Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

VCA to nowa opcja dla pacjentów wymagających skomplikowanej rekonstrukcji chirurgicznej. Urazy pourazowe lub resekcje guza powodują utratę objętości tkanki, która może być trudna do zrekonstruowania. VCA oferuje przeszczep wielu tkanek, takich jak skóra, kości, mięśnie, nerwy i naczynia krwionośne, jako przeszczep kompozytowy od dawcy do biorcy¹. Pomimo swojego obiecującego charakteru, VCA jest ograniczone ze względu na długoterminowe schematy immunosupresyjne. Stosowanie takich leków przez całe życie powoduje zwiększone ryzyko infekcji oportunistycznych, nowotworów złośliwych i toksyczności dla narządów końcowych^1,2,3. Aby pomóc zmniejszyć i/lub wyeliminować potrzebę immunosupresji, rusztowania inżynierii tkankowej wykorzystujące metody decelularyzacji VCA są bardzo obiecujące.

Decelularyzacja tkanek polega na zachowaniu struktury macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym usunięciu zawartości komórkowej i jądrowej. To bezkomórkowe rusztowanie może być ponownie zapełnione komórkami specyficznymi dla pacjenta⁴. Dodatkowym wyzwaniem jest jednak zachowanie sieci tkanek kompozytowych ECM. Wynika to z obecności wielu typów tkanek o różnej gęstości tkanki, architekturze i położeniu anatomicznym w rusztowaniu. Obecny protokół oferuje technikę chirurgiczną i metodę decelularyzacji kończyny tylnej szczura. Jest to model potwierdzający słuszność koncepcji zastosowania tej techniki inżynierii tkankowej do tkanek złożonych. Może to również skłonić do podjęcia dalszych wysiłków na rzecz regeneracji tkanek kompozytowych poprzez recelularyzację.

Zwłoki samce szczurów Lewisa (300-430 g) uzyskane z Instytutu Badawczego Szpitala Ogólnego w Toronto zostały użyte do wszystkich eksperymentów. Do wszystkich zabiegów chirurgicznych używano sterylnych narzędzi i materiałów w celu utrzymania techniki aeptycznej (patrz tabela materiałów). Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami w Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kanada). W sumie cztery kończyny tylne zostały pozbawione komórek.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Przygotuj 50 ml 5% soli fizjologicznej heparynizowanej. Z worka z solą fizjologiczną o pojemności 50 ml wyjmij 2,5 ml roztworu soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i wyrzuć. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml dodaj 2,5 ml heparyny do worka z solą fizjologiczną. Odwróć worek z solą fizjologiczną, aby wymieszać jego zawartość.
2. Umieść martwego szczura w pozycji leżącej na plecach pod niebieską podkładką. Ogol obwodowo kończyny tylne i pachwiny za pomocą golarki elektrycznej i usuń włosy.
3. Przynieś szczura do stanowiska chirurgicznego i nałóż roztwór peelingu jodowego powidonu za pomocą gazy na kończynę tylną i pachwinę. Następnie nałóż 70% alkoholu izopropylowego, aby zetrzeć roztwór peelingujący za pomocą gazy.
4. Wyrzuć niebieską podkładkę z kroku 1.2 i zmień ją na nowe, sterylne rękawice.

2. Zakup tylnych kończyn szczura

1. Wykonaj nacięcie skóry za pomocą ostrza chirurgicznego #10 i prowadnicy ostrza #3 wzdłuż poziomu więzadła pachwinowego, przesuwając się z kierunku bocznego do przyśrodkowego (Rysunek 1A). Użyj kleszczyków Adson, aby przytrzymać otaczającą skórę, aby zapewnić gładkie nacięcie.
2. Kiedy leżący pod spodem tłuszcz zostanie odsłonięty, użyj sekcji, aby ostrożnie przeciąć tłuszcz. Zlokalizuj górne naczynia w nadbrzuszu.
3. Użyj mikronożyczek, aby wypreparować proksymalnie i odsłonić leżący poniżej nerw udowy, tętnicę i żyłę na poziomie więzadła pachwinowego.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj naczynia udowe i wypreparuj tętnicę i żyłę proksymalnie za pomocą cienkich kleszczy, aby uzyskać wystarczającą długość od punktów rozwidlenia sieci tętniczej (Rysunek 1B).
5. Podwiązywać osobno tętnicę udową i żyłę za pomocą szwów 6-0.
6. Przeprowadź rozwarstwienie obwodowe wokół pozostałej części kończyny tylnej, nie naruszając podwiązanych naczyń udowych.
7. Przeciąć kość udową w połowie długości za pomocą noża do kości.
8. Aby w pełni odizolować kończynę tylną, należy przeciąć podwiązane naczynia udowe poniżej więzadeł za pomocą mikronożyczek.
9. Kankaniuj tętnicę udową za pomocą angiocewnika 24 G pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj cienkich kleszczyków, aby ostrożnie włożyć kaniulę. Przepłukać solą fizjologiczną podgrzaną heparyną, aż do uzyskania wyraźnego odpływu z żyły udowej.
10. Zabezpiecz kaniulę, zawiązując jeden szew wokół naczynia kaniulowanego, a drugi szew dystalnie wokół samej kaniuli. Upewnij się, że kaniula jest umieszczona proksymalnie, aby zapobiec blokowaniu punktów rozwidlenia.
11. Zanurz pozyskane kończyny tylne w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do czasu decelularyzacji.

Rysunek 1: Pozyskiwanie tylnych kończyn szczura. (A) Oznakowanie nacięcia skóry na poziomie więzadła pachwinowego od bocznego do przyśrodkowego. (B) Widok żyły udowej i tętnicy udowej, które zostały wypreparowane proksymalnie w kierunku więzadła pachwinowego, wskazywane linią przerywaną. Skróty: L = boczny; M = przyśrodkowy; FV = żyła udowa; FA = tętnica udowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie roztworów

1. W szklanej kolbie o pojemności 6 l przygotuj 5-litrowy zbiornik na detergent z 0,25% dodecylosiarczanem sodu (SDS), rozpuszczając 12,5 g proszku SDS w 5 l ultraczystej wody destylowanej. Przykryć otwór kolby parafilmem, aby go uszczelnić.
2. W szklanym słoiku o pojemności 1 l przygotuj oddzielnie 1 l 0,25% roztworu SDS, rozpuszczając 2,5 g SDS w 1 l ultraczystej wody destylowanej. Dodaj mieszadło, aby wymieszać roztwór na mieszadle magnetycznym, aż cała SDS się rozpuści.
3. Przygotuj 1 l 1x PBS roztworu do płukania z 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (AA). Do kolby o pojemności 1 l dodać 990 ml 1 x PBS roztworu i 10 ml AA.
4. Oddzielnie, w szklanym słoiku o pojemności 500 ml, przygotuj ponownie 1x PBS + 1% roztwór AA, używając 495 ml 1x PBS roztworu i 5 ml AA.
5. Przygotować 200 ml 1% roztworu kwasu nadoctowego (PAA)/4% etanolu (EtOH). Przygotuj ten roztwór pod wyciągiem.

4. Budowa bioreaktora i obwodu perfuzyjnego

UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 2, aby zapoznać się z konfiguracją bioreaktora i obwodu perfuzyjnego na wymienionych etapach.

1. W komorze o pojemności 500 ml (plastikowy pojemnik) wywierć trzy otwory (1/4 cala) w oznaczonych miejscach w Rysunek 2: Port A to linia doprowadzająca, port B to linia uzupełniająca, a port C to linia wylotowa. Usuń i wyrzuć nadmiar plastiku. Spryskaj i przetrzyj komorę 70% etanolem.
2. Wytnij trzy silikonowe rurki o długości 5 cm i włóż po jednej do połowy do każdego portu komory. Podłącz męskie złącze Luer w otworze portu A skierowane do wnętrza komory i żeńskie złącze Luer na drugim końcu rurki na zewnątrz komory.
3. Podłącz żeńskie złącze Luer do portu B i portu C na końcach rurek skierowanych na zewnątrz komory.
4. W hermetycznej pokrywie plastikowego pojemnika wywierć jeden otwór na powierzchni pokrywki.
5. Wytnij silikonową rurkę o długości 3 cm i włóż ją do otworu w pokrywce. Upewnij się, że około 2 cm rurki znajduje się poza pokrywą, jak pokazano na Rysunek 2.
6. Wysterylizuj zarówno komorę, jak i pokrywę za pomocą rurki.
7. Wytnij nożyczkami dwie silikonowe rurki o długości 30 cm. Podłącz złącze 1/16 cala do złącza 1/8 cala na jednym końcu każdej rurki.
8. Osobno wytnij dwie silikonowe rurki o długości 12 cm za pomocą nożyczek. Podłącz złącze 1/16 cala do złącza 1/8 cala na jednym końcu obu rurek. Podłącz męskie złącze Luer na drugim końcu jednej rurki i żeńskie złącze Luer do drugiej rurki.
9. Wysterylizuj cały materiał rurki z kroku 4.7 i kroku 4.8. Dołącz do sterylizacji dwie rurki z pompą 3-stopową (1,85 mm).
10. Przygotuj trzy 3-drogowe zawory odcinające, jeden filtr strzykawkowy, dwie pipety serologiczne o pojemności 1 ml i jedną strzykawkę o pojemności 10 ml do konfiguracji decelularyzacji. Wyjąć filtr z pipet serologicznych o pojemności 1 ml.

Rysunek 2: Przygotowanie budowy bioreaktora i obwodu perfuzyjnego. Pokazana aparatura obwodu perfuzyjnego, w tym (A) pompa perystaltyczna i (B) odpowiednie kasety zarówno dla przewodów wlotowych, jak i wylotowych. (C, D) Rurki silikonowe o długości 12 cm i 30 cm są również pokazane z odpowiednimi łącznikami. (E) Rurka do pompy perystaltycznej (1,85 mm). Komora bioreaktora z oznaczonymi portami dla (F) dopływu, (G) portu napełniania i (H) odpływu. (I) Pokrywa bioreaktora pokazana z portem wentylacyjnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Decelularyzacja tylnych kończyn szczura

1. Umieść wysterylizowaną komorę i przykręć trzy jednorazowe 3-drogowe zawory odcinające na liniach wlotowych, wylotowych i uzupełniających. Upewnij się, że zawór odcinający portu uzupełniania jest zaślepiony na pozostałych dwóch portach, aby zapobiec wyciekom.
2. Przymocuj rurki wykonane w kroku 4.8 do kurków na przewodach wlotowych i wylotowych.
3. Podłącz rurki perystaltyczne do rurek w powyższym kroku. Przymocuj kasetę do rurki perystaltycznej i umieść ją na pompie perystaltycznej. Nie zabezpieczaj jeszcze kaset rurkami na miejscu.
4. Podłącz jedną rurkę z kroku 4.7 do końca rurki perystaltycznej przewodu wylotowego od kroku powyżej. Podłącz pipetę serologiczną o pojemności 1 ml na drugim końcu. Zawiesić końcówkę przymocowaną pipetą serologiczną w kolbie zbiornika na odpady.
5. Powtórz krok 4.7 dla przewodu dopływowego. Zawiesić koniec rurki dołączonej do pipety serologicznej w zbiorniku detergentu. Natychmiast uszczelnić otwór kolby zbiornika detergentu parafilmem. Zobacz Rysunek 3A,B, aby zapoznać się z przeglądem obwodu decelularyzacji.
6. Dodaj 0,25% SDS ze szklanego słoika o pojemności 1 l (krok 3.2) do komory bioreaktora na połowie poziomu.
7. Weź zakupioną tylną kończynę za pomocą kleszczy Adson i ostrożnie zawieś ją w komorze bioreaktora.
8. Użyj dwóch par kleszczy Adson, aby poprowadzić kaniulowaną część kończyny tylnej do linii wlotowej. Trzymając kaniulę jedną parą kleszczy, użyj drugiej pary kleszczyków, aby skręcić i przymocować przewód dolotowy do kaniuli. Upewnij się, że kaniula nie jest ciągnięta ani skręcana, aby zapobiec deniuulacji.
9. Po zabezpieczeniu dodaj więcej 0,25% SDS ze szklanego słoika o pojemności 1 l, aby w razie potrzeby całkowicie zanurzyć kończynę. Upewnij się, że port wylotowy jest również zanurzony w zbiorniku bioreaktora, aby zapewnić utrzymanie stałego odpływu (Rysunek 3C).
10. Podłącz jednorazowy filtr strzykawkowy do otworu wentylacyjnego w pokrywie komory bioreaktora, odnosząc się do kroku 4.4 i kroku 4.5.
11. Zabezpiecz pokrywę bioreaktora i upewnij się, że komora jest uszczelniona ze wszystkich stron (Rysunek 3B).
12. Aby usunąć powietrze z przewodów i zalać obwód perfuzyjny, użyj nowej, jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml do pobrania detergentu ze zbiornika detergentu za pomocą 3-kierunkowego zaworu odcinającego na przewodzie dolotowym.
13. Po pobraniu użyj tego samego płynu, aby włożyć go do 3-drogowego kranu na przewodzie wylotowym. Upewnij się, że detergent jest obecny w przewodach zarówno na przewodzie wlotowym, jak i wylotowym.
14. Dociśnij i zabezpiecz kasety z rurką do pompy perystaltycznej. Włącz pompę perystaltyczną za pomocą przycisku zasilania.
    1. Na ekranie pompy perystaltycznej przejdź do drugiej zakładki za pomocą strzałki, aby ustawić szybkość perfuzji dla pierwszego kanału. Wprowadź natężenie przepływu jako sposób dostarczania i ustaw szybkość perfuzji na 1 ml/min. Upewnij się, że kierunek przepływu jest prawidłowy zgodnie z konfiguracją aparatury. Powtórz te czynności dla drugiego kanału.
    2. Skalibruj pompę perystaltyczną, aby upewnić się, że ilość płynu dostarczanego przez przewód dolotowy i/lub pobieranego z przewodu wylotowego przepływa ze stałą prędkością między nimi. Upewnij się, że identyfikator przewodu jest ustawiony na 1.85 mm.
15. Rozpocznij decelularyzację poprzez perfuzję maszynową z prędkością 1 ml/min zarówno dla linii wlotowej, jak i wylotowej, naciskając przycisk zasilania na klawiaturze. Monitoruj i upewnij się, że przepływ jest stały i ciągły zarówno na przewodach wlotowych, jak i wylotowych.
16. Kontynuuj decelularyzację i monitoruj codziennie. Użyj 1 l 0,25% SDS (krok 3.2), aby w razie potrzeby uzupełnić zbiornik bioreaktora przez port uzupełniania. Zwróć uwagę na biały, półprzezroczysty wygląd tkanki, który pojawi się do 5 dnia, wskazując na decelularyzację tylnych kończyn szczura.

Rysunek 3: Przegląd obwodu bioreaktora decelularyzacji perfuzyjnej tylnej kończyny szczura. (A) Schematyczne przedstawienie obwodu perfuzji bioreaktora. Niebieskie strzałki wskazują kierunek przepływu detergentu i odpadów. (B) Przegląd obwodu decelularyzacji z bioreaktorem zawierającym tylną kończynę szczura. Zbiornik SDS (lewa kolba) prowadzi do pompy perystaltycznej i do rurki wlotowej bioreaktora. Odpływ jest podłączony do zbiornika nieczystości (prawa kolba) poprzez pompę perystaltyczną. (C) (I) Bioreaktor zawierający tylną kończynę szczura z rurką wlotową podłączoną do kaniulowanej tętnicy udowej. (II) Port do uzupełniania znajdujący się w rogu do perfuzji detergentu. (III) Rurka odpływowa zawieszona w zbiorniku zawieszenia. Skrót: SDS = dodecylosiarczan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Mycie i sterylizacja po decelularyzacji

1. Po potwierdzeniu decelularizacji wymień zbiornik detergentu na 1x zbiornik PBS + 1% AA. Uszczelnić otwór kolby parafilmem. Rozpocznij 1x PBS + 1% perfuzja AA w tempie 1 ml/min i kontynuuj przez 2 dni.
2. Zastąp zbiornik 1x PBS + 1% AA na 200 ml zbiornika 0,1% PAA/4% EtOH i rozpocznij perfuzję z prędkością 1 ml / min przez 2 godziny.
3. Odłącz tylną kończynę od przewodu wlotowego za pomocą dwóch par sterylnych kleszczy Adsona, z jedną parą kleszczyków do skręcania przewodu wlotowego, a drugą trzymającą kaniulę. Upewnij się, że kaniula nie jest pociągnięta, aby zapobiec dekaniulacji.
4. Przechowuj kończynę w szklanym słoiku o pojemności 500 ml zawierającym 1x PBS + 1% AA w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.

Protokół pobierania był udany w izolowaniu i kaniulacji wspólnych tętnic udowych dla kolejnych etapów perfuzji. Reprezentatywne obrazy preparacji w Rysunek 1A,B pokazują miejsce nacięcia i odsłonięcie naczyń udowych w wystarczającej odległości od punktów rozwidlenia. Rysunek 2 pokazuje aparaturę wymaganą do przygotowania bioreaktora i obwodu perfuzji. Punkt końcowy decelularyzacji został określony poprzez obserwację białego, półprzezroczystego wyglądu tkanki. System perfuzji maszynowej ex vivo okazał się skuteczny w decelularyzacji perfuzji kończyn tylnych szczura. Utrzymano jednoprzebiegowy, zamknięty obwód systemu (Rysunek 3). Ogólna morfologia rodzimej kończyny tylnej zmieniła się w biały, blady wygląd po 5 dniach perfuzji 0,25% SDS (Rysunek 4).

Usunięcie zawartości komórkowej zaobserwowano po zabarwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E) w naczyniach udowych, skórze, nerwach, kościach i mięśniach, gdzie nie znaleziono żadnych jąder. Struktury każdej struktury tkankowej analizowano w stosunku do tkanki natywnej. Zarówno pozbawiona komórek tętnica i żyła udowa wykazywały utratę zawartości jądra we wszystkich warstwach i otaczającej tkance łącznej, biorąc pod uwagę brak jąder zabarwionych na niebiesko, w przeciwnym razie obecnych w naczyniach natywnych (Rysunek 5A, B i Rysunek 5D, E). Tunica intima, media i adventitia zarówno żyły udowej, jak i tętnic były utrzymywane w naczyniach pozbawionych komórek (Rysunek 5D, E). Nerw udowy wykazał zachowanie struktury tkankowej, w tym endonerium (Ryc. 5C i Ryc. 5F). Kość zachowała swoją ogólną strukturę tkankową po decelularyzacji, z obserwalną utratą barwionych jąder osteocytów z kości oraz z otaczających warstw śródkostnej i okostnej (Rysunek 5G i Rysunek 5J). Skóra wykazywała ubytek komórek z naskórka i skóry właściwej. Skóra właściwa wykazywała zatrzymane włókna kolagenowe, podobne do natywnej tkanki skórnej ( Rysunek 5H i Rysunek 5K). Wreszcie, widok poprzeczny mięśni szkieletowych wykazał utratę jąder znajdujących się na obrzeżach endomysium. Zawartość włókien mięśniowych pozostała zachowana w odpowiednich pęczkach po decelularyzacji (Rysunek 5I i Rysunek 5L). Przeprowadzono również kwantyfikację DNA za pomocą Picogreen, gdzie zawartość DNA została znacznie zmniejszona w naczyniach udowych, nerwach, skórze, mięśniach i kościach (Rysunek 6).

Rysunek 4: Ogólna morfologia natywnych i pozbawionych komórek kończyn tylnych szczura. (A) Tętnica udowa rodzimej kończyny tylnej kaniulowana za pomocą angiocewnika 24 G po pobraniu. (B) Biały, półprzezroczysty wygląd kończyny tylnej po 5 dniach decelularyzacji 0,25% SDS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Barwienie histologiczne tkanek kończyn tylnych szczura za pomocą hematoksyliny i eozyny. Natywna (górny panel) i bezkomórkowa (dolny panel) (A, D) żyła udowa i (B, E) tętnica, (C, F) nerw, (G, J) kość, (H, K) skóra i (I, L) mięsień. Ubytek jąder i zawartości komórkowej widoczny we wszystkich próbkach pozbawionych komórek komórkowych. Podziałka = 200 μm (naczynia, nerwy, kości) i 300 μm (skóra, mięśnie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Kwantyfikacja DNA natywnych i pozbawionych komórek tkanek kończyn tylnych szczura. Zawartość DNA jest zmniejszona w naczyniach natywnych i bezkomórkowych, nerwach, mięśniach, skórze i kościach, wyrażona w ng/mg suchej masy. Tkanki suszono i trawiono w papainie przez noc w temperaturze 65 °C. DNA wykrywano fluorescencyjnie za pomocą PicoGreen. Przeprowadzono wiele niesparowanych testów t. Dane przedstawione jako średnia ± SD. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Skróty: N = rodzimy; D = decellularized. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.