Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64064

⸱

9 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Stem Cell Research (CSCR), A unit of InStem Bengaluru, Christian Medical College campus, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Streszczenie

CRISPR/Cas9 to bardzo wszechstronne i skuteczne narzędzie do edycji genów, powszechnie stosowane do korygowania różnych mutacji genetycznych. Możliwość manipulacji genami hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) in vitro sprawia, że HSPC są idealną komórką docelową do terapii genowej. Jednak HSPC umiarkowanie tracą swój potencjał wszczepienia i ponownego zasiedlenia wieloliniowego w hodowli ex vivo. W niniejszym badaniu opisano idealne warunki hodowli, które poprawiają wszczepianie HSPC i generują zwiększoną liczbę komórek zmodyfikowanych genowo in vivo. Bieżący raport przedstawia zoptymalizowane warunki hodowli in vitro, w tym rodzaj pożywki hodowlanej, unikalną suplementację koktajlami małocząsteczkowymi, stężenie cytokin, płytki do hodowli komórkowych i gęstość hodowli. Oprócz tego zapewniona jest zoptymalizowana procedura edycji genów HSPC wraz z walidacją zdarzeń edycji genów. W przypadku walidacji in vivo wyświetlana jest infuzja HSPC z edytowanym genem i analiza po wszczepieniu u biorców myszy. Wyniki pokazały, że system hodowli zwiększył częstość występowania funkcjonalnych HSC in vitro, co skutkowało solidnym wszczepianiem komórek z edytowanymi genami in vivo.

Wprowadzenie

Niedostępność do dawców z ludzkim antygenem leukocytarnym (HLA) w warunkach transplantacji allogenicznej oraz szybki rozwój wysoce wszechstronnych i bezpiecznych narzędzi inżynierii genetycznej sprawiają, że autologiczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) jest strategią leczenia dziedzicznych chorób krwi1,2. Terapia genowa autologicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) obejmuje pobieranie HSPC pacjentów, manipulację genetyczną, korektę mutacji powodujących chorobę oraz przeszczepienie HSPC skorygowanych genowo do pacjenta3,4. Jednak pomyślny wynik terapii genowej zależy od jakości przeszczepu zmodyfikowanego genowo. Etapy manipulacji genami i hodowla ex vivo HSPC wpływają na jakość przeszczepu poprzez zmniejszenie częstości występowania długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC), co wymaga infuzji dużych dawek HSPC manipulowanych genami2,5,6.

Kilka małych molekuł, w tym SR1 i UM171, jest obecnie wykorzystywanych do rozbudowy HSPC krwi pępowinowej7,8. W przypadku dorosłych HSPC, ze względu na wyższą wydajność komórek uzyskaną podczas mobilizacji, nie jest wymagana silna ekspansja. Jednak zachowanie macierzystej izolowanych HSPC w hodowli ex vivo ma kluczowe znaczenie dla zastosowań terapii genowej. W związku z tym opracowano podejście skupiające się na wzbogacaniu hodowli krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) przy użyciu kombinacji małych cząsteczek: Resweratrol, UM729 i SR1 (RUS)7. Zoptymalizowane warunki hodowli HSPC sprzyjają wzbogacaniu HSC, co skutkuje zwiększoną częstotliwością modyfikowanych genowo HSC in vivo i zmniejsza potrzebę manipulowania dużymi dawkami HSPC przez geny, ułatwiając opłacalne podejścia do terapii genowej8.

Tutaj opisany jest obszerny protokół hodowli HSPC, wraz z infuzją i analizą komórek z edytowanymi genami in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty in vivo na myszach z niedoborem odporności zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu Etyki Zwierząt (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Indie. Próbki krwi obwodowej zmobilizowane czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) pobrano od zdrowych dawców ludzkich za świadomą zgodą po uzyskaniu zgody Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB).

1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) i oczyszczanie komórek CD34 +

  1. Wykonaj izolację PBMNC, wykonując poniższe czynności.
    UWAGA: W przypadku hodowli HSPC in vitro i edycji genów idealne jest rozpoczęcie od co najmniej 1 x 106 HSPC/grupę. W przypadku analizy wszczepienia in vivo początkowa liczba komórek co najmniej 5 x 106 HSPC / grupa jest idealna, jeśli grupa zawiera osiem myszy, a każda mysz jest podawana w infuzji z co najmniej 6 x 105 komórek. Aby uzyskać wystarczającą liczbę PBMNC (~1 x 109) do zabiegu, zaleca się rozpoczęcie od 20 ml zmobilizowanej krwi obwodowej (mPB).
    1. Po pobraniu mPB rozcieńczyć 20 ml mPB sterylnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w stosunku 1:1.
      UWAGA: Skuteczność mobilizacji G-CSF może się różnić w zależności od osoby9, a zatem liczba HSPC uzyskanych z 20 ml zmobilizowanej krwi różni się w zależności od dawcy.
    2. Dodać 10 ml pożywki o gradiencie gęstości (Lymphoprep, patrz tabela materiałów) do probówki o pojemności 50 ml i ułożyć rozcieńczoną krew przez boki probówki w stosunku 1:2.
      UWAGA: Przechylenie probówki o pojemności 50 ml pod kątem 20° podczas dodawania rozcieńczonej krwi zapobiega jej mieszaniu się z Lymphoprep, co prowadzi do wyraźnego oddzielenia składników krwi po odwirowaniu.
    3. Wirować przy 600 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) z prędkością przyspieszenia 1 m/s² i szybkością zwalniania 1 m/s². Odrzucić górną warstwę (osocze) za pomocą pipety serologicznej i zebrać kożuchową powłokę obecną na interfazie (PBMNC) powyżej warstwy pożywki o gradiencie gęstości.
      UWAGA: Odessać kożuchową sierść za pomocą pipety serologicznej, delikatnie obracając ją po bokach probówki. Unikaj zbierania większej objętości interfazy podczas zasysania kożucha kożuchowego, aby zapobiec zanieczyszczeniu granulocytów i erytrocytów.
    4. Przenieść PBMNC do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć zawiesinę komórek 1x PBS w stosunku 1:2.
      UWAGA: Rozcieńczyć zawiesinę komórek 1x PBS w stosunku 1:4, jeśli podczas zasysania kożucha kożucha zebrano nadmiar interfazy.
    5. Odwirować zawiesinę komórek przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z szybkością przyspieszenia 9 m/s² i szybkością zwalniania 7 m/s² i odrzucić supernatant za pomocą pipety serologicznej. Dodać 30 ml lodowatego buforu do lizy RBC (patrz Tabela 7) do osadu i inkubować w lodzie przez 10 minut. Mieszaj, odwracając rurkę co 2 minuty.
    6. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z prędkością przyspieszenia 9 m/s² i szybkością zwalniania 7 m/s² i odrzucić supernatant. Powtórz kroki 1.1.5.-1.1.6. aż zniknie zaczerwienienie granulki. Zawiesić osad za pomocą podłoża podstawowego (IMDM, patrz Tabela Materiałów) i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą błękitu trypanowego w komorze Neubauera10.
      UWAGA: Wyizolowane PBMNC mogą być natychmiast użyte do oczyszczania CD34+ HSPC. Alternatywnie, PBMNC mogą być kriokonserwowane i reaktywowane w dowolnym momencie w celu wzbogacenia CD34+. W celu kriopkonserwacji odwirować 5 x 108 komórek przy 200 x g przez 5 minut i dodać 4 ml pożywki kriogenicznej zawierającej IMDM: FBS: DMSO (patrz tabela materiałów) w stosunku 7:2:1.
    7. Przenieść fiolki do chłodnicy kriogenicznej o temperaturze 1 °C i przechowywać je w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 12 godzin. Przenieść i przechowywać kriowiale w pojemniku z ciekłym azotem do długotrwałego przechowywania.
  2. Ożyw kriokonserwowane PBMNC.
    1. Rozmrozić kriowiale do połowy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie obracając przez <1 min. Przenieść zawiesinę komórek kriowialu do probówki o pojemności 50 ml zawierającej IMDM w stosunku 1:10.
    2. Odwirować zawiesinę komórek przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z szybkością przyspieszenia 9 m/s² i szybkością opóźnienia 7 m/s² i odrzucić supernatant za pomocą pipety serologicznej.
  3. Oczyść komórki CD34+ z PBMNC, wykonując poniższe czynności.
    1. Przygotować bufor oczyszczający ze sterylnym 1x PBS zawierającym 2% przefiltrowaną płodową surowicę bydlęcą (FBS). Zawiesić osad komórek PBMNC w buforze zgodnie z tabelą 1.
      UWAGA: Bufor musi być wolny od Ca++ i Mg++.
    2. Przenieść zawiesinę komórek zawierającą 1 x 108-5 x 108 komórek świeżych lub kriokonserwowanych PBMNC do probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml z polistyrenu (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Dodać DNazę (patrz Tabela materiałów) w końcowym stężeniu 100 μg/ml do zawiesiny komórek, aby zapobiec zlepianiu się komórek. Użyliśmy dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania CD34 zawierającego Human CD34 Positive Selection Cocktail i Dextran Rapid Spheres (patrz Tabela Materiałów).
    3. Dodać dostępny w handlu ludzki koktajl selekcji pozytywnej CD34 (patrz tabela materiałów) o stężeniu 100 μl/ml komórek i delikatnie zawiesić.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut i delikatnie zawiesić zawiesinę komórek co 5 minut. Dodać 50 μl/ml dostępnych w handlu Dextran Rapid Spheres (patrz tabela materiałów) i delikatnie zawiesić.
      UWAGA: Wiruj kulki dekstranu z dużą prędkością przez 5 sekund, aby upewnić się, że cząsteczki wydają się równomiernie rozproszone, a następnie dodaj je do komórek.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut i delikatnie zawiesić zawiesinę komórek co 5 minut. Zawiesinę komórek uzupełnić do całkowitej objętości 2,5 ml za pomocą buforu oczyszczającego i delikatnie zawiesić.
    6. Umieścić probówkę w dostępnym w handlu magnesie immunomagnetycznym bez kolumny (patrz Tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odwróć magnes i wyrzuć supernatant jednym ciągłym ruchem.
      UWAGA: Komórki CD34 + oznaczone dekstranem Rapid Spheres pozostają przyciągane do boków rurki przez pole magnetyczne. Rurkę należy trzymać w pozycji odwróconej przez 2-3 s. Unikaj drżenia lub ocierania kropli, które pozostają zwisające z wylotu tubki.
    7. Wyjmij probówkę z magnesu i dodaj 2,5 ml buforu oczyszczającego. Powtórz kroki 1.3.6-1.3.7 pięć razy.
      UWAGA: Podczas dodawania buforu oczyszczającego należy ustawić probówkę pod ostrym kątem i dodać bufor, obracając probówkę, ponieważ komórki mogą przylegać do ścianek powierzchni podczas odwracania magnesu.
    8. Po wykonaniu pięciu płukań wyjmij probówkę z magnesu, dodaj 4 ml 1x sterylnego PBS i ponownie zawieś zawiesinę komórek. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i uzupełnić do 10 ml za pomocą 1x PBS. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą błękitu trypanowego w komorze Neubauera10.
    9. Wirować przy 200 x g przez 5 minut przy RT (przyspieszenie ~9 m/s², opóźnienie ~7 m/s²) i odrzucić supernatant za pomocą pipety. Aby wyhodować HSPC, ponownie zawieś komórki w pożywce hodowlanej HSPC, jak wspomniano w kroku 2.1.
      UWAGA: Nadmiar oczyszczonych HSPC poddano kriokonserwacji w dostępnym na rynku podłożu do krioprezerwacji (patrz Tabela materiałów) o gęstości 9 x 106 komórek/ml po hodowli HSPC przez 12 godzin w pożywkach hodowlanych HSPC.
  4. Ożyw kriokonserwowane HSPC.
    1. Rozmrażaj kriowiale przez <1 min w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie obracając. Przenieść zawiesinę komórek w kriowiale do probówki o pojemności 50 ml.
    2. Dodaj 1% BSA zawieszony w 1x PBS kropla po kropli ze stałym mieszaniem i uzupełnij do 20 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z prędkością przyspieszenia 9 m/s² i szybkością zwalniania 7 m/s² i odrzucić supernatant za pomocą pipety serologicznej.
    3. Powtórzyć krok 1.4.2. 1x. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej HSPC i kulturze zgodnie z opisem w kroku 2.1.

2. Hodowla in vitro oczyszczonych HSPC

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną za pomocą SFEM-II z SCF (240 ng/ml), FLT3 (240 ng/ml), TPO (80 ng/mL), IL6 (40 ng/ml) i 1x antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się świeżo przygotowane podłoża hodowlane. Pożywki można jednak przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin po przygotowaniu.
  2. Zawiesić osad CD34+ z pożywką hodowlaną, dodać 3 μl koktajlu RUS/ml pożywki (Resweratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; Trzpień Reginina-1, 750 nM; patrz tabela materiałów) i hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: UM171 (10 nm) może być używany do zastąpienia UM729 (500 nM), ponieważ oba mają podobny wpływ na utrzymanie stemness HSPC7. Fiolki nie mogą być zamrażane i rozmrażane więcej niż dwa razy.
  3. Początkowo wysiewaj oczyszczone komórki w zbiegu 5 x 105 / ml na dostępnych w handlu 6-dołkowych płytkach delta poddanych działaniu powierzchni (patrz Tabela materiałów) w celu usunięcia przylegających komórek.
  4. Ponownie zasiać komórki w zawiesinie w zbiegu 2 x 105 komórek/ml na nowej 6-dołkowej płytce po 6 godzinach oczyszczania.
  5. Scharakteryzuj łodygę HSPC za pomocą cytometrii przepływowej przed edycją genów.
    1. Do analizy cytometrii przepływowej należy pobrać 1 x 105 komórek w 100 μl 1x PBS i dodać 3 μl (75 ng) CD34 PE, 4 μl (100 ng) CD133 FITC i 4 μL (100 ng) CD90 APC (patrz tabela materiałów).
    2. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Przemyć komórki 2 ml 1x PBS 2x i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant za pomocą pipety, ponownie zawiesić osad komórek za pomocą 150 μl 1x PBS i pobrać go w cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Jeśli procent komórek CD34+ wynosi <90%, zwiększ liczbę prań do sześciu razy w kroku 1.3.7. Oczyszczone HSPC należy zasiać w pożywkach hodowlanych i po 6 godzinach zebrać tylko komórki w zawiesinie. Większość komórek CD34- przylega do płytki hodowlanej.

3. Edycja genów HSPC

  1. Wykonaj rekonstytucję przewodnika RNA.
    UWAGA: Syntetyczne sgRNA z modyfikacjami fosforotionianu ukierunkowane na locus CCR5 uzyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).
    1. W celu rozpuszczenia ustawić termomikser na 37 °C i podgrzać 1x bufor TE (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Odwirować fiolkę syntetycznego chemicznie modyfikowanego sgRNA w temperaturze 11 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
    2. Do fiolki sgRNA zawierającej 1,5 nM liofilizowanego sgRNA dodaj 15 μL 1x buforu TE, uzyskując końcowe stężenie 100 pM/μL. Ponownie delikatnie zawiesić do 5x, obracając końcówkę wokół rogów.
    3. Inkubować w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 °C przez 30-40 s z minimalnym wstrząsaniem. Po krótkim wirowaniu zbierz 15 μl sgRNA i przechowuj jako 1 μl podwielokrotności (100 pM/μL) w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości przez okres do 1 roku.
      UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Zalecany jest maksymalnie jeden cykl zamrażania i rozmrażania podwielokrotnego gRNA.
  2. Wykonaj nukleofekcję, wykonując poniższe czynności.
    1. W 3 dniu hodowli policz komórki za pomocą ulepszonej komory do liczenia komórek Neubauera10.
    2. Do przygotowania RNP (do nukleofekcji 2 x 105 komórek) należy pobrać 1 μl sgRNA ukierunkowanego na gen CCR5 (100 pM) w probówce o pojemności 0,5 ml i dodać 2,65 μl Cas9 (50 pM), delikatnie obracając wokół dna fiolki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      UWAGA: Sekwencja gRNA: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG.
    3. W celu przygotowania buforu dodać 16,4 μl roztworu komórek pierwotnych P3 i 3,6 μl suplementu, dostarczonych z dostępnym w handlu zestawem do nukleofekcji (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przygotować pożywkę hodowlaną (krok 2.1.) i wstępnie inkubować w temperaturze 37 °C na płytce hodowlanej przed nukleofekcją.
    4. Osad 2 x 105 komórek przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i delikatnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu. Zawiesić osad z 20 μl buforu przygotowanego w kroku 3.2.3. i delikatnie zawiesić go ponownie.
    5. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową z przygotowanym kompleksem RNP (krok 3.2.2.) bez pęcherzyków powietrza. Przenieś zawiesinę do komercyjnego paska nukleofekcji (patrz Tabela materiałów) i wybierz kod impulsu DZ100, aby elektroporować komórki za pomocą nukleofektora 4D (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Ostateczna objętość zawiesiny ogniwa, w tym buforu i składników RNP, nie może przekraczać więcej niż 27 μl/elektroporację.
    6. Do kontroli doświadczalnej zawiesić 2 x 105 nieedytowanych HSPC przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze suchej at, a następnie ponownie zawiesić osad z 20 μl buforu przygotowanego w kroku 3.2.3 bez kompleksu RNP.
    7. Dodać 100 μl wstępnie inkubowanych pożywek hodowlanych (etap 3.2.3.) do elektroporowanych komórek i pozostawić komórki w spokoju przez 10 minut w pasku nukleofekcji w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach inkubacji przenieść zawartość na płytkę hodowlaną zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.
      UWAGA: Protokół ten można zastosować do niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) za pośrednictwem ukierunkowanego zakłócenia dowolnego locus genomowego przy użyciu docelowego gRNA. Ten sam protokół można zastosować do wprowadzania dużych delecji poprzez włączenie podwójnego gRNA w kroku 3.2.2. 11. Ponadto, po 10 minutach inkubacji RNP, ten sam protokół może być użyty do edycji genów opartej na homologii kierowanej naprawie (HDR), jeśli zostanie dostarczony z szablonem dawcy12. Protokół został zweryfikowany przez ukierunkowane zakłócenie AAVS1, pseudo β-globin, β-globiny i locus5 CCR5 locus7,8.

4. Walidacja zdarzeń edycji genów w HSPC

  1. Wykonaj ekstrakcję DNA.
    1. Po 72 godzinach od nukleofekcji wykonać zliczanie komórek przy użyciu błękitu trypanowego w komorze Neubauera. Zbierz 1 x 105 HSPC z edytowanymi genami do ekstrakcji DNA.
    2. Odwirować komórki przy 11 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad w 1 ml 1x PBS i powtórzyć wirowanie, a supernatant wyrzucić. Do osadu dodać 20 μl roztworu do szybkiego ekstrakcji (patrz Tabela Materiałów) dla komórek 1 x 105 i ponownie zawiesić osad.
    3. Mieszaninę inkubować w termocyklerze w temperaturze 68 °C przez 30 minut. Po krótkim wirowaniu mieszaninę inkubować w termocyklerze w temperaturze 98 °C przez 10 minut. Zmierz stężenie DNA w surowym lizacie za pomocą spektrofotometru13.
  2. Wykonaj amplifikację locus edytowanego genem za pomocą PCR.
    1. Korzystając z Primer3 (patrz Tabela materiałów), zaprojektuj startery specyficzne dla locus obejmujące miejsce pęknięcia dwuniciowego (DSB) o rozmiarach amplikonów w zakresie 400-700 pz (Tabela 2).
      UWAGA: Primer3 to internetowe narzędzie typu open source do projektowania starterów PCR.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną zgodnie z tabelą 3 i uruchomić termocykler w warunkach cyklicznych wymienionych w tabeli 4. Aby potwierdzić amplifikację pożądanego locus, zmieszaj 5 μl produktu PCR z 6-krotnym barwnikiem ładującym i załaduj na 2% elektroforezę w żelu agarozowym wykonaną przy użyciu buforu TAE.
      UWAGA: Składniki bufora TAE są podane w tabeli 7.
    3. Pracować przez 30-40 minut przy napięciu 100 V i wykryć amplikon za pomocą systemu obrazowania żelowego (patrz tabela materiałów). Zgodnie z protokołem producenta oczyszczania PCR (patrz tabela materiałów), należy oczyścić amplifikowany produkt PCR.
    4. Zmierzyć stężenie oczyszczonego produktu PCR za pomocą spektrofotometru nanokroplowego (patrz tabela materiałów).
  3. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera i usuń wolny terminator barwnika, wykonując poniższe czynności.
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną zgodnie z tabelą 5. Uruchom termocykler w warunkach cyklicznych, jak podano w Tabeli 6.
    2. Dodać 10 μl odczynnika HighPrep DTR (patrz tabela materiałów) i 40 μl 85% etanolu do 10 μl próbki PCR w probówce o pojemności 1,5 ml i wymieszać energicznie pipetując około 8x-10x.
    3. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać 100 μl 85% etanolu.
    4. Odrzucić supernatant i powtórzyć krok 4.3.3. 1x. Wyjmij probówki o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 10 minut w mieszalniku termicznym w celu wysuszenia etanolu.
    5. Energicznie zawiesić kulki w 40 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść probówkę na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut i wykonaj sekwencjonowanie Sangera zgodnie z opublikowanymi raportami14,15.
  4. Przeprowadź ocenę częstotliwości indel za pomocą analizy ICE16.
    1. Użyj Synthego (patrz tabela materiałów) do analizy ICE.
    2. Prześlij pliki ab1 z edytowanymi i nieedytowanymi próbkami oraz sekwencjami gRNA, a następnie kliknij analizuj, aby uzyskać częstotliwość Indels.

5. Przeszczepienie HSPC z edytowanymi genami

  1. Wstępnie przygotuj dostępną na rynku mysz gamma NOD scid (NSG)17 i NOD. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 myszy (patrz Tabela Materiałów) do przeszczepu szpiku kostnego.
    1. Do wstępnego kondycjonowania myszy NSG wybierz 6-8-tygodniowe samice myszy i podziel je na grupy kontrolne i edytowane przez ślepą randomizację.
    2. Umieść myszy NSG w klatkach ciasta i napromieniuj pod ciśnieniem 3,5 Gy za pomocą dostępnego w handlu napromieniacza (patrz Tabela materiałów) 6-8 godzin przed przeszczepem HSPC.
      UWAGA: Zaleca się zważenie myszy przed napromienianiem, a myszy o wadze >20 g zostaną poddane napromieniowaniu.
    3. W celu przygotowania do przygotowania 6-8-tygodniowego samca i samicy myszy z NBSGW, należy wstrzyknąć busulfan (patrz tabela materiałów) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) w dawce 12,5 mg/kg masy ciała na 48 godzin przed przeszczepem HSPC.
      UWAGA: Kondycjonowanie busulfanem zwiększa wszczepianie ludzkich HSPC do szpiku kostnego myszy i zmniejsza potrzebę podawania dużych dawek HSPC z edytowanymi genami19. Idealny zakres dawek busulfanu dla kondycjonowania wynosi od 10 mg/kg do 15 mg/kg masy ciała. Zwiększenie dawek busulfanu spowoduje poważne problemy ze śmiertelnością.
  2. Przygotować zawiesinę komórkową do przeszczepienia szpiku kostnego.
    1. Po 10 minutach inkubacji HSPC z edytowanym genem w pasku nukleofekcji (patrz krok 3.2.7), przenieś zawiesinę komórkową do 10 ml 1x PBS. Policz komórki za pomocą ulepszonej komory do liczenia komórek Neubauera10.
    2. Do infuzji jednej myszy należy umieścić 6 x 105 komórek w probówce o pojemności 1,5 ml, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 100 μl 1x PBS.
  3. Wlej HSPC przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, wykonując poniższe czynności.
    1. Umieść wstępnie kondycjonowaną mysz NSG lub NBSGW w ograniczniku myszy (patrz tabela materiałów).
    2. Przytrzymaj końcówkę myszy i delikatnie popchnij wtyczkę, aby przytrzymać mysz. Delikatnie przetrzyj ogon myszy 70% etanolem. Odessać 100 μl zawiesiny komórkowej do strzykawki insulinowej 31 G.
      UWAGA: Należy bezwzględnie unikać powstawania pęcherzyków powietrza w produkcie infuzyjnym poprzez delikatne stukanie w strzykawkę lub delikatne przesuwanie tłoka.
    3. Skieruj światło z lampy na podczerwień na ogon na 30-40 s, pokrywając obszar ciała myszy fałdami bibuły. Delikatnie wsunąć skośną część igły do lewej lub prawej żyły ogonowej ogona pod kątem 20°.
    4. Podnieś ogon lewym palcem wskazującym, aby utrzymać go w osi płaskiej za pomocą strzykawki. Wcisnąć tłok, aby wprowadzić zawiesinę komórkową do żyły. Delikatnie uciskaj bibułą w pobliżu przekłutego obszaru i wyciągnij igłę.
    5. Po 30 sekundach delikatnego ucisku wyjmij mysz z ogranicznika i przenieś ją do klatki.

6. Ocena krótkoterminowego potencjału wszczepienia

  1. Po 4 tygodniach od przeszczepu HSPC u człowieka należy ocenić krótkotrwałe wszczepienie, pobierając krew przez zatokę żylną oczodołu w heparynizowanej probówce za pomocą pipety Pasteura.
    1. Znieczulić zwierzę preparatem ketaminy (90-120 mg/kg) i ksylazyny (8-12 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP) przed pobraniem próbki.
      UWAGA: Delikatnie uciskaj tylne kończyny znieczulonej myszy, aby potwierdzić utratę czucia.
    2. Po znieczuleniu ustaw zwierzę w pozycji leżącej brzusznej i delikatnie potrząśnij myszką, aby otworzyć oko, co pozwala na lekkie wysunięcie gałki ocznej.
    3. Delikatnie włóż pipetę Pasteura do przyśrodkowej kanty oka pod membraną nakłuwającą pod kątem 30°-45°. Po umieszczeniu pipety Pasteura we właściwej pozycji, lekko dociśnij rurkę i zacznij delikatnie obracać probówkę.
      UWAGA: Krew dostanie się do rurki przez działanie kapilarne, gdy tylko splot zaoczodołowy zostanie przebity.
  2. Po pobraniu 50-80 μl krwi obwodowej delikatnie wyjmij pipetę z przyśrodkowej kanty oka.
    1. Aby zatamować krwawienie wokół oczodołu, zamknij powieki i delikatnie uciskaj za pomocą kawałka gazy.
  3. Wybarwić komórki odpowiednimi przeciwciałami (Tabela 8) i inkubować komórki w ciemności przez 25-30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. W przypadku lizy RBC do zawiesiny komórek dodać 3 ml 1x buforu do lizy RBC (Tabela 7) i inkubować przez 10 minut w lodzie.
    1. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant za pomocą pipety. Powtórz krok 6.4. aż zniknie zaczerwienienie granulki.
    2. Dodaj 2 ml 1x PBS i odwiruj przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki komórek związane z lizą RBC.
    3. Dodaj 150 μL 1x PBS do osadu, a następnie kontynuuj immunofenotypowanie do cytometrii przepływowej w celu oceny procentu wszczepionych komórek ludzkich7.

7. Ocena długoterminowego potencjału wszczepienia

  1. Poddaj myszy eutanazji.
    1. Poświęć przeszczepione myszy w 16 tygodniu do analizy wszczepienia, wprowadzając 100% CO2 astrixiation20 wewnątrz klatki myszy na 1-2 minuty.
    2. Potwierdź eutanazję, stwierdzając zatrzymanie akcji serca i oddechu oraz brak ruchów mięśni z delikatnym szczypaniem kończyn tylnych. Jeśli oba warunki są spełnione, wyjmij myszy z klatki.
    3. Aby ocenić chimeryzm komórek ludzkich, zbierz komórki ze szpiku kostnego.
  2. Odizoluj komórki od szpiku kostnego, wykonując poniższe czynności.
    1. Po eutanazji wykonaj pionowe nacięcie 1 cm powyżej cewki moczowej i rozciągnij do 1 cm poniżej przepony. Ciąć poziomo w rogach naciętego obszaru, aby szeroko otworzyć okolicę brzucha.
    2. Wypreparuj kość udową i piszczelową i usuń tkanki miękkie przyczepione do kości udowej i piszczelowej za pomocą nożyczek. Delikatnie wyszoruj bibułą i za pomocą skalpela wykonaj mały otwór o średnicy nie większej niż 0,2 cm na dnie probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml.
    3. Usuń proksymalne końce kości za pomocą skalpela i umieść kości przeciętą stroną skierowaną w stronę otworu probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Umieść probówkę o pojemności 0,5 ml z kośćmi w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl sterylnego 1x PBS.
    4. Zamknąć pokrywę, obracać probówki przez 3 minuty w temperaturze 1000 x g w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej i wyrzucić probówki o pojemności 0,5 ml zawierające kości z pustą jamą szpiku. Dodać 1 ml 1x PBS do 1,5 ml probówki reakcyjnej zawierającej szpik kostny i delikatnie zawiesić komórki w przybliżeniu nie mniej niż 10x za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    5. Przenieść 1 ml zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml buforu do lizy RBC. Inkubować komórki w lodzie przez 7 minut, delikatnie odwracając probówki co 2 minuty.
    6. Po 7 minutach odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z przyspieszeniem 9 m/s² i przyspieszeniem 7 m/s². Powtórz krok 7.2.5. aż do zaobserwowania klarownej bladobiałej granulki.
    7. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml sterylnego 1x DPBS i przefiltrować zawiesinę komórek szpiku kostnego za pomocą sitka do komórek 40 μm na probówce o pojemności 15 ml. Przepłucz sitko komórkowe 2 ml 1x PBS 2x, aby uniknąć utraty komórek.
    8. Wirować przez 5 minut przy 200 x g, RT i odrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić komórki za pomocą 10 ml IMDM z DNazą-I w stężeniu roboczym 100 μg/ml.
    9. Weź 1 x 106 komórek jednojądrzastych w probówce FACS do analizy wszczepienia za pomocą cytometrii przepływowej. Aby ocenić częstość edycji genów w wszczepionych komórkach jednojądrzastych szpiku kostnego, należy osadzać 1 x 106 komórek jednojądrzastych w temperaturze 11 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.

8. Immunofenotypowanie

  1. Inkubować komórki szpiku kostnego z 1,5 μl oczyszczonego rekombinowanego ludzkiego białka Fc (patrz tabela materiałów) przez 15 minut w temperaturze 4 °C przed barwieniem przeciwciałami.
    UWAGA: Zastosowane tutaj ludzkie białko Fc zostało opracowane w celu blokowania nieswoistego barwienia przeciwciał wywołanego przez receptory dla IgG; W ten sposób zwiększa swoistość znakowania przeciwciałami7,21,22. Przed barwieniem komórek docelowych przeciwciałami należy przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał. Zdecydowanie zaleca się włączenie kontroli FMO i kontroli izotypu podczas pracy nad wielokolorową analizą cytometryczną
    2. przepływową.
  2. Aby określić procent wszczepienia komórek ludzkich za pomocą cytometru przepływowego, należy pobrać 1 x 106 komórek jednojądrzastych w probówce FACS i wybarwić komórki, jak wspomniano w tabeli 8.
  3. Inkubować komórki w ciemności przez 25-30 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  4. Pozyskaj komórki za pomocą cytometru przepływowego, przesuń populację komórek (P1) za pomocą rozproszenia do przodu (FSC) i bocznego (SSC) komórek jednojądrzastych i dostosuj napięcie w zależności od populacji komórek. Zdobądź 50 000 zdarzeń komórkowych w populacji P1.
  5. Aby przeanalizować ludzkie populacje leukocytów w szpiku kostnym myszy, należy zbramować ludzkie komórki CD45 + i mysie CD45.1 z populacji komórek P1 za pomocą oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
  6. Oblicz wszczepienie komórek ludzkich za pomocą następującego wzoru8:
    % wszczepienia = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100,
    UWAGA: Próg dla wszczepienia człowieka został uznany za 0,1% dodatni dla CD45.
  7. Ponadto przeanalizuj procent komórek hCD34 + z ludzkich komórek CD45 +, aby ocenić długoterminowe komórki ponownego zasiedlenia. Aby ocenić wieloliniową rekonstytucję przeszczepionych komórek ludzkich, należy zabarwić 100 μl zawiesiny komórkowej zgodnie z tabelą 9.
    UWAGA: Przeciwciała muszą być miareczkowane przed eksperymentami.
  8. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, bramkuje hCD45 z populacji komórek P1, a z hCD45 określ procentowo procent hCD19, hCD3 i hCD13 (podzbiory limfoidalne i szpikowe).

9. Ocena częstości edycji genów w komórkach jednojądrzastych przeszczepionego szpiku kostnego

  1. Do osadu komórek jednojądrzastych szpiku kostnego dodać 50 μl roztworu szybkiego ekstraktu (patrz tabela materiałów) dla komórek 5 x 105 i ponownie zawiesić osad.
  2. Mieszaninę inkubować w termocyklerze w temperaturze 68 °C przez 30 minut. Po krótkim wirowaniu mieszaninę inkubować w termocyklerze w temperaturze 98 °C przez 10 minut.
  3. Zmierzyć stężenie DNA w surowym lizacie za pomocą spektrofotometru. Wykonaj kroki 4.2.-4.4. aby zweryfikować częstotliwość edycji genów za pomocą analizy ICE8,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsze badanie określa optymalne warunki hodowli HSPC, które ułatwiają utrzymanie komórek HSC CD34+CD133+CD90+ w hodowli ex vivo. Aby wykazać wzbogacenie populacji HSC w hodowli wraz ze zwiększoną generacją zmodyfikowanych genetycznie komórek HSC, przedstawiono zoptymalizowane procedury izolacji PBMNC, oczyszczania komórek CD34+, hodowli, edycji genów, transplantacji, charakterystyki engraftmentu oraz komórek zmodyfikowanych genetycznie in vivo (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomyślny wynik terapii genowej HSPC zależy przede wszystkim od jakości i ilości możliwych do wszczepienia HSC w przeszczepie. Jednak na właściwości funkcjonalne HSC duży wpływ ma faza przygotowawcza produktów terapii genowej, w tym hodowla in vitro i toksyczność związana z procedurą manipulacji genami. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zidentyfikowaliśmy idealne warunki hodowli HSPC, które zachowują macierzystość HSC CD34 + CD133 + CD90 + w hodowli ex vivo. Wiele grup b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować personelowi zakładu cytometrii przepływowej i zakładu dla zwierząt CSCR. A. C. jest finansowany przez stypendium ICMR-SRF, K. V. K. jest finansowany przez stypendium DST-INSPIRE, a P. B. jest finansowany przez stypendium CSIR-JRF. Praca ta została sfinansowana przez Departament Biotechnologii Rządu Indii (grant nr 1). BT/PR26901/MED/31/377/2017 oraz BT/PR31616/MED/31/408/2019)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4D-Nucleofector® X JednostkaLONZA BIOSCIENCEAAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit (16-dołkowy nukleokulet i handel; Paski)LONZA BIOSCIENCEV4XP-3032
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)THERMO SCIENTIFIC15240096
Anty-ludzki CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
Anty-ludzki CD13 PEBD BIOSCIENCE
Anty-ludzki CD19 PerCPBD BIOSCIENCE
Anty-ludzki CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE557749
Anty-ludzki CD90 APCBD BIOSCIENCE
561971 Anty-ludzki CD133/1 Miltenyibiotec130-113-673
Anty-ludzki CD34 PEBD BIOSCIENCE
Anty-mysie CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Iraladior krwi-2000  BRIT (Wydział Biotechnologii, Indie)BI 2000 
Naczynie do hodowli komórkowych (płytki 6-dołkowe poddane obróbce powierzchniowej delta)NUNC (THERMO SCIENTIFIC)
CrysoStor CS10BioLife roztwory#07952
BusulfanCELON LABS (60mg/10mL)- 
Guide-it Rekombinowany Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
  Probówka wirówkowa-15mlCORNING430790
  Probówka wirówkowa-50mlNUNC (THERMO SCIENTIFIC)
DMSOMPBIO219605590
DNAazaSTEMCELL TECHNOLOGIES6469
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ Ludzki zestaw selekcji pozytywnej CD34 IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
Magnes EasySepSTEMCELL TECHNOLOGIES18000
Jednostka do elektroforezyPOMARAŃCZOWA INDIEHDS0036
ARIA IIIBD BIOSCIENCE-&NBSP;
FlowJo BD BIOSCIENCE&nbsp;-
Flt3-LPEPROTECH300-19-1000
System obrazowania żelemCELL BIOSCIENCES11630453
Odczynnik HighPrep DTRMAGBIOGENOMICSDT-70005
Ludzki blok BD FcBD BIOSCIENCE553141
IL6PEPROTECH200-06-50
IMDM mediaTHERMO SCIENTIFIC12440053
Lampa na podczerwieńMURPHY-Strzykawka
insulinowa 6mm 31GBD BIOSCIENCE
KetaminaKETMIN 50-Loading
dye 6XTAKARA BIO9156
LymphoprepSTEMCELL TECHNOLOGIES7851
Ogranicznik myszyAVANTORTV-150
Nano kropliTHERMO SCIENTIFICND-2000C
Komora zliczania komórek NeubauerROHEM INSTRUMENTSCC-3073
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Laboratorium JacksonaRRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6. SCID Il2rγ −/− ZestawW41/W41 (NBSGW)Laboratorium JacksonaRRID:IMSR_JAX:026622
Płytka 6-dołkowa Nuncdelta THERMO SCIENTIFIC140675
Polistyrenowa rurka okrągłodennaBD352008
pierwotna komórka P3 Roztwór nukleofekcjiLONZA BIOSCIENCEPBP3-02250
Pipeta PasteuraFISHER SCIENTIFIC13-678-20A
Zestaw do czyszczenia PCRTAKARA BIO740609.25
Klatka na ciasto dla myszyFISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
polistyrenowa rurka okrągłodenna (12 x 75 mm)STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3Instytut Badań Biomedycznych Whiteheadhttps://primer3.ut.ee/
Szybki ekstrakt i handel; Roztwór do ekstrakcji DNALucigenQE09050
ReserveratrolSTEMCELL TECHNOLOGIES72862
SCFPEPROTECH300-07-1000
SFEM-IISTEMCELL TECHNOLOGIES9655
sgRNASYNTHEGO- 
SPINWINTARSON1020
StemReginin 1STEMCELL TECHNOLOGIES72342
Narzędzie do analizy ICESYNTHEGOa href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/
Tris-EDTA roztwór buforowy (TE) 1XSYNTHEGODostarczany z gRNA 
TermocyklerAPPLIED BIOSYSTEMS4375305
TPOPEPROTECH300-18-1000
Błękit trypanowyHIMEDIA LABSTCL046
UM171STEMCELL TECHNOLOGIES72914
UM729STEMCELL TECHNOLOGIES72332
KsylazynaXYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED-
555394 340421 348057 140675 339652 FBS THERMO SCIENTIFIC 10270106 Cytometr przepływowy – 324903 Spektrofotometr <

Bibliografia

  1. Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).
  2. Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).
  3. Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
  4. Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).
  5. Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
  6. Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
  7. Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
  8. Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684(2022).
  9. Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
  10. Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
  11. Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
  12. Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).
  13. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  14. Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
  15. Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421(2020).
  16. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
  17. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  18. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
  19. Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
  20. Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
  21. Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
  22. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
  23. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  24. Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
  25. Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).
  26. Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  27. Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
  28. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hematopoetyczne komórki macierzystehodowla ex vivonukleofekcjacytometria przepływowaanaliza szpiku kostnegokomórki CD34-dodatnie
Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.