Artykuł metodologiczny

Mikroprzepływowe podejście do badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu

DOI:

10.3791/64072

⸱

18 sierpnia 2022

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Yeshiva University, 2Department of Physics, Katz School of Science and Health, Yeshiva University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje krystalizację mikroskopijnych kryształków lodu i hydratów klatratu w urządzeniach mikroprzepływowych, umożliwiając wymianę cieczy wokół utworzonych kryształów. Daje to niezrównane możliwości badania procesu krystalizacji i mechanizmów wiązania inhibitorów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładny mechanistyczny opis krystalizacji wody jest trudny i wymaga kilku kluczowych elementów: doskonałej kontroli temperatury, która pozwala na tworzenie pojedynczych mikroskopijnych kryształów oraz odpowiedniego systemu mikroskopowego sprzężonego z zimnym etapem. Opisana tutaj metoda dodaje kolejną ważną cechę, która obejmuje wymianę roztworów wokół lodu i kryształów hydratów klatratu. Opisany system składa się z połączenia unikalnych i opracowanych przez nas urządzeń, w tym mikrofluidyki, zimnych stopni o wysokiej rozdzielczości i mikroskopii fluorescencyjnej. Etap zimny został zaprojektowany dla urządzeń mikroprzepływowych i pozwala na tworzenie mikronowych kryształów lodu/hydratu wewnątrz kanałów mikroprzepływowych i wymianę roztworów wokół nich. Rozdzielczość temperaturowa i stabilność zimnego etapu wynosi jeden milikelwin, co ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania wzrostu tych małych kryształów. Ten zróżnicowany system jest wykorzystywany do badania różnych procesów krystalizacji lodu i hydratów oraz mechanizmu, za pomocą którego wzrost tych kryształów jest hamowany. Protokół opisuje, jak przygotować urządzenia mikroprzepływowe, jak hodować i kontrolować mikroskopijne kryształy w kanałach mikroprzepływowych oraz w jaki sposób wykorzystanie przepływu cieczy wokół kryształów lodu/hydratu dostarcza nowych informacji na temat krystalizacji wody.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka zapobiegające zamarzaniu (AFP) i glikoproteiny przeciw zamarzaniu (AFGPs) chronią różne organizmy przystosowane do zimna przed uszkodzeniami spowodowanymi mrozem1. AFP i AFGP (uogólnione jako AF(G)Ps) hamują wzrost kryształków lodu, wiążąc się nieodwracalnie z ich powierzchnią i hamując dalszy wzrost z powodu efektu Gibbsa-Thomsona2,3,4,5. Powstała w ten sposób luka, która tworzy się między temperaturą topnienia, która jest w dużej mierze niezmieniona, a nowo obniżoną temperaturą zamarzania, nazywana jest histerezą termiczną (TH) i stanowi mierzalny parametr odpowiadający aktywności AFP6. Stosowanie AFP do hamowania wzrostu lodu ma daleko idące i różnorodne zastosowania, oferując potencjalne ulepszenia w różnych dziedzinach, w tym w krioprezerwacji, jakości mrożonej żywności i ochronie upraw narażonych na zimno.

Krystalizacja wody w niskich temperaturach i pod wysokim ciśnieniem w obecności małych cząsteczek organicznych powoduje powstawanie hydratów klatratu (lub hydratów gazowych), gdzie najobfitszym hydratem jest hydrat metanu7. Krystalizacja hydratów metanu w przewodach przepływu gazu/ropy może powodować powstawanie korków, które mogą powodować eksplozje w wyniku zapłonu gazu8,9,10. Obecne wysiłki mające na celu zapobieganie krystalizacji hydratów w liniach przepływowych obejmują stosowanie inhibitorów termodynamicznych (alkohole i glikole) i kinetycznych (głównie polimerów)11,12,13,14. Stwierdzono również, że AFP wiążą się z kryształami hydratów klatratu i hamują ich wzrost, co wskazuje na potencjalne zastosowanie AFP do utrudniania tworzenia się czopów, zapewniając w ten sposób bardziej ekologiczne rozwiązanie15.

Mikrofluidyka jest powszechnie stosowaną metodą do badania właściwości płynów o niewielkich objętościach próbek (do fL), które przepływają przez sieć mikrokanałów16. Mikrokanały są zgodne ze wzorem utworzonym na płytce krzemowej (formie) za pomocą litografii17. Powszechnie stosowanym materiałem do wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych jest polidimetylosiloksan (PDMS), który jest niedrogi i stosunkowo prosty w obsłudze w laboratoriach badawczych. Konstrukcja funkcji (kanałów) jest skomponowana z uwzględnieniem konkretnego przeznaczenia urządzenia; dzięki temu może być wykorzystywany do różnych zastosowań, w tym do wykrywania DNA18, diagnostyki medycznej19 i procesów krystalizacji3,20,21.

Obecny protokół opisuje unikalną metodę mikroprzepływową hodowli mikronowych kryształów lodu i hydratów za pomocą różnych inhibitorów, w tym AFP i AFGP. W tych eksperymentach użyto hydratów tetrahydrofuranu (THF), aby naśladować właściwości hydratów metanu gazowego22, które wymagają specjalistycznego sprzętu do kontroli ciśnienia i temperatury23. Znakowane fluorescencyjnie AF(G)P wykorzystano do wizualizacji i analizy adsorpcji białek na powierzchni kryształu, a w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, podejście mikroprzepływowe pozwoliło na uzyskanie kluczowych cech procesu wiązania tych cząsteczek z powierzchniami kryształów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

  1. Przykryj wewnętrzną powierzchnię szalki Petriego folią aluminiową i umieść wcześniej przygotowaną formę na szalce Petriego.
    1. Wytwarzaj formy przy użyciu technik litograficznych opisanych w piśmiennictwie. Dwa projekty urządzeń użyte w niniejszej pracy są przedstawione w Rysunek 1.
  2. Przygotować 30-40 ml mieszaniny PDMS, ważąc mieszaninę utwardzacza i elastomeru w proporcji 1:10 (wagowo) (patrz Tabela materiałów) i mieszając w sposób ciągły przez około 5 minut, aż mieszanina stanie się biała i prawie nieprzezroczysta.
    UWAGA: Umieść plastikowy kubek na wadze, wlej elastomer do kubka, a następnie dodaj utwardzacz, aby uzyskać stosunek wagowy 1:10.
  3. Wlać mieszaninę PDMS do szalki Petriego z foremką i odgazować w eksykatorze, aż nie pozostaną pęcherzyki (około 30 minut).
  4. Formę z płynem PDMS pieczemy w piekarniku lub na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C, aż do uzyskania konsystencji gumy. Ten proces trwa około godziny.
  5. Wytnij urządzenie, śledząc elementy skalpelem, uważając, aby pchać skalpelem do przodu zamiast w dół, ponieważ pleśń jest delikatna. Wyjmij wycięte urządzenie PDMS, umieszczając je do góry nogami na nowej szalce Petriego. Usuń cząsteczki kurzu i brudu z dolnej powierzchni, przyklejając i usuwając kawałek taśmy klejącej (patrz Tabela materiałów).
  6. Za pomocą igły strzykawkowej (20 G) wybij otwory w urządzeniu na podstawie nadrukowanego wzoru, w razie potrzeby używając mikroskopu. Upewnij się, że otwór przechodzi przez drugą stronę urządzenia i użyj pęsety, aby usunąć wybite kawałki.
  7. Dokładnie umyj szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm, 0,14 mm grubości) wodą z mydłem, a następnie izopropanolem. Użyj ciśnienia powietrza, aby wysuszyć oczyszczone szkiełko nakrywkowe.
  8. Włóż oczyszczony PDMS i szkiełko nakrywkowe do myjki plazmowej, zamknij zawory i włącz zasilanie, próżnię i pompę. Pozwól czyszczyjce plazmowej pracować przez około minutę, ustaw RF na HI i pozwól, aby trochę powietrza dostało się do odkurzacza plazmowego za pomocą zaworu dokładnego.
    1. Gdy kolor okienka podglądu zmieni się z fioletowego na różowy, pozwól myjce plazmowej pracować przez 50 sekund i wyłącz RF. Pozostaw pompę włączoną przez minutę, a po jej wyłączeniu stopniowo otwieraj główny zawór, aby powietrze mogło dostać się do myjki plazmowej.
      UWAGA: Alternatywną metodą osiągania porównywalnych rezultatów jest klejenie na gorąco. W przypadku tej metody należy położyć formę na szkiełku nakrywkowym i umieścić ją na płycie grzejnej ustawionej na 70-80 °C na około 60 minut.
  9. Dociśnij powierzchnię PDMS do oczyszczonego szkiełka nakrywkowego i upewnij się, że są one połączone, obserwując brak oderwania podczas lekkiego podciągania szkiełka nakrywkowego.
  10. Zabezpiecz igłę igły 90° (18 G) szczypcami i zdejmij plastikowe złącze strzykawki, aby je wyjąć. Włóż jeden koniec igły do rurki Tygon (0.020" ID, 0.060" OD, patrz Tabela materiałów), a drugi koniec do jednego z wyciętych otworów urządzenia. Powtórz ten proces dla pozostałych otworów.
  11. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, wstrzyknij wodę/bufor do kanałów za pomocą szklanej strzykawki (pompa jest opcjonalna, ale nie użyto tutaj pompy). Przefiltruj wszystkie płyny za pomocą filtra 0,22 μm przed wstrzyknięciem ich do urządzenia.
  12. Użyj środka blokującego, takiego jak 1% roztwór BSA, aby zapobiec wiązaniu się znakowanych fluorescencyjnie AFP ze ściankami PDMS. Wstrzyknąć środek blokujący do kanału wlotowego i pozostawić go w mikrokanalikach przez 20 minut. Następnie wstrzyknąć roztwór buforowy do kanału wlotowego, aby wypłukać roztwór BSA.
    UWAGA: Powstałe urządzenie PDMS jest przymocowane do szkiełka nakrywkowego wzdłuż jego dolnej powierzchni, podłączone do rurki w otworach wlotowych i wylotowych oraz pokryte środkiem blokującym w kanałach.

2. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego

  1. Nałóż niewielką ilość olejku immersyjnego na powierzchnię zimnego etapu miedzi (patrz Tabela materiałów) i rozprowadź za pomocą niestrzępiącej się chusteczki, aby utworzyć cienką warstwę oleju. Następnie umieść czysty dysk szafirowy (patrz Tabela materiałów) na utworzonej warstwie oleju. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na środek szafirowej tarczy i umieść urządzenie PDMS na kropli w taki sposób, aby cechy urządzenia były wyrównane nad viewotwór zimnego stage.
  2. Przytrzymaj urządzenie na miejscu i przymocuj rurkę do zewnętrznych ścianek aluminiowej skrzynki, w której znajduje się zimny skręt, za pomocą taśmy klejącej. Zanotuj położenie każdej konkretnej rurki.
  3. Za pomocą szklanej strzykawki wstrzyknąć 4-5 μl roztworu AF(G)P (patrz Tabela materiałów) do kanału dolotowego. Zamknij pokrywę zimnego sceny.
    UWAGA: Stężenie roztworów AFP może być zróżnicowane i ustalane na podstawie ich intensywności fluorescencji. W niniejszym protokole zakres stężeń wynosił 5-40 μL.

3. Powstawanie monokryształów w kanałach mikroprzepływowych

  1. Oczyść zimny etap suchym powietrzem/azotem, aby zapobiec tworzeniu się w nim kondensacji. Aktywuj cyrkulacyjną kąpiel chłodzącą, aby cyrkulować wodę przez zimny etap i służyć jako radiator.
  2. Uruchom program kontroli temperatury i ustaw temperaturę na -25 °C.
    UWAGA: Zamarzanie nastąpi, gdy próbka osiągnie temperaturę ~-20 °C, co można zaobserwować jako nagłe ciemnienie i szorstkość próbki. W tym momencie można użyć dowolnego obiektywu, najlepiej obiektywu 4x, który umożliwia użytkownikowi obserwację całości kanałów mikroprzepływowych.
  3. Powoli, zwiększając temperaturę o około 1 °C/5 s, zbliżaj się do temperatury topnienia próbki, która może wynosić od -1 do -0,2 °C w zależności od buforu zastosowanego w roztworze AF(G)P. Gdy temperatura zbliży się do temperatury topnienia, poczekaj, aż kilka pojedynczych kryształów zostanie odizolowanych.
    UWAGA: W razie potrzeby niechciany lód można miejscowo stopić za pomocą lasera IR (980 nm) (patrz Tabela materiałów), który jest zamocowany na mikroskopie. Laser topi pobliskie kryształki lodu tak długo, jak długo jest włączony.
  4. W tym momencie zaleca się przełączenie na obiektywy 10x lub 20x, aby lepiej obserwować monokryształy. Po uzyskaniu pojedynczego kryształu w żądanym miejscu, hoduj kryształ, nieznacznie obniżając temperaturę (o ~0,01 °C), aż krawędzie kryształu zetkną się ze ściankami kanału.
  5. Przełącz się na obiektyw 50x, wstrzyknij roztwór AF(G)P do kanałów i obserwuj wzrost intensywności fluorescencji, co wskazuje, że roztwór białka został pomyślnie wstrzyknięty do kanałów. Wykonaj ten krok ostrożnie, aby uniknąć stopienia kryształu lodu podczas wymiany roztworów. Uważnie monitoruj i reguluj zarówno natężenie przepływu (poprzez większy/mniejszy nacisk na szklaną strzykawkę), jak i temperaturę podczas procesu wymiany roztworu.
  6. Poczekaj, aż białka zgromadzą się i zwiążą na powierzchni kryształu.
    UWAGA: Różni się to w zależności od szybkości akumulacji i adsorpcji AF(G)P5,25. W typowym eksperymencie dopuszcza się 5-10 minut na akumulację AFP

4. Pomiar aktywności histerezy termicznej (TH)

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny.

  1. Określ temperaturę topnienia kryształu, dostosowując temperaturę małymi krokami o 0,002 °C i obserwując najwyższą temperaturę, jakiej może być poddany mały kryształ bez jego topnienia.
  2. W funkcji RAMP regulatora temperatury ustaw szybkość chłodzenia na -0,05 do -0,01 °C/4 s i aktywuj RAMP. Zwróć uwagę na dokładną temperaturę, w której następuje nagły wzrost kryształów.
    UWAGA: Ta wartość nazywana jest temperaturą pęknięcia i odpowiada temperaturze zamarzania. Różnica między temperaturą topnienia i zamarzania to aktywność TH 25.

5. Wymiana roztworu wokół monokryształów

  1. Upewnij się, że temperatura próbki znajduje się w szczelinie TH, aby zapobiec topnieniu lub wzrostowi kryształu podczas eksperymentu.
  2. Nagraj proces wymiany roztworu za pomocą programu do obrazowania NIS Elements (patrz Tabela materiałów) w celu późniejszej analizy danych fluorescencyjnych. Powoli wstrzyknąć roztwór buforowy do drugiego wlotu urządzenia mikroprzepływowego i zaobserwować spadek sygnału fluorescencyjnego w szybkości zależnej od ciśnienia przyłożonego do strzykawki.
    1. Użyj tej reprezentacji wizualnej, aby upewnić się, że zastosowane ciśnienie nie jest zbyt wysokie, aby nie spowodować stopienia kryształu. Zobacz Rysunek 2 przedstawia sekwencję obrazów demonstrujących proces wymiany roztworu.
  3. Zmierz intensywność fluorescencji w kanale mikroprzepływowym za pomocą programu do obrazowania.
    UWAGA: Sygnał powinien osiągać szczyt w obszarze w pobliżu powierzchni kryształu, co wskazuje na wiązanie AFP, i powinien być stosunkowo niski w otaczającym roztworze, który został przepłukany buforem.
  4. Zmierz aktywność TH po wymianie roztworu zgodnie z krokiem 4.
  5. Powtórz eksperyment, izolując nowy kryształ (kroki 3.3-3.5). Wstrzyknąć roztwór AFP za pomocą szklanej strzykawki i powtórzyć wymianę roztworu (kroki 5.1-5.3). Otrzymać nowy monokryształ (kroki 3.3-3.5) i przelać roztwór AFP do kanałów za pomocą szklanej strzykawki.

6. Eksperymenty z hydratami klatratu

  1. Aby uzyskać hydraty THF, należy przygotować roztwór THF/woda o stosunku molowym 1:15, który jest stosunkiem objętości 1:3.326. Utrzymać ten stosunek we wszystkich roztworach stosowanych w poniższych doświadczeniach, w tym w roztworach zawierających AF(G)P lub inne inhibitory.
  2. Wykonaj kroki 1 i 2, aby przygotować urządzenie mikroprzepływowe i umieścić je w zimnym scenie. Ustaw temperaturę na -25 °C; próbka zamarznie w temperaturze ~-20 °C, jak opisano w kroku 3.2.
  3. Po zamrożeniu roztworu THF powoli zwiększaj temperaturę, aż cały lód się stopi.
    UWAGA: Temperatura topnienia lodu jest lekko obniżona przez THF.
  4. Aby upewnić się, że wszystkie kryształki lodu stopiły się z wyłączeniem hydratów, należy utrzymywać temperaturę 1 °C przez 3 minuty.
  5. Ustawić temperaturę na -2 °C i obserwować obfitość hydratów, które pojawiają się w kanałach mikroprzepływowych przy braku inhibitorów.
    UWAGA: Hydraty THF mają kształt ośmiościanów (Rysunek 2), aw niektórych przypadkach kryształy są bardzo cienkie; W związku z tym wyraźna obserwacja może być trudna. W takich przypadkach zaleca się powtórzenie kroków 6.4-6.5 w celu uzyskania nowych kryształów.
  6. Wstrzyknąć inhibitor AF(G)P / do kanału mikroprzepływowego za pomocą szklanej strzykawki, jednocześnie dostosowując temperaturę, aby uzyskać pewność, że otrzymane kryształy nie topią się/nie rosną. Odczekaj kilka minut, aż cząsteczki inhibitora zaadsorbują się na powierzchni kryształu.
  7. W razie potrzeby zmierz aktywność TH zgodnie z krokiem 4.
  8. Wymienić roztwór wokół kryształów zgodnie z opisem w krokach 5.2-5.3.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wymiana roztworu z kryształkami lodu
Udana wymiana roztworu wokół kryształu lodu jest przedstawiona w Rysunek 3. Sygnatura czasowa na każdej migawce wskazuje, że wymiana rozwiązania była stosunkowo szybka; Możliwa jest jednak wolniejsza wymiana. Intensywność fluorescencji pochodzącej z zaadsorbowanych w lodzie cząsteczek AFGP jest wyraźnie obserwowana po zakończeniu wymiany (Rysunek 3, po prawej). Analiza ilościowa stężenia AFP na powierzchni lodu jest monitorowana za pomocą narzędzia do wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI) (Rysunek 4). W tym eksperymencie4 użyto AFP typu III (izoforma QAE) rozcieńczonego w 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) i 100 mM NaCl. Roztwór jest wymieniany wokół kryształu w kształcie bipiramidy i monitorowana jest intensywność fluorescencji w roztworze i na lodzie. Czerwony wykres wskazujący sygnał fluorescencji w roztworze jest zmniejszany o współczynnik 100 podczas wymiany roztworu, podczas gdy obliczony sygnał (zielony wykres) na powierzchni lodu pozostaje stały. Obliczony sygnał cząsteczek zaadsorbowanych w lodzie uzyskano poprzez odjęcie sygnału pochodzącego z roztworu (pomnożonego przez stałą odnoszącą się do grubości kanału mikroprzepływowego) od sygnału pochodzącego z ice4.

Wymiana roztworu z hydrates THF
Eksperymenty mikroprzepływowe z hydratami THF przeprowadzono podobnie jak eksperymenty z lodem. Po tym, jak kryształy hydratu zostały dopuszczone do adsorpcji cząsteczek inhibitora z roztworu, roztwór wolny od inhibitora wstrzyknięto do kanałów. Rysunek 5 przedstawia hydraty THF po wymianie roztworu z dwoma typami inhibitorów: AFGP1-5 znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Rysunek 5A) i safranina O (patrz Tabela Materiałów), która jest barwnikiem fluorescencyjnym26 (Rysunek 5B). Jest to pierwszy przypadek wiązania AFGP z powierzchnią hydratu klatratu.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie kanałów mikroprzepływowych użytych w niniejszym badaniu. Obie konstrukcje zawierają dwa wloty i jeden wylot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Hydraty THF powstały w kanale mikroprzepływowym po schłodzeniu temperatury do ~-2 °C. Morfologia wszystkich przedstawionych kryształów to czworościan; Jednak niektóre kryształy są zorientowane inaczej. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywny eksperyment pokazujący wymianę roztworu wokół pojedynczego kryształu lodu w kanale mikroprzepływowym. Początkowo roztwór zawierał AFGP1-5 znakowany FITC, a AFGP zaadsorbowane w lodzie nie były obserwowane. Po wymianie roztworu na roztwór wolny od AFGP, białka, które wcześniej zostały zaadsorbowane na powierzchni lodu, zostały wyraźnie wykryte (zdjęcie po prawej). Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ilościowa i jakościowa analiza stężenia AFP na powierzchni lodu. (A) Kryształ lodu o wysokim stężeniu roztworu AFP (przed wymianą roztworu). (B) Ten sam kryształ po roztworze AFP został wymieniony na roztwór buforowy wolny od AFP. Podziałka = 20 μm. (C) Analiza ilościowa intensywności fluorescencji na powierzchni lodu () i w roztworze (czerwona) podczas wymiany roztworu. Zielona krzywa przedstawia obliczoną intensywność na powierzchni lodu. Rysunek został zaadaptowany za zgodą reference4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Pojedyncze kryształy hydratu THF w kanałach mikroprzepływowych po wymianie roztworu wokół nich (A, AFGP1-5) lub (B, Safranina O). Obraz w (B) jest odtworzony z reference26. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół został zaprojektowany w celu wykorzystania połączenia przepływu mikroprzepływowego z mikroskopijnymi kryształami w celu ujawnienia nowych informacji na temat wzrostu kryształów i jego hamowania. Zimny stopień27 z regulacją temperatury o rozdzielczości milikelwinów umożliwia kontrolę pojedynczych mikroskopijnych kryształów znajdujących się wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, umożliwiając w ten sposób wymianę roztworów wokół nich. Podczas gdy wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych jest standardowe i podobne do powszechnych praktyk 17,18, kontrola nad wzrostem i topnieniem kryształów wewnątrz urządzenia jest wyjątkowa i nowatorska. Najbardziej krytycznym elementem tego systemu jest doskonała kontrola temperatury, którą uzyskuje się dzięki zastosowaniu chłodnic termoelektrycznych Peltiera, sprzężenia zwrotnego z termistora znajdującego się blisko próbki oraz regulatora temperatury o wysokiej rozdzielczości, który zarządza pętlą sprzężenia zwrotnego.

Kolejnym krytycznym krokiem jest sama wymiana roztworu, ponieważ kryształy mogą się stopić lub urosnąć podczas tego procesu; W związku z tym temperatura musi być dostosowana podczas wymiany roztworu, aby zapobiec wzrostowi/topnieniu. Tworzenie się kryształów w kanałach mikroprzepływowych zakłóca przepływ cieczy i stanowi główne wyzwanie tego systemu; Stąd wzrost tych kryształów musi być kontrolowany. W tym przypadku laser IR (980 nm) został zamontowany na odwróconym mikroskopie i został użyty do lokalnego stopienia niechcianych kryształów lodu/hydratu28. Jeśli taki laser nie może być użyty, metalowe łączniki urządzenia mikroprzepływowego mogą być podgrzewane przez dodatkową chłodnicę termoelektryczną Peltiera, która stopi lód na wlocie/wylocie urządzenia.

Opisana tutaj metoda obejmuje przyrządy opracowane przez siebie (etap zimny) i wymaga szkolenia, ponieważ niektóre z wyżej wymienionych kroków są trudne. Ponieważ stężenie roztworu otaczającego kryształy może się zmieniać nawet wtedy, gdy przepływ nie jest zamierzony, prosty krokkalibracji 5 może zapewnić wiarygodne oszacowanie stężenia na podstawie sygnału fluorescencji. Innym możliwym rozwiązaniem problemu niepożądanego przepływu (na przykład podczas pomiarów TH) są zawory mikroprzepływowe, które są opisane w odnośniku4.

System ten został również wykorzystany do zbadania zachowania wzrostu lodu D2O w cieczy H2O, badanie, które ujawniło nowe zjawisko mikroskopijnych, ząbkowanych powierzchni lodu27. Dzięki temu mikrofluidyka może być wykorzystywana w badaniu różnych układów krystalicznych, które dobrze reagują na zmiany temperatury.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podziękowania dla Darczyńców Funduszu Badań Naftowych Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego za wsparcie tych badań (numer grantu 60191-UNI5). Autorzy pragną podziękować prof. Ido Braslavsky'emu za pionierskie zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania białek płynu niezamarzającego i lodu. Autorzy są wdzięczni prof. Arthurowi DeVriesowi, prof. Konradowi Meisterowi i prof. Peterowi Daviesowi za dostarczenie próbek białek zapobiegających zamarzaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry 0,22 mikronaFisher Scientific
igłyGauge 18
Białka przeciw zamarzaniu i glikoproteiny przeciw zamarzaniuPrezentZobacz referencje 5 i 28
igły18 i 20 Gauge
(BSA)Sigma-Aldrich
Cold scenaDomowa robota
Szkiełka nakrywkoweGlobe Scientific18 X 18 mm, grubość 0,14 mm
Szklana strzykawka
Laser na podczerwień 980 nmOpto Engine LLC
Mikroskop odwrócony, Eclipse Ti - SNikon
Niewidoczna taśmaZszywki
niestrzępiąca się chusteczkaRegulator temperatury Kimwipes
Newport 3040Newport
NIS-Elements Pompaoleju Nikon
Harrick Plasma
PDC-32G
Polidimetylosiloksan (zestaw elastomerów silikonowych Dow Corning Sylgard 184)Dow Corning Syglard
Safranine OSigma-AldrichS2255-25G
Szafirowy dyskTed Pella Inc16005-1010  Średnica 25,4 mm, grubość 0,3 mm
Kamera sCMOS, Neo 5.5Andor
Tetrahydrofuran (THF)Sigma-Aldrich401757-100ML
Tygon Microbore rurka do urządzenia mikroprzepływowegoCole-Parmer  0,020" ID, 0,060"OD, 100 stóp/rolkę.
Wężyk Tygon do cyrkulacji wody i azotuCole-Parmer1/8" Identyfikator, 3/16" OD
wygięte pod kątem 90 stopni Albumina surowicy bydlęcej Oprogramowanie do obrazowania próżniowa Środek do czyszczenia plazmy Harrick Plasma

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. Ice-Binding Proteins and Their Function. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).
  2. Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  3. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  4. Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition. Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).
  5. Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice. Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).
  6. Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. Journal of Visualized Experiments. (72), e4189(2013).
  7. Ruppel, C. D., Kessler, J. D. The interaction of climate change and methane hydrates. Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).
  8. Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems. Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).
  9. Sa, J. H., et al. Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids. Scientific Reports. 6, 31582(2016).
  10. Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates. Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).
  11. Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by α-Helical Antifreeze Proteins. Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).
  12. Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation. Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).
  13. Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein. Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).
  14. Walker, V. K., et al. Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors. Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).
  15. Gordienko, R., et al. Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates. PloS One. 5 (2), 8953(2010).
  16. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  17. Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device. Journal of Visualized Experiments. (106), e53516(2015).
  18. Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview. Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).
  19. Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. Advances in diagnostic microfluidics. Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).
  20. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4 (3), 032202(2017).
  21. Haleva, L., et al. Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins. Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).
  22. Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties. Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).
  23. Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor. Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).
  24. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  25. Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics. Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526(2014).
  26. Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures. ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).
  27. Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v, Ward, M. D. Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).
  28. Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity. Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microfluidic CrystallizationIce CrystallizationAntifreeze ProteinsSolution ExchangeCold Stage MicroscopyFluorescence MicroscopySingle Crystal GrowthTemperature ControlTHF Hydrates

Powiązane artykuły