Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64059

⸱

11 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje dwupunktowe wstrzykiwanie lizofosfatydylocholiny przez ramkę stereotaktyczną w celu wygenerowania stabilnego i powtarzalnego modelu demielinizacji u myszy.

Streszczenie

Sygnalizacja lizofosfolipidowa za pośrednictwem receptorów przyczynia się do patofizjologii różnych chorób neurologicznych, zwłaszcza stwardnienia rozsianego (SM). Lizofosfatydylocholina (LPC) jest endogennym lizofosfolipidem związanym ze stanem zapalnym i może wywoływać szybkie uszkodzenia z toksycznością lipidów mielinowych, prowadząc do ogniskowej demielinizacji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół stereotaktycznego dwupunktowego wstrzyknięcia LPC, który może bezpośrednio spowodować ciężką demielinizację i szybko i stabilnie odtworzyć eksperymentalne uszkodzenie demielinizacyjne u myszy za pomocą zabiegu chirurgicznego. W związku z tym model ten ma duże znaczenie dla chorób demielinizacyjnych, zwłaszcza stwardnienia rozsianego, i może przyczynić się do związanych z tym postępów w badaniach klinicznych. Zastosowano również metody immunofluorescencji i szybkiego barwienia na niebiesko Luxol, aby zobrazować przebieg czasowy demielinizacji ciała modzelowatego u myszy, którym wstrzyknięto LPC. Ponadto metodę behawioralną wykorzystano do oceny funkcji poznawczych myszy po modelowaniu. Ogólnie rzecz biorąc, dwupunktowe wstrzyknięcie lizofosfatydylocholiny przez ramkę stereotaktyczną jest stabilną i powtarzalną metodą generowania modelu demielinizacji u myszy do dalszych badań.

Wprowadzenie

Sygnalizacja lizofosfolipidowa za pośrednictwem receptorów obejmuje różnorodne procesy fizjologiczne prawie wszystkich układów narządowych1. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) sygnalizacja ta odgrywa kluczową rolę w patogenezie autoimmunologicznych chorób neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). Stwardnienie rozsiane jest przewlekłym zaburzeniem o podłożu immunologicznym, charakteryzującym się patologiczną demielinizacją i reakcją zapalną, powodującą dysfunkcję neurologiczną i upośledzenie funkcji poznawczych2,3. Po ciągłym nawrocie i remisji we wczesnej fazie choroby, większość pacjentów ostatecznie przechodzi do etapu wtórnie postępującego, co może spowodować nieodwracalne uszkodzenie mózgu i wynikającą z tego niepełnosprawność4. Uważa się, że patologiczną cechą charakterystyczną przebiegu wtórno-postępującego są blaszki demielinizacyjne spowodowane zmianami zapalnymi5. Istniejące metody leczenia stwardnienia rozsianego mogą znacznie zmniejszyć ryzyko nawrotu choroby. Jednak nadal nie ma skutecznej terapii długotrwałych uszkodzeń demielinizacyjnych spowodowanych przez postępujące MS6. W związku z tym do badania przedklinicznych terapii, które koncentrują się na zwyrodnieniu istoty białej, wymagany jest stabilny i łatwo odtwarzalny model.

Demielinizacja i remielinizacja to dwa główne procesy patologiczne w rozwoju stwardnienia rozsianego. Demielinizacja to utrata osłonki mielinowej wokół aksonów wywołana przez mikroglej o fenotypach prozapalnych7, która prowadzi do powolnego przewodzenia impulsów nerwowych i powoduje utratę neuronów oraz zaburzenia neurologiczne. Remielinizacja jest endogenną reakcją naprawczą, w której pośredniczą oligodendrocyty, w której zaburzenia mogą prowadzić do neurodegeneracji i upośledzenia funkcji poznawczych8. Reakcja zapalna ma kluczowe znaczenie dla całego procesu, wpływając zarówno na stopień uszkodzenia mieliny, jak i na jej naprawę.

Dlatego stabilny model zwierzęcy uporczywej demielinizacji zapalnej jest znaczący dla dalszego badania strategii terapeutycznych dla SM. Ze względu na złożoność stwardnienia rozsianego, stworzono różne typy modeli zwierzęcych naśladujących zmiany demielinizacyjne in vivo, w tym eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE), modele toksyczno-demielinizacyjne, cuprizone (CPZ) i lizofosfatydylocholina (LPC)9. LPC jest endogennym lizofosfolipidem związanym ze stanem zapalnym i może wywoływać szybkie uszkodzenia z toksycznością lipidów mielinowych, prowadząc do ogniskowej demielinizacji. Na podstawie wcześniejszych raportów i badań10,11, przedstawiono szczegółowy protokół wstrzykiwania dwupunktowego z pewnymi modyfikacjami. Ogólnie rzecz biorąc, klasyczny jednopunktowy model iniekcji LPC powoduje tylko miejscową demielinizację w miejscu wstrzyknięcia i często towarzyszy jej spontaniczna remielinizacja12,13. Jednak model LPC z dwupunktowym wstrzyknięciem może wykazać, że LPC może bezpośrednio indukować demielinizację w ciele modzelowatym myszy i powodować trwalszą demielinizację przy niewielkiej regeneracji mieliny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Instytutu Opieki nad Zwierzętami Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Chiny. Do niniejszego badania wykorzystano dorosłe samce i samice myszy C57BL/6 (typ dziki, WT; 20-25 g; 8-10 tygodni). Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów). Myszy trzymano w specyficznym pomieszczeniu dla zwierząt wolnym od patogenów (SPF), z wodą i pokarmem dostarczanym ad libitum. Trzymano je w naprzemiennym 12-godzinnym cyklu światła i ciemności w standardowych warunkach temperatury 22 °C i wilgotności względnej 55%-60%.

1. Przygotowanie roztworu LPC

  1. Rozpuścić 25 mg proszku LPC (patrz tabela materiałów) w 250 μl zmieszanego roztworu chloroformu i metanolu (1:1) w celu uzyskania 10% roztworu LPC i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 500 μl.
    UWAGA: Jeśli LPC nie jest całkowicie rozpuszczony, umieść probówkę wirówkową w myjce ultradźwiękowej i ultradźwięki pod częstotliwością 40 kHz przez ~1 h, aby uzyskać jednolity roztwór.
  2. Podzielić roztwór na 3 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Roztwór może być przechowywany przez ~2 lata.
  3. Przed zabiegiem należy rozcieńczyć roztwór (krok 1.2) 27 μl 0,9% roztworu NaCl i przechowywać roztwór w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Roztwór należy przygotować tuż przed rozpoczęciem wstrzykiwania.

2. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Za pomocą igły 32 G, 2 cale połączyć ze strzykawką o pojemności 5 μl (patrz Tabela Materiałów). Upewnij się, że strzykawka z mikrolitrami jest drożna. Pobrać 5 μl roztworu LPC w celu przygotowania wstrzyknięcia.
  2. Znieczulenie myszy w komorze indukcyjnej podłączonej do parownika izofluranu z 3% izofluranem zmieszanym ze 100% tlenem z szybkością około 0,3 l/min.
  3. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp, gdy oddech jest płynny.
  4. Ogol głowę myszy między uszami za pomocą golarki elektrycznej. Zastosuj nawilżające krople do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
  5. Następnie umieść mysz w ramce stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów) grzbietem do góry i zabezpiecz głowę stożkiem nosowym i zaciskiem na ząb. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,2%-1,6% izofluranu przez nos.
    UWAGA: Stężenie izofluranu można dostosować w zależności od stanu oddechowego myszy.

3. Zabieg chirurgiczny

UWAGA: Zwierzęta są umieszczane na poduszce grzewczej podczas wszystkich procedur.

  1. Przymocuj mysz do aparatu stereotaktycznego za pomocą obustronnych nauszników. Upewnij się, że nauszniki są wypoziomowane, a głowa jest pozioma i stabilna.
  2. Zdezynfekuj skórę na głowie, przecierając ją kilkakrotnie jodoforem, a następnie alkoholem okrężnymi ruchami. Następnie za pomocą skalpela wytnij małe nacięcie o długości około 1,5 cm wzdłuż linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
  3. Przetrzyj czaszkę bawełnianym wacikiem zamoczonym w 1% nadtlenku wodoru, aż bregma, lambda i tylne ciemiączko zostaną odsłonięte. Umieścić strzykawkę na aparacie stereotaktycznym.
    UWAGA: Używaj nadtlenku wodoru ostrożnie i unikaj dotykania otaczających tkanek.
  4. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest ułożona w poziomie (zarówno przód, jak i tył oraz lewo i prawo).
    1. Wyreguluj pokrętło osi Z ramy stereotaktycznej tak, aby końcówka igły i czaszka po prostu stykały się bez zginania, a następnie zmierz współrzędną osi Z. Sprawdź współrzędne Z bregmy i ciemiączka tylnego.
    2. Wyreguluj listwę douszną tak, aby różnica między współrzędnymi Z bregmy i ciemiączka tylnego nie przekraczała 0.02 mm. Następnie postępuj zgodnie z tą samą metodą, aby zmierzyć współrzędne Z odpowiednich pozycji po lewej i prawej stronie linii środkowej. Wyreguluj pasek douszny, aby upewnić się, że lewy i prawy są na tym samym poziomie.
  5. Zlokalizuj ciało modzelowate. Ustaw początek układu współrzędnych XYZ na bregma.
    UWAGA: Pierwsze miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1,0 mm bocznie w stosunku do bregmy, 2,4 mm głębokości i 1,1 mm z przodu. Drugie miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1,0 mm bocznie w stosunku do bregmy, na głębokości 2,1 mm i 0,6 mm z przodu. Na przykład współrzędna bregmy to (0,0,0). Zmierz współrzędną Z odpowiedniego położenia oznaczonego jako (-1, 1.1, X) i (-1, 0.6, Y). Można określić współrzędną pierwszego miejsca wstrzyknięcia ciała modzelowatego (-1, 1,1, −[X + 2,4]), a drugiego miejsca wstrzyknięcia (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
  6. Po ustaleniu miejsca wstrzyknięcia należy wykonać na czaszce znak sterylnym markerem i zapisać współrzędne.
  7. Delikatnie wywierć zaznaczone miejsce wiertłem do czaszki (patrz Tabela materiałów). Należy uważać, aby uniknąć krwawienia.
  8. Powoli przesunąć igłę do podanych współrzędnych i rozpocząć wstrzykiwanie. Aby wywołać demielinizację ciała modzelowatego, należy wstrzyknąć 2 μl roztworu LPC (krok 1.) w każde miejsce wstrzyknięcia (krok 3.5) z szybkością 0,4 μl/min.
  9. Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę w każdym miejscu przez dodatkowe 10 minut.
    UWAGA: Należy upewnić się, że odstęp między dwoma wstrzyknięciami nie przekracza 20 minut.
  10. Zszyj skórę szwem 4-0 i poczekaj, aż zwierzę obudzi się w ciągu 10 minut. Pooperacyjne leki przeciwbólowe należy podawać zgodnie z przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
    UWAGA: Zalecany czas eutanazji można określić w zależności od celu eksperymentu.

4. Pobieranie próbek do ogniskowej demielinizacji

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego kroku, zobacz poprzednio opublikowany raport14.

  1. Rozpuść obojętny czerwony barwnik (patrz tabela materiałów) w 1% roztworze w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. godzin przed poświęceniem myszy (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz poprzedni odnośnik10), wstrzyknij 500 μl 1% neutralnego czerwonego barwnika do PBS przez wstrzyknięcie dootrzewnowe dla każdej myszy.
  3. Wykonaj perfuzję serca12 z 30 ml 0,1% PBS wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C.
  4. Pokrój mózg na 1 mm za pomocą formy do mózgu (patrz tabela materiałów).
  5. Wizualizuj zmianę zabarwioną neutralną czerwienią pod mikroskopem i dysocjuj zmianę.
    UWAGA: Usuń jak najwięcej otaczającej normalnej tkanki, aby poprawić dokładność późniejszej analizy. Tkankę zmiany chorobowej można badać za pomocą RT-PCR, mikroskopii elektronowej i analiz western blot.

5. Barwienie histologiczne i immunofluorescencja

  1. Do barwienia histologicznego i immunofluorescencji12, po perfuzji serca (krok 4.3.), usuń brain10, utrwal w 4% PFA przez noc (w temperaturze 4 °C) i całkowicie odwodnij w 30% sacharozy.
  2. Pokrój na 20-milimetrowe skrawki mózgu koronalnego za pomocą mrożonej krajalnicy10 w stałej temperaturze (−20 °C).
  3. Użyj plastrów do barwienia Luxol fast blue (LFB), immunofluorescencji i western blot 10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwupunktowa injekcja LPC spowodowała bardziej trwałą demielinizację
LPC prowadzi głównie do szybkiego uszkodzenia z toksycznością wobec mieliny oraz naruszeniem integralności aksonów15. Dzień injekcji uznano za dzień 0. Myszy utrzymywano przez okres od 10 do 28 dni (10 dpi i 28 dpi). Do oceny obszaru demielinizacji u myszy w tych punktach czasowych wykorzystano barwienie Luxol Fast Blue (LFB)10. W modelu dwupunktowej injekcji w 10 dpi stwierdzono znaczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stwardnienie rozsiane, przewlekła choroba demielinizacyjna OUN, jest jedną z najczęstszych przyczyn dysfunkcji neurologicznych u młodych dorosłych20. Klinicznie około 60%-80% pacjentów ze stwardnieniem rozsianym doświadcza cyklu nawrotów i remisji przed rozwinięciem się wtórnie postępującego stwardnienia rozsianego21,22, co ostatecznie prowadzi do skumulowanych zaburzeń ruchowych i deficytów poznawczych w czasie23. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Granty: 82071380, 81873743).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
L-&alfa;-Lizofosfatydylocholina z żółtka jajaSigma-AldrichL4129-25MG
32 gauge IgłaHAMILTON7762-05
10 μ l strzykawkaHAMILTON80014
szybkobieżna wiertarka czaszkimocna, koreastrong204
wiertarkaHager & Meisinger, Niemcy REF 500 104 001 001 005
Respirator Matrx Animal AneathesiaMIDMARKVMR
Przenośny instrument stereotaktyczny dla myszyNagroda68507
MikrostrzykawkaNagrodaKDS LEGATO 130
Isoflurane VETEASY
ParaformaldehydServicebioG1101
Bufor fosforanowyBOSTERPYG0021
LuxoL fast bLueServicebioG1030-100ML
SzewFUSUNPHARMA20152021225
Pleśń mózgowaNagroda68707
Utrwalaczmikroskopu elektronowegoServicebioG1102-100ML
Neutralny czerwony (CI 50040), do mikroskopii CertistainSigma-Aldrich1.01376
Przeciwciało przeciwko mielinie Millipore#AB5864
anty-GST-P MBL#311
Ki-67 (SolA15)Thermo Fisher  Scientific14-5698-95
Przeciwciało monoklonalne beta aktynyProteintech66009-1-IG 
Mielina Podstawowe białko Przeciwciało poliklonalneProteintech10458-1-AP
OLIG2 Przeciwciało poliklonalneProteintech13999-1-AP
Alexa Fluor 488  AffiniPure  Anty-Królik Osła  IgG (H+L)YEASEN34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) YEASEN34412ES60
Alexa Fluor 594  AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) YEASEN34212ES60
HRP Koza Anty-Królicza IgG (H+L)abklonalnaAS014
HRP Koza Anty-Mysia IgG (H+L) abclonalAS003
Dorosły C57BL/6 samce i samice myszyHunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd
Przeciwciało monoklonalne

Bibliografia

  1. Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
  2. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  3. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  4. Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
  5. Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).
  6. Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
  7. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).
  8. Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
  9. Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).
  10. Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).
  11. Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
  12. Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
  13. Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
  14. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  15. Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
  16. Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
  17. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
  18. Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
  19. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  20. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
  21. Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
  22. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  23. Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
  24. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
  25. Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).
  26. Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
  27. Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843(2020).
  28. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
  29. Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
  30. Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wtryskiwanie lyzofosfatydylocholinymodel stwardnienia rozsianegochirurgia stereotaktycznaciałomóżdżowatebarwienie Luxol Fast Bluebarwienie immunofluorescencyjnekomórki progenitorowe oligodendrocytówWestern blotmikroskopia elektronowa
Stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.