Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64076

⸱

7 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ilustruje test transcytozy komórek śródbłonka in vitro jako model do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka poprzez pomiar zdolności ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki do transportu peroksydazy chrzanowej przez komórki w procesach transportu transkomórkowego, w których pośredniczą kaweole.

Streszczenie

Dysfunkcja bariery krew-siatkówka (BRB) przyczynia się do patofizjologii wielu chorób naczyniowych oczu, często powodując obrzęk siatkówki i późniejszą utratę wzroku. Wewnętrzna bariera krew-siatkówka (iBRB) składa się głównie ze śródbłonka naczyniowego siatkówki o niskiej przepuszczalności w warunkach fizjologicznych. Ta cecha niskiej przepuszczalności jest ściśle regulowana i utrzymywana przez niskie szybkości transportu parakomórkowego między sąsiednimi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki, a także transportu transkomórkowego (transcytozy) przez nie. Ocena przepuszczalności bariery transkomórkowej siatkówki może dostarczyć fundamentalnych informacji na temat integralności iBRB w zdrowiu i chorobie. W tym badaniu opisujemy test transcytozy komórek śródbłonka (EC) jako model in vitro do oceny przepuszczalności iBRB, przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (HRMEC). Test ten ocenia zdolność HRMEC do transportu transferyny i peroksydazy chrzanowej (HRP) odpowiednio w procesach transportu międzykomórkowego, w których pośredniczą receptory i kaweole. W pełni zlewające się HRMEC hodowane na porowatej błonie inkubowano z fluorescencyjnie znakowaną transferyną (transcytoza zależna od klatryny) lub HRP (transcytoza za pośrednictwem kaweoli) w celu zmierzenia poziomów transferyny lub HRP przenoszonych do dolnej komory, co wskazuje na poziomy transcytozy w monowarstwie EC. Sygnalizacja Wnt, znany szlak regulujący iBRB, została zmodyfikowana w celu zademonstrowania metody testu transcytozy opartej na HRP za pośrednictwem kaweoli. Opisany tutaj test transcytozy EC może stanowić użyteczne narzędzie do badania molekularnych regulatorów przepuszczalności EC i integralności iBRB w patologiach naczyniowych oraz do badań przesiewowych systemów dostarczania leków.

Wprowadzenie

Ludzka siatkówka jest jedną z najbardziej energochłonnych tkanek w ciele. Prawidłowe funkcjonowanie siatkówki nerwowej wymaga wydajnego dostarczania tlenu i składników odżywczych wraz z ograniczonym strumieniem innych potencjalnie szkodliwych cząsteczek w celu ochrony środowiska siatkówki, w którym pośredniczy bariera krew-siatkówka (BRB)1. Podobnie jak bariera krew-mózg (BBB) w ośrodkowym układzie nerwowym, BRB działa jak selektywna bariera w oku, regulując ruch jonów, wody, aminokwasów i cukru do i z siatkówki. BRB utrzymuje również homeostazę siatkówki i jej przywilej immunologiczny, zapobiegając narażeniu na czynniki krążeniowe, takie jak komórki odpornościowe, przeciwciała i szkodliwe patogeny2. Dysfunkcja BRB przyczynia się do patofizjologii kilku chorób naczyniowych oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa, zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), retinopatia wcześniaków (ROP), niedrożność żyły siatkówki i zapalenie błony naczyniowej oka, powodując obrzęk naczyniopochodny i późniejszą utratę wzroku3,4,5.

BRB składa się z dwóch oddzielnych barier dla dwóch odrębnych sieci naczyń ocznych, odpowiednio: unaczynienia siatkówki i fenestrowanej naczyniówki pod siatkówką. Wewnętrzny BRB (iBRB) składa się głównie z komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (RMEC) wyściełających mikrokrążenie siatkówki, które odżywia wewnętrzne warstwy neuronalne siatkówki. Z drugiej strony, nabłonek barwnikowy siatkówki stanowi główny składnik zewnętrznego BRB, który znajduje się między siatkówką neurosensoryczną a naczyniówką włosowatą2. W przypadku iBRB transport molekularny przez RMEC odbywa się zarówno drogą parakomórkową, jak i transkomórkową (Rysunek 1). Wysoki stopień selektywności substancji w całym iBRB opiera się na (i) obecności kompleksów białek połączeniowych, które ograniczają transport parakomórkowy między sąsiednimi komórkami śródbłonka (EC) oraz (ii) niskich poziomach ekspresji mediatorów kaweoli, transporterów i receptorów w komórkach śródbłonka, które utrzymują niskie wskaźniki transportu międzykomórkowego1,6,7,8. Kompleksy połączeniowe regulujące przepływ przykomórkowy składają się z połączeń ścisłych (klaudyny, okludyny), połączeń adherenowych (kadheryny VE) i połączeń szczelinowych (koneksyny), umożliwiających przepływ wody i małych związków rozpuszczalnych w wodzie. Podczas gdy małe cząsteczki lipofilowe pasywnie dyfundują po wnętrzu RMEC, ruch większych cząsteczek lipofilowych i hydrofilowych jest regulowany przez szlaki transśródbłonkowe sterowane przez ATP, w tym transport pęcherzykowy i transportery błonowe5,9.

Transcytoza pęcherzykowa może być sklasyfikowana jako transcytoza kaweolinowa, transcytoza zależna od klatryny (i za pośrednictwem receptora) oraz makropinocytoza niezależna od klatryny (Rysunek 2). Te procesy transportu pęcherzykowego obejmują pęcherzyki różnej wielkości, przy czym makropinosomy są największe (w zakresie 200-500 nm), a kaweole są najmniejsze (średnio 50-100 nm), podczas gdy pęcherzyki pokryte klatryną wahają się od 70-150 nm10. Kaweole to bogate w lipidy wgłębienia błony plazmatycznej w kształcie kolby z płaszczem białkowym, składającym się głównie z kaweoliny-1, która wiąże błonę lipidową, cholesterol i inne białka strukturalne i sygnałowe poprzez ich domenę rusztowania kaweoliny11. Kaweoleliny współpracują z obwodowo przyczepioną caviną, aby promować stabilizację kaweoli na błonie plazmatycznej12. Błony kaweoli mogą również przenosić receptory dla innych cząsteczek, takich jak insulina, albumina i krążące lipoproteiny, w tym lipoproteiny o dużej gęstości (HDL) i lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL), aby wspomóc ich ruch przez komórki śródbłonka13. Podczas rozwoju tworzenie funkcjonalnego BRB zależy od supresji transcytozy EC8. Dojrzały śródbłonek siatkówki, w związku z tym, ma stosunkowo niski poziom receptorów kaweoliny, kaweoliny-1 i albuminy w stosunku do innych komórek śródbłonka w warunkach fizjologicznych, co przyczynia się do jego właściwości barierowych4,9.

Ponieważ rozpad iBRB jest główną cechą charakterystyczną wielu patologicznych chorób oczu, konieczne jest opracowanie metod oceny przepuszczalności naczyń siatkówki in vivo i in vitro. Metody te pomagają uzyskać prawdopodobny wgląd w mechanizmy naruszonej integralności BRB i ocenić skuteczność potencjalnych celów terapeutycznych. Obecne obrazowanie in vivo lub ilościowe testy przecieku naczyniowego zwykle wykorzystują fluorescencyjne (fluoresceina sodu i dekstran), kolorymetryczne (barwnik Evans Blue i substrat peroksydazy chrzanowej [HRP]) lub radioaktywne znaczniki14 do wykrywania wynaczynienia z układu krwionośnego do otaczających tkanek siatkówki za pomocą obrazowania mikroskopowego lub w izolowanym lizacie tkankowym. Idealny znacznik do ilościowego określania integralności naczyń krwionośnych powinien być obojętny i wystarczająco duży, aby swobodnie przenikać przez uszkodzone naczynia, gdy jest zamknięty w zdrowych i nienaruszonych naczyniach włosowatych. Metody wykorzystujące fluoresceinę sodu lub dekstran sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny (dekstran FITC) w angiografii fluoresceinowej żywego dna oka (FFA) lub izolowanych płaskich mocowań siatkówki są szeroko stosowane do ilościowego oznaczania wynaczynienia siatkówki in vivo lub ex vivo. FITC-dekstran ma tę zaletę, że jest dostępny w różnych masach cząsteczkowych w zakresie od 4 do 70 kDa do badań selektywnych pod względem wielkości15,16,17. Albumina FITC (~68 kDa) jest alternatywnym znacznikiem białkowym o dużym rozmiarze o znaczeniu biologicznym dla badań przecieków naczyniowych18. Niebieski barwnik Evansa, wstrzykiwany dosercowo19, retro-orbitalnie lub przez żyłę ogonową20, również opiera się na wiązaniu z endogenną albuminą, tworząc dużą cząsteczkę, którą można określić ilościowo głównie za pomocą detekcji spektrofotometrycznej lub, rzadziej, mikroskopii fluorescencyjnej w flat mounts20,21. Jednak te ilościowe lub lekkie metodologie obrazowania często nie odróżniają transportu parakomórkowego od transportu przezśródbłonkowego. Do specyficznej analizy transcytozy z ultrastrukturalną wizualizacją transcytozowanych pęcherzyków, cząsteczki znacznikowe, takie jak HRP, są zwykle używane do lokalizacji transcytozowanych pęcherzyków w komórkach śródbłonka, które można obserwować pod mikroskopem elektronowym22,23,24 (Rysunek 3A-C).

Rozwój i wykorzystanie modeli iBRB in vitro do oceny przepuszczalności komórek śródbłonka może dostarczyć solidnej i wysokiej przepustowości oceny, która uzupełni eksperymenty in vivo i pomoże w badaniu molekularnych regulatorów przecieku naczyniowego. Powszechnie stosowane testy do oceny transportu parakomórkowego i integralności połączeń ścisłych obejmują transśródbłonkowy opór elektryczny (TEER), miarę przewodnictwa jonowego (Rysunek 4)2,25, oraz test przecieku naczyniowego in vitro przy użyciu znaczników fluorescencyjnych o małej masie cząsteczkowej26. Ponadto testy transcytozy oparte na transferynie modelujące BBB zostały wykorzystane do zbadania transcytozy zależnej od klatryny27. Mimo to testy do oceny BRB, a dokładniej transcytozy kawetolarnej EC siatkówki in vitro, są ograniczone.

W tym badaniu opisujemy test transcytozy EC z wykorzystaniem ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka siatkówki (HRMEC) jako modelu in vitro do określenia przepuszczalności iBRB i transcytozy EC. Test ten opiera się na zdolności HRMEC do transportu transferyny lub HRP odpowiednio przez szlaki transcytozy zależne od receptora lub kaweoli (Ryc. 2). HRMEC hodowane do pełnej konfluencji w komorze wierzchołkowej (tj. wkładzie filtrującym) inkubowano z fluorescencyjnie sprzężoną transferyną (Cy3-Tf) lub HRP w celu zmierzenia intensywności fluorescencji odpowiadającej poziomom transferyny lub HRP przeniesionej do dolnej komory wyłącznie przez transcytozę EC. Zbieżność monowarstwy ogniwa można potwierdzić poprzez pomiar TEER, wskazujący na integralność złącza ścisłego25. Aby zademonstrować technikę testu TEER i transcytozy, wykorzystano znane molekularne modulatory przepuszczalności naczyń i transcytozy EC, w tym czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)28 oraz te w sygnalizacji Wnt (ligandy Wnt: Wnt3a i Norrin)29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie do generowania mikroskopii świetlnej i obrazów EM (Rysunek 3). Protokoły do badań in vivo można uzyskać od Wang et al.24. Wszystkie eksperymenty z udziałem ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (HRMEC) zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Roztwór do powlekania naczynia do hodowli tkankowej: Przygotować 0,1% roztwór żelatyny, rozpuszczając 1 ml roztworu podstawowego żelatyny (40%-50%) w 500 ml sterylnej hodowli tkankowej klasy 1x PBS (pH = 7,4). Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm. Przechowywać 0,1% roztwór żelatyny w temperaturze 2-8°C. Może być przechowywany w tej temperaturze przez czas nieokreślony w stanie sterylnym.
  2. Pożywka wzrostowa: Przygotować 500 ml kompletnej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (EGM), rozpuszczając suplementy EGM w pożywce podstawowej wzrostu komórek śródbłonka (EBM) zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Podwielokrotną pożywkę rozlać na probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Okres przechowywania pożywki wynosi 12 miesięcy w temperaturze 4 °C.
  3. Roztwór trypsyny: W przypadku 0,25% roztworu trypsyny-EDTA, porcję z fiolki podstawowej rozlać do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C (do 2 tygodni) lub -20 °C (do 24 miesięcy).

2. Hodowla HRMEC

  1. Początkowa hodowla komórkowa
    1. Szalki Petriego (100 mm średnicy x 20 mm wysokości) pokryć 5 ml 0,1% roztworu żelatyny pod kapturem z przepływem laminarnym i przechowywać je w stanie nienaruszonym w kapturze przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu uzyskania jednolitego powlekania.
      UWAGA: Żelatynowa powłoka naczyń zwiększa przyczepianie komórek. Alternatywnie można również użyć kolb hodowlanych T75 pokrytych żelatyną.
    2. Przed wysiewem komórek odessać roztwór żelatyny za pomocą pompy próżniowej. Podciśnienie zastosowanego aspiratora wynosiło do 724 mmHg.
      UWAGA: Aspirację należy wykonać bezpośrednio przed wysiewem komórek, aby zapobiec wysychaniu roztworu powlekającego.
    3. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z HRMEC (z przechowywania w ciekłym azocie) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub dodając do fiolki ciepłą pożywkę wzrostową. Po rozmrożeniu przenieść zawiesinę komórkową do 9 ml pożywki wzrostowej (zakładając, że rozmrożona fiolka z HRMEC ma 1 ml).
      UWAGA: HRMEC zostały pozyskane komercyjnie (tabela materiałów). Pożywkę wzrostową dodaną do komórek należy zawsze podgrzać do temperatury 37 °C przed użyciem.
    4. Wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie zassać supernatant, aby uniknąć usunięcia osadu komórkowego.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wzrostowej i przenieść powstałą zawiesinę na pokrytą żelatyną płytkę Petriego. Utrzymać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zazwyczaj HRMEC zlewają się w 70%-80% po 72 godz.
      UWAGA: Pożywka wzrostowa jest zmieniana co drugi dzień.
  2. Subkultura HRMEC na przepuszczalnych wkładach membranowych
    1. Przygotować wkłady filtracyjne do hodowli komórkowych (wkładki 6,5 mm z membraną poliwęglanową o wielkości porów 0,4 μm, umieszczone na płytce 24-dołkowej) do wysiewu HRMEC poprzez pokrycie każdej wkładki (komory wierzchołkowej) 200 μl 0,1% roztworu żelatyny przez 30 minut pod okapem z przepływem laminarnym. Upewnij się, że roztwór pokrywa całą dolną powierzchnię wkładu filtra.
      UWAGA: Każda studzienka ma komorę wierzchołkową i podstawno-boczną oddzieloną porowatą membraną.
    2. Wyjąć z inkubatora szalkę Petriego z hodowanymi HRMEC (etap 2.1.5) i odessać pożywkę wzrostową. Delikatnie przepłucz komórki 2x 10 ml 1x PBS pod kapturem z przepływem laminarnym, aby pozbyć się potencjalnych pływających/martwych komórek.
    3. Oddzielić komórki za pomocą 0,5-1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i umieścić szalkę Petriego w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) na 5 minut.
    4. Ugasić aktywność trypsyny, dodając 4,5-9 ml pożywki wzrostowej i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    5. Wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml pożywki wzrostowej.
    6. Policz liczbę komórek za pomocą ręcznego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i zasiewaj w gęstości 4 x 104 komórek na wkład filtracyjny (tj. 1,25 x 105 komórek/cm2). Objętość zawiesiny komórek dla każdej wkładki wynosi 250 μL.
    7. Odessać roztwór powlekający ze studzienek zawierających przepuszczalne wkłady i przenieść 250 μl zawiesiny komórek na wkładkę (komorę wierzchołkową). Dodać tylko pożywkę (tj. bez komórek) do jednej z wkładek, która będzie używana jako "ślepa kontrola" do pomiaru TEER. Jednocześnie dodaj również 750 μl pożywki na studzienkę w komorach podstawno-bocznych.
    8. Przechowywać 24-dołkową płytkę z przepuszczalnymi wkładkami w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) przez 7-12 dni, aż wyhodowane komórki staną się w pełni zlewające się i zostanie osiągnięta pożądana wartość TEER wynosząca ~20 Ω·cm2.
    9. Zmieniaj podłoże co drugi dzień. Podczas wymiany pożywki należy ostrożnie zassać pożywkę, aby zminimalizować zakłócenie monowarstwy komórkowej i dodać 250 μl i 750 μl świeżej pożywki na studzienkę odpowiednio do komory wierzchołkowej i podstawno-bocznej.
      UWAGA: Pożywka wzrostowa jest zmieniana zarówno dla komory wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej studni.

3. Pomiary TEER (Rysunek 4)

  1. W 14 dniu po wysiewie komórek (krok 2.2.9) zmierz TEER dla HRMEC za pomocą systemu rezystancji elektrycznej (ER) nabłonkowego woltomierza i omów (EVOM) (tabela materiałów) w następujący sposób.
  2. Naładuj wstępnie system ER i sprawdź działanie miernika za pomocą elektrody testowej STX04. W razie potrzeby przeprowadzić kalibrację.
  3. Podłącz elektrodę do miernika i zrównoważ elektrodę, najpierw mocząc ją w 70% etanolu na 15-20 minut, a następnie zanurzając ją na krótko w pożywce wzrostowej EGM do hodowli komórkowej.
  4. W międzyczasie trzymaj 24-dołkową płytkę zawierającą komórki w okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut w celu zrównoważenia temperatury.
    UWAGA: Na pomiary TEER ma wpływ temperatura, dlatego niezbędny jest krok równowagi.
  5. W celu pomiaru TEER należy dodać świeżą pożywkę wzrostową zarówno do komory wierzchołkowej (250 μl), jak i bazobocznej (750 μl) studzienek.
  6. Wykonaj pomiar TEER, ostrożnie zanurzając elektrodę tak, aby krótsza końcówka znajdowała się we wkładce, a dłuższa końcówka dotykała dna studni. Najpierw zmierz rezystancję w poprzek ślepej próby. Dla każdej wkładki zmierz TEER w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: Do płukania elektrody pomiędzy pomiarami stosuje się pożywkę hodowlaną. Upewnij się, że elektroda jest trzymana pod kątem 90° do dna wkładki, aby uzyskać stabilne odczyty.
  7. Obliczyć opór elektryczny (w Ω · cm2) na monowarstwie, korzystając ze wzoru, TEER = rezystancja netto (Ω) x pole powierzchni wkładu filtracyjnego (cm2); tutaj rezystancja netto to różnica między rezystancją każdego dołka (pożywka wzrostowa z komórkami) a studzienką ślepą (tylko pożywka wzrostowa).
  8. Dalszą obróbkę komórek należy przeprowadzić dopiero po osiągnięciu wartości TEER ~20 Ω·cm2. Jeśli żądany poziom TEER nie zostanie osiągnięty, należy przechowywać płytkę w inkubatorze i zmierzyć TEER następnego dnia.
    UWAGA: Zbieganie HRMEC można również potwierdzić przez badanie morfologiczne kształtu komórki (pod mikroskopem) z typową morfologią bruku i/lub przez obecność białek połączenia komórkowego z oddzielnym barwieniem immunohistochemicznym.

4. Test transcytozy

  1. Test transcytozy in vitro za pośrednictwem klatryny przy użyciu transferyny znakowanej Cy3 (Figura 5)
    1. Po osiągnięciu zbiegu z wartościami TEER około 20 Ω·cm2, surowicę pozbawia komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy użyciu 0,5% FBS w EBM (pożywka o obniżonej surowicy) w obu komorach (komora wierzchołkowa: 250 μL i komora podstawno-boczna: 750 μL) przed leczeniem ligandem. W całym teście stosowano EBM o obniżonej zawartości surowicy.
    2. Inkubować komórki (przy użyciu pożywki o obniżonej zawartości surowicy w kroku 4.1.1) w komorze wierzchołkowej z fluorescencyjnym (cyjanina 3) znakowanym ligandem transferyny (Cy3-Tf) (końcowe stężenie 40 μg/ml) przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Płytki zawierające Cy3-Tf należy chronić przed światłem, aby uniknąć fotowybielania Cy3-Tf poprzez owinięcie w nie folii aluminiowej i przeprowadzenie eksperymentu w kapturze do hodowli komórkowej przy wyłączonym świetle.
    3. Po 1 godzinie umieścić płytkę na lodzie i przemyć monowarstwę wierzchołkowo i zasadzkowo 4x (3-5 minut na mycie) pożywką o obniżonej zawartości surowicy w temperaturze pokojowej, aby usunąć wolny niezwiązany Cy3-Tf.
      UWAGA: Mycie jest niezbędne, aby usunąć wolne cząsteczki znacznikowe i umożliwić dokładny odczyt transcytozy bez potencjalnego wycieku z drogi parakomórkowej.
    4. Dodać świeżą pożywkę o obniżonej surowicy (jak w kroku 4.1.1) do dokładnie umytych wkładów filtracyjnych zawierających komórki i przenieść wkładki do świeżych studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej wstępnie podgrzaną pożywkę o obniżonej surowicy.
    5. Inkubować komórki przez kolejne 90 minut w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ), a następnie pobrać pożywkę z komory podstawno-bocznej.
    6. Zapisać intensywność fluorescencji roztworu z komory podstawno-bocznej za pomocą detektora fluorescencji. Poziomy intensywności fluorescencji, mierzone jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU), wskazują ilość kompleksu Cy3-Tf transcytozowanego przez monowarstwę HRMEC poprzez transcytozę zależną od klatryny.
  2. Test transcytozy in vitro za pośrednictwem kaweoli przy użyciu HRP (Ryc. 6)
    1. Po osiągnięciu pełnej zbieżności z wartościami TEER około 20 Ω·cm2, surowicę pozbawić komórek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy użyciu 0,5% pożywki EBM zawierającej FBS (pożywka o obniżonej surowicy) przed leczeniem (jak w kroku 4.1.1.). Pożywka EBM o obniżonej zawartości surowicy była używana przez cały czas trwania testu.
    2. Potraktuj komórki w komorze wierzchołkowej pożądanymi zabiegami i kontrolami nośnika.
      UWAGA: Tutaj użyliśmy modulatorów Wnt jako przykładu, aby zademonstrować regulację transcytozy za pośrednictwem kaweoli przez szlak sygnałowy Wnt w HRMEC: ludzki rekombinowany Norrin i inhibitor Wnt XAV939. W typowym eksperymencie komórki traktowano przez 24 godziny w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) następującymi stężeniami: Norrin (125 ng / ml), Norrin (125 ng / ml) + XAV939 (10 μM) i roztwór kontrolny nośnika. Ponadto zastosowano również pożywkę kondycjonowaną Wnt3a (wytwarzaną z ogniw L Wnt-3A).
    3. Inkubować komórki w komorze wierzchołkowej z HRP (5 mg/ml) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Następnie umieść 24-dołkową płytkę na lodzie i intensywnie umyj komorę wierzchołkową i podstawno-boczną 6x buforem P (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM pirogronian sodu, 10 mM glukozy, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) w celu usunięcia wolnego zewnątrzkomórkowego HRP.
      UWAGA: Mycie jest niezbędne, aby usunąć wolne cząsteczki znacznikowe i umożliwić dokładny odczyt transcytozy bez potencjalnego wycieku z drogi parakomórkowej.
    5. Dodać świeżą pożywkę o obniżonej surowicy (jak w kroku 4.1.1) do komory wierzchołkowej i przenieść wkładki do świeżej studzienki zawierającej wstępnie podgrzane podłoże.
    6. Inkubować monowarstwę przez dodatkowe 90 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed pobraniem pożywki z komory podstawno-bocznej.
    7. Do zebranej pożywki dodać 100 μl substratu peroksydazy fluorogenicznej HRP (tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed zatrzymaniem reakcji ze 100 μl roztworu Stop.
    8. Wykrywanie poziomów produktu reakcji substratu HRP w pożywce za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Zmierz intensywność fluorescencji przy długości fali emisji 420 nm (ze wzbudzeniem 325 nm) i jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU). Wartości wskazują poziom HRP transcytozowanego w warstwie HRMEC przez transcytozę za pośrednictwem kaweoli.
      UWAGA: Zastosowany tutaj produkt fluorescencyjny (Tabela materiałów) nie powoduje fotowybielania. Ochrona przed światłem przed fotowybielaniem nie jest potrzebna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazy EM śródbłonka naczyń siatkówki wykazują pęcherzykowy transport transcytotyczny oraz pęcherzyki kaweolarne w komórkach śródbłonka in vivo.
Transcytózę komórek śródbłonka można zwizualizować in vivo w przekrojach poprzecznych siatkówki jako ciemnobrązowy osad odpowiadający naczyniom krwionośnym zawierającym HRP pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 3A) oraz jako elektrongęsty osad wskazujący na pęcherzyki transcytotyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

BRB odgrywa istotną rolę w zdrowiu i chorobach siatkówki. Techniki in vitro oceniające przepuszczalność naczyń krwionośnych okazały się kluczowymi narzędziami w badaniach nad rozwojem i funkcją bariery (BRB/BBB). Opisana tutaj procedura może być wykorzystana do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transcytozy EC lub oceny powiązanych modulatorów molekularnych wpływających na przepuszczalność BRB. Metody in vitro Testy transcytozy EC mają wiele zalet w porównaniu z testami in vivo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów ani interesów finansowych, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH (R01 EY028100, EY024963 i EY031765) dla JC. ZW otrzymał wsparcie od Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Hodowla komórkowa Petridyczny Gniazdo Biotechnologia704001
Wirówka Eppendorf5702
Probówki wirówkowe (15 ml)Corning Inc.
Probówki wirówkowe (50 ml)Denville Scientific Inc.C1062-P
Cyjanina 3-ludzka transferyna Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) Suplementy SingleQuotsLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)MilliporeMERS00002
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
Hemocytometr żelatynowySigma-AldrichG7765
(2-chipowy)Bulldog BioDHC-N002
Peroksydaza chrzanowa (HRP)Sigma-AldrichP8250
Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka siatkówki (HRMEC)Systemy komórkoweInkubator ACBRI 181
Thermo Electron Korporacja, Thermo Fisher Scientific3110
L ogniwa (do podłoża kondycjonowanego kontrolnie)ATCCCRL-2648
L Ogniwa Wnt-3A (do podłoża kondycjonowanego Wnt3A)ATCCCRL-2647
Mikroskop świetlnyLeicaDMi1
Wielomodowy czytnik płytekEnSight, PerkinElmer
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) bufor (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Zestaw substratów peroksydazy fluorogenicznejThermo Fisher Scientific15169
Rekombinowana ludzka Norrin (rhNorrin)R& D Systems3014-NR
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (rhVEGF)R& D Systems293-VE
Filtr strzykawkowy (0,22 &mikro; m)Wkładki MilliporeSLGP033RS
Transwell (6,5 mm transwell, 0,4 i mikro; wkładka z membrany poliestrowej o porach m)Corning Inc.CLS3470-48EA
Trypsyna-EDTA (0,25%) (1x)GIBCO25-200-072
kąpiel wodna, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (inhibitor Wnt/β-kateniny)SelleckchemS1180
352097Precyzyjna

Bibliografia

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877(2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211(2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903(2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154(2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062(2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340(2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188(2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953(2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019(2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transcytoza r db onkowaHRMECpomiar TEERtransport za po rednictwem kaweoltranscytoza zale na od klatrynysygnalizacja Wntperoksydaza chrzanowapobieranie transferyny
Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.