Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca²⁺ w miocytach gryzoni

Analiza funkcji pompy serca często wymaga szeregu podejść w celu uzyskania odpowiedniego wglądu, szczególnie w przypadku zwierzęcych modeli niewydolności serca (HF). Echokardiografia lub pomiary hemodynamiczne dostarczają wglądu w dysfunkcję serca in vivo¹, podczas gdy podejścia in vitro są często stosowane w celu określenia, czy dysfunkcja wynika ze zmian w miofilamentach i/lub transjencie Ca²⁺ odpowiedzialnym za wzbudzenie sprzężenia, czy też potencjału czynnościowego z funkcją skurczu (np. sprzężenie wzbudzenie-skurcz [E-C]). Podejścia in vitro dają również możliwość badania przesiewowego funkcjonalnej odpowiedzi na neurohormony, zmiany genetyczne wywołane przez wektory, a także potencjalne środki terapeutyczne² przed zastosowaniem kosztownych i/lub pracochłonnych strategii leczenia in vivo.

Dostępnych jest kilka podejść do badania funkcji kurczliwości in vitro, w tym pomiary siły w nienaruszonych beleczkach³ lub permeabilized miocytes⁴, a także niezaładowane skracanie i przejściowe Ca²⁺ w nienaruszonych miocytach w obecności i braku HF5^,6. Każde z tych podejść koncentruje się na funkcji skurczowej miocytów serca, która jest bezpośrednio odpowiedzialna za funkcję pompy serca^2,7. Jednak analiza zarówno skurczu, jak i sprzężenia E-C jest najczęściej wykonywana poprzez pomiar skrócenia długości mięśni i stanów przejściowych Ca²⁺ w izolowanych, tolerancyjnych na Ca^{2 +} dorosłych miocytach. Laboratorium wykorzystuje szczegółowy, opublikowany protokół do izolacji miocytów z serc szczurów na tym etapie⁸.

Zarówno przejściowe^Ca2+, jak i miofilamenty przyczyniają się do skracania i ponownego wydłużania nienaruszonych miocytów i mogą przyczyniać się do dysfunkcji kurczliwości^2,7. Dlatego takie podejście jest zalecane, gdy analiza funkcjonalna in vitro wymaga nienaruszonego miocytu zawierającego maszynerię rowerową Ca^{2 +} oraz miofilamenty. Na przykład, nienaruszone izolowane miocyty są pożądane do badania funkcji skurczu po modyfikacji funkcji cyklicznej miofilamentu lub Ca²⁺ poprzez transfer genów⁹. Ponadto sugeruje się podejście oparte na nienaruszonych miocytach do analizy funkcjonalnego wpływu neurohormonów podczas badania wpływu szlaków sygnałowych drugiego przekaźnika i/lub odpowiedzi na środki terapeutyczne². Alternatywny pomiar siły zależnej od obciążenia w pojedynczych miocytach jest najczęściej wykonywany po przepuszczalności błony (lub skórowaniu) w niskich temperaturach (≤15 °C) w celu usunięcia przejściowego wkładu Ca²⁺ i skupienia się na funkcji miofilamentu¹⁰. Pomiar siły zależnej od obciążenia plus stany nieustalone Ca²⁺ w nienaruszonych miocytach jest rzadki, głównie ze względu na złożone i techniczne wyzwanie podejścia¹¹, zwłaszcza gdy potrzebna jest wyższa przepustowość, na przykład do pomiaru odpowiedzi na sygnalizację neurohormonalną lub jako badanie przesiewowe dla środków terapeutycznych. Analiza beleczków serca pozwala przezwyciężyć te wyzwania techniczne, ale może również mieć na nią wpływ brak miocytów, zwłóknienie i/lub przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej². Każde z opisanych powyżej podejść wymaga preparatu zawierającego dorosłe miocyty, ponieważ miocyty noworodków i miocyty pochodzące z indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) nie wyrażają jeszcze pełnego zestawu dorosłych białek miofilamentowych i zwykle brakuje im poziomu organizacji miofilamentów obecnego w dorosłym miocytach w kształcie pałeczek². Dotychczasowe dane w iPSC wskazują, że pełne przejście do dorosłych izoform trwa ponad 134 dni w culture¹².

Biorąc pod uwagę, że ta kolekcja skupia się na HF, protokoły zawierają podejścia i analizy do różnicowania funkcji skurczowej u nieuszkodzonych i nieuszkodzonych miocytów. Reprezentatywne przykłady przedstawiono z miocytów szczurów badanych 18-20 tygodni po koarktacji nadnerkowej, opisanej wcześniej^5,13. Następnie dokonuje się porównań z miocytami szczurów leczonych pozorowo.

Opisany tutaj protokół i platforma obrazowania są używane do analizy i monitorowania zmian w przejściowych skrótach i Ca²⁺ w pręcikowatych miocytach serca podczas rozwoju HF. Na potrzeby tej analizy 2 x 10⁴ tolerancyjne na Ca²⁺, pręcikowe miocyty są powlekane na 22 mm² powlekanych lamininą szklanych szkiełkach nakrywkowych (CS) i hodowane przez noc, jak opisano wcześniej⁸. Komponenty zmontowane dla tej platformy obrazowania, wraz z mediami i używanymi do optymalnego obrazowania, znajdują się w Tabeli Materiałów. Dostępny jest również przewodnik dotyczący analizy danych za pomocą oprogramowania oraz reprezentatywne wyniki. Ogólny protokół jest podzielony na oddzielne podsekcje, przy czym pierwsze trzy sekcje koncentrują się na izolowanych miocytach szczurów i analizie danych, a następnie na przejściowych eksperymentach komórkowych Ca^{2 +} i analizie danych w miocytach.

Badania przeprowadzone na gryzoniach były zgodne z Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan. Na potrzeby tego badania miocyty wyizolowano od 3-34-miesięcznych szczurów Sprague-Dawley i F344BN o wadze ≥ 200 g⁵. Zastosowano zarówno stawki męskie, jak i żeńskie.

1. Stymulacja miocytów w badaniach funkcji skurczu

1. Przygotuj świeże pożywki na bazie M199 dla każdego zestawu izolowanych miocytów (tabela materiałów). 1 dzień przed stymulacją, płytka 2 x 10⁴ tolerancyjne na Ca²⁺, pręcikowe miocyty na 22 mm² szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (CS), jak opisano wcześniej⁸.
2. Aby przygotować komory, namocz każdą komorę w 10% wybielaczu przez 1 godzinę. Następnie płucz komory bieżącą wodą z kranu przez 30-45 minut, następnie wodę destylowaną wymieniaj co 5 minut przez 30 minut, a następnie wodę dejonizowaną wymieniaj co 5 minut przez 30 minut i końcowe płukanie w wodzie dejonizowanej.
3. Suszyć komory na czystej powierzchni przez 20-30 minut (rysunek uzupełniający 1A-C). Następnie poddaj komory działaniu promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 5 minut w każdym kierunku (łącznie = 20 minut). Ten krok nie jest wymagany w przypadku komór wstępnie wysterylizowanych.
   UWAGA: Opuść obszar, aby zminimalizować ekspozycję na promieniowanie UV.
4. Zdejmij pokrywę z komory, dodaj 3 ml pożywki na bazie M199 (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki (rysunek uzupełniający 1B), załóż pokrywę i podgrzej komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i 20% O_{2 .}
5. Sterylizuj kleszcze w sterylizatorze z gorącymi kulkami w temperaturze 250 °C przez 20-25 s. Przenieś podgrzaną komorę stymulacji z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.
6. Przenieś każde szkiełko nakrywkowe (CS) zawierające miocyty serca do poszczególnych studzienek w komorze stymulacji za pomocą sterylnych kleszczy. Przenoś CS po cztery na raz, a następnie podgrzewaj przez 10 minut przed przeniesieniem pozostałych czterech CS, aby utrzymać temperaturę mediów.
7. Przymocuj podnośniki bananowe do komory stymulacji z jednej strony (rysunek uzupełniający 1C), a z drugiej do stymulatora (rysunek uzupełniający 1D).
8. Ustaw częstotliwość stymulatora na 0,2 Hz i ustaw napięcie (~12 V), aby osiągnąć skurcz w ~10%-20% wszystkich miocytów serca w kształcie pręcików w studzience. Aby określić liczbę kurczących się miocytów, umieść komorę pod odwróconym mikroskopem o powiększeniu od 4x do 10x.
9. Umieścić komorę stymulacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ (rysunek uzupełniający 1E). Zmieniaj pożywkę co 12 godzin, używając pożywki podgrzanej w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 20-25 minut. Kontynuuj stymulację elektryczną do 3 dni z wymianą pożywki co 12 godzin.

2. Analiza funkcji kurczliwości miocytów serca dorosłego szczura

1. Przed eksperymentem podgrzej żel i pożywkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
2. Włącz elementy platformy funkcji kurczliwości wymienione w tabeli materiałów i pokazane na rysunku uzupełniającym 2, zwracając szczególną uwagę na kluczowe elementy, do których należą stół antywibracyjny (rysunek uzupełniający 2A-1) z odwróconym mikroskopem z filtrem ciemnoczerwonym (590 nm) (rysunek uzupełniający 2A-2,3) i kamerą CCD (rysunek uzupełniający 2A-4) podłączoną do kontrolera CCD (Rysunek uzupełniający 2A-5 i rysunek uzupełniający 2C-5) oraz zintegrowany z komputerem PC (rysunek uzupełniający 2B-14).
3. Zamontować rurkę w pompie perystaltycznej (rysunek uzupełniający 2A-8; Rysunek uzupełniający 2A-8), przenieś podgrzany pakiet żelu do uchwytu probówki (rysunek uzupełniający 2A-9) i włącz próżnię (rysunek uzupełniający 2A-11) i zasilanie stymulatora komórkowego (rysunek uzupełniający 2B-13).
4. Umieść probówkę o pojemności 50 ml z pożywką w izolowanym uchwycie probówki (rysunek uzupełniający 2A-9) i rozpocznij perfuzję z prędkością ~0,5 ml / min przez rurkę pompy perystaltycznej (rysunek uzupełniający 2E-8).
5. Dodaj niewielką ilość podgrzanego podłoża do małej łódki wagowej (~2 ml). Przenieść jeden CS zawierający miocyty z komory stymulacyjnej do łodzi wagowej. Przywrócić temperaturę komory stymulacji do 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2
.
6. Wyjmij CS z łodzi wagowej i delikatnie wytrzyj spód. Przenieś CS do świeżo natłuszczonej komory CS (rysunek uzupełniający 2A, F-10; strzałka) i delikatnie dodaj kroplę pożywki (~200 μL) na CS.
7. Umieść platynowy uchwyt elektrody na CS (rysunek uzupełniający 2F; szara strzałka) i połóż nowy CS na górze za pomocą kleszczy. Umieść górne mocowanie (rysunek uzupełniający 2F; biała strzałka) nad kanapką CS, a następnie wkręć dwie lub cztery z stożkowym stożkowym stożkowym stożkowym #0, aby zakończyć montaż komory.
8. Gdy media znajdą się w przewodach pompy, podłącz rurkę do podgrzewacza, a następnie podłącz podgrzewacz do komory CS zmontowanej w kroku 2.7. Rozpocznij perfuzję od 0,5 ml/min i umieść chusteczkę chusteczkową pod komorą, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
9. Umieść komorę CS w stage adapter. Perfaktoryzowane media są zbierane na przeciwległym końcu komory za pomocą rurki podłączonej do systemu próżniowego. Włącz system grzewczy (rysunek uzupełniający 2A, D-7) i zrównoważ komorę, obiektyw i podgrzewacz przez ~5-10 minut, aby osiągnąć stałą temperaturę medium 37 °C. Wizualizuj miocyty za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzenia w wodzie pod mikroskopem w tym czasie równowagi.
10. Aktywuj stymulator stymulacji (rysunek uzupełniający 2B-13), ustawiając napięcie na 1,5 raza większe niż ustawienie potrzebne do skurczenia się 80% komórek w kształcie pręcików, co zwykle wynosi 35-40 V. Ustaw częstotliwość stymulacji na 0,2 Hz, aby zoptymalizować funkcję skurczu i przeżycie miocytów.
11. Zbierz ślady skracania i ponownego wydłużania skurczu z miocytów poddanych ciągłej perfuzji i stymulacji. Do zbierania pomiarów skracania należy użyć kamery CCD (rysunek uzupełniający 2A-4) podłączonej do sterownika CCD (rysunek uzupełniający 2B-5,C) oraz dedykowanego komputera z płytką kontrolera I/O (rysunek uzupełniający 2B-14; patrz tabela materiałów). Platforma mierzy skrócenie sarkomeru w miocytach szczurów, chociaż podobne wyniki uzyskuje się z pomiarów miocytów pobranych z podłużnych krawędzi miocytów (patrz Ecklerle et al.¹⁴).
12. Aby zebrać ślady skracania sarkomeru, otwórz oprogramowanie na komputerze, wybierz OK, a następnie Plik > Nowy. Przygotuj szablon ekranu, wybierając opcję Ślady > Edytuj limity użytkownika > długości sarkomeru, a następnie ustawiając wartości maksymalne i minimalne, które zwykle mieszczą się w zakresie od 2,0 μm do 1,5 μm. Skalibruj kamerę CCD za pomocą siatki 0,01 mm przed wykonaniem pomiarów w miocytach (Rysunek 1D).
13. Aby zarejestrować ślady długości sarkomeru, wybierz opcję Plik > Nowy. Zidentyfikuj kurczący się miocyt i umieść miocyt wzdłuż osi podłużnej aparatu, tak aby wzór prążkowania był pionowy (Rysunek 1B).
14. Użyj myszy komputerowej, aby umieścić pole obszaru zainteresowania (ROI) (różowe pole) nad miocytami (Rysunek 1C). Wybierz opcję Zbierz i Rozpocznij, aby zarejestrować funkcję skurczu. Zapisuj skracanie przez 60 s z każdego miocytu przy niskich częstotliwościach stymulacji (≤0,5 Hz).
15. Zapisz skrócenie sarkomeru od 5-10 komórek na CS. Wykonaj pomiary przy 1 komórce/CS, jeśli badania obejmują leczenie agonistami/antagonistami. Przygotuj oddzielne wstępnie podgrzane podłoże i inny, dedykowany kawałek rurki perfuzyjnej załadowany do wielokanałowej pompy perystaltycznej i postępuj zgodnie z krokami 2.9.-2.14. do pomiaru wpływu dostarczania leków lub neurohormonów na funkcję skurczową miocytów.
16. Aby zmierzyć skrócenie w zakresie częstotliwości, nadaj tempo miocytom przy każdej częstotliwości, aby uzyskać skrócenie w stanie ustalonym przed nagraniem⁵. W przypadku tych badań należy podwoić szybkość perfuzji i rozpocząć rejestrację 15-20 s po stymulacji z nową częstotliwością, aby uzyskać spójne odpowiedzi skurczowe w stanie ustalonym dla częstotliwości w zakresie 0,2 Hz i 2 Hz. Zazwyczaj rejestruj nie więcej niż 2 miocyty / CS w celu skrócenia w danym zakresie częstotliwości stymulacji.
17. Zapisz co najmniej 7 skurczów na komórkę, aby uzyskać wiarygodne dane uśrednione sygnałem podczas analizy nagrań (patrz krok 3.).

3. Analiza danych funkcji skurczowej w izolowanych miocytach

1. Aby rozpocząć, wybierz pozycję Plik, wybierz zarejestrowany ślad, a następnie wybierz pozycję Otwórz. Wybierz Tab 1 (lewa strona) śladu podstawowego, a następnie ustaw żółty panel w górnej części ścieżki na Sarc-Length. Wybierz opcję Ślady i szablon ekranu przygotowany w kroku 2.12.
2. Aby przygotować szablon analizy, wybierz Operacje, Opcje monotonnej analizy stanów nieustalonych, Znacznik zdarzenia TTL w polu Definicja t0, a także następujące opcje z menu: Linia bazowa (spoczynkowa długość sarkomeru), Prędkość odlotu względem t0 (dep v), Szczyt (wysokość piku i %wysokość szczytu/linia bazowa lub bl%szczyt h), Prędkość powrotu względem tPeak (ret v), Czas do osiągnięcia szczytu 50% (TTP_50%) przy użyciu t0 i czas do punktu odniesienia 50% (TTR_50%) przy użyciu tPeak. Zapisz te opcje analizy, wybierając opcję Szablony > Zapisz szablon analizy z identyfikatorem. Załaduj ten szablon analizy przed analizą każdego śladu.
3. Aby rozpocząć analizę danych, wybierz opcję Znaczniki > bramie > Dodaj stan przejściowy > Konwertuj ze znacznika zdarzenia > zakresu analizy. Teraz ustaw zakres czasu od -0,01 s do 1,20 s dla miocytów w tempie 0,2 Hz (Rysunek 2A, czerwone znaki w dolnej części surowego śladu). Wybierz krótszy zakres czasu dla miocytów stymulowanych wyższymi częstotliwościami.
4. Utwórz ślad uśredniony według sygnału, wybierając pozycję Operacje > Średnia liczba zdarzeń. Nagranie uśrednione sygnałem pojawia się poniżej oryginalnej ścieżki podstawowej.
5. Wybierz pozycję Tab 1 uśrednionego sygnału (po lewej stronie ekranu), a następnie wybierz pozycję Znaczniki w górnym menu, a następnie pozycję Dodaj stan przejściowy. Wybierz Operacje z górnego menu i Monotoniczna analiza stanów nieustalonych, aby wyświetlić uśrednione wartości sygnału dla podstawowej długości sarkomeru, wysokości piku, bl% peak h, dep v, ret v, TTP_50% i TTR_50% w panelu wyświetlania uśrednionego sygnału.
6. Przenieś każdą analizę stanów przejściowych sarkomeru do arkusza kalkulacyjnego w celu złożonej analizy wielu miocytów, wybierając opcję Eksportuj > Monotoniczną analizę stanów nieustalonych > Prąd schowka. Wklej te dane do arkusza kalkulacyjnego dla każdego śladu.
7. Aby skopiować ślad uśredniony > sygnału, wybierz opcję Eksportuj bieżący ślad > Opcje schowka > i ustaw liczbę miejsc dziesiętnych na 5, a następnie wybierz opcję Ogranicznik tabulatorów i kliknij przycisk OK, a następnie przycisk OK. Wklej uśrednione sygnałowo ślady dla każdego zapisu miocytów do drugiego arkusza kalkulacyjnego.

4. Rejestrowanie stanów przejściowych Ca²⁺ w miocytach serca dorosłych szczurów

1. Przed pomiarem stanów nieustalonych Ca²⁺ włącz komponenty platformy opisane w kroku 2.2 wraz z dodatkowymi komponentami obrazowania fluorescencyjnego (patrz dodatkowe komponenty do analizy obrazowania Ca²⁺ w Tabeli materiałów; Rysunek uzupełniający 2A-5,6; 2B-12).
2. Przygotować roztwór podstawowy Fura-2AM zawierający 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probenecyd w dimetylosulfotlenku (DMSO). Probenecyd minimalizuje wyciek Fura-2AM¹⁵.
3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do 5 μM Fura-2AM i 2,5 mM probenecydu w 2,5 ml pożywki (patrz tabela materiałów) w jednym dołku na płytce 6-dołkowej. Dodać 2,5 ml samej pożywki (bez Fura-2AM) do trzech dodatkowych studzienek w płytce, przykryć płytkę folią aluminiową i podgrzać pożywkę do 37 °C.
4. Przenieść CS zawierający miocyty z komory stymulacyjnej do studzienki zawierającej Fura-2AM, przykryć i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 4 minuty. Zamontować rurkę w pompie perfuzyjnej i perfaktorować pożywką w okresie ładowania Fura-2AM, jak opisano w kroku 2.4.
5. Wyłącz lub zminimalizuj oświetlenie w pomieszczeniu, aby zmniejszyć fotowybielanie fluorescencyjne i zoptymalizować sygnał fluorescencji. Wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora, a następnie umyć CS przez 10 sekund w każdym z trzech dołków zawierających samą pożywkę. Przenieś CS do małej łodzi wagowej zawierającej wstępnie podgrzane podłoże (bez dodatku Fura-2AM).
6. Zamontuj CS w świeżo nasmarowanej komorze CS po delikatnym wytarciu spodu CS. Delikatnie dodaj kroplę nośnika do CS, a następnie zamontuj mocowanie elektrody nad CS, a następnie drugi CS i górne mocowanie. Użyj z stożkowym stożkowym stożkowym #0, aby zakończyć montaż komory ogniwa, zgodnie z opisem w krokach 2.6.-2.7.
7. Podłącz rurkę pompy wypełnioną mediami do podgrzewacza, podłącz podgrzewacz do komory CS i umieść w stage adapter, jak opisano w kroku 2.8. Zebrać media za pomocą systemu przewodów próżniowych i włączyć system grzewczy (rysunek uzupełniający 2A,D-7), aby wyrównać temperaturę komory do 37°C, jak opisano w krokach 2.8.-2.9.
8. Aktywuj stymulator stymulacji (rysunek uzupełniający 2B-13) ustawiony na 35-40 V i 0.2 Hz, jak opisano w kroku 2.10.
9. Przed nagraniem stanu przejściowego Ca²⁺ włącz małą latarkę lub latarkę do książek zamontowaną w pobliżu klawiatury komputera, aby pomóc zobaczyć klawiaturę. Ponadto zapisz tło fluorescencyjne w obszarze bez miocytów serca. Aby rozpocząć, wybierz pozycję Plik > Rozpocznij > Nowy, zgodnie z opisem w kroku 2.12.
10. Wybierz ROI i ustaw jedną zakładkę (lub pasek śledzenia, po lewej stronie) dla surowego licznika i drugą zakładkę dla surowego mianownika, zdefiniowaną w górnej środkowej części każdej karty. Nagrywaj tło przez 10-20 s. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij nad jednym panelem paska śledzenia, aby uzyskać surowe wartości licznika i mianownika uśrednione dla sygnału. Wprowadź te wartości, wybierając Operacje > Stałe, a następnie wprowadź wartości nieprzetworzone.
11. Przygotuj nowy szablon ekranu, aby zebrać zarówno skróty, jak i stany nieustalone Ca²⁺. W przypadku długości sarkomeru wybierz zakładkę 1 i użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 2.13. W przypadku obrazowania Ca²⁺ wybierz opcję Tab 2 > Ratio (górny środek karty) > Ślady > Edytuj limity użytkowników, aby ustawić minimalne i maksymalne poziomy współczynnika, które są zwykle ustawiane w zakresie od 1 do 5. Użyj tego samego procesu, aby zdefiniować zakresy licznika i mianownika dla kart 3 i 4 (po lewej stronie).
12. Umieść pole ROI na obrazie miocytów, zgodnie z opisem w kroku 2.14. Wybierz pozycję File (Plik> Nowy > zbierz. Teraz wybierz Start, aby zebrać dane skracania i ratiometryczne Ca²⁺. Rejestruj skurcze ≥7 na komórkę w celu analizy uśrednionej sygnału.
13. Powtórz zapis śladu tła opisany w kroku 4.10 po zarejestrowaniu 2-4 miocytów. Zazwyczaj zapisuj 4-5 miocytów/CS lub mniej miocytów, jeśli występują znaczące zmiany w odczycie tła.

5. Analiza danych stanów przejściowych Ca²⁺ w izolowanych miocytach.

1. Otwórz żądany plik do analizy i wybierz Szablony > Szablon ekranu do skracania oraz stany nieustalone Ca²⁺. Następnie wybierz zakładki 1 i 2 (po lewej), aby pokazać odpowiednio długość sarkomeru i stosunek Ca²⁺. Wybierz Operacje > Stałe i wprowadź wartości licznika i mianownika ze śladu tła Ca²⁺.
2. Przygotuj szablony analizy do skracania oraz dane przejściowe Ca²⁺. Wybierz kartę 1 (po lewej stronie) i użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 3.2. , aby ustawić szablon analizy długości sarkomeru.
3. Wybierz zakładkę 2 (po lewej stronie) i wybierz Operacje, Opcje monotonnej analizy stanów nieustalonych, znacznik zdarzenia TTL w polu Definicja t0 oraz następujące opcje z menu: Linia bazowa (stosunek podstawowy), Prędkość odlotu względem t0 (dep v), Szczyt (wysokość piku i %wysokość szczytu/linia bazowa lub bl%szczyt h), Prędkość zaniku względem tPeak (ret v), Czas do osiągnięcia szczytu 50% (TTP_50%) przy użyciu t0 i czas do punktu odniesienia 50% (TTR_50%) przy użyciu tPeak. Zapisz te opcje analizy, wybierając Szablony i Zapisz szablon analizy przy użyciu nowej nazwy identyfikatora. Załaduj ten szablon analizy przed analizą każdego śladu.
4. Użyj tego samego procesu, jak opisano w krokach 3.3.-3.6., aby uśrednić sygnał, a następnie przeanalizować długość sarkomeru, a następnie wykonaj te same kroki dla stanów nieustalonych Ca²⁺. Ustaw osobne znaczniki dla długości sarkomeru i dla śladu współczynnika stanów przejściowych Ca²⁺.

Badania funkcji skurczu są przeprowadzane na miocytach szczurów począwszy od następnego dnia po izolacji (dzień 2) do 4 dni po izolacji. Chociaż miocyty mogą być rejestrowane dzień po izolacji (tj. w dniu 2), po transferze genów lub leczeniu często wymagane są dłuższe czasy hodowli w celu modyfikacji funkcji skurczu8. W przypadku miocytów hodowanych przez ponad 18 godzin po izolacji, protokół stymulacji opisany w punkcie 1 pomaga utrzymać kanaliki T i spójne wyniki skracania i ponownego wydłużania.

Reprezentatywna część CS zawierająca miocyty do skracania badań jest pokazana w Rysunek 1A, wraz z odpowiednio ustawionym miocytem przed ustawieniem ROI (Rysunek 1B). Po zidentyfikowaniu ROI (Rysunek 1C; różowe pole), informacje algorytmu pokazane poniżej miocytów pomagają również zoptymalizować pozycjonowanie miocytów przed rejestracją. W szczególności liniowa gęstość optyczna (LOD; linia) jest wskaźnikiem liczby i odstępów między sarkomorami, a ostre widmo mocy w szybkiej ścieżce transformaty Fouriera (FFT, czerwona linia) pomaga osiągnąć optymalne wyrównanie dla zapisu skracania i ponownego wydłużania. Wzór siatki używany do kalibracji długości sarkomeru (i wykrywania krawędzi) jest pokazany w Rysunek 1D. Typowy wyrównany zapis skracania długości sarkomeru jest pokazany w Rysunek 2A (górny panel), wraz z analizą uśrednionego sygnału opisaną w sekcji 3 (dolny panel).

Dysfunkcja jest często wykrywana w miocytach, podczas gdy dysfunkcja in vivo występuje w modelach zwierzęcych. Na przykład dysfunkcja skurczowa obserwowana przez echokardiografię w odpowiedzi na przeciążenie ciśnieniem (PO)13 jest również wykrywana w badaniach skracania miocytów5. Aby zilustrować ślady danych, reprezentatywne surowe (Rysunek 2; górny panel) i uśrednione sygnałem (Rysunek 2; dolny panel) ślady uzyskane przy 0,2 Hz pokazano dla miocytów szczurów pozorowanych (Rysunek 2A) i PO-traktowanych (Figura 2B). Aby sprawdzić, czy funkcja miocytów może zostać uratowana po PO, transfer genów za pośrednictwem wirusa w czasie izolacji miocytów został również wykorzystany do zastąpienia endogennej sercowej troponiny I (cTnI) fosfo-mimetyczną substytucją cTnI T144D (T144D) w klasie sarkomeru16. Wstępna analiza wykazała, że wywołane przez PO zmniejszenie funkcji skurczowej (Tabela 1, górny panel) powróciło do pozorowanych poziomów w miocytach PO 4 dni po transferze genu cTnIT144D (Tabela 1; dolny panel).

Ta platforma może być również używana do pomiaru stanów przejściowychCa2+, wraz ze skracaniem izolowanych miocytów. Skrócenie i Ca2+ nie zostały zarejestrowane po PO, ponieważ PO zmniejsza przyleganie miocytów szczura do lamininy13, a porównywalny model wcześniej wykazał, że zmienione obchodzenie się z Ca2+ rozwija się w podobnym punkcie czasowym17. Zamiast tego przeprowadzono reprezentatywne eksperymenty na miocytach załadowanych Fura-2AM wyizolowanych od 2-3-miesięcznych szczurów. Reprezentatywny zapis i uśrednione sygnały są pokazane w Rysunek 3, wraz z analizą danych w Tabeli 2. W tym zestawie eksperymentów badano miocyty wyizolowane od dorosłych szczurów 4 dni po transferze genów za pośrednictwem adenowirusa (mnogość infekcji = 100) cTnIT144D lub cTnI typu dzikiego. Zarówno skrócenie sarkomeru, jak i stany nieustalone Ca2 + mierzono po załadowaniu miocytów Fura-2AM. Transfer genu cTnIT144D poprawił skrócenie pików i podwyższony rozkurczowy poziom Ca2+ w porównaniu z cTnI w tych początkowych badaniach (Tabela 2). Chociaż potrzebna jest bardziej obszerna analiza, wstępne wyniki sugerują, że zastąpienie in vivo cTnIT144D może spowodować złożony fenotyp serca ze względu na zmiany zarówno w funkcji skurczu, jak i obchodzeniu się z Ca2+ w czasie.

Rysunek 1: Miocyty serca dorosłego szczura wykorzystane do badań funkcjonalnych. (A) Reprezentatywne izolowane miocyty serca od dorosłego szczura (podziałka = 50 μm). Strzałka wskazuje reprezentatywny miocyt zobrazowany do analizy funkcji skurczu. (B) Reprezentatywny miocyt z ROI (różowy) znajdujący się z boku (podziałka = 20 μm). (C) Reprezentatywny miocyt z ROI (górny panel), wzór sarkomerowy dla tego miocytu (dolny panel, niebieski; pasek skali = 20 μm) i ostry szczyt widma mocy (dolny panel, czerwony). (D) Zrzut ekranu siatki 0,01 mm w celu kalibracji pomiarów skracania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne nagrania z miocytów szczura. Surowy zapis (górny panel) i uśredniony sygnał (dolny panel) ślad zarejestrowany przy 0,2 Hz w miocytach od szczurów leczonych (A) pozorowanym i (B) przeciążeniem ciśnieniowym (PO). Miocyty izolowano 18-20 tygodni po operacji, a PO wyprodukowano metodą koarktacji nadnerkowej13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywny zapis i analiza długości sarkomeru (SL) i stanów przejściowych Ca2+ z dorosłych miocytów sercowych załadowanych Fura-2AM. (A) Surowe ślady dla SL, stosunek (stosunek) przejściowy Ca2+ oraz ślady licznika i mianownika użyte do wytworzenia współczynnika przejściowego Ca2+. (B) Przykład uśrednionych sygnałowo śladów dla SL (górna ścieżka) i współczynnika przejściowego Ca2+ (dolna ścieżka). (C) Ślady są analizowane pod kątem długości sarkomeru (SL) i stosunku przejściowego Ca2+ przy użyciu algorytmu śledzenia monotonicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie funkcji skurczu miocytów serca w odpowiedzi na przeciążenie ciśnieniowe (PO) i transfer genów. Wyniki skracania miocytów pochodzą z pozorowanych i PO szczurzych serc 18-20 tygodni po operacji (górny panel)5,13 i miocytów od szczurów pozorowanych i PO 4 dni po transferze genu cTnIT144D (dolny panel). Funkcja skurczu jest mierzona 4 dni po izolacji miocytów/transferze genów we wszystkich grupach. Wyniki są wyrażone jako średnia ± SEM (n = liczba miocytów). Każdy zestaw danych fikcyjnych i PO jest porównywany za pomocą testu t-Studenta, przy czym *p < 0,05 jest uważane za statystycznie istotne. Wyniki amplitudy pików dla samych miocytów pozorowanych i PO zostały zgłoszone wcześniej w Ravichandran et al.5.

Tabela 2: Funkcja skurczu i stany przejściowe Ca2+ w miocytach dorosłych szczurów 4 dni po transferze genu cTnIT144D. Przedstawiono analizę funkcji skurczowej (górny panel) i stanów przejściowych Ca2+ (dolny panel) w miocytach po transferze genu cTnIT144D w porównaniu z cTnI typu dzikiego. Miocyty izoluje się od 2-3-miesięcznych dorosłych szczurów, a dane przedstawiono jako średnią ± SEM (n = liczba miocytów). Statystyczne porównania funkcji skurczu (po lewej) i stanów przejściowych Ca2+ (po prawej) są wykonywane przy użyciu niesparowanego testu t Studenta o istotności ustawionej na *p < 0,05.

Rysunek uzupełniający 1: Elementy systemu stymulacji dla miocytów platerowanych na CS pokrytych lamininą. (A) Niestandardowa komora stymulująca zawierająca elektrody platynowe w każdej komorze. (B) Komora stymulacji z pierwszymi czterema komorami wypełnionymi pożywką. (C) Komora stymulacyjna podpięta do przewodów typu banana-jack, które są podłączone do komory oraz (D) stymulatora. (E) Połączenie pomiędzy stymulatorem (po prawej) a inkubatorem o temperaturze 37 °C (po lewej). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Składniki potrzebne do pomiaru funkcji kurczliwości miocytów i/lub pomiarów przejściowych Ca2+. (A) Platforma funkcji kurczliwości przedstawiająca każdy komponent, z ponumerowanymi pozycjami wyjaśnionymi bardziej szczegółowo w tabeli materiałów. Komponenty platformy obejmują stół antywibracyjny (#1), mikroskop odwróconego jasnego pola (#2,3), kamerę CCD (#4), kontroler CCD i zasilacz ksenonowy (#4), źródło światła o podwójnej emisji (#7), regulator temperatury (#7), pompę perystaltyczną (#7), izolowany uchwyt rurki (#1), komorę perfuzyjną montowaną na szkiełku nakrywkowym (#10) i system próżniowy (#11). (B) Dodatkowe podzespoły obejmują interfejs fluorescencji (#12), stymulator komory (#13), oraz komputer PC (#14), które wyjaśnione są bardziej szczegółowo w Tabeli Materiałów. Zbliżenia ponumerowanych elementów w panelu A są pokazane w C-F. (C) Widok zasilacza ksenonowego (po lewej) i sterownika CCD (po prawej). (D) Regulator temperatury. (E) Pompa perystaltyczna. (F) Widok podstawy komory perfuzyjnej CS (strzałka), mocowania elektrody platynowej (szara strzałka), oraz mocowania góry (biała strzałka) ze z stożkowym stożkowym stożkowym #0. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.