Artykuł metodologiczny

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

DOI:

10.3791/64082

⸱

24 lutego 2023

 ,  ,  , 
1La Jolla Institute for Immunology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligand kinazy tyrozynowej 3 podobny do FMS (Flt3L) jest cytokiną krwiotwórczą, która wspomaga przeżycie i różnicowanie komórek dendrytycznych (DC). Jest stosowany w szczepionkach przeciwnowotworowych w celu aktywacji odporności wrodzonej i wzmocnienia odpowiedzi przeciwnowotworowych. Protokół ten przedstawia model terapeutyczny z wykorzystaniem komórkowej szczepionki przeciwnowotworowej składającej się z komórek czerniaka B16-F10 wykazujących ekspresję Flt3L wraz z analizą fenotypową i funkcjonalną komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza (TME). Opisano procedury przygotowania hodowlanych komórek nowotworowych, implantacji guza, napromieniania komórek, pomiaru wielkości guza, wewnątrznowotworowej izolacji komórek odpornościowych i analizy cytometrii przepływowej. Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie przedklinicznego modelu immunoterapii guzów litych oraz platformy badawczej do badania związku między komórkami nowotworowymi a infiltrującymi komórkami odpornościowymi. Opisany tutaj protokół immunoterapii można łączyć z innymi metodami terapeutycznymi, takimi jak blokada immunologicznych punktów kontrolnych (przeciwciała anty-CTLA-4, anty-PD-1, anty-PD-L1) lub chemioterapia w celu poprawy efektu terapeutycznego czerniaka w przypadku raka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoterapia nowotworów została uznana za obiecującą strategię terapeutyczną opartą na mniej toksycznych skutkach ubocznych i trwalszych reakcjach. Opracowano kilka rodzajów immunoterapii, w tym terapie wirusami onkolitycznymi, szczepionki przeciwnowotworowe, terapie cytokinowe, przeciwciała monoklonalne, adoptywny transfer komórek (komórki CAR-T lub CAR-NK) oraz blokadę immunologicznego punktu kontrolnego1.

Dla szczepionek przeciwnowotworowych istnieją różne formy szczepionek terapeutycznych, takie jak szczepionki oparte na całych komórkach, szczepionki białkowe lub peptydowe oraz szczepionki RNA lub DNA. Szczepienie opiera się na zdolności komórek prezentujących antygen (APC) do przetwarzania antygenów nowotworowych, w tym antygenów specyficznych dla nowotworu, i prezentowania ich w formie immunogennej limfocytom T. Komórki dendrytyczne (DC) są znane jako najsilniejsze APC i uważa się, że odgrywają ważną rolę w odporności przeciwnowotworowej2,3. Komórki te pobierają i przetwarzają antygeny nowotworowe, a następnie migrują do drenujących węzłów chłonnych (dLN) w celu przygotowania i aktywacji specyficznych dla nowotworu komórek efektorowych T (Teff) poprzez zaangażowanie receptora komórek T (TCR) i cząsteczek kostymulujących. Powoduje to różnicowanie i ekspansję cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla nowotworu (CTL), które infiltrują guz i zabijają komórki nowotworowe4. W związku z tym aktywacja i dojrzewanie DC stanowią atrakcyjne strategie stymulowania odporności na antygeny nowotworowe.

Flt3L jest znany z promowania dojrzewania i ekspansji funkcjonalnie dojrzałych DC, które wyrażają białka MHC klasy II, CD11c, DEC205 i CD865. Wykazano, że doguzowe, ale nie dożylne, podawanie wektora adenowirusowego zawierającego gen Flt3L (Adv-Flt3L) promuje immunologiczną aktywność terapeutyczną przeciwko nowotworom ortrotopowym6. Flt3L jest również stosowany w szczepionkach opartych na komórkach nowotworowych składających się z napromieniowanych komórek B16-F10 o stabilnej ekspresji transdukowanego retrowirusowo Flt3L jako sposób na zwiększenie krzyżowej prezentacji antygenów nowotworowych przez DC, a tym samym zwiększenie odpowiedzi przeciwnowotworowych. Opisany tutaj protokół szczepienia przeciw nowotworom B16-Flt3L opiera się na badaniu opublikowanym przez grupę dr Jamesa Allisona 7. W tym artykule poinformowali, że szczepionka B16-Flt3L w połączeniu z blokadą CTLA-4 synergistycznie indukowała odrzucenie ustalonego czerniaka, co skutkowało zwiększeniem przeżycia.

Celem tego protokołu jest dostarczenie przedklinicznego modelu immunoterapii czerniaka. Tutaj opisano szczegółowe procedury przygotowania i wszczepienia szczepionek przeciwnowotworowych oraz jak analizować skład i funkcję wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych z guza litego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy użyte w badaniu były utrzymywane i trzymane w wiwarium Instytutu Immunologii La Jolla (LJI) w określonych warunkach wolnych od patogenów, z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością. Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono na samicach myszy C57BL/6 w wieku 8-14 tygodni zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami LJI.

1. Przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych do implantacji

  1. Hodowla komórek czerniaka B16-F10 w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco firmy Iscove (IMDM) zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1 mM aminokwasów endogennych MEM i po 100 U/ml penicyliny i streptomycyny. Utrzymuj linię komórkową w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
  2. Wysiewaj 1,5-2 x 106 komórek B16-F10 w kolbie 175T i hoduj przez 2 dni. Zbieraj komórki, gdy są zlewające się w 75%-80%.
  3. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć kolbę raz PBS. Odessać PBS i dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA, a następnie ostro postukać w krawędź kolby hodowlanej.
  4. Dodać 15 ml pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę-EDTA i wlać zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyj powierzchnię naczynia 10 ml PBS i wlej do tej samej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant i rozbić osad komórkowy, stukając palcem w dno probówki.
  6. Dodać zimne 10 ml PBS i delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, a następnie ręcznie policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Przed wstrzyknięciem należy trzymać komórki na lodzie.

2. Implantacja guza

  1. Myszy należy znieczulić gazem za pomocą 5% izofluranu przy natężeniu przepływu gazu 1,0 l na minutę w dygestorium. Zmień natężenie przepływu na dawkę podtrzymującą 2% izofluranu, gdy myszy są w pełni znieczulone. W przypadku tego protokołu znieczulenie zostało przeprowadzone przez lekarza weterynarii zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.
  2. Ogolić włosy na lewym boku myszy i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia za pomocą chusteczek nasączonych alkoholem. Śródskórnie (i.d.) wszczepić komórki nowotworowe B16-F10 w 5 x 105 komórek w 50 μL zimnego PBS w lewym boku za pomocą igły 30 G.
    UWAGA: Dawka wszczepionych komórek nowotworowych B16-F10 może wymagać dostosowania w zakresie 0,5-5 x 105 komórek w celu pomyślnego rozwoju guza.
  3. Po implantacji należy mierzyć długość i szerokość guza trzy razy w tygodniu za pomocą elektronicznej suwmiarki cyfrowej. Oblicz objętość guza (mm3) za pomocą wzoru:
    Objętość guza (mm3) = szerokość2 × długość × 0,5
    Leczyć myszy szczepionką przeciwnowotworową, gdy guzy osiągną rozmiar ≥2 mm.
    UWAGA: Guzy zwykle można zmierzyć w 3 dniu po implantacji 5 x 105 komórek nowotworowych. Szybsze tempo wzrostu guza B16-F10 zaobserwowano u samców myszy C57BL/6, Rag1-/- lub Rag2-/-γc-/-. Podobna obserwacja została opisana w innych badaniach8. Zaleca się utrzymanie stałej płci myszy. Należy jednak pamiętać, że NIH kładzie nacisk na płeć jako ważną zmienną biologiczną w badaniach biomedycznych.

3. Przygotowanie szczepionki i wstrzyknięcie komórek B16-F10 (B16-Flt3L) wykazujących ekspresję Flt3L

  1. Utrzymuj komórki B16-Flt3L w DMEM zawierające 8% inaktywowanego termicznie FBS, 2 mM glutaminy i po 100 U/ml penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2.
  2. Wysiewać 1 x 106 komórek B16-Flt3L w kolbie 175T i hodować przez 2 dni. Zbierz komórki, gdy są zlewające się w 75%-80%, jak opisano w krokach od 1.3 do 1.6 i zawieś w 1 ml zimnego PBS.
  3. Naświetlanie ogniw dawką promieniowania gamma 150 Gy za pomocą promiennika rentgenowskiego o napięciu 160 kV i ustawieniu parametrów 25 mA. Policz i sprawdź żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym przed wstrzyknięciem.
  4. Myszy należy znieczulić gazem zgodnie z wcześniejszym opisem i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia za pomocą chusteczek nasączonych alkoholem. Śródskórnie wstrzyknąć myszom 1 x 106 napromieniowanych komórek B16-Flt3L w 50 μl zimnego PBS na tym samym boku, co pierwotna implantacja guza, ~ 1 cm od miejsca guza pierwotnego w dniach 3, 6 i 9 po początkowej implantacji komórek.
  5. Oznacz miejsca wstrzyknięcia szczepionki kolorowym pisakiem, aby odróżnić ją od guza pierwotnego.
    UWAGA: Jeśli początkowo wszczepia się 0,5 x 105 komórek B16-F10, zaleca się przeprowadzenie leczenia szczepionką w dniach 8, 11 i 14.

4. Izolacja komórek odpornościowych wewnątrz nowotworu

  1. Ofiarować myszy za pomocą CO2 i zwichnięcia szyjki macicy w okapie wyciągowym pod koniec eksperymentu (w 15 dniu po implantacji guza; Rysunek 1).
  2. Chirurgicznie usuń guz ze skórą z każdej myszy i umieść go na 24-dołkowej płytce z 1 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640. Osusz guzy ręcznikiem papierowym przed ważeniem.
  3. Pokrój guzy na małe kawałki. Dodać 2 ml buforu wytrawiającego (100 μg/ml TL Liberazy i 200 μg/ml DNazy I w pożywce RPMI-1640) i inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Dodaj 10 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640, aby zatrzymać trawienie. Przenieść komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i użyć tłoka strzykawki o pojemności 1 ml do rozdrobnienia tkanki na sitku do komórek o wielkości 40 μm.
  5. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 5 ml pożywki o 40% gradiencie gęstości w PBS, rozcieńczonej do stężenia 1x).
  6. Powoli dodawać zawiesinę komórkową na 5 ml pożywki o 80% specyficznej dla gradientu gęstości zawierającej PBS. Odwirować komórki przy 325 x g z niskim ustawieniem hamulca przez 23 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Po odwirowaniu ostrożnie zebrać warstwę leukocytów na granicy między 40% a 80% pożywką specyficzną dla gradientu gęstości i przepuścić ją przez sitko do komórek 40 μm. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Inkubować osad w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać 10 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640, aby ugasić bufor do lizy RBC.
  9. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640 i policzyć całkowitą liczbę komórek przed użyciem do dalszej analizy.
    UWAGA: Zbierz śledzionę lub dLN jako kontrolę dla strategii bramkowania podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Postępuj zgodnie z opisaną powyżej metodą izolacji komórek z następującymi zmianami: Użyj tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, aby zmielić tkankę na filtrze siatkowym 70 μm. Umyj tkankę 10% pożywką FBS/RPMI-1640, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe. Lizuj RBC zgodnie z opisem.

5. Analiza cytometrii przepływowej

UWAGA: Komórki pobrane z warstwy leukocytów zawierają komórki odpornościowe i komórki nowotworowe. Zalecane są dwa niezależne panele barwiące.

  1. Barwienie powierzchni
    1. Przenieś komórki do 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V. Przemyć komórki PBS i wybarwić je barwnikiem żywotności komórek (50-100 μl/dołek) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wybarwić markery powierzchniowe mieszanymi przeciwciałami (szczegółowe rozcieńczenie znajduje się w tabeli materiałów) w buforze FACS (1% FBS i 0,05% NaN3 w PBS) przez 30 minut na lodzie (50-100 μL/studzienkę).
    3. Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyć je buforem FACS.
    4. Utrwalić komórki za pomocą buforu do utrwalania komórek (50-100 μl / studzienka) przez 35 minut na lodzie. Odwirować komórki o stężeniu 500 x g przez 5 minut i dwukrotnie przepłukać je buforem FACS.
    5. Przechowywać próbki w buforze FACS (150-200 μl/probówkę) w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. Pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego. W przypadku populacji komórek DC i T postępuj zgodnie ze strategiami bramkowania podanymi w Rysunek 2B i Rysunek 3A.
      UWAGA: Do barwienia mieloidalnych DC zaleca się inkubację FC-blokera (szczurzy anty-mysz CD16/CD32) przez 15 minut na lodzie przed inkubacją przeciwciał powierzchniowych (krok 5.1.2).
  2. Analiza cytokin po restymulacji ex vivo
    1. Umieść komórki w kompletnym pożywce (RPMI-1640 uzupełniony 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i streptomycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy) i stymulować 50 ng/ml PMA plus 1 μM jonomycyny w obecności inhibitora transportu białek przez 4 godziny w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
    2. Wykonaj barwienie powierzchni dla markerów powierzchniowych zgodnie z powyższym opisem w kroku 5.1.
    3. Dodać roztwór permeabilizacyjny (50-100 μl/studzienkę) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia wewnątrzkomórkowego. Inkubować komórki z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin lub białek jądrowych w roztworze przepuszczalnym (50-100 μl/basenik) przez 60 minut na lodzie lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyć je buforem FACS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. Pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego.
      UWAGA: W razie potrzeby może być konieczne dostosowanie rozcieńczenia przeciwciał w celu uzyskania optymalnego barwienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Widoczna kropka wszczepionych komórek B16-F10 jest zwykle obserwowana na powierzchni skóry ~3 dni po implantacji guza. Myszy są leczone szczepionką przeciwnowotworową 3, 6 i 9 dni po tym, jak guzek guza osiągnie rozmiar ≥2 mm. Zaobserwowaliśmy znaczne zmniejszenie wzrostu guza w grupie zaszczepionych myszy ~ 2 tygodnie po implantacji guza (Rysunek 1). Pod koniec eksperymentu wyizolowaliśmy wewnątrznowotworowe komórki odpornościowe i przeanalizowaliśmy ich liczbę oraz ekspresję markerów na powierzchni ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół oparty jest na badaniu przeprowadzonym przez grupę Allison. Wykazali, że połączenie szczepionki B16-Flt3L z blokadą CTLA-4 wykazało synergiczny wpływ na wskaźnik przeżycia i wzrost guza, podczas gdy u myszy otrzymującychsamą szczepionkę B16-Flt3L lub leczenie przeciwciałami anty-CTLA-4 nie zaobserwowano zmniejszenia wzrostu nowotworu7. Ostatnie badania ujawniły nowy szlak sygnałowy CTLA4-PKCη inherentny Treg, który odgrywa ważną obowiązkową rolę w regulacji zależnej od konta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Stephenowi Schoenbergerowi za dostarczenie komórek B16-Flt3L oraz personelowi zakładu LJI do cytometrii zwierzęcej i przepływowej za doskonałe wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTA Gibco25200-056
10% inaktywowany termicznie FBSOmega ScientificFB-02 Działka# 209018
Igła 30GBD Biosciences305106
96-dołkowa płytka dolna w kształcie litery VSARSTEDT83.3926.500
Linia komórkowa B16 eksprymująca ligand kinazy tyrozynowej 3 podobny do FMS (B16-Flt3L)Prezent dr Stephena Schoenbergera, LJI CDNA Flt3L sklonowano do wektora retrowirusowego pMG-Lyt2, jak w odniesieniu 5, Rysunek uzupełniający 1
Linie komórkowe B16-F10 WirówkaATCCCRL-6475
5810RBufor
Cytofix BD BiosciencesBDB554655Bufor do utrwalania komórek (4,2% PFA) 
Zestaw Cytofix/Cytoperm BD Biosciences554714Zestaw roztworów do utrwalania/permeabilizacji
DNase ISigma11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM) Corning10013CV
Elektroniczna suwmiarka cyfrowaFisherbrand14-648-17
Oprogramowanie FlowJo Analiza danych cytometru TreeStar
GolgiStop (inhibitor transportu białek)BD Biosciences554724rozcieńczenie 1:1500
HEPES (1M)Gibco15630-080
IonomycynaSigmaI0634
Iscove' s zmodyfikowany Dulbecco" s medium (IMDM)Cytometry Thermo Fisher12440053
LSR-II BD BiosciencesCytometr przepływowy
MEM aminokwasy endogenneGibco11140-050
penicylina i streptomycyna Gibco15140-122
Percoll GE Healthcare Life SciencesGE17-0891-02gęstości specyficzny dla medium
PMASigmaP1585
Bufor lizujący czerwone krwinki Hybri-Max płyn SigmaR7757-100ML
RPMI 1640 średniCorning10-040-CV
RS2000 NaświetlaczRad Source Technologies
PirogroniansoduGibco11360-070
Sitko sterylne 40 μ mFisherbrand22-363-547
Sterylne sitko do komórek 70 μ mFisherbrand22-363-548
TL LiberaseRoche477530
Zestaw do naprawy żywotności Zombie AquaPrzeciwciała BioLegend423101
Anty-mCD45BioLegend103135Klon: 30-F11
Fluorofor: BV570
Rozcieńczenie: 1:200
BioLegend100327Klon: 145-2C11
Fluorofor: PerCP-Cy5.5
Rozcieńczenie: 1:200
Anty-mCD8BioLegend100730
100724		Klon: 53-6,7
Fluorofor: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647
Rozcieńczenie: 1:200
Anty-mCD4BioLegend100414Klon: GK1,5
Fluorofor: APC-Cy7
Rozcieńczenie: 1:200
Anty-mFoxp3Thermo Fisher Scientific 11577382Klon: FJK-16s
Fluorofor: FITC
Rozcieńczenie: 1:100
Anty-m/hGzmBBioLegend372208Klon: QA16A02
Fluorofor: PE
Rozcieńczenie: 1:100
Anty-mIFNgBioLegend505826Klon: XMG1.2
Fluorofor: PE-Cy7
Rozcieńczenie: 1:100
Anty-mCD19BioLegend115543Klon: 6D5
Fluorofor: BV785
Rozcieńczenie: 1:100
Anty-mGr1BioLegend108423Klon: RB6-8C5
Fluorofor: APC/Cy7
Rozcieńczenie: 1:200
Anty-mCD11bBioLegend101223Klon: M1/70
Fluorofor: Pacyficzny niebieski
Rozcieńczenie: 1:100
Anty-mF4/80BioLegend123114Klon: BM8
Fluorofor: PECy7
Rozcieńczenie: 1:100
Anty-mCD11cBioLegend117328Klon: N418
Fluorofor: PerCP Cy5,5
Rozcieńczenie: 1:100
Anty-mMHCIIBioLegend107622Klon: M5/114.15.2
Fluorofor: AF700
Rozcieńczenie: 1:400
Anty-mCD103BioLegend121410Klon: 2E7
Fluorofor: Alexa Fluor 647
Rozcieńczenie: 1:200
Anty-mCD86BioLegend105007Klon: GL-1
Fluorofor: PE
Rozcieńczenie: 1:200
FC-bloker (szczurzy anty-mysz CD16/CD32)BD Biosciences553141Klon: 2.4G2
Rozcieńczenie: 1:200
utrwalający Eppendorf Flow gradient rentgenowski Anty-mCD3ε

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  4. Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
  5. Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
  6. Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280(2004).
  7. Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
  8. Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
  9. Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938(2014).
  10. Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  11. Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792(2021).
  12. Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Szczepionka przeciwnowotworowa Flt3Lczerniak B16 F10kom rki dendrytycznemikro rodowisko guzacytometria przep yewowaizolacja kom rek odporno ciowychblokada punkt w kontrolnych

Powiązane artykuły