Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Summary

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca²⁺) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Abstract

Dysfunkcja skurczowa i przejściowe stany Ca²⁺ są często analizowane na poziomie komórkowym jako część kompleksowej oceny uszkodzeń i/lub przebudowy wywołanych przez serce. Jednym z podejść do oceny tych zmian funkcjonalnych jest nieobciążone skracanie i analizy przejściowe Ca^{2 +} w pierwotnych dorosłych miocytach serca. W tym podejściu dorosłe miocyty są izolowane przez trawienie kolagenazy, uzyskuje tolerancję Ca²⁺, a następnie przykleja się do szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą, a następnie następuje stymulacja elektryczna w pożywce wolnej od surowicy. Ogólny protokół wykorzystuje miocyty serca dorosłych szczurów, ale można go łatwo dostosować do miocytów pierwotnych innych gatunków. Zmiany funkcjonalne w miocytach z uszkodzonych serc można porównać do miocytów pozorowanych i/lub do leczenia in vitro. Metodologia obejmuje podstawowe elementy potrzebne do stymulacji miocytów, a także elementy komory komórkowej i platformy. Szczegółowy protokół dla tego podejścia obejmuje etapy pomiaru nieobciążonego skrócenia za pomocą detekcji długości sarkomeru i komórkowych stanów przejściowych Ca²⁺ mierzonych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego Fura-2 AM, a także do analizy surowych danych.

Introduction

Analiza funkcji pompy serca często wymaga szeregu podejść w celu uzyskania odpowiedniego wglądu, szczególnie w przypadku zwierzęcych modeli niewydolności serca (HF). Echokardiografia lub pomiary hemodynamiczne dostarczają wglądu w dysfunkcję serca in vivo¹, podczas gdy podejścia in vitro są często stosowane w celu określenia, czy dysfunkcja wynika ze zmian w miofilamentach i/lub transjencie Ca²⁺ odpowiedzialnym za wzbudzenie sprzężenia, czy też potencjału czynnościowego z funkcją skurczu (np. sprzężenie wzbudzenie-skurcz [E-C]). Podejścia in vitro dają również możliwość badania przesiewowego funkcjonalnej o....

Protocol

Badania przeprowadzone na gryzoniach były zgodne z Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan. Na potrzeby tego badania miocyty wyizolowano od 3-34-miesięcznych szczurów Sprague-Dawley i F344BN o wadze ≥ 200 g⁵. Zastosowano zarówno stawki męskie, jak i żeńskie.

1. Stymulacja miocytów w badaniach funkcji skurczu

1. Przygotuj świeże pożywki na bazie M199 dla każdego zestawu izolowanych miocytów (tabela materiałów). 1 dzień....

Results

Badania funkcji skurczu są przeprowadzane na miocytach szczurów począwszy od następnego dnia po izolacji (dzień 2) do 4 dni po izolacji. Chociaż miocyty mogą być rejestrowane dzień po izolacji (tj. w dniu 2), po transferze genów lub leczeniu często wymagane są dłuższe czasy hodowli w celu modyfikacji funkcji skurczu⁸. W przypadku miocytów hodowanych przez ponad 18 godzin po izolacji, protokół stymulacji opisany w punkcie 1 pomaga utrzymać kanaliki T i spójne wyniki skracania i ponownego wydłużania.......

Discussion

Protokół przewlekłej stymulacji opisany w kroku 1 wydłuża użyteczny czas badania izolowanych miocytów i oceny wpływu dłuższych terapii. W naszym laboratorium spójne wyniki uzyskano do 4 dni po izolacji, mierząc funkcję skurczu za pomocą długości sarkomeru na miocytach o przewlekłym tempie. Jednak funkcja skurczu miocytów szybko się pogarsza, gdy używa się pożywek starszych niż 1 tydzień do stymulacji miocytów.

W przypadku badań funkcji skurczowych dane zbiera się w temperaturze 37 °C, która je.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma (Roche)	3117057001	Stężenie końcowe = 0,2% (w/v)
Glutation	Sigma	G-6529	Stężenie końcowe = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Stężenie końcowe = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 butelka wystarcza na 1 l; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Stężenie końcowe = 4 mM
Penicylina/streptomycyna	Fisher	15140122	Stężenie końcowe = 100 U/ml penicyliny, 100 μ g/ml streptomycyny
ODCZYNNIKI SPECJALNIE DO OBRAZOWANIA Ca2+
dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (sondy molekularne)	F1221	50 μ g / fiolka;   Przygotować roztwór podstawowy 1 mM Fura-2AM + 0,5 M probenicydu w DMSO;   Końcowe stężenie Fura2-AM w pożywkach wynosi  5 μ M
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Dodać 7,2 mg probenicydu (0,5 M) do 1 mM Fura-2AM zapasu; Końcowe stężenie w pożywce wynosi 2,5 mM
MATERIAŁY DO STYMULACJI MIOCYTÓW SZCZURÓW
#1 22  mm2 szklane szkiełka nakrywkowe	Corning	2845-22
3 x 36 cali z gniazdami bananowymi	Pomona Electronics	B-36-2	Rysunek uzupełniający 1, panel C
37oC Inkubator  z 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Rysunek uzupełniający 1, panel E.  Wiele modeli jest odpowiednich
Klasa II A/B3 Szafa bezpieczeństwa biologicznego z lampą UV	Forma	1286	Wiele modeli jest odpowiednich
Kleszcze - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Sterylizator gorących kulek	Fine Science Tools	1800-45
Mikroskop odwrócony o małym powiększeniu	Leica	DM-IL	Umieść ten mikroskop w pobliżu inkubatora, aby monitorować pobudzone miocyty pod kątem skurczu na początku stymulacji i po zmianie pożywki; Zalecane obiektywy 4X i 10X
Komora stymulacji	Niestandardowy		Rysunek uzupełniający 1, panel A. System Ionoptix C-pace jest dostępną na rynku alternatywą lub patrz 22
Stymulator	Ionoptix	Myopacer	Rysunek uzupełniający 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION i/lub Ca2+ ANALIZA OBRAZOWA			ID na rysunku uzupełniającym 2 i Alternatywy/Zalecane opcje Dodatkowe
komponenty do analizy obrazowania Ca2+	Elementy systemu Ionoptix	Essential: -- System zliczania fotonów                      --  Zasilacz ksenonowy z podwójnym źródłem światła wzbudzenia                      --  Interfejs fluorescencji	- System zliczania fotonów zawiera rurkę fotopowielacza (PMT) i zwierciadło dichroiczne i jest zainstalowany obok kamery CCD  (panel A #4).                                                                                                                                          - Zasilanie źródła światła żarówki ksenonowej (patrz panel A #5 i panel C, po lewej) jest zintegrowane z podwójnym interfejsem wzbudzenia (wzbudzenie 340/380 nm i emisja 510 nm) pokazanym na panelu A #6.                                                                                                                                                                                                                                                               - Interfejs fluorescencyjny między komputerem a  źródło światła pokazano na panelu B, #12.
Kamera CCD z akwizycją obrazu  sprzęt i oprogramowanie (240 klatek/s)	Ionoptix	Myocam z kontrolerem CCD	Kontroler Myocam i CCD pokazano na rys. 2, panel A #4  i  odpowiednio panel A #5 i panel C #5 (po prawej).  Sterownik jest zintegrowany z systemem komputerowym PC (panel B #14).
Stymulator komorowy	Ionoptix		Panel Mięśniowy B, #13; Alternatywa:  Trawiasty model S48
Komora perfuzyjna montowana na szkiełku nakrywkowym	Niestandardowa komora do szkiełka nakrywkowego 22 mm2 z silikonowym adapterem i 2-4 Phillips z stożkowym stożkowym #0  (strzałka, panel F)		Panel A #10 i panel F;     Temperatura komory jest kalibrowana do 37oC za pomocą sondy TH-10Km i regulatora temperatury TC2BIP (patrz regulator temperatury).  Alternatywy komercyjne:  Komórka Ionoptix FHD lub C-stim  Komory; System stymulacji hodowli Cell MicroControls
Dedykowany komputer i oprogramowanie do zbierania i analizy danych o stanach nieustalonych funkcji/Ca2+	Ionoptix	PC z płytą PC Ionwizard i oprogramowaniem	Panel B, #14; Funkcja kurczliwości jest mierzona za pomocą modułów akwizycji SarcLen (długość sarkomeru) lub SoftEdge (długość miocytów) oprogramowania IonWizard. Oprogramowanie Ionwizard zawiera również oprogramowanie do akwizycji PMT dla ratiometric  Obrazowanie Ca2+ w mioyctesach załadowanych Fura-2AM. - Do umieszczenia somputera i stymulatora komórkowego zalecana jest 4-słupkowa elektroniczna szafa rackowa i półki.  Interfejs fluorescencyjny do obrazowania Ca2+ również znajduje się w tej szafie (patrz poniżej).
Kleszcze - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Izolowany uchwyt na rurkę do mediów	Niestandardowy		panel A #9; Ten uchwyt można łatwo zmontować za pomocą styropianu i wstępnie podgrzany pakiet żelowy utrzymujący ciepło
podłoża Mikroskop odwróconego jasnego pola	Nikon	TE-2000S	Zainstaluj obrotową wieżyczkę do epi-fluorescencji (Panel A #2) do obrazowania Ca2+.    Zalecany jest również ciemnoczerwony (590 nm) filtr kondensatorowy, aby zminimalizować wybielanie fluorescencyjne podczas obrazowania Ca2+.
Stół izolacyjny	TMC Vibration Control	30 x 36 cali	Panel A, #1; Pożądane:  regały podwyższone, osłona Faradaya
Okulary mikroskopowe i obiektyw	Okulary	Nikon 10X CFI Wodoodporny obiektyw CFI Plan Fluor	Panel A #3; Obiektyw 40X:  n.d. 0,08; w.d. 2 mm.  Grzejnik obiektywowy Cell MicroControls HLS-1 jest zamontowany wokół obiektywu (patrz regulator temperatury poniżej).                  UWAGA:  Dozowniki zanurzeniowe w wodzie są teraz dostępne również dla celów opartych na wodzie.
Pompa perystaltyczna	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 i panel E
mała łódź wagowa	Fisher	08-732-112
Regulator temperatury	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. Ten regulator temperatury podgrzewa komorę szkiełka nakrywkowego do 37oC.      Dla tej platformy zalecany jest podgrzewacz wstępny i grzejnik obiektywowy.  Podgrzewacz Cell MicroControls HPRE2 i  Grzejniki obiektywowe HLS-1 są sterowane  przez regulator temperatury TC2BIP dla naszych badań.
Oświetlenie podszafkowe LED z czujnikiem ruchu	Lampa LED Sylvania	#72423	Zalecana do zbierania danych podczas obrazowania przejściowego Ca2+ przy minimalnym oświetleniu pomieszczenia.   Alternatywa:  Klips latarki / latarki do książki z elastyczną szyjką - dostępnych jest wielu dostawców.
Przewód podciśnieniowy z liniową kolbą Ehrlenmeyera i filtrem ochronnym	Fisher	Tygon - E363;   kolba polipropylenowa Ehrlenmeyer - 10-182-50B; Filtr próżniowy - 09-703-90	Panel A #11