Artykuł metodologiczny

Strategia badania komórek limfoidalnych wytwarzających IL-9 w modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64075

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Limfocyty T i ILC2 wykazujące ekspresję IL-9 są indukowane podczas infekcji N. brasiliensis, jednak ich charakterystyka została w dużej mierze przeoczona w zakażonym jelicie ze względu na ich niską częstotliwość i różnicową kinetykę. Protokół ten opisuje izolację tych komórek z różnych narządów docelowych i potwierdzenie ich tożsamości za pomocą cytometrii przepływowej na różnych etapach infekcji.

Streszczenie

IL-9 to plejotropowa cytokina związana z różnymi procesami, w tym odpornością przeciwnowotworową, indukcją patologii alergicznych i odpowiedzią immunologiczną przeciwko infekcjom robakami pasożytniczymi, gdzie odgrywa ważną rolę w wydalaniu pasożyta. W mysim modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis IL-9 jest wytwarzana głównie przez limfocyty T CD4 + i wrodzone komórki limfoidalne znajdujące się w płucach, jelicie cienkim i drenujących węzłach chłonnych. Biorąc pod uwagę trudności techniczne związane z wewnątrzkomórkowym barwieniem IL-9, a także złożoność izolowania komórek krwiotwórczych z jelita cienkiego po zakażeniu, istnieje pilna potrzeba kompleksowego, ale prostego protokołu do analizy ekspresji IL-9 w różnych tkankach limfoidalnych i nielimfoidalnych w tym modelu. Opisany tutaj protokół przedstawia kinetykę IL-9 wytwarzanej przez limfocyty T CD4 + i wrodzone komórki limfoidalne w płucach i jelicie cienkim, głównych narządach docelowych przez N. brasiliensis, a także w węzłach chłonnych śródpiersia i krezkowych, przez cały czas trwania infekcji. Ponadto wyszczególnia liczbę larw potrzebnych do infekcji, w zależności od typu komórki i narządu będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół ten ma na celu pomoc w standaryzacji testów w celu zaoszczędzenia czasu i zasobów, oferując możliwość skupienia się na konkretnych komórkach, narządach i stadiach choroby będących przedmiotem zainteresowania w modelu infekcji N. brasiliensis.

Wprowadzenie

Tęgoryjce to pasożyty jelitowe, które infekują około 700 milionów ludzi na całym świecie, głównie w obszarach tropikalnych w krajach słabo rozwiniętych. Zakażenia o wysokiej intensywności Ancylostoma duodenale i Necator americanus, najczęstszymi pasożytami tęgoryjca u ludzi, powodują niedokrwistość i niedobór białka, co może skutkować opóźnionym wzrostem i rozwojem umysłowym1. N. americanus i pasożyt gryzoni Nippostrongylus brasiliensis indukują prototypową odpowiedź immunologiczną typu 2 u swojego gospodarza i wykazują podobieństwa w cyklu życiowym. W związku z tym zakażenie myszy N. brasiliensis jest najczęściej stosowanym modelem zakażeń tęgoryjcem u ludzi. Etap 3 (L3): Larwy zakaźne N. brasiliensis przemieszczają się ze skóry do płuc w ciągu pierwszych kilku godzin po zakażeniu. Po dostaniu się do płuc stają się L4 i migrują w górę tchawicy, aby zostać połknięte, przejść przez żołądek i dotrzeć do jelita, aby stać się dorosłymi (L5) w ciągu 4-5 dni. W jelitach robaki L5 składają jaja, które są wydalane z kałem, aby wznowić cykl życiowy pasożyta2.

Odpowiedź immunologiczna wywołana przez N. brasiliensis charakteryzuje się wzrostem kilku cytokin typu 2, w tym IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 i IL-13, wraz z eozynofilią, bazofilią, hiperplazją komórek tucznych i kubkowych oraz zwiększoną produkcją IgG1 i IgE. Większość badań próbujących zidentyfikować i zdefiniować odpowiedzi immunologiczne wywołane zakażeniem N. brasiliensis koncentruje się na roli IL-4 lub IL-13 w tym modelu3. Jednak identyfikacja i charakterystyka komórek wykazujących ekspresję IL-9 oraz funkcja tej cytokiny były w dużej mierze pomijane, dopóki Licona-Limón i in. nie opublikowali pierwszego badania wykazującego kluczową rolę IL-9 w odpowiedzi immunologicznej przeciwko N. brasiliensis. Wykorzystując myszy reporterowe, badanie to opisało limfocyty T (głównie T helper 9) i wrodzone komórki limfoidalne typu 2 (ILC2s) jako główne podzbiory komórkowe wyrażające IL-9 po infekcji4.

Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z płuc zakażonych robakami pasożytniczymi jest możliwa i została obszernie opisana3,4. Jednak ze względu na nieodłączną przebudowę tkanek i produkcję śluzu, zrobienie tego w zakażonym jelicie okazało się wyzwaniem technicznym, aż do niedawnej publikacji Ferrer-Font et al.5. Grupa opracowała protokół izolowania i analizowania jednokomórkowych zawiesin podzbiorów immunologicznych z mysich jelit zakażonych Heligmosomoides polygyrus. Na tej podstawie ustandaryzowaliśmy protokół izolacji i analizy cytometrycznej komórek limfoidalnych wykazujących ekspresję IL-9 z jelita zakażonego N. brasiliensis. Ponadto ustaliliśmy kinetykę IL-9 z różnych źródeł komórkowych i lokalizacji anatomicznych podczas całej infekcji.

Scharakteryzowanie odrębnych populacji komórek biorących udział w tej infekcji jest niezbędne dla szerszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej na pasożyta i jego interakcji z gospodarzem. Ten kompleksowy protokół zapewnia jasną drogę do izolacji i analizy komórek wytwarzających IL-9 z pożądanych narządów w interesujących stadiach choroby, co pozwala na znaczne poszerzenie wiedzy na temat roli tych komórek w zakażeniu N. brasiliensis i ogólnie w zakażeniach pasożytami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Wewnętrzny Komitet ds. Postępowania ze Zwierzętami (CICUAL) Instytutu Fizjologii Komórkowej Narodowego Uniwersytetu Autonomicznego Meksyku.

UWAGA: Schemat blokowy całego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Trzymanie myszy

  1. Używaj 8-10-tygodniowych, żeńskich lub męskich grup myszy, trzymanych w pomieszczeniach dla zwierząt o stałej temperaturze i wilgotności w 12-godzinnych cyklach światła/ciemności, z dostępem ad libitum do wody i pożywienia.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje szczep myszy reporterowej IL-9 w tle C57BL/6, jak opisano wcześniej4; jednak można użyć innych szczepów reporterowych IL-96,7,8, a także wewnątrzkomórkowego barwienia IL-9, ze zmiennymi wynikami9.

2. Zakażenie myszy

  1. Ogol grzbiet myszy od środka ciała do prawie podstawy ogona 1 dzień przed infekcją. Stosowanie środków znieczulających nie jest konieczne.
  2. Podskórnie zaszczepić każdą mysz 200 żywotnymi larwami N. brasiliensis trzeciego stadium (L3) w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)10 w dolnej części pleców, jak opisano wcześniej2,11, lub wstrzyknąć 100 μL samego PBS jako kontrolę. Uśmierc zwierzęta w 4, 7 lub 10 dniu po zakażeniu.

3. Izolacja węzłów chłonnych płuc, jelita cienkiego, śródpiersia i krezki

  1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Umieść mysz na plecach i spryskaj ją 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek i otwórz skórę, aby odsłonić okolice brzucha i klatki piersiowej.
    UWAGA: Izofluran może być stosowany jako alternatywna metoda eutanazji12. Komory na dwutlenek węgla nie są zalecane, ponieważ CO2 prowadzi do uszkodzenia tkanki płucnej i krwotoku13.
  2. Izolacja węzłów chłonnych śródpiersia i płuc
    1. Wykonaj nacięcie w mostku i wytnij w kształcie litery "V", aby usunąć żebra i mięśnie klatki piersiowej. Po odsłonięciu klatki piersiowej zlokalizuj węzły chłonne śródpiersia obok przełyku, poniżej serca (patrz rysunek uzupełniający 1).
    2. Wyodrębnij węzły chłonne śródpiersia i zbierz je w 1 ml pożywki R-10 (Tabela 1) na 12-dołkowej płytce hodowlanej. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu przetworzenia.
      UWAGA: Próbki należy chronić przed światłem, aby uniknąć zmniejszenia sygnału fluorescencyjnego od myszy reporterowych używanych w tych eksperymentach.
    3. Wyodrębnij płuca i zbierz je w 1 ml pożywki R-10 na 12-dołkowej płytce hodowlanej na mysz. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu przetworzenia.
  3. Izolacja łańcuchów węzłów chłonnych krezkowych i jelita cienkiego
    1. Odsłoń jamę otrzewnej i ostrożnie przesuń jelito cienkie w prawo, aby odsłonić łańcuch krezkowego węzła chłonnego (MLN) wzdłuż okrężnicy.
    2. Za pomocą kleszczy usuń MLN, delikatnie zwiń go na ręczniku papierowym i wyciągnij tłuszcz.
    3. Przenieść MLN do 1 ml pożywki R-10 na 12-dołkowej płytce hodowlanej. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu przetworzenia.
    4. Przetnij jelito cienkie tuż poniżej zwieracza odźwiernika i powyżej jelita ślepego. Powoli wyciągnij jelito za pomocą kleszczy, usuwając przyczepioną krezkę i tkankę tłuszczową.
    5. Umieść jelito cienkie na ręczniku papierowym i obficie zwilż je PBS. Usuń plastry Peyera z jelita cienkiego nożyczkami.
      UWAGA: Aby zachować żywotność, usuń pozostałą tkankę tłuszczową i utrzymuj wilgotne jelito cienkie za pomocą PBS podczas całego procesu.
    6. Przetnij jelito cienkie wzdłuż za pomocą nożyczek i delikatnie przesuń kleszcze po otwartym jelicie, aby usunąć zawartość kału i śluz.
    7. Trzymaj jelito cienkie kleszczami i umyj je w 5 ml PBS na lodzie, ostrożnie zanurzając je kilka razy. Powtórz dwa razy.
    8. Pokrój jelito cienkie na krótkie kawałki (około 5 mm) i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 10 ml HBSS14 z 2% FBS (Tabela 1). Natychmiast kontynuuj izolację komórek śródnabłonkowych i blaszki właściwej.

4. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z jelita cienkiego, płuc i węzłów chłonnych

UWAGA: Jest niezwykle ważne, aby podczas przygotowywania zawiesin jednokomórkowych z jelita cienkiego przetwarzać maksymalnie sześć myszy na osobę, ponieważ żywotność komórek znacznie spada wraz z dłuższymi okresami przetwarzania. Ta metoda została zaadaptowana z mysiego modelu infekcji Heligmosomoides polygyrus5.

  1. Wstępnie ogrzać inkubator do wytrząsania, pożywkę R-20, HBSS i HBSS-2 mM EDTA (Tabela 1) w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować 10 ml pożywki do trawienia jelita cienkiego (tabela 1) na próbkę.
  3. Energicznie potrząśnij ręcznie kawałkami jelita z kroku 3.3.8.
  4. Przefiltrować każdą próbkę przez nylonową siatkę (około 10 cm x 10 cm) nad szklanym lejkiem. Przemyć próbkę, dodając 10 ml wstępnie ogrzanego HBSS na siatkę i odrzucić przepływ. Powtórz jeszcze raz.
    UWAGA: Użyj nowej siatki dla każdej próbki i używaj jej ponownie przez cały czas trwania procedury.
  5. Usunąć siatkę z lejka i pobrać próbkę z siatki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 10 ml ciepłego HBSS-2 mM EDTA (krok 4.1). Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min.
  6. Wirować przez 10 s z maksymalną prędkością (3 200 obr./min) i przefiltrować próbkę z siatką przez szklany lejek, odzyskując przepływ w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  7. Powtórzyć kroki 4.5 i 4.6 dwukrotnie, odzyskując przepływ w tej samej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Komórki śródnabłonkowe znajdują się w tej frakcji 30 ml. Zachowaj pozostałą tkankę.
  8. Preparat zawiesiny jednokomórkowej z komórek śródnabłonkowych
    1. Odwirować 30 ml zawiesiny komórkowej, odzyskanej w kroku 4.7, przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant.
    2. Dodać 5 ml PBS i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    3. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNazy (Tabela 1). Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem aż do zabarwienia komórek.
  9. Preparat zawiesiny jednokomórkowej z komórek blaszki właściwej
    1. Umyj pozostałą tkankę jelita cienkiego z kroku 4.7, przelewając ponad 10 ml ciepłego HBSS przez siatkę nad lejkiem. Powtórz pranie. Zebrać tkankę z siatki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 10 ml pożywki do trawienia jelita cienkiego.
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min. Wiruj z maksymalną prędkością przez 10 s co 5 minut.
    3. Dodać 10 ml buforu FACS-EDTA (Tabela 1), aby zatrzymać reakcję trawienia i umieścić go na lodzie.
    4. Przefiltrować każdą próbkę przez sitko o wielkości 100 μm za pomocą pipety serologicznej, odzyskując zawiesinę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie.
    5. Wirować przy 600 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Odrzucić supernatant. Przemyć osad komórkowy 5 ml PBS i odwirować przy 600 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNazy. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem aż do zabarwienia komórek.
  10. Preparat zawiesiny jednokomórkowej z płuc
    UWAGA: Każde płuco i jelito cienkie powinny być przetwarzane równolegle przez dwie osoby, aby uniknąć wydłużonego czasu obsługi, co skutkuje niską żywotnością komórek.
    1. Przygotować 4 ml pożywki do wytrawiania płuc (Tabela 1) na każdą przetworzoną próbkę.
    2. Usunąć pożywkę RPMI ze studzienki zawierającej płuca z kroku 3.2.3. Pokrój płuco na małe kawałki cienkimi nożyczkami.
    3. Przenieść kawałki płuc do stożkowej rurki o pojemności 15 ml za pomocą szpatułki. Dodać 4 ml pożywki do trawienia płuc (Tabela 1).
    4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 250 obr./min. Po zakończeniu trzymać na lodzie, aż każda próbka zostanie przetworzona.
    5. Przefiltrować każdą próbkę przez sitko o wielkości 100 μm, umieszczone w pojedynczym dołku 6-dołkowej płytki hodowlanej. Oddzielić tkankę za pomocą tłoka strzykawki.
    6. Odzyskać każdą próbkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dodać 4 ml pożywki R-2 (Tabela 1). Przechowywać na lodzie do czasu przetworzenia pozostałych próbek.
    7. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki R-5 (Tabela 1).
    8. Podczas wirowania przygotuj 4 ml roztworu o gradiencie gęstości 27,5% (Tabela 1) na próbkę, aby wzbogacić frakcję komórek krwiotwórczych15,16. Ta strategia separacji pojedynczych komórek jest bardziej wydajna, opłacalna i mniej toksyczna w porównaniu z innymi mediami o podobnym gradiencie gęstości17.
    9. Dodać 4 ml roztworu o gradiencie gęstości 27,5% do 1 ml zawiesiny komórek z kroku 4.10.7 i energicznie wstrząsnąć.
    10. Powoli dodawać 1 ml pożywki R-5 (Tabela 1) na wierzch zmieszanej zawiesiny, aby utworzyć dwie fazy.
    11. Wirować przy 1 500 x g przez 20 minut przy suchej smoła, przy niskim przyspieszeniu i wyłączonym hamulcu. Obserwuj pierścień utworzony między dwiema fazami.
    12. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml odzyskać pierścień utworzony między dwiema fazami i ponownie zawiesić w 4 ml pożywki R-2.
    13. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu ACK (Tabela 1) i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    14. Dodać 4 ml pożywki R-5 i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki R-10. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu zabarwienia do cytometrii przepływowej.
  11. Preparat zawiesiny jednokomórkowej z węzłów chłonnych
    1. Umieścić węzły chłonne z kroków 3.2.2 lub 3.3.3 między dwoma kawałkami siatki w studzience z 6-dołkowej płytki hodowlanej i oddzielić od nich za pomocą tłoka strzykawki.
    2. Odzyskać zawiesinę komórkową w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki R-10. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu barwienia do cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Jeśli widoczne są grudki, przefiltruj próbkę przez sitko o wielkości 100 μm.

5. Barwienie komórek w cytometrii przepływowej (Rysunek 2 i Rysunek 3)

UWAGA: Odwiruj zawiesiny komórek węzłów chłonnych z kroku 4.11.3 przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 500 μL buforu FACS (Tabela 1).

  1. Barwienie komórek w celu identyfikacji ILC2 (Rysunek 3 i Rysunek uzupełniający 2)
    UWAGA: Ta procedura barwienia jest specyficzna dla identyfikacji komórek ILC2 wykazujących ekspresję IL-9.
    1. Płytka 150 μl na próbkę płuc (około 1,8 x 106 komórek) z kroku 4.10.14 i 50 μl na próbkę węzła chłonnego z kroku 4.11.3 (około 0,7 x 106 i 2,2 x 106 komórek odpowiednio dla próbek węzłów chłonnych śródpiersia i krezki) w 96-dołkowej stożkowej płytce hodowlanej dna. Dodać 100 μl buforu FACS i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Płytka 100 μl na próbkę jelita cienkiego (około 2,7 x 106 i 0,6 x 106 komórek odpowiednio dla próbek śródnabłonkowych i blaszki właściwej) z etapów 4.8.3 i 4.9.7 na 96-dołkowej stożkowej płytce do hodowli dolnej. Dodać 150 μl buforu FACS i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 50 μl biotynylowanego koktajlu przeciwciał (Tabela 2) rozcieńczonego w buforze FACS. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
      UWAGA: Użyj buforu FACS z 20 μg/ml DNazy do próbek śródnabłonkowych i blaszki właściwej.
    4. Dodać 150 μl buforu FACS. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu FACS. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl koktajlu przeciwciało/barwnik (tabela 2) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
    7. Dodać 150 μl buforu FACS. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu FACS. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant. Powtórzyć pranie (krok 5.1.7) i wyrzucić supernatant.
    9. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu FACS i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.
    10. W przypadku próbek z jelita cienkiego i płuc należy zastosować strategię bramkowania: limfocyty, pojedyncze komórki, żywe komórki, komórki krwiotwórcze, komórki linii CD90 +, komórki ST2 + i komórki IL-9 + (Rysunek 3A, B i rysunek uzupełniający 2A). W przypadku próbek węzłów chłonnych należy zastosować strategię bramkowania: żywe komórki, pojedyncze komórki, komórki linii CD90 +, komórki ST2 + i komórki IL-9 + (rysunek uzupełniający 2B, C).
  2. Barwienie komórek w celu identyfikacji limfocytów wytwarzających IL-9 (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 3)
    1. Przenieś 800 μl na próbkę płuc z kroku 4.10.14 do probówki o pojemności 1,5 ml (około 14,6 x 106 komórek). Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    2. W przypadku próbek z węzłów chłonnych należy umieścić 400 μl zawiesiny komórek z kroku 4.11.3 (około 5,6 x 106 i 17,5 x 106 komórek odpowiednio dla próbek węzłów chłonnych śródpiersia i krezki) w 96-dołkowej stożkowej płytce dolnej w dwóch etapach.
      1. Najpierw przenieść 200 μl, odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
      2. Przenieś kolejne 200 μl do odpowiedniego dołka. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    3. Zawiesić osad komórkowy w 50-400 μl koktajlu przeciwciało/barwnik (Tabela 3) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Próbki płuc należy zawiesić w 400 μl, próbki węzłów chłonnych śródpiersia w 50 μl, a próbki węzłów chłonnych krezki w 100 μl koktajlu barwiącego.
    4. Dodać 150 μl buforu FACS do próbek węzłów chłonnych śródpiersia i 100 μl do próbek węzłów chłonnych krezkowych. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    5. Przemyć próbki płuc i węzłów chłonnych, ponownie zawieszając granulki odpowiednio w 1 ml i 200 μl buforu FACS. Wirować przy 450 xg przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i powtórzyć płukanie.
    6. Zawiesić próbki płuc w 600 μl buforu FACS i przeanalizować je za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj strategii bramkowania: limfocyty, pojedyncze komórki, żywe komórki, komórki krwiotwórcze, komórki CD4 + TCRβ + i komórki IL-9 + (Rysunek 2A).
    7. Zawiesić próbki węzłów chłonnych w 300 μl buforu FACS i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj strategii bramkowania: limfocyty, pojedyncze komórki, żywe komórki, komórki CD4 + TCRβ + i komórki IL-9 + (Rysunek 2B i rysunek uzupełniający 3A).

6. Wyznaczanie bezwzględnej liczby komórek w zawiesinach jednokomórkowych

  1. Rozcieńczyć próbki z etapów izolacji 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 i 4.11.3 PBS w stosunku 1:20 (10 μl próbki + 190 μl PBS).
  2. Zmieszać 10 μl każdej rozcieńczonej próbki z kroku 6.1 z 10 μl błękitu trypanowego. Załadować 10 μl do hemocytometru i policzyć żywe komórki, biorąc pod uwagę każde rozcieńczenie.
  3. Bezwzględną liczbę komórek obliczyć przez pomnożenie procentowego udziału populacji w żywych komórkach wyznaczonego za pomocą cytometrii przepływowej (komórki ujemne pod względem żywotności) przez całkowitą liczbę żywych komórek w zawiesinie jednokomórkowej po izolacji i podzielenie tej liczby przez 100 (rysunek uzupełniający 4, rysunek uzupełniający 5 i rysunek uzupełniający 6).
    Liczba bezwzględna = (Procent populacji będącej przedmiotem zainteresowania z żywych komórek określony za pomocą cytometrii przepływowej x Całkowita liczba żywych komórek w zawiesinie pojedynczej komórki)/100

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszy otrzymywały podskórnie iniekcję 200 larw N. brasiliensis w stadium L3 lub PBS w przypadku kontroli pozorowanych. Liczbę larw zastosowaną w tym protokole dostosowano tak, aby móc wyizolować żywe komórki z płuc, tkanki limfatycznej i jelita cienkiego, w przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień, w których stosowano wyższe dawki nicieni w celu wykrycia komórek wyłącznie w tkankach limfatycznych i płucach4. Płuca, węzły chłonne śródpiersia, węzły chłonne krezkowe oraz jelito cienkie p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pełne zrozumienie interakcji pasożyt-gospodarz w jelitach i odpowiedzi immunologicznej na zakażenie robakami pasożytniczymi wymaga identyfikacji i analizy różnych populacji komórek i cząsteczek efektorowych, które są kluczowe dla indukcji przebudowy tkanek i wydalania robaków. Zakażenia robakami pasożytniczymi przenoszonymi przez glebę stanowią duży problem w krajach rozwijających się na całym świecie. Jednak do niedawna protokół, który pozwalał na analizę rzadkich populacji komórek obecnych w jelicie cienkim, głównym na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować José Luisowi Ramosowi-Balderasowi za jego wsparcie techniczne. Prace te zostały wsparte następującym grantem dla PLL z CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P i EO-M otrzymały stypendium CONACYT (odpowiednio 736162 i 481437). MCM-M otrzymał stypendium CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor ACKDomowy
cytometr Attune NxtThermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
Kolagenaza DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Specyficzna aktywność: ≥ 10 000 jednostek/mg     
Sortownik Facs ARIA IIsortownik komórek BD Biosciences
FACS MelodyBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
Fcε RIeBioscience13589885
Płodowa surowica bydlęcaGibco26140079
FlowJoFlowJoOprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej
Gr-1Tonbo305931
Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Domowy
biolegendIL-9514103
NK1.1& nbsp;Biolegend108704
Siatka nylonowa  ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Domowy
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptawidynaBiolegend405206
TCR-β  Biolegend109203
TCR-β (PE/CY7)Biolegend109222
TCR-γ δ  Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Bufor Tricine Domowej roboty
Zombie Aqua Fixable Viability DyeBiolegend423101
, ,

Bibliografia

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678(2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94(2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713(2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967(2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki produkuj ce IL 9model infekcji helmintamilimfocyty T CD4wrodzone kom rki limfoidalnewewn trzkom rkowe barwienie cytokinizolacja tkanki limfoidalnejimmunologia jelita cienkiegoodpowied immunologiczna p ucw z y ch onne krezkowe

Powiązane artykuły