjnego. Po 48 godzinach lub po upływie tych godzin sygnał może zacząć zanikać (patrz Rysunek 2).

4. Obrazowanie metodą wypełniania barwnikiem

1. Przygotuj 2% agarozę w sterylnym roztworze wodnym. Całkowicie rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej.
   UWAGA: Agaroza (2%) w roztworze wodnym może być wielokrotnie używana, aż powtarzająca się utrata wody zwiększy stężenie agarozy do punktu, w którym roztwór stanie się zbyt lepki.
2. Zaopatrz się w szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm do przygotowania wafor z agarozy. Za pomocą szklanej pipety umieść małą kroplę stopionej 2% agarozy w wodzie na jednym szklanym szkiełku podstawowym i szybko umieść szkiełko nakrywkowe na kropli agarozy. Gdy podkładka agarozowa całkowicie zastygnie, usuń szkiełko nakrywkowe, pozostawiając wacik agarozowy na szkiełku podstawowym.
   UWAGA: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków w płatkach agarozowych, ponieważ mogą one utrudniać obrazowanie zwierząt.
3. Dodać 5-10 μl środka znieczulającego (10 mM lewamizolu) na powierzchnię wabiki agarozowej. Przenieś 5-20 zwierząt do środka znieczulającego, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem na podkładce agarozowej.
4. Obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego stereo, złożonego i/lub konfokalnego, w zależności od dostępnego sprzętu oraz potrzeb w zakresie badań przesiewowych i obrazowania. DiI ma pik wzbudzenia przy 550 nm i szczyt emisji przy 564 nm; w ten sposób wyświetl go za pomocą kostki filtracyjnej kompatybilnej z tetrametylorodaminą/cyjaniną 3/żółtym białkiem fluorescencyjnym (TRITC/Cy3/YFP).
   UWAGA: Odpowiednie ustawienia mikroskopu, takie jak czas ekspozycji, wzmocnienie i moc lasera, potrzebne do uzyskania wyraźnych obrazów wypełniania barwnikiem mogą się różnić w zależności od typu mikroskopów i powinny być niezależnie określane przez użytkowników zgodnie z ich unikalnymi potrzebami.

Wyniki

Dorosłe robaki N2 zobrazowane 24 godziny po wypełnieniu barwnikiem wykazują wyraźny sygnał fluorescencyjny rozłożony względnie równomiernie w neuronach amphid (Rysunek 1A,A') i neuronach phasmid (Rysunek 1D,D'). U tych zwierząt można łatwo odróżnić dendrytyczne projekcje i ciała komórkowe neuronów. W projekcjach dendrytycznych nie ma grudek barwnika, ani nie ma żadnych przerw w sygnale fluorescencyjnym w żadnej czę...

Dyskusja

Skuteczne napełnianie barwnikiem opiera się na dokładnym rozważeniu etapu rozwoju i tła genetycznego zwierząt, a także czasu, jaki upłynął do obrazowania. Niektóre mutacje genetyczne zaburzają strukturę i/lub funkcję zewnętrznie odsłoniętych rzęskowych neuronów czuciowych, co powoduje, że zwierzęta nie są w stanie prawidłowo się wypełnić. W związku z tym wypełnianie barwnikiem nowych mutantów C. elegans może być stosowane jako prosty identyfikator pierwszego przejścia dla defektów w strukturze lub funkcji neuron...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DiI	Biotium	60010	Nie rozpuszczalny w wodzie, przygotować 2 mg / ml roztworu w DMF. Roztwór jest światłoczuły, przykryj folią. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Roztwór dobry przez wiele lat.
Chlorowodorek lewamizolu	Fisher	AC187870100	10 mM roztwór w buforze M9. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Roztwór dobry przez wiele lat.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Dostępny do kupienia, ale także łatwy do wykonania na miejscu zgodnie z przepisem w protokole.
N2 (szczep C. elegans)	CGC	N2	C. elegans dziki izolat
YH2125 (szczep C. elegans)	n/a	/d	Szczep wygenerowany w Yoder Laboratory (Bentley-Ford i in., 2021)

n