Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Summary

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca²⁺) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Abstract

Dysfunkcja skurczowa i przejściowe stany Ca²⁺ są często analizowane na poziomie komórkowym jako część kompleksowej oceny uszkodzeń i/lub przebudowy wywołanych przez serce. Jednym z podejść do oceny tych zmian funkcjonalnych jest nieobciążone skracanie i analizy przejściowe Ca^{2 +} w pierwotnych dorosłych miocytach serca. W tym podejściu dorosłe miocyty są izolowane przez trawienie kolagenazy, uzyskuje tolerancję Ca²⁺, a następnie przykleja się do szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą, a następnie następuje stymulacja elektryczna w pożywce wolnej od surowicy. Ogólny protokół wykorzystuje miocyty serca dorosłych szczurów, ale można go łatwo dostosować do miocytów pierwotnych innych gatunków. Zmiany funkcjonalne w miocytach z uszkodzonych serc można porównać do miocytów pozorowanych i/lub do leczenia in vitro. Metodologia obejmuje podstawowe elementy potrzebne do stymulacji miocytów, a także elementy komory komórkowej i platformy. Szczegółowy protokół dla tego podejścia obejmuje etapy pomiaru nieobciążonego skrócenia za pomocą detekcji długości sarkomeru i komórkowych stanów przejściowych Ca²⁺ mierzonych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego Fura-2 AM, a także do analizy surowych danych.

Introduction

Analiza funkcji pompy serca często wymaga szeregu podejść w celu uzyskania odpowiedniego wglądu, szczególnie w przypadku zwierzęcych modeli niewydolności serca (HF). Echokardiografia lub pomiary hemodynamiczne dostarczają wglądu w dysfunkcję serca in vivo¹, podczas gdy podejścia in vitro są często stosowane w celu określenia, czy dysfunkcja wynika ze zmian w miofilamentach i/lub transjencie Ca²⁺ odpowiedzialnym za wzbudzenie sprzężenia, czy też potencjału czynnościowego z funkcją skurczu (np. sprzężenie wzbudzenie-skurcz [E-C]). Podejścia in vitro dają również możliwość badania przesiewowego funkcjonalnej odpowiedzi na neurohormony, zmiany genetyczne wywołane przez wektory, a także potencjalne środki terapeutyczne² przed zastosowaniem kosztownych i/lub pracochłonnych strategii leczenia in vivo.

Dostępnych jest kilka podejść do badania funkcji kurczliwości in vitro, w tym pomiary siły w nienaruszonych beleczkach³ lub permeabilized miocytes⁴, a także niezaładowane skracanie i przejściowe Ca²⁺ w nienaruszonych miocytach w obecności i braku HF5^,6. Każde z tych podejść koncentruje się na funkcji skurczowej miocytów serca, która jest bezpośrednio odpowiedzialna za funkcję pompy serca^2,7. Jednak analiza zarówno skurczu, jak i sprzężenia E-C jest najczęściej wykonywana poprzez pomiar skrócenia długości mięśni i stanów przejściowych Ca²⁺ w izolowanych, tolerancyjnych na Ca^{2 +} dorosłych miocytach. Laboratorium wykorzystuje szczegółowy, opublikowany protokół do izolacji miocytów z serc szczurów na tym etapie⁸.

Zarówno przejściowe^Ca2+, jak i miofilamenty przyczyniają się do skracania i ponownego wydłużania nienaruszonych miocytów i mogą przyczyniać się do dysfunkcji kurczliwości^2,7. Dlatego takie podejście jest zalecane, gdy analiza funkcjonalna in vitro wymaga nienaruszonego miocytu zawierającego maszynerię rowerową Ca^{2 +} oraz miofilamenty. Na przykład, nienaruszone izolowane miocyty są pożądane do badania funkcji skurczu po modyfikacji funkcji cyklicznej miofilamentu lub Ca²⁺ poprzez transfer genów⁹. Ponadto sugeruje się podejście oparte na nienaruszonych miocytach do analizy funkcjonalnego wpływu neurohormonów podczas badania wpływu szlaków sygnałowych drugiego przekaźnika i/lub odpowiedzi na środki terapeutyczne². Alternatywny pomiar siły zależnej od obciążenia w pojedynczych miocytach jest najczęściej wykonywany po przepuszczalności błony (lub skórowaniu) w niskich temperaturach (≤15 °C) w celu usunięcia przejściowego wkładu Ca²⁺ i skupienia się na funkcji miofilamentu¹⁰. Pomiar siły zależnej od obciążenia plus stany nieustalone Ca²⁺ w nienaruszonych miocytach jest rzadki, głównie ze względu na złożone i techniczne wyzwanie podejścia¹¹, zwłaszcza gdy potrzebna jest wyższa przepustowość, na przykład do pomiaru odpowiedzi na sygnalizację neurohormonalną lub jako badanie przesiewowe dla środków terapeutycznych. Analiza beleczków serca pozwala przezwyciężyć te wyzwania techniczne, ale może również mieć na nią wpływ brak miocytów, zwłóknienie i/lub przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej². Każde z opisanych powyżej podejść wymaga preparatu zawierającego dorosłe miocyty, ponieważ miocyty noworodków i miocyty pochodzące z indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) nie wyrażają jeszcze pełnego zestawu dorosłych białek miofilamentowych i zwykle brakuje im poziomu organizacji miofilamentów obecnego w dorosłym miocytach w kształcie pałeczek². Dotychczasowe dane w iPSC wskazują, że pełne przejście do dorosłych izoform trwa ponad 134 dni w culture¹².

Biorąc pod uwagę, że ta kolekcja skupia się na HF, protokoły zawierają podejścia i analizy do różnicowania funkcji skurczowej u nieuszkodzonych i nieuszkodzonych miocytów. Reprezentatywne przykłady przedstawiono z miocytów szczurów badanych 18-20 tygodni po koarktacji nadnerkowej, opisanej wcześniej^5,13. Następnie dokonuje się porównań z miocytami szczurów leczonych pozorowo.

Opisany tutaj protokół i platforma obrazowania są używane do analizy i monitorowania zmian w przejściowych skrótach i Ca²⁺ w pręcikowatych miocytach serca podczas rozwoju HF. Na potrzeby tej analizy 2 x 10⁴ tolerancyjne na Ca²⁺, pręcikowe miocyty są powlekane na 22 mm² powlekanych lamininą szklanych szkiełkach nakrywkowych (CS) i hodowane przez noc, jak opisano wcześniej⁸. Komponenty zmontowane dla tej platformy obrazowania, wraz z mediami i używanymi do optymalnego obrazowania, znajdują się w Tabeli Materiałów. Dostępny jest również przewodnik dotyczący analizy danych za pomocą oprogramowania oraz reprezentatywne wyniki. Ogólny protokół jest podzielony na oddzielne podsekcje, przy czym pierwsze trzy sekcje koncentrują się na izolowanych miocytach szczurów i analizie danych, a następnie na przejściowych eksperymentach komórkowych Ca^{2 +} i analizie danych w miocytach.

Protocol

Badania przeprowadzone na gryzoniach były zgodne z Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan. Na potrzeby tego badania miocyty wyizolowano od 3-34-miesięcznych szczurów Sprague-Dawley i F344BN o wadze ≥ 200 g⁵. Zastosowano zarówno stawki męskie, jak i żeńskie.

1. Stymulacja miocytów w badaniach funkcji skurczu

1. Przygotuj świeże pożywki na bazie M199 dla każdego zestawu izolowanych miocytów (tabela materiałów). 1 dzień przed stymulacją, płytka 2 x 10⁴ tolerancyjne na Ca²⁺, pręcikowe miocyty na 22 mm² szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (CS), jak opisano wcześniej⁸.
2. Aby przygotować komory, namocz każdą komorę w 10% wybielaczu przez 1 godzinę. Następnie płucz komory bieżącą wodą z kranu przez 30-45 minut, następnie wodę destylowaną wymieniaj co 5 minut przez 30 minut, a następnie wodę dejonizowaną wymieniaj co 5 minut przez 30 minut i końcowe płukanie w wodzie dejonizowanej.
3. Suszyć komory na czystej powierzchni przez 20-30 minut (rysunek uzupełniający 1A-C). Następnie poddaj komory działaniu promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 5 minut w każdym kierunku (łącznie = 20 minut). Ten krok nie jest wymagany w przypadku komór wstępnie wysterylizowanych.
   UWAGA: Opuść obszar, aby zminimalizować ekspozycję na promieniowanie UV.
4. Zdejmij pokrywę z komory, dodaj 3 ml pożywki na bazie M199 (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki (rysunek uzupełniający 1B), załóż pokrywę i podgrzej komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i 20% O_{2 .}
5. Sterylizuj kleszcze w sterylizatorze z gorącymi kulkami w temperaturze 250 °C przez 20-25 s. Przenieś podgrzaną komorę stymulacji z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.
6. Przenieś każde szkiełko nakrywkowe (CS) zawierające miocyty serca do poszczególnych studzienek w komorze stymulacji za pomocą sterylnych kleszczy. Przenoś CS po cztery na raz, a następnie podgrzewaj przez 10 minut przed przeniesieniem pozostałych czterech CS, aby utrzymać temperaturę mediów.
7. Przymocuj podnośniki bananowe do komory stymulacji z jednej strony (rysunek uzupełniający 1C), a z drugiej do stymulatora (rysunek uzupełniający 1D).
8. Ustaw częstotliwość stymulatora na 0,2 Hz i ustaw napięcie (~12 V), aby osiągnąć skurcz w ~10%-20% wszystkich miocytów serca w kształcie pręcików w studzience. Aby określić liczbę kurczących się miocytów, umieść komorę pod odwróconym mikroskopem o powiększeniu od 4x do 10x.
9. Umieścić komorę stymulacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ (rysunek uzupełniający 1E). Zmieniaj pożywkę co 12 godzin, używając pożywki podgrzanej w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 20-25 minut. Kontynuuj stymulację elektryczną do 3 dni z wymianą pożywki co 12 godzin.

2. Analiza funkcji kurczliwości miocytów serca dorosłego szczura

1. Przed eksperymentem podgrzej żel i pożywkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
2. Włącz elementy platformy funkcji kurczliwości wymienione w tabeli materiałów i pokazane na rysunku uzupełniającym 2, zwracając szczególną uwagę na kluczowe elementy, do których należą stół antywibracyjny (rysunek uzupełniający 2A-1) z odwróconym mikroskopem z filtrem ciemnoczerwonym (590 nm) (rysunek uzupełniający 2A-2,3) i kamerą CCD (rysunek uzupełniający 2A-4) podłączoną do kontrolera CCD (Rysunek uzupełniający 2A-5 i rysunek uzupełniający 2C-5) oraz zintegrowany z komputerem PC (rysunek uzupełniający 2B-14).
3. Zamontować rurkę w pompie perystaltycznej (rysunek uzupełniający 2A-8; Rysunek uzupełniający 2A-8), przenieś podgrzany pakiet żelu do uchwytu probówki (rysunek uzupełniający 2A-9) i włącz próżnię (rysunek uzupełniający 2A-11) i zasilanie stymulatora komórkowego (rysunek uzupełniający 2B-13).
4. Umieść probówkę o pojemności 50 ml z pożywką w izolowanym uchwycie probówki (rysunek uzupełniający 2A-9) i rozpocznij perfuzję z prędkością ~0,5 ml / min przez rurkę pompy perystaltycznej (rysunek uzupełniający 2E-8).
5. Dodaj niewielką ilość podgrzanego podłoża do małej łódki wagowej (~2 ml). Przenieść jeden CS zawierający miocyty z komory stymulacyjnej do łodzi wagowej. Przywrócić temperaturę komory stymulacji do 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2
.
6. Wyjmij CS z łodzi wagowej i delikatnie wytrzyj spód. Przenieś CS do świeżo natłuszczonej komory CS (rysunek uzupełniający 2A, F-10; strzałka) i delikatnie dodaj kroplę pożywki (~200 μL) na CS.
7. Umieść platynowy uchwyt elektrody na CS (rysunek uzupełniający 2F; szara strzałka) i połóż nowy CS na górze za pomocą kleszczy. Umieść górne mocowanie (rysunek uzupełniający 2F; biała strzałka) nad kanapką CS, a następnie wkręć dwie lub cztery z stożkowym stożkowym stożkowym stożkowym #0, aby zakończyć montaż komory.
8. Gdy media znajdą się w przewodach pompy, podłącz rurkę do podgrzewacza, a następnie podłącz podgrzewacz do komory CS zmontowanej w kroku 2.7. Rozpocznij perfuzję od 0,5 ml/min i umieść chusteczkę chusteczkową pod komorą, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
9. Umieść komorę CS w stage adapter. Perfaktoryzowane media są zbierane na przeciwległym końcu komory za pomocą rurki podłączonej do systemu próżniowego. Włącz system grzewczy (rysunek uzupełniający 2A, D-7) i zrównoważ komorę, obiektyw i podgrzewacz przez ~5-10 minut, aby osiągnąć stałą temperaturę medium 37 °C. Wizualizuj miocyty za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzenia w wodzie pod mikroskopem w tym czasie równowagi.
10. Aktywuj stymulator stymulacji (rysunek uzupełniający 2B-13), ustawiając napięcie na 1,5 raza większe niż ustawienie potrzebne do skurczenia się 80% komórek w kształcie pręcików, co zwykle wynosi 35-40 V. Ustaw częstotliwość stymulacji na 0,2 Hz, aby zoptymalizować funkcję skurczu i przeżycie miocytów.
11. Zbierz ślady skracania i ponownego wydłużania skurczu z miocytów poddanych ciągłej perfuzji i stymulacji. Do zbierania pomiarów skracania należy użyć kamery CCD (rysunek uzupełniający 2A-4) podłączonej do sterownika CCD (rysunek uzupełniający 2B-5,C) oraz dedykowanego komputera z płytką kontrolera I/O (rysunek uzupełniający 2B-14; patrz tabela materiałów). Platforma mierzy skrócenie sarkomeru w miocytach szczurów, chociaż podobne wyniki uzyskuje się z pomiarów miocytów pobranych z podłużnych krawędzi miocytów (patrz Ecklerle et al.¹⁴).
12. Aby zebrać ślady skracania sarkomeru, otwórz oprogramowanie na komputerze, wybierz OK, a następnie Plik > Nowy. Przygotuj szablon ekranu, wybierając opcję Ślady > Edytuj limity użytkownika > długości sarkomeru, a następnie ustawiając wartości maksymalne i minimalne, które zwykle mieszczą się w zakresie od 2,0 μm do 1,5 μm. Skalibruj kamerę CCD za pomocą siatki 0,01 mm przed wykonaniem pomiarów w miocytach (Rysunek 1D).
13. Aby zarejestrować ślady długości sarkomeru, wybierz opcję Plik > Nowy. Zidentyfikuj kurczący się miocyt i umieść miocyt wzdłuż osi podłużnej aparatu, tak aby wzór prążkowania był pionowy (Rysunek 1B).
14. Użyj myszy komputerowej, aby umieścić pole obszaru zainteresowania (ROI) (różowe pole) nad miocytami (Rysunek 1C). Wybierz opcję Zbierz i Rozpocznij, aby zarejestrować funkcję skurczu. Zapisuj skracanie przez 60 s z każdego miocytu przy niskich częstotliwościach stymulacji (≤0,5 Hz).
15. Zapisz skrócenie sarkomeru od 5-10 komórek na CS. Wykonaj pomiary przy 1 komórce/CS, jeśli badania obejmują leczenie agonistami/antagonistami. Przygotuj oddzielne wstępnie podgrzane podłoże i inny, dedykowany kawałek rurki perfuzyjnej załadowany do wielokanałowej pompy perystaltycznej i postępuj zgodnie z krokami 2.9.-2.14. do pomiaru wpływu dostarczania leków lub neurohormonów na funkcję skurczową miocytów.
16. Aby zmierzyć skrócenie w zakresie częstotliwości, nadaj tempo miocytom przy każdej częstotliwości, aby uzyskać skrócenie w stanie ustalonym przed nagraniem⁵. W przypadku tych badań należy podwoić szybkość perfuzji i rozpocząć rejestrację 15-20 s po stymulacji z nową częstotliwością, aby uzyskać spójne odpowiedzi skurczowe w stanie ustalonym dla częstotliwości w zakresie 0,2 Hz i 2 Hz. Zazwyczaj rejestruj nie więcej niż 2 miocyty / CS w celu skrócenia w danym zakresie częstotliwości stymulacji.
17. Zapisz co najmniej 7 skurczów na komórkę, aby uzyskać wiarygodne dane uśrednione sygnałem podczas analizy nagrań (patrz krok 3.).

3. Analiza danych funkcji skurczowej w izolowanych miocytach

1. Aby rozpocząć, wybierz pozycję Plik, wybierz zarejestrowany ślad, a następnie wybierz pozycję Otwórz. Wybierz Tab 1 (lewa strona) śladu podstawowego, a następnie ustaw żółty panel w górnej części ścieżki na Sarc-Length. Wybierz opcję Ślady i szablon ekranu przygotowany w kroku 2.12.
2. Aby przygotować szablon analizy, wybierz Operacje, Opcje monotonnej analizy stanów nieustalonych, Znacznik zdarzenia TTL w polu Definicja t0, a także następujące opcje z menu: Linia bazowa (spoczynkowa długość sarkomeru), Prędkość odlotu względem t0 (dep v), Szczyt (wysokość piku i %wysokość szczytu/linia bazowa lub bl%szczyt h), Prędkość powrotu względem tPeak (ret v), Czas do osiągnięcia szczytu 50% (TTP_50%) przy użyciu t0 i czas do punktu odniesienia 50% (TTR_50%) przy użyciu tPeak. Zapisz te opcje analizy, wybierając opcję Szablony > Zapisz szablon analizy z identyfikatorem. Załaduj ten szablon analizy przed analizą każdego śladu.
3. Aby rozpocząć analizę danych, wybierz opcję Znaczniki > bramie > Dodaj stan przejściowy > Konwertuj ze znacznika zdarzenia > zakresu analizy. Teraz ustaw zakres czasu od -0,01 s do 1,20 s dla miocytów w tempie 0,2 Hz (Rysunek 2A, czerwone znaki w dolnej części surowego śladu). Wybierz krótszy zakres czasu dla miocytów stymulowanych wyższymi częstotliwościami.
4. Utwórz ślad uśredniony według sygnału, wybierając pozycję Operacje > Średnia liczba zdarzeń. Nagranie uśrednione sygnałem pojawia się poniżej oryginalnej ścieżki podstawowej.
5. Wybierz pozycję Tab 1 uśrednionego sygnału (po lewej stronie ekranu), a następnie wybierz pozycję Znaczniki w górnym menu, a następnie pozycję Dodaj stan przejściowy. Wybierz Operacje z górnego menu i Monotoniczna analiza stanów nieustalonych, aby wyświetlić uśrednione wartości sygnału dla podstawowej długości sarkomeru, wysokości piku, bl% peak h, dep v, ret v, TTP_50% i TTR_50% w panelu wyświetlania uśrednionego sygnału.
6. Przenieś każdą analizę stanów przejściowych sarkomeru do arkusza kalkulacyjnego w celu złożonej analizy wielu miocytów, wybierając opcję Eksportuj > Monotoniczną analizę stanów nieustalonych > Prąd schowka. Wklej te dane do arkusza kalkulacyjnego dla każdego śladu.
7. Aby skopiować ślad uśredniony > sygnału, wybierz opcję Eksportuj bieżący ślad > Opcje schowka > i ustaw liczbę miejsc dziesiętnych na 5, a następnie wybierz opcję Ogranicznik tabulatorów i kliknij przycisk OK, a następnie przycisk OK. Wklej uśrednione sygnałowo ślady dla każdego zapisu miocytów do drugiego arkusza kalkulacyjnego.

4. Rejestrowanie stanów przejściowych Ca²⁺ w miocytach serca dorosłych szczurów

1. Przed pomiarem stanów nieustalonych Ca²⁺ włącz komponenty platformy opisane w kroku 2.2 wraz z dodatkowymi komponentami obrazowania fluorescencyjnego (patrz dodatkowe komponenty do analizy obrazowania Ca²⁺ w Tabeli materiałów; Rysunek uzupełniający 2A-5,6; 2B-12).
2. Przygotować roztwór podstawowy Fura-2AM zawierający 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probenecyd w dimetylosulfotlenku (DMSO). Probenecyd minimalizuje wyciek Fura-2AM¹⁵.
3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do 5 μM Fura-2AM i 2,5 mM probenecydu w 2,5 ml pożywki (patrz tabela materiałów) w jednym dołku na płytce 6-dołkowej. Dodać 2,5 ml samej pożywki (bez Fura-2AM) do trzech dodatkowych studzienek w płytce, przykryć płytkę folią aluminiową i podgrzać pożywkę do 37 °C.
4. Przenieść CS zawierający miocyty z komory stymulacyjnej do studzienki zawierającej Fura-2AM, przykryć i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 4 minuty. Zamontować rurkę w pompie perfuzyjnej i perfaktorować pożywką w okresie ładowania Fura-2AM, jak opisano w kroku 2.4.
5. Wyłącz lub zminimalizuj oświetlenie w pomieszczeniu, aby zmniejszyć fotowybielanie fluorescencyjne i zoptymalizować sygnał fluorescencji. Wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora, a następnie umyć CS przez 10 sekund w każdym z trzech dołków zawierających samą pożywkę. Przenieś CS do małej łodzi wagowej zawierającej wstępnie podgrzane podłoże (bez dodatku Fura-2AM).
6. Zamontuj CS w świeżo nasmarowanej komorze CS po delikatnym wytarciu spodu CS. Delikatnie dodaj kroplę nośnika do CS, a następnie zamontuj mocowanie elektrody nad CS, a następnie drugi CS i górne mocowanie. Użyj z stożkowym stożkowym stożkowym #0, aby zakończyć montaż komory ogniwa, zgodnie z opisem w krokach 2.6.-2.7.
7. Podłącz rurkę pompy wypełnioną mediami do podgrzewacza, podłącz podgrzewacz do komory CS i umieść w stage adapter, jak opisano w kroku 2.8. Zebrać media za pomocą systemu przewodów próżniowych i włączyć system grzewczy (rysunek uzupełniający 2A,D-7), aby wyrównać temperaturę komory do 37°C, jak opisano w krokach 2.8.-2.9.
8. Aktywuj stymulator stymulacji (rysunek uzupełniający 2B-13) ustawiony na 35-40 V i 0.2 Hz, jak opisano w kroku 2.10.
9. Przed nagraniem stanu przejściowego Ca²⁺ włącz małą latarkę lub latarkę do książek zamontowaną w pobliżu klawiatury komputera, aby pomóc zobaczyć klawiaturę. Ponadto zapisz tło fluorescencyjne w obszarze bez miocytów serca. Aby rozpocząć, wybierz pozycję Plik > Rozpocznij > Nowy, zgodnie z opisem w kroku 2.12.
10. Wybierz ROI i ustaw jedną zakładkę (lub pasek śledzenia, po lewej stronie) dla surowego licznika i drugą zakładkę dla surowego mianownika, zdefiniowaną w górnej środkowej części każdej karty. Nagrywaj tło przez 10-20 s. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij nad jednym panelem paska śledzenia, aby uzyskać surowe wartości licznika i mianownika uśrednione dla sygnału. Wprowadź te wartości, wybierając Operacje > Stałe, a następnie wprowadź wartości nieprzetworzone.
11. Przygotuj nowy szablon ekranu, aby zebrać zarówno skróty, jak i stany nieustalone Ca²⁺. W przypadku długości sarkomeru wybierz zakładkę 1 i użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 2.13. W przypadku obrazowania Ca²⁺ wybierz opcję Tab 2 > Ratio (górny środek karty) > Ślady > Edytuj limity użytkowników, aby ustawić minimalne i maksymalne poziomy współczynnika, które są zwykle ustawiane w zakresie od 1 do 5. Użyj tego samego procesu, aby zdefiniować zakresy licznika i mianownika dla kart 3 i 4 (po lewej stronie).
12. Umieść pole ROI na obrazie miocytów, zgodnie z opisem w kroku 2.14. Wybierz pozycję File (Plik> Nowy > zbierz. Teraz wybierz Start, aby zebrać dane skracania i ratiometryczne Ca²⁺. Rejestruj skurcze ≥7 na komórkę w celu analizy uśrednionej sygnału.
13. Powtórz zapis śladu tła opisany w kroku 4.10 po zarejestrowaniu 2-4 miocytów. Zazwyczaj zapisuj 4-5 miocytów/CS lub mniej miocytów, jeśli występują znaczące zmiany w odczycie tła.

5. Analiza danych stanów przejściowych Ca²⁺ w izolowanych miocytach.

1. Otwórz żądany plik do analizy i wybierz Szablony > Szablon ekranu do skracania oraz stany nieustalone Ca²⁺. Następnie wybierz zakładki 1 i 2 (po lewej), aby pokazać odpowiednio długość sarkomeru i stosunek Ca²⁺. Wybierz Operacje > Stałe i wprowadź wartości licznika i mianownika ze śladu tła Ca²⁺.
2. Przygotuj szablony analizy do skracania oraz dane przejściowe Ca²⁺. Wybierz kartę 1 (po lewej stronie) i użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 3.2. , aby ustawić szablon analizy długości sarkomeru.
3. Wybierz zakładkę 2 (po lewej stronie) i wybierz Operacje, Opcje monotonnej analizy stanów nieustalonych, znacznik zdarzenia TTL w polu Definicja t0 oraz następujące opcje z menu: Linia bazowa (stosunek podstawowy), Prędkość odlotu względem t0 (dep v), Szczyt (wysokość piku i %wysokość szczytu/linia bazowa lub bl%szczyt h), Prędkość zaniku względem tPeak (ret v), Czas do osiągnięcia szczytu 50% (TTP_50%) przy użyciu t0 i czas do punktu odniesienia 50% (TTR_50%) przy użyciu tPeak. Zapisz te opcje analizy, wybierając Szablony i Zapisz szablon analizy przy użyciu nowej nazwy identyfikatora. Załaduj ten szablon analizy przed analizą każdego śladu.
4. Użyj tego samego procesu, jak opisano w krokach 3.3.-3.6., aby uśrednić sygnał, a następnie przeanalizować długość sarkomeru, a następnie wykonaj te same kroki dla stanów nieustalonych Ca²⁺. Ustaw osobne znaczniki dla długości sarkomeru i dla śladu współczynnika stanów przejściowych Ca²⁺.

Results

Badania funkcji skurczu są przeprowadzane na miocytach szczurów począwszy od następnego dnia po izolacji (dzień 2) do 4 dni po izolacji. Chociaż miocyty mogą być rejestrowane dzień po izolacji (tj. w dniu 2), po transferze genów lub leczeniu często wymagane są dłuższe czasy hodowli w celu modyfikacji funkcji skurczu⁸. W przypadku miocytów hodowanych przez ponad 18 godzin po izolacji, protokół stymulacji opisany w punkcie 1 pomaga utrzymać kanaliki T i spójne wyniki skracania i ponownego wydłużania...

Discussion

Protokół przewlekłej stymulacji opisany w kroku 1 wydłuża użyteczny czas badania izolowanych miocytów i oceny wpływu dłuższych terapii. W naszym laboratorium spójne wyniki uzyskano do 4 dni po izolacji, mierząc funkcję skurczu za pomocą długości sarkomeru na miocytach o przewlekłym tempie. Jednak funkcja skurczu miocytów szybko się pogarsza, gdy używa się pożywek starszych niż 1 tydzień do stymulacji miocytów.

W przypadku badań funkcji skurczowych dane zbiera się w temperaturze 37 °C, która je...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma (Roche)	3117057001	Stężenie końcowe = 0,2% (w/v)
Glutation	Sigma	G-6529	Stężenie końcowe = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Stężenie końcowe = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 butelka wystarcza na 1 l; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Stężenie końcowe = 4 mM
Penicylina/streptomycyna	Fisher	15140122	Stężenie końcowe = 100 U/ml penicyliny, 100 μ g/ml streptomycyny
ODCZYNNIKI SPECJALNIE DO OBRAZOWANIA Ca2+
dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (sondy molekularne)	F1221	50 μ g / fiolka;   Przygotować roztwór podstawowy 1 mM Fura-2AM + 0,5 M probenicydu w DMSO;   Końcowe stężenie Fura2-AM w pożywkach wynosi  5 μ M
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Dodać 7,2 mg probenicydu (0,5 M) do 1 mM Fura-2AM zapasu; Końcowe stężenie w pożywce wynosi 2,5 mM
MATERIAŁY DO STYMULACJI MIOCYTÓW SZCZURÓW
#1 22  mm2 szklane szkiełka nakrywkowe	Corning	2845-22
3 x 36 cali z gniazdami bananowymi	Pomona Electronics	B-36-2	Rysunek uzupełniający 1, panel C
37oC Inkubator  z 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Rysunek uzupełniający 1, panel E.  Wiele modeli jest odpowiednich
Klasa II A/B3 Szafa bezpieczeństwa biologicznego z lampą UV	Forma	1286	Wiele modeli jest odpowiednich
Kleszcze - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Sterylizator gorących kulek	Fine Science Tools	1800-45
Mikroskop odwrócony o małym powiększeniu	Leica	DM-IL	Umieść ten mikroskop w pobliżu inkubatora, aby monitorować pobudzone miocyty pod kątem skurczu na początku stymulacji i po zmianie pożywki; Zalecane obiektywy 4X i 10X
Komora stymulacji	Niestandardowy		Rysunek uzupełniający 1, panel A. System Ionoptix C-pace jest dostępną na rynku alternatywą lub patrz 22
Stymulator	Ionoptix	Myopacer	Rysunek uzupełniający 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION i/lub Ca2+ ANALIZA OBRAZOWA			ID na rysunku uzupełniającym 2 i Alternatywy/Zalecane opcje Dodatkowe
komponenty do analizy obrazowania Ca2+	Elementy systemu Ionoptix	Essential: -- System zliczania fotonów                      --  Zasilacz ksenonowy z podwójnym źródłem światła wzbudzenia                      --  Interfejs fluorescencji	- System zliczania fotonów zawiera rurkę fotopowielacza (PMT) i zwierciadło dichroiczne i jest zainstalowany obok kamery CCD  (panel A #4).                                                                                                                                          - Zasilanie źródła światła żarówki ksenonowej (patrz panel A #5 i panel C, po lewej) jest zintegrowane z podwójnym interfejsem wzbudzenia (wzbudzenie 340/380 nm i emisja 510 nm) pokazanym na panelu A #6.                                                                                                                                                                                                                                                               - Interfejs fluorescencyjny między komputerem a  źródło światła pokazano na panelu B, #12.
Kamera CCD z akwizycją obrazu  sprzęt i oprogramowanie (240 klatek/s)	Ionoptix	Myocam z kontrolerem CCD	Kontroler Myocam i CCD pokazano na rys. 2, panel A #4  i  odpowiednio panel A #5 i panel C #5 (po prawej).  Sterownik jest zintegrowany z systemem komputerowym PC (panel B #14).
Stymulator komorowy	Ionoptix		Panel Mięśniowy B, #13; Alternatywa:  Trawiasty model S48
Komora perfuzyjna montowana na szkiełku nakrywkowym	Niestandardowa komora do szkiełka nakrywkowego 22 mm2 z silikonowym adapterem i 2-4 Phillips z stożkowym stożkowym #0  (strzałka, panel F)		Panel A #10 i panel F;     Temperatura komory jest kalibrowana do 37oC za pomocą sondy TH-10Km i regulatora temperatury TC2BIP (patrz regulator temperatury).  Alternatywy komercyjne:  Komórka Ionoptix FHD lub C-stim  Komory; System stymulacji hodowli Cell MicroControls
Dedykowany komputer i oprogramowanie do zbierania i analizy danych o stanach nieustalonych funkcji/Ca2+	Ionoptix	PC z płytą PC Ionwizard i oprogramowaniem	Panel B, #14; Funkcja kurczliwości jest mierzona za pomocą modułów akwizycji SarcLen (długość sarkomeru) lub SoftEdge (długość miocytów) oprogramowania IonWizard. Oprogramowanie Ionwizard zawiera również oprogramowanie do akwizycji PMT dla ratiometric  Obrazowanie Ca2+ w mioyctesach załadowanych Fura-2AM. - Do umieszczenia somputera i stymulatora komórkowego zalecana jest 4-słupkowa elektroniczna szafa rackowa i półki.  Interfejs fluorescencyjny do obrazowania Ca2+ również znajduje się w tej szafie (patrz poniżej).
Kleszcze - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Izolowany uchwyt na rurkę do mediów	Niestandardowy		panel A #9; Ten uchwyt można łatwo zmontować za pomocą styropianu i wstępnie podgrzany pakiet żelowy utrzymujący ciepło
podłoża Mikroskop odwróconego jasnego pola	Nikon	TE-2000S	Zainstaluj obrotową wieżyczkę do epi-fluorescencji (Panel A #2) do obrazowania Ca2+.    Zalecany jest również ciemnoczerwony (590 nm) filtr kondensatorowy, aby zminimalizować wybielanie fluorescencyjne podczas obrazowania Ca2+.
Stół izolacyjny	TMC Vibration Control	30 x 36 cali	Panel A, #1; Pożądane:  regały podwyższone, osłona Faradaya
Okulary mikroskopowe i obiektyw	Okulary	Nikon 10X CFI Wodoodporny obiektyw CFI Plan Fluor	Panel A #3; Obiektyw 40X:  n.d. 0,08; w.d. 2 mm.  Grzejnik obiektywowy Cell MicroControls HLS-1 jest zamontowany wokół obiektywu (patrz regulator temperatury poniżej).                  UWAGA:  Dozowniki zanurzeniowe w wodzie są teraz dostępne również dla celów opartych na wodzie.
Pompa perystaltyczna	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 i panel E
mała łódź wagowa	Fisher	08-732-112
Regulator temperatury	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. Ten regulator temperatury podgrzewa komorę szkiełka nakrywkowego do 37oC.      Dla tej platformy zalecany jest podgrzewacz wstępny i grzejnik obiektywowy.  Podgrzewacz Cell MicroControls HPRE2 i  Grzejniki obiektywowe HLS-1 są sterowane  przez regulator temperatury TC2BIP dla naszych badań.
Oświetlenie podszafkowe LED z czujnikiem ruchu	Lampa LED Sylvania	#72423	Zalecana do zbierania danych podczas obrazowania przejściowego Ca2+ przy minimalnym oświetleniu pomieszczenia.   Alternatywa:  Klips latarki / latarki do książki z elastyczną szyjką - dostępnych jest wielu dostawców.
Przewód podciśnieniowy z liniową kolbą Ehrlenmeyera i filtrem ochronnym	Fisher	Tygon - E363;   kolba polipropylenowa Ehrlenmeyer - 10-182-50B; Filtr próżniowy - 09-703-90	Panel A #11