Artykuł metodologiczny

Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

DOI:

10.3791/64056

⸱

7 czerwca 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje test określający odpowiedź na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów acetylocholiny Caenorhabditis elegans. W tym płynnym teście pływania z lewamizolem naukowcy wizualnie obserwują i określają ilościowo zależny od czasu paraliż zwierząt hodowanych na 24-dołkowych płytkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na skrzyżowaniu nerwowo-mięśniowym (NMJ), wiązanie pobudzającego neuroprzekaźnika acetylocholiny (ACh) z receptorami postsynaptycznymi prowadzi do skurczu mięśni. Podobnie jak w mięśniach szkieletowych kręgowców, do poruszania się wymagana jest sygnalizacja cholinergiczna w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego Caenorhabditis elegans. Narażenie na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów ACh na mięśniach ściany ciała, powoduje zależny od czasu paraliż zwierząt typu dzikiego. Zmieniona wrażliwość na lewamizol sugeruje defekty w sygnalizacji w NMJ lub funkcji mięśni. W tym miejscu przedstawiono protokół testu płynnego lewamizolu przeprowadzonego na C. elegans hodowanych na płytkach 24-dołkowych. Energiczne pływanie zwierząt w płynie pozwala na ocenę i ilościowe określenie paraliżu wywołanego lewamizolem u setek robaków w ciągu jednej godziny bez konieczności fizycznej manipulacji. Procedura ta może być stosowana zarówno w przypadku dzikich typów, jak i mutantów, które mają zmienioną wrażliwość na lewamizol, aby zademonstrować funkcjonalne konsekwencje zmienionej sygnalizacji w NMJ.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywacja postsynaptycznych receptorów acetylocholiny (AChR) na mięśniach szkieletowych powoduje sygnał elektryczny, który prowadzi do skurczu mięśni. Zaburzenie funkcji nerwowo-mięśniowej powoduje powstawanie zespołów miastenicznych i dystrofii mięśniowych u ludzi1,2,3,4. Nicienie Caenorhabditis elegans były szeroko wykorzystywane do poznawania ewolucyjnie zachowanych podstawowych procesów biologicznych i mechanizmów chorób. Mięśnie szkieletowe kręgowców i mięśnie ściany ciała C. elegans są funkcjonalnie równoważne w kontroli lokomocji5. Tutaj przedstawiono prosty test, który można wykorzystać do porównania C. elegans typu dzikiego z mutantami, które mają zmienioną sygnalizację nerwowo-mięśniową lub funkcję mięśni.

Pobudzające i hamujące dane wejściowe otrzymywane odpowiednio z cholinergicznych i GABA-ergicznych neuronów ruchowych powodują kurczenie się mięśni po jednej stronie ciała C. elegans, podczas gdy mięśnie po drugiej stronie rozluźniają się, umożliwiając skoordynowaną lokomocję6. Lewamizol, środek przeciwrobaczy stosowany w leczeniu infekcji pasożytniczych nicieni, wiąże się i konstytutywnie aktywuje jedną klasę AChR na mięśniach ściany ciała, powodując paraliż zależny od czasu7. W ten sposób zmieniona wrażliwość na lewamizol może być wykorzystana do identyfikacji C. elegans z defektami w równowadze sygnalizacji pobudzającej i hamującej7,8,9,10,11,12,13,14,15. Na przykład mutacje w podjednostkach wrażliwego na lewamizol AChR (L-AChR), takich jak UNC-63, a także homolog C. elegans Cubiliny, LEV-10, który jest wymagany do grupowania L-AChR w synapsie, wpływają na sygnalizację pobudzającą i powodują oporność na lewamizol7,8. Mutacje w receptorze GABAA UNC-49 zmniejszają sygnalizację hamującą i powodują nadwrażliwość na lewamizol12.

Nadwrażliwość lub odporność na lewamizol była tradycyjnie oceniana poprzez przenoszenie zwierząt na płytki agarowe zawierające lewamizol, a następnie regularne szturchanie robaków w celu określenia punktu czasowego, w którym następuje paraliż13,14,15. Opracowaliśmy płynny test pływania z lewamizolem, który eliminuje potrzebę fizycznej manipulacji zwierzętami i pozwala na badanie przesiewowe setek zwierząt w ciągu zaledwie 1 godziny. Tutaj opisano zastosowanie tego testu ze zwierzętami typu dzikiego, UNC-63 (x26), LEV-10 (x17) i UNC-49 (E407). Jednak protokół ten można również przeprowadzić na C. elegans wystawionych na działanie RNAi, tak jak zrobiono to w celu walidacji knockdownów zidentyfikowanych w badaniu przesiewowym RNAi całego genomu pod kątem zmienionej wrażliwości na lewamizol11.

Dla tego testu farmakologicznego, robaki hodowano do dorosłości na 24-dołkowych płytkach, do każdej studzienki dodawano 0,4 mM lewamizolu w buforze M9, a liczba poruszających się zwierząt była rejestrowana co 5 minut przez 1 godzinę. Paraliż wywołany lewamizolem był wizualnie obserwowany w czasie, a po zakończeniu testu, dane zostały określone ilościowo. Ocena mutantów wraz z C. elegans typu dzikiego pozwala uczniom najpierw przewidzieć potencjalne skutki fenotypowe, a następnie przeprowadzić eksperymenty w celu przetestowania swoich hipotez. Podsumowując, ten prosty, niedrogi, płynny test lewamizolu jest idealnym sposobem na wykazanie wpływu utraty określonych genów na funkcję NMJ.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytek do testu lewamizolu

  1. Przygotować pożywkę dla nicieni (NGM), łącząc 3 g NaCl, 2,5 g peptonu i 17 g agaru z 1 litrem wody dejonizowanej (DI) w kolbie z mieszadłem.
  2. Po sterylizacji w autoklawie umieścić podłoże na płycie grzejnej ustawionej na 70 °C i mieszać z umiarkowaną prędkością przez 1 godzinę.
  3. Dodaj kroplami 1 ml cholesterolu 5 mg / ml, aby zapobiec wytrącaniu się, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 i 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu o pH 6,0 do pożywki.
  4. Przenieś 2 ml pożywki NGM do każdej studzienki 24-dołkowej płytki za pomocą sterylnej pipety serologicznej (Rysunek 1).
  5. Pozostaw talerze do wyschnięcia na blacie na 2 dni przed wysiewem z bakteriami. W przypadku długotrwałego przechowywania należy je umieścić w temperaturze 4 °C.
  6. Umieść OP50 E. coli na talerzu bulionu lizogenicznego (LB) i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C.
  7. Pobrać pojedynczą kolonię OP50 do bulionu B (10 g tryptonu i 5 g NaCl w 1 L DI H2O) i ustawić kulturę na wstrząs w temperaturze 37 °C przez noc.
  8. Za pomocą sterylnej pipety upuść 30 μl zawiesiny OP50 na agar w środku każdej studzienki (Rysunek 1).
    UWAGA: Pamiętaj, aby nie uszkodzić powierzchni agaru, ponieważ doprowadzi to do zakopywania się robaków.
  9. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 dni po wysianiu, aby umożliwić utworzenie się bakteryjnego trawnika.
    UWAGA: Jeśli bakterie w środkowych studzienkach nie wyschną po 2 dniach, pozostaw płytki otwarte w okapie na 20 minut (Rysunek 1). Płytki należy wylać i wysiać bakteriami na 1-2 tygodnie przed testem.

2. Synchronizacja C. elegans (dzień 1)

  1. Uprawiaj C. elegans typu dzikiego, unc-63(x26), lev-10(x17) i unc-49(e407) C. elegans do dorosłości na 6 cm płytkach, przygotowując co najmniej osiem płytek na szczep. Upewnij się, że na talerzach znajduje się wiele niewygłodzonych, gravidowych dorosłych.
    UWAGA: Jest to dwa razy więcej talerzy niż potrzeba; Jednak ważne jest, aby mieć zapasowe płytki na wypadek, gdyby pierwsza partia jaj została zniszczona podczas bielenia.
  2. Przygotować 10x bufor M9, rozpuszczając 59,6 g Na2HPO4 (dwuzasadowy), 29,9 g KH2PO4 (jednozasadowy), 12,8 g NaCl i 2,5 gMgSO4 w 750 ml wody DI mieszając. Po rozpuszczeniu zwiększyć objętość do 1 l i wysterylizować filtrem. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 i przelać w autoklawie, aby uzyskać 1x bufor M9.
    UWAGA: Bufor 1x M9 może być wykonany z tygodniowym lub miesięcznym wyprzedzeniem.
  3. Przygotuj roztwór wybielający pod maską w dniu synchronizacji. Wymieszaj 10 ml wybielacza (tabela materiałów), 2,5 ml 10 N NaOH i 37,5 ml wody DI w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Noś okulary, rękawice i fartuch laboratoryjny podczas pracy z roztworem wybielającym.
  4. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przemyć ciężarne dorosłe robaki z co najmniej czterech płytek za pomocą 1x buforu M9 i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Wirować w temperaturze 716 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant za pomocą pipety transferowej.
  6. Dodać 10 ml roztworu wybielającego. Odwróć lub delikatnie potrząsaj probówką przez ~4 minuty, aż większość, ale nie wszystkie, tuszki robaków się rozpuszczą (Rysunek 1).
    UWAGA: Uważaj, aby nie przesadzić z robakami, ponieważ zniszczy to jaja. Niektóre mutacje mogą zwiększać trudność izolacji komórek jajowych.
  7. Wirować z prędkością 716 x g przez 1 min.
  8. Wylej roztwór wybielacza jednym ruchem; dopóki probówka nie zostanie w tym momencie wstrząśnięta, jajka przykleją się do boku tubki.
  9. Dodaj 15 ml 1x buforu M9 i odwróć. Wirować w temperaturze 716 x g przez 1 minutę i jednym płynnym ruchem odlewać bufor M9.
  10. Wykonaj łącznie trzy mycia z 1x buforem M9, jak opisano w kroku 2.9.
  11. Po ostatnim płukaniu dodać 10 ml świeżego 1x M9 i umieścić na noc w rotatorze w temperaturze 15 °C, aby wyizolować zsynchronizowaną populację wygłodzonych zwierząt w stadium larwalnym (L1).
    UWAGA: Przed umieszczeniem na rotatorze sprawdź, czy w buforze M9 znajdują się jaja. Jeśli nie, powtórz przygotowanie z zapasowymi płytkami i wybielaczem przez krótszy czas.

3. Poszycie zsynchronizowane C. elegans (dzień 2)

  1. Wydrukuj 24-dołkową mapę płytek i przypisz szczepy do losowych miejsc. Każdy szczep powinien być reprezentowany na płytce 24-dołkowej co najmniej sześć razy.
  2. Około 24 godziny po przygotowaniu wybielacza, wykluć wyklute, wygłodzone robaki L1 w buforze M9 o stężeniu 716 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć ~9 ml buforu M9 za pomocą plastikowej pipety transferowej, a następnie delikatnie wymieszać zagłodzone pierwsze robaki w stadium larwalnym (L1) w pozostałym buforze M9.
  4. Natychmiast odpipetować 3 μl robaków w buforze M9 na szkiełko mikroskopowe i określić liczbę L1; pożądana liczba to 20-30 L1 w 3 μL. Odkręć i usuń M9, jeśli stężenie robaka jest zbyt niskie, i dodaj M9, jeśli stężenie jest zbyt wysokie.
    UWAGA: Sprawdź liczbę robaków na 3 μL co najmniej 2x, za każdym razem odwracając probówkę.
  5. Odpipetuj 3 μl L1 (łącznie 20-30 robaków) do każdej studzienki zgodnie z wcześniej przygotowaną mapą płytową (krok 3.1; Rysunek 1).
    UWAGA: Często odwracaj rurkę z L1 w M9, aby utrzymać równomierny rozkład robaków, ponieważ osiądą one na dnie. Jeśli nie zostanie to zrobione, niektóre studnie będą miały za mało robaków, podczas gdy inne będą miały ich za dużo. Nie należy również przekłuwać agaru końcówką pipety, ponieważ spowoduje to zakopanie się zwierząt.
  6. Pozwól robakom rosnąć do dorosłości przez 3 dni w temperaturze 20 °C.
    UWAGA: Stosowanie różnych temperatur wzrostu i niektórych mutacji może wpływać na szybkość dojrzewania, więc należy wziąć pod uwagę cykl życiowy C. elegans.

4. Wykonywanie testu na obecność lewamizolu (dzień 5)

  1. Wydrukuj pusty arkusz danych, który będzie używany do rejestrowania liczby robaków poruszających się w każdej studzience co 5 minut przez 1 godz.
    UWAGA: Uczniowie będą mogli policzyć robaki w maksymalnie 12 dołkach co 5 minut. Pierwsze 12 dołków jest oznaczanych w pierwszej godzinie, a dolne 12 dołków jest oznaczanych w następnej godzinie.
  2. Sprawdź robaki w płytkach 24-dołkowych. Za pomocą markera zrób "X" na pokrywie talerza nad wszystkimi studzienkami, które są zanieczyszczone, głodują lub mają zbyt wiele robaków (>40), co utrudni liczenie.
  3. Przygotować 0,4 mM roztworu lewamizolu, dodając 200 μl 100 mM bulionu lewamizolu do 50 ml 1x M9. Przygotować 100 mM bulionu lewamizolu, rozpuszczając 240,76 mg chlorowodorku lewamizolu w 10 mlH2Oi przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Lewaizol należy rozcieńczyć w M9; rozcieńczenie wH2Oprzyspiesza paraliż. Uczniowie powinni nosić rękawiczki. Spożycie wysokich stężeń lewamizolu jest toksyczne.
  4. Uruchom stoper, a następnie, za pomocą pipety transferowej, dodaj 1 ml 0,4 mM lewamizolu do pierwszych dwóch studzienek, tak aby zwierzęta mogły swobodnie pływać. Kontynuuj dodawanie lewamizolu do sąsiednich studzienek, rozkładając czas w zależności od liczby studzienek, które mają być badane.
    UWAGA: Na przykład, jeśli testuje się 10 studzienek, lewamizol zostanie dodany w następujący sposób: studzienki 1 i 2 w czasie 0, studzienki 3 i 4 po 1 minucie, studzienki 5 i 6 po 2 minutach, studzienki 7 i 8 po 3 minutach, a studzienki 9 i 10 po 4 minutach.
  5. Po 5 minutach zacznij ręcznie liczyć tylko liczbę poruszających się robaków w każdym dołku, zaczynając od pierwszego dołka, i zapisz tę liczbę w arkuszu danych (Rysunek 1). Liczniki mogą być używane, ale nie są wymagane do dokładnego określenia liczby poruszających się robaków.
    UWAGA: Uczniowie muszą pilnować licznika czasu, ponieważ czasami zostaną w tyle we wczesnych punktach czasowych, zanim wiele robaków sparaliżuje. W razie potrzeby można dostosować liczbę punktów czasowych lub w razie potrzeby w każdym punkcie czasowym można oznaczyć mniejszą liczbę dołków.
  6. Kontynuuj liczenie poruszających się robaków w każdym studzience co 5 minut przez 1 godz.
    UWAGA: Zanurzenie w M9 wywołuje ciągły ruch pływacki w trakcie tego 1-godzinnego testu, co eliminuje potrzebę szturchania robaków w celu oceny paraliżu (Rysunek 2A). Narażenie na 0,4 mM roztworu lewamizolu wywołuje paraliż zależny od czasu, który obserwuje się po zaprzestaniu pływania; Robaki, które paraliżują, nie wracają do zdrowia.
  7. Powtórz kroki 4.4.-4.6. dla pozostałych dołków w płycie.
  8. Na końcu testu lub gdy czas na to pozwala, należy zanotować całkowitą liczbę robaków w każdym dołku.

5. Analiza danych

  1. Uzyskać mapę płyt (krok 3.1) i zapisać, które odkształcenie odpowiada każdej studzience.
    UWAGA: Ze względu na ilość zebranych danych, późniejsza analiza i omówienie danych zajmie co najmniej kilka godzin.
  2. Wprowadź dane do arkusza kalkulacyjnego, zaczynając od całkowitej liczby robaków w każdej studzience i porządkując je według genotypu.
  3. Łącząc dane z odwiertów, określ liczbę robaków poruszających się w każdym punkcie czasowym dla każdego szczepu.
  4. Wykorzystaj te dane do stworzenia "krzywej przeżycia" w oprogramowaniu statystycznym (Tabela materiałów), aby wizualnie przedstawić zależny od czasu paraliż populacji (Rysunek 2B).
  5. Utwórz tabelę danych w taki sposób, aby kolumna po lewej stronie wskazywała czas, a kolejne kolumny zawierały dane dla każdego szczepu. Dla każdego zwierzęcia, które zostanie sparaliżowane w ciągu pierwszych 5 minut, utwórz rząd i wprowadź "1" na 5 minut. Powtórz to dla każdego punktu czasowego. W przypadku wszystkich zwierząt, które nie zostaną sparaliżowane do końca testu, wprowadź "0" na 60 minut.
  6. Wykonaj porównania parami za pomocą testu logarytmicznego (Mantela-Coxa) w oprogramowaniu statystycznym (Tabela materiałów), aby określić, czy istnieje statystycznie istotna różnica między dwoma różnymi szczepami.
  7. W przypadku dodatkowej/alternatywnej analizy, zamiast wykonywać kroki 5.3 i 5.4, należy określić odsetek zwierząt poruszających się w każdym dołku w każdym punkcie czasowym. Wykreśl średnią z błędem standardowym w każdym punkcie czasowym dla wszystkich szczepów testowanych za pomocą arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego (Rysunek 2C).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja za pomocą receptorów AChRs i GABA pozwala mięśniom po jednej stronie ciała C. elegans kurczyć się, podczas gdy mięśnie po drugiej stronie rozluźniają się, umożliwiając skoordynowaną lokomocję6,16. Wiązanie lewamizolu z jonotropowym L-AChR powoduje skurcz, co prowadzi do zależnego od czasu paraliżu zwierząt typu dzikiego. Tutaj oceniliśmy wrażliwość typu dzikiego, mutanta unc-63 L-AChR, mutanta grupującego L-AChR lev-10 i mutanta receptora unc-49 GABAA C. elegans na lewamizol. Mutacje w podjednostkach L-AChR, a także w genach wymaganych do transportu L-AChR do błony plazmatycznej mięśni, grupowania postsynaptycznych L-AChR i dalszej sygnalizacji Ca2+, powodują odporność na paraliż wywołany lewamizolem7,8,9,10,11,16,17, jak zaobserwowano w mutantach unc-63 i lev-10 (Rysunek 2B,C). Utrata kanału jonowego bramkowanego GABA UNC-49 spowodowała nadwrażliwość na lewamizol (Rysunek 2B,C) z powodu zakłócenia właściwej równowagi sygnalizacji cholinergicznej i GABA-ergicznej12. Kiedy ten test został niedawno przeprowadzony przez studentów w zaawansowanym laboratorium genetycznym, 100% studentów zaobserwowało oporność na lewamizol w przypadku mutantów unc-63 i lev-10, podczas gdy 88% zaobserwowało nadwrażliwość na lewamizol w przypadku mutanta unc-49. Dane zebrane za pomocą testu pływania z płynnym lewamizolem są zgodne z fenotypami obserwowanymi w tradycyjnych testach lewamizolu na płytkach7,8,11,12,13.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przygotowania i wdrożenia testu lewamizolu. Wylewane są 24-dołkowe płytki NGM; 2 dni później OP50 Escherichia coli zostaje wysiana do studzienek. C. elegans są synchronizowane poprzez przygotowanie wybielacza i pierwsze stadium larwalne (L1) zwierząt dla każdego szczepu, który ma być badany (typ dziki,; UNC-63(x26), purpurowy; LEW-10(x17), zielony; UNC-49(E407), niebieski) są pipetowane do studzienek zgodnie z wcześniej ustaloną mapą płytkową następnego dnia. Po 3 dniach wzrostu w temperaturze 20 ºC lub gdy zwierzęta osiągną dorosłość, do każdej studzienki dodaje się 0,4 mM lewamizolu w buforze M9, a liczbę poruszających się zwierząt liczy się co 5 minut przez 1 godzinę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Paraliż wywołany przez lewamizol u dzikiego typu i reprezentatywnego mutanta C. elegans. (A) Narażenie na 0,4 mM lewamizolu powoduje paraliż zależny od czasu; Nie obserwuje się tego u zwierząt pływających w buforze 1x M9 przez 1 godzinę. (B) Zależny od czasu paraliż zwierząt typu dzikiego (), UNC-63(x26) (magenta), LEV-10(x17) (zielony) i UNC-49(E407) (niebieski) w teście pływania lewamizolu. Utrata podjednostki L-AChR UNC-63 lub białka grupującego L-AChR LEV-10 powodowała oporność na lewamizol, a utrata receptora GABAA UNC-49 powodowała nadwrażliwość na lewamizol. n ≥ 50 na genotyp, p < 0,0001 dla wszystkich mutantów w porównaniu z typem dzikim w tym reprezentatywnym doświadczeniu. (C) Korzystając z tych samych danych, co w panelu (B), dla każdego szczepu określono odsetek przemieszczających się zwierząt w każdym punkcie czasowym (średnia z procentów dla każdego dołka ± SE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmieniona odpowiedź na lewamizol może zidentyfikować geny wymagane do postsynaptycznej sygnalizacji cholinergicznej i funkcji mięśni. Niniejszy protokół opisuje test płynnego lewamizolu stosowany do ilościowego oznaczania paraliżu zależnego od czasu w okresie 1 godziny. Uczniowie dokonują przewidywań dotyczących skutków pewnych mutacji genetycznych, przeprowadzają eksperyment na dużej próbie, a następnie oceniają ilościowo swoje wyniki. Ten test jest prostym i skutecznym sposobem ilościowego oznaczania paraliżu wywołanego lewamizolem bez wybierania lub szturchania zwierząt, dzięki czemu nadaje się do laboratoriów licencjackich, a także naukowców zajmujących się przekaźnictwem nerwowo-mięśniowym. Omówiono tutaj niektóre z najczęstszych pułapek, ograniczenia testu oraz odmianę protokołu, która umożliwia jego stosowanie u zwierząt z nokautem RNAi; Omówiono tutaj również, w jaki sposób ten test można osadzić w doświadczeniu badawczym opartym na kursie licencjackim.

Niezbędne jest prawidłowe przygotowanie płytek 24-dołkowych. Po pierwsze, trawniki bakteryjne muszą być całkowicie suche, zanim zauważy się zwierzęta L1 w studniach. Jeśli nie zostaną wystarczająco wysuszone, bakterie mieszają się z roztworem lewamizolu podczas testu, zmieniając płyn w mętny i uniemożliwiając osobnikom policzenie robaków. Po drugie, podczas synchronizacji robaków za pomocą preparatu wybielającego, zwierzęta nie mogą być zbyt długo wystawione na działanie roztworu wybielacza, ponieważ spowoduje to rozpad powłoki ochronnej na jajach. Po trzecie, ważne jest, aby dostrzec tylko 20-30 L1 na odwiert, ponieważ zbyt wiele robaków w studniach niezwykle utrudnia dokładne policzenie liczby poruszających się w wyznaczonym czasie. Wreszcie, ważne jest, aby zachować technikę aseptyczną podczas przygotowywania płytek, ponieważ nie można zbadać zanieczyszczonych studni.

Istnieje kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania tego testu. Po pierwsze, liczenie liczby poruszających się robaków w każdym dołku co 5 minut może być przytłaczające dla osób, które nie mają wcześniejszego doświadczenia laboratoryjnego, a to może prowadzić do nieprecyzyjnego zbierania danych. Jeśli chodzi o inne testy stosowane do określania wrażliwości leku 18,19, eksperyment ten można przeprowadzić z mniejszą liczbą punktów czasowych. Po drugie, posiewanie wygłodzonych L1 wyizolowanych z preparatu wybielającego jest łatwą metodą uzyskania zsynchronizowanej populacji; Należy jednak dokonać dostosowań, jeśli czas rozwoju różni się między badanymi szczepami. Do tego testu możliwe jest pobranie zwierząt w późnym czwartym stadium larwalnym (L4) na 24-dołkową płytkę; Jednak przy przygotowywaniu wielu talerzy jest to zbyt pracochłonne. Alternatywnie, należy określić czas potrzebny każdemu szczepowi do osiągnięcia L4, a następnie umieścić L1 w studzienkach w różnym czasie, aby dostosować się do różnic w szybkości dojrzewania. Wreszcie, podczas gdy test ten może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów ważnych dla postsynaptycznej funkcji mięśni11, zmieniona odpowiedź lewamizolu może być również spowodowana mutacją lub knockdownem RNAi genów presynaptycznych12. W przypadku zaobserwowania zmienionej wrażliwości lewamizolu, należy przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu ustalenia przyczyny tego fenotypu.

Dokonując kilku modyfikacji w 24-dołkowych płytkach, opisany test pływania lewamizolu można również przeprowadzić na zwierzętach z nokautem RNAi11. Nokaut genów przez RNAi można osiągnąć poprzez karmienie bakterii C. elegans, które wyrażają dwuniciowe RNA odpowiadające genowi będącemu przedmiotem zainteresowania20. Do przygotowania płytek RNAi należy dodać 1 ml 1M IPTG i 1 ml 25 mg/ml karbenicyliny na litr pożywki po wyjęciu z autoklawu. Kultury bakteryjne hoduje się, wybierając pojedynczą kolonię do 3 ml bulionu LB plus 3 μl 25 mg/ml karbenicyliny i wytrząsając w temperaturze 37 °C przez noc, a mapa płytki jest tworzona, gdy różne bakterie zostaną zauważone w studzienkach. C. elegans są synchronizowane przez preparat wybielający zgodnie z opisem; jednak szczep eri-1 (mg366) nadwrażliwy na RNAi powinien być stosowany zamiast typu dzikiego, aby zwiększyć knockdown genu. Knockdowny RNAi skutkują tymi samymi fenotypami lewamizolu, które obserwuje się w przypadku mutantów utraty funkcji11.

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany w badaniach laboratoryjnych, jako samodzielny eksperyment w laboratorium licencjackim lub w pierwszych tygodniach zaawansowanego kursu licencjackiego jako wprowadzenie do podstawowych technik C . elegans i funkcji nerwowo-mięśniowych. Na bardziej zaawansowanym kursie opartym na odkryciach studenci mogą użyć tego testu, aby określić, czy utrata homologów genów C. elegans zmutowanych u osób z zespołami miastenicznymi, dystrofiami mięśniowymi lub miopatiami zmienia wrażliwość na lewamizol. Podsumowując, ten prosty, niedrogi test wrażliwości na lewamizol zapewnia praktyczne podejście do nauki sygnalizacji w NMJ i zdobywania doświadczenia w pracy z systemem modelowym C. elegans .

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Riyi Dattani i Lauren Hogstrom, które zebrały dane na rysunku 2B,C ślepe na genotyp w BISC413 Advanced Genetics Laboratory (wiosna 2022) na Uniwersytecie Delaware. Dodatkowe informacje na temat BISC413 doświadczenia badawczego opartego na kursach licencjackich (CURE), a także dostęp do podręcznika laboratoryjnego zaprojektowanego przez J. Tanisa, są dostępne na życzenie. Szczepy nicieni zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest wspierane przez NIH-ORIP (P40 OD010440). Praca ta została wsparta nagrodą P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (dla J.E.T.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
60 mm bez wentylacji, ostra krawędź Szalki PetriegoTriTech ResearchCat #: T3308
BD Difco Bacto AgarFisher Scientific Cat#: DF0140-01-0
BioLite 24 Well MultidishFisher ScientificCat#: 12-556-006
Dwuwodny chlorek wapniaFisher ScientificCat#: BP510-500
CholesterolMP BiomedicalsKot#: 02101382-CF
em>eri-1(MG366)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)GR1373
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificCat#: DF0118-17-0
Gibco Bacto TryptoneFisher Scientific Kot#: DF0123-17-3
GraphPad Prism (oprogramowanie statystyczne)GraphPad Software, Inc.
lev-10(x17)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)ZZ17
Chlorowodorek lewamizoluFisher ScientificCat#: AC187870100
Zwykły wybielacz o niskim rozprysku - 121 uncji - w górę i w góręWyszukiwanie celówtarget.com
Siarczan magnezu siedmiowodnyFisher ScientificCat#: BP213-1
Microsoft ExcelMicrosoft, Inc
N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2
OP50 E. coliCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher Scientific Cat#: BP363-1
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificKot #: BP362-500
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificCat#: BP358-1
Wodorotlenek sodu 10NFisher ScientificKot#: SS255-1
Fosforan sodu dwuzasadowyFisher ScientificCat#: BP332-1
unc-49(e407)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)CB407
unc-63(x26)Genetyki Caenorhabditis (CGC)ZZ26
< typu dzikiego Bristol Centrum

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
  2. Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
  3. Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
  4. Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
  5. Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
  6. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
  7. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
  8. Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
  9. Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
  10. Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
  11. Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047(2021).
  12. Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
  13. Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
  14. Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
  15. Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
  16. Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
  17. Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
  18. Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
  19. Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400(2017).
  20. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wra liwo na lewamisolz cze nerwowo mi niowep ynny test lewamisolowyparali mi nisygnalizacja cholinergicznap ytki 24 do kowewyciszanie RNAisygnalizacja GABAergiczna

Powiązane artykuły