Method Article

Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/64085

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metodę immunoznakowania białka w skrawkach tkanki serca za pomocą kropek kwantowych. Technika ta stanowi użyteczne narzędzie do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji i ekspresji dowolnego białka na poziomie ultrastrukturalnym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokalizacja subkomórkowa jest kluczowa dla określenia prawidłowej funkcji i określenia mechanizmów molekularnych danego białka. W celu określenia subkomórkowej lokalizacji białek stosuje się kilka technik jakościowych i ilościowych. Jedną z pojawiających się technik określania subkomórkowej lokalizacji białka jest immunoznakowanie białka za pośrednictwem kropek kwantowych (QD), a następnie obrazowanie ich za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). QD to nanokryształ półprzewodnikowy o podwójnej właściwości struktury krystalicznej i wysokiej gęstości elektronów, co sprawia, że znajdują zastosowanie w mikroskopii elektronowej. Ta obecna metoda wizualizowała subkomórkową lokalizację białka receptora Sigma 1 (Sigmar1) za pomocą QD-TEM w tkance serca na poziomie ultrastrukturalnym. Małe kostki skrawków tkanki serca myszy typu dzikiego utrwalono w 3% aldehydzie glutarowym, a następnie osmikowano, wybarwiono octanem uranylu, a następnie sekwencyjnie odwodniono etanolem i acetonem. Te odwodnione skrawki tkanki serca zostały zatopione w żywicach epoksydowych o niskiej lepkości, pocięte na cienkie odcinki o grubości 500 nm, umieszczone na siatce, a następnie poddane demaskowaniu antygenu za pomocą 5% metaperiodianu sodu, a następnie wygaszaniu pozostałych aldehydów glicyną. Tkanki zostały zablokowane, a następnie nastąpiła sekwencyjna inkubacja w przeciwciałie pierwszorzędowym, biotynylowanym przeciwciałie drugorzędowym i QD sprzężonym ze streptawidyną. Te poplamione skrawki zostały wysuszone i zobrazowane w dużym powiększeniu za pomocą TEM. Technika QD-TEM pozwoliła na wizualizację Lokalizacja subkomórkowa białka Sigmar1 na poziomie ultrastrukturalnym w sercu. Techniki te można wykorzystać do wizualizacji obecności dowolnego białka i lokalizacji subkomórkowej w dowolnym układzie narządów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciało ludzkie składa się z wielu białek odpowiedzialnych za liczne funkcje organizmu. Funkcja białek w dużej mierze zależy od ich lokalizacji w narządzie i organellach komórkowych. Kilka technik, w tym frakcjonowanie subkomórkowe, immunofluorescencja i ekstrakcja białek za pośrednictwem detergentów, jest powszechnie stosowanych do określenia lokalizacji subkomórkowej białka1,2. Mikroskopia z użyciem barwnika immunofluorescencyjnego jest najczęściej stosowaną metodą spośród tych technik. Jednak barwniki fluorescencyjne używane w tej technice są mniej stabilne i podatne na fotowybielanie3. Inne techniki obejmowały mikroskopię o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji białka na poziomie ultrastrukturalnym poprzez immunoznakowanie białek za pomocą gęstych elektronów, metali ciężkich (złoto, ferrytyna) lub nanokryształów kropek kwantowych, a następnie wizualizacja ich za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)4,5.

QD to półprzewodnikowy nanokryształ złożony ze związków metali półprzewodnikowych o kontrolowanych właściwościach fotoluminescencyjnych, mający duże znaczenie w systemach biologicznych3. Nanokryształy QD są wytwarzane w formacie rdzeń-powłoka, w którym nanokryształ jest zamknięty w tworzeniu nanokryształów, aby zapewnić ich odpowiednią stabilność i funkcjonowanie. Powszechnie stosowaną kombinacją nanokryształów rdzeń-powłoka to CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS i CdTe/CdS/ZnS (rdzeń/powłoka/powłoka)3. Spośród tych kombinacji nanokryształów, CdSe/ZnS i CdSe/CdS są najintensywniej badane i często używane jako drugorzędowe koniugaty przeciwciał3,6. Te nanocząstki QD mają również właściwości fluorescencyjne z innymi widmami wzbudzenia i emisji niż tradycyjne fluorofory. QD wykorzystuje wzbudzenie elektronów z masowego pasma walencyjnego, aby wykazać wyższą wydajność kwantową fluorescencji w porównaniu z tradycyjnymi fluoroforami. Nanokrystaliczny układ metali półprzewodnikowych sprawia, że etykietowanie za pośrednictwem QD jest bardziej stabilne i odporne na fotowybielanie6. Ponadto, rdzeń nanokrystaliczny w QD i jego struktura krystaliczna pozwala QD o różnych rozmiarach na szeroki zakres widm absorpcyjnych i bardzo wąskie piki emisji7. Co więcej, te cząstki QD są wystarczająco duże, aby uzyskać wysoką gęstość elektronów, co czyni je użytecznymi w technikach mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, w tym w transmisyjnej mikroskopii elektronowej5,8,9. Te nanokryształy QD są również dostępne na rynku w wielu rozmiarach z różnymi widmami emisji fluorescencji i kształtami, co czyni je doskonałym kandydatem do znakowania wieloma przeciwciałami10,11.

Technologia QD zyskała ogromne znaczenie w badaniach biologicznych ze względu na wiele właściwości funkcjonalnych, w tym zastosowanie w obrazowaniu żywych komórek, badaniu mechanizmów transportu w komórce, transporcie błonowym ruchu dyfuzji białka, funkcjonalnej heterogeniczności komórek i znakowaniu organelli wewnątrzkomórkowych3,12,13,14,15,16. QD jest również przydatny w diagnostyce molekularnej do celowania i wykrywania tkanek nowotworowych, charakteryzowania profilu molekularnego guza i statusu immunologicznego oraz wizualizacji ciała szklistego i błon nasiatkówkowych3,17,18. Ponadto QD może być również stosowany w terapiach medycznych w leczeniu nowotworów złośliwych za pomocą terapii fotodynamicznej i anomalii okulistycznych poprzez dostarczanie leków do oczu3,17,18,19.

Korzystając z tych wysoce użytecznych nanokryształów QD, niniejsze badanie określiło subkomórkową lokalizację białka o nazwie receptor Sigma 1 (Sigmar1). Sigmar1 jest wszechobecnym, wielozadaniowym, molekularnym białkiem opiekuńczym. Szeroko zakrojone badania koncentrujące się na subkomórkowej lokalizacji Sigmar1 w różnych tkankach i narządach wykazały specyficzną dla komórek i typów tkanek lokalizację subkomórkową wywołującą funkcję molekularną20. W różnych komórkach (neuronalnych, fotoreceptorowych i odpornościowych) i tkankach (wątroba i mózg) przy użyciu różnych podejść biochemicznych, badania wykazały lokalizację Sigmar1 na retikulum endoplazmatycznym (ER), błonie ER związanej z mitochondriami (MAM), otoczce jądrowej, błonie plazmatycznej, retikulum nukleoplazmatycznym, jądrze i mitochondriach. Pomimo tych wszystkich badań, subkomórkowa lokalizacja Sigmar1 w sercu pozostała nieznana20. W związku z tym subkomórkową lokalizację Sigmar1 w tkance serca określono za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem QD, a następnie obrazowania TEM.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury postępowania ze zwierzętami w tym protokole były zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (wydanie ósme, National Institutes of Health, Bethesda, MD) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Stanowego Luizjany-Shreveport. Do niniejszego badania wykorzystano sześciomiesięczne samce myszy z pochodzeniem FVB/N. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów). Wykorzystane myszy były trzymane w dobrze regulowanym środowisku w klatkach umożliwiających 12-godzinny cykl światła i ciemności, zaopatrzone w wodę i regularną dietę ad libitum i były pod opieką zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Cały proces jest zilustrowany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu. Otwórz klatkę piersiową, wykonując poziome nacięcie w okolicy nad środkową częścią brzucha i ciągnąc za skórę. Ostrożnie wykonaj kolejne nacięcie, aby otworzyć jamę klatki piersiowej bez nakłuwania innych narządów21,22,23.
    1. Perfuse24 najpierw przez wierzchołek, a następnie przez prawą komorę, używając zimnego 3% aldehydu glutarowego w roztworze kardioplegicznym (50 mM KCl, 5% dekstrozy w PBS, patrz Plik Uzupełniający 1) przez 2 minuty, aby zapewnić całkowite rozluźnienie mięśnia sercowego.
  2. Perfuzjować serce za pomocą lodowatego 3% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,4, krok 2.1.1) przez kolejne 2 minuty. Używając ciśnienia grawitacyjnego, użyj igły 25 G 5/8", aby wprowadzić utrwalacze do serca. Natychmiast po tym, jak serce zacznie wypełniać się utrwalaczem, podnieś wierzchołek serca i przetnij naczynia pod spodem w odległości 1-2 mm od serca, aby zmniejszyć ciśnienie i umożliwić odpływ płynów.
  3. Rozkrój serce, usuń przedsionki24 i wrzuć komory do lodowatego 3% aldehydu glutarowego/0,1 M kakodylanu sodu na szalce Petriego. Wykonaj cięcie motyla po 30-60 minutach utrwalania i umieść go na szalce Petriego zawierającej 3% aldehydu glutarowego/kakodylanu (patrz tabela materiałów). Posiekaj serce za pomocą ostrza chirurgicznego w małe kostki o wielkości 1 mm3 w roztworze aldehydu glutarowego/kakodylanu.
  4. Utrwalić/zanurzyć wypreparowaną tkankę serca w roztworze aldehydu glutarowego/kakodylanu na 24 godziny w temperaturze 4 °C.

2. Przetwarzanie tkanki serca

  1. Po 24 godzinach utrwalania przemyć tkanki w 0,1 M buforu kakodylanu sodu przez 20 minut.
    1. Przygotować 0,1 M bufor kakodylowy, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
      1. Aby przygotować 0,1 M bufor kakodylanu sodu, należy przygotować zapas z 1 M buforu kakodylanu sodu, rozpuszczając kakodylan sodu (21,4 g) i 1% roztworu chlorku wapnia (3 ml) w 90 ml wody destylowanej. Zwiększ objętość roztworu do 100 ml, dodając wodę destylowaną. Dobrze wymieszaj roztwór i pozostaw na noc, aby rozpuścił substancję rozpuszczoną.
      2. Następnie weź 10 ml 1 M roztworu podstawowego kakodylanu sodu i dodaj go do 80 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i zwiększ objętość do 100 ml, dodając wodę destylowaną.
  2. Powtórzyć płukanie w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przez kolejne 20 minut. Usunąć tkanki z buforu kakodylanu sodu i zanurzyć je w 2% roztworze tetratlenku osmu na 4 godziny w temperaturze pokojowej. Ten proces nazywa się osmikacją.
    1. Przygotuj 2% roztwór tetratlenku osmu, wykonując poniższe czynności.
      1. Aby przygotować 2% roztwór tetratlenku osmu, weź 4% roztwór tetratlenku osmu, 4 ml (patrz tabela materiałów), 1 M roztwór podstawowy kakodylanu sodu (0,8 ml) i wodę destylowaną (3,2 ml), aby uzyskać łącznie 8 ml roztworu.
        UWAGA: Cały ten proces i kolejne kroki należy przeprowadzić w dygestorium.
  3. Po osmikacji zanurz tkanki w 2% roztworze octanu sodu na 10 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Przygotować 2% roztwór octanu sodu, rozpuszczając 4 g octanu sodu w 20 ml wody destylowanej.
  4. Następnie zanurz tkanki w 2% roztworze octanu uranylu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    1. Przygotować 2% roztwór octanu uranylu, rozpuszczając 4 g octanu uranylu w 20 ml wody destylowanej.
  5. Po barwieniu octanem uranylu należy odwodnić tkanki kolejno za pomocą stopniowanych alkoholi i acetonu w kolejności podanej w pliku uzupełniającym 1.

3. Osadzanie tkanki serca

  1. Osadź odwodnione tkanki w żywicy epoksydowej o niskiej lepkości, wykonując poniższe czynności.
    1. Aby wytworzyć żywicę epoksydową o niskiej lepkości, wymieszaj 10,24 ml monomeru epoksydowego dwutlenku cykloheksenu winylu (ERL 4221), 6,74 ml eteru diglicydylowego glikolu polipropylenowego (DER 732) i 30,05 ml bezwodnika nonenylobursztynowego (NSA) (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml. Dobrze mieszać zawiesinę ręcznie przez 2 minuty.
    2. Dodać 18 kropli przyspieszacza epoksydowego 2-dimetyloaminoetanolu (DMAE, patrz tabela materiałów) i wymieszać zawiesinę, aby dokładnie wymieszać składniki.
    3. Zaimpregnować tkanki żywicą epoksydową w następującej kolejności mieszanki.
      1. Zastąp 100% aceton żywicą 1:1: zawiesina acetonu i zanurz w niej tkanki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      2. Zastąp żywicę: zawiesinę acetonu żywicą 6:1: zawiesinę acetonu i zanurz w niej tkanki na 3 godziny.
      3. Na koniec zastąp zawiesinę żywicy 6:1 – acetonem 100% zawiesiną żywicy i pozostaw zanurzone w niej tkanki na noc w temperaturze pokojowej.
  2. Umieść chusteczki w świeżej żywicy w mikroforemkach o średnicy 8 mm (patrz tabela materiałów) i utwardź osadzone tkanki w temperaturze 70 °C przez noc.
    UWAGA: Upewnij się, że żywica jest twarda, ale nie krucha po utwardzeniu.

4. Cięcie tkanek za pomocą ultramikrotomu

  1. Przyciąć bloki żywicy z tkanką do nie większej niż 1 mm przed zamontowaniem na ultramikrotomie (patrz Tabela materiałów). Umieść formę tak precyzyjnie, jak to możliwe, w segmentowym ramieniu ultramikrotomu i ręcznie przesuń formę próbki w kierunku noża diamentowego.
  2. Wytnij sekcje o grubości 500 nm (pół mikrona) nożem Histo (patrz Tabela materiałów) i za pomocą narzędzia do pętli EM podnieś je i umieść na szkiełku podstawowym.
  3. Umieść szkiełko podstawowe na gorącym talerzu, aby uzyskać niebieską plamę toluidynową25, aby znaleźć obszar zainteresowania.
  4. Po znalezieniu obszaru zainteresowania użyj noża Ultra 45° (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać ultracienkie sekcje z jasnego złota (100 nm). Umieść te ultracienkie sekcje po matowej stronie miedzianej siatki o oczkach 200.

5. Ultracienkie barwienie sekcji serca

  1. Barwienie należy rozpocząć od zdemaskowania antygenu za pomocą roztworu do wytrawiania, tj. 5% roztworu metaperiodianu sodu.
    1. Przygotować 500 μl 5% roztworu metaperiodianu sodu (patrz Tabela Materiałów) w wodzie destylowanej.
      UWAGA: Przed użyciem przygotuj świeży roztwór.
    2. Umieść 20 μl roztworu metaperiodynianu sodu na czystej folii parafinowej. Umieść całkowicie wysuszone siatki z sekcjami tkanek na kropli roztworu do wytrawiania.
      UWAGA: Matowa strona siatki z sekcją tkankową musi być skierowana w stronę roztworu do trawienia.
    3. Pozostaw siatkę sekcji na roztworze na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Umyj wytrawiony fragment tkanki, umieszczając go na kropli wody destylowanej na 60 s.
  3. Zablokuj resztkowe aldehydy, umieszczając siatki sekcyjne na kropli 0,05 M roztworu glicyny na 10 minut w temperaturze pokojowej. Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej, aby usunąć resztki roztworu glicyny.
    1. Przygotować 0,05 M roztwór glicyny (patrz Tabela Materiałów) rozpuszczając 3,75 mg glicyny w 1 ml 1x PBS (pH 7,4).
  4. Umieścić kratki sekcyjne w 10-20 μl roztworu blokującego na 25 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Skład roztworu blokującego: 2 μL 1% normalnej surowicy koziej (NGS) + 20 μL 1% BSA (stężenie końcowe: 10%) + 178 μL 1x PBS (pH 7,4), aby uzyskać końcową objętość 200 μL.
  5. Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej i umieść część siatki na rozcieńczalniku przeciwciał w celu kondycjonowania w temperaturze pokojowej na 10 minut.
  6. Inkubować skrawki siatki z pierwszorzędowym przeciwciałem (w tym przypadku Sigmar1, patrz Tabela Materiałów; rozcieńczone w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciał) przez 1 godzinę 30 minut w wilgotnej komorze.
  7. Osuszyć siatkę i umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez 5 minut każdy.
  8. Inkubować skrawki siatki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (w tym przypadku biotynylowanym kozim poliklonalnym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko królikowi, patrz Tabela materiałów; rozcieńczone w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciała) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.
  9. Osuszyć siatkę i umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez 5 minut każdy.
  10. Inkubować odcinki siatki w dostępnej w handlu QD sprzężonej ze streptawidyną (QD655nm, patrz Tabela materiałów; rozcieńczony w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciała) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Zapobiegaj ekspozycji na światło, przykrywając komorę folią aluminiową.
  11. Osusz krawędzie rusztu za pomocą bibuły filtracyjnej i umyj sekcje siatki, umieszczając je na kropelkach wody na 2 minuty.
  12. Osusz krawędzie siatki do wyschnięcia.

6. Obrazowanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

  1. Umieść ultracienkie sekcje na miedzianych siatkach w uchwycie na kwartet próbek i zaciśnij je w pozycji umożliwiającej wybór siatek w wiązce elektronów.
  2. Włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu i włącz przełącznik pompy, aby opróżnić goniometr, a następnie całkowicie włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu (patrz Tabela materiałów).
  3. Ustaw napięcie na 80 kV przed wygenerowaniem wiązki do obserwacji obrazu.
  4. Ustaw ostrość na żądanym obszarze, uchwyć obraz za pomocą szybkiego aparatu cyfrowego i zapisz plik w .tif formacie.
    UWAGA: Ustawienie mikroskopu do uchwycenia obrazu w tym badaniu polegało na przyspieszeniu napięcia lub napięcia wysokiego napięcia 80 kV i powiększeniu 20 000x.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna metodologia QD-TEM wizualizowała obecność Sigmar1 i jego lokalizację na subkomórkowych przedziałach serca, wykonując ukierunkowane znakowanie QD anty-Sigmar1 na ultracienkich odcinkach serca dorosłych myszy. QD znakowany anty-Sigmar1 o dużej gęstości elektronów na błonach mitochondrialnych (wewnętrznych i zewnętrznych), lizosomach i interfejsie błona-mitochondria retikulum endoplazmatycznego / retikulum sarkoplazmatycznego (ER / SR) (Figura 2A, B) zilustrowano obrazami QD-TEM. Ponadto skrawki serca zostały również oznaczone króliczymi IgG i QD jako kontrolą izotypu dla pierwszorzędowego przeciwciała anty-Sigmar1 królika (Figura 2C, D). W związku z tym obrazowanie QD-TEM uwypukliło lokalizację endogennego Sigmar1 i jego wzbogacenie głównie na lizosomach i błonach mitochondrialnych.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja przedstawiająca sekwencyjne kroki i procedury używane do wykonania QD-TEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Znakowane immunologicznie QD Sigmar1 w tkankach serca dorosłych myszy. (A,B) Reprezentatywne obrazy TEM pokazujące znakowaną Sigmar1 QD na mitochondriach (błona zewnętrzna i wewnętrzna), błonach retikulum endoplazmatycznego (ER) związanego z mitochondriami / retikulum sarkoplazmatycznego (SR) i lizosomach. (C,D) Obraz TEM odcinków serca w kontroli izotypu znakowanych QD i króliczą IgG. Podziałka: 200 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Skład PBS i innych roztworów używanych do dehydratacji tkanek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu zastosowano znakowanie immunologiczne za pośrednictwem QD, aby wyraźnie pokazać subkomórkową lokalizację Sigmar1. Za pomocą QD przedstawiono lokalizację Sigmar1 na błonie mitochondrialnej, zwłaszcza na wewnętrznej błonie mitochondrialnej, w tkance serca. Ponadto stwierdzono również, że Sigmar1 znajduje się na siateczce sarkoplazmatycznej/endoplazmatycznej (S / ER) i lizosomach na poziomie ultrastrukturalnym, jak pokazano na rysunku 2A-D.

Krytycznym krokiem w tym protokole jest etap trawienia lub demaskowania antygenu przy użyciu wysoce stężonego roztworu metaperiodianu sodu w celu zdemaskowania antygenu po utrwaleniu i osmikacji aldehydu glutarowego. W protokole tym zastosowano pojedynczą kurację metaperiodianem sodu o wysokim stężeniu (5%) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ dłuższy czas trwania lub wyższe stężenie inkubacji metaperiodianu sodu spowoduje agregację struktur, utratę definicji błony dla organelli i spowoduje perforacje w przekroju, co utrudni wizualizację białka lub struktury. Alternatywnie, zamiast 5% metaperiodatu można również zastosować roztwór metaperiodatu o niższym stężeniu (3%) w dwóch etapach przez 30 minut. Badania wykazały, że ta opcja daje podobne wyniki, jak w przypadku 5% roztworu metaperiodatu do jednoetapowej 30-minutowej inkubacji. Jednak 3% roztwór metaperiodatu przez 30 minut inkubacji przez dwa razy zapewnia lepszą kontrolę nad procesem 26,27,28. Początkowo protokół ten wykorzystywał inkubację skrawków z 10% roztworem metaperiodatu przez 30 minut. Jednak ze względu na zbyt wiele perforacji powstałych w sekcji tkankowej przez to stężenie, końcowe stężenie i czas inkubacji roztworu metaperiodatu zostały zmniejszone i zoptymalizowane do 5% przez 30 minut.

Kolejnym krokiem była optymalizacja czasu wiązania aldehydem glutarowym. Nieoptymalne utrwalenie tkanek powoduje nieodpowiednie oznakowanie QD, podczas gdy nadmierne utrwalenie tkanek skutkuje wyższym znakowaniem nieswoistym. W związku z tym należy zwrócić szczególną uwagę na określenie i miareczkowanie optymalnego poziomu utrwalenia tkanek dla prawidłowego i specyficznego znakowania białek. W tej metodzie z wykorzystaniem tkanek serca czas wiązania aldehydem glutarowym miareczkowano przy użyciu 24 h i 48 h jako punktów czasowych. Na podstawie obrazów barwienia odcinków ustalonych dla obu punktów czasowych stwierdzono, że odcinki ustalone na 24 godziny wykazały lepsze wyniki. Do tej pory nanokryształy QD są dostępne w wielu rozmiarach, w tym 525, 565, 585, 605, 655 i 705 nm11,29. Każdy z tych QD ma swoje własne widma emisyjne i emituje fluorescencję na różnych długościach fal. Dodatkowo, te dostępne na rynku QD o różnych rozmiarach mają różne kształty; na przykład QD 525, 565 i 585 są praktycznie kuliste o różnych rozmiarach, podczas gdy QD 605, 655 i 705 mają nieregularny, podłużny kształt. Spośród tych różnych nanokryształów QD, QD 525, 565 i 655 są łatwo odróżnialne od siebie11,29. Te różnice w widmach emisyjnych i kształtach sprawiają, że QD jest doskonałym kandydatem do wielokrotnego znakowania białek i wizualizacji za pomocą fluorescencji i mikroskopii elektronowej. W tym badaniu użyto dostępnego na rynku QD, QD 655, do znakowania białka Sigmar1 w celu odróżnienia go od dowolnego niespecyficznego tła w barwionych sekcjach.

Innym odpowiednikiem QD do znakowania białek w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości jest cząstka immunogold. Cząsteczki immunogold są tradycyjnie używane do znakowania białek do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Te cząsteczki złota mają dużą gęstość elektronów i są łatwe do zidentyfikowania w porównaniu z nanokryształami QD. Jednak QD wykazuje lepszą skuteczność dzięki lepszej penetracji w tkankach, wyższej stabilności i trwałości oraz lepszej retencji składników ultrastrukturalnych, co czyni je lepszym kandydatem do znakowania białek 4,5. QD ma również unikalną zdolność do wykrywania zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej, co zwiększa jego wartość w porównaniu z znakowaniem immunozłotem10.

Jednym z ograniczeń tego znakowania immunologicznego za pośrednictwem QD jest użycie tetratlenku osmu podczas przetwarzania. Tetratlenek osmu jest stosowany do zwiększania gęstości elektronów, przewodności i kontrastu inaczej mniej gęstych elektronów i mniej kontrastowych biologicznych struktur błonowych 5,30. Jednak użycie tetratlenku osmu natychmiast i nieodwracalnie niszczy właściwość próbki do tworzenia fluorescencji po znakowaniu QD6. Ogranicza to zastosowanie QD w mikroskopii fluorescencyjnej. Alternatywne podejście, polegające na pominięciu tetratlenku osmu, będzie korzystne dla zachowania właściwości fluorescencyjnych, a tym samym dla podwójnego zastosowania immunoznakowania za pośrednictwem QD. Niektóre z nowszych modeli TEM mają możliwość dołączenia systemu Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDX), który umożliwia identyfikację składu pierwiastkowego materiałów. Kolejnym ograniczeniem badania jest brak mapowania pierwiastkowego próbki i analizy obrazu za pomocą EDX. Dlatego przyszłe badania powinny koncentrować się na analizie EDX widm QD w celu analizy składu pierwiastkowego.

Znakowanie QD białek zyskało w ostatnim czasie wiele uwagi. QD oferuje wiele zastosowań i zalet zarówno w badaniach biologicznych, jak i terapiach medycznych. QD dodatkowo owinięty ligandem wielozębnym wykazuje zwiększoną stabilność, utrzymując wydajność kwantową. Co więcej, kapsułkowanie QD tymi biologicznie korzystnymi środkami zwiększa również jego biodostępność w tkankach, co czyni go dobrym kandydatem do potencjalnego zastosowania w wykrywaniu nowotworów, obrazowaniu żywych komórek, dostarczaniu leków i obrazowaniu tkanek 3,31,32.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 i R01HL152723; Nagroda LSUHSC-S CCDS Finish Line, Nagroda za badania nad COVID-19 i Nagroda za badania LARC dla MSB; LSUHSC-S Stypendium podoktorskie Malcolma Feista w dziedzinie chorób sercowo-naczyniowych i AHA w CSA (20POST35210789); oraz LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship dla RA.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siatka miedziana 200 MeshTed PellaG200HH
6-miesięczne samce myszy z tłem FVB/NJackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Aceton 100%Fisher ChemicalsA949
Rozcieńczalnik przeciwciałDakoS3022
anty-Sigmar1Sygnalizacja komórkowa61994S
Biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgGSigma AldrichB7389
BSAc (10%)Mikroskopia elektronowa Nauki25557
Chlorek wapniaSigma AldrichC7902
Cytoseal XylThermo fisher8312-4
DER 732C36AA10:C33Mikroskopia elektronowa Sciences13010
DekstrozaSigma AldrichG7528
Nóż diamentowyDiatomeHisto; Ultra 450
DMAEMikroskopia elektronowa Sciences13300
Mikroskop elektronowyJEOLJEOL-1400 Flash
ERL 4221Mikroskopia elektronowa Sciences15004
Etanol 100%Fisher ChemicalsA405P
Aldehyd glutarowy 3%Mikroskopia elektronowa Nauki16538-15
GlycineAlfa AesarA13816
Kwas solnyFisher ScientificSA56
MicromoldsTed Pella10505
MicrotomeLeica MicrosystemEM UC7
Normalna surowica koziaInvitrogenPCN5000
NSA Mikroskopia elektronowa Sciences19050
Tetratlenek osmuMikroskopia elektronowa Nauki19150
ParafilmGenesse Scientific16-101
Chlorek potasuSigma AldrichP5655
Fosforan potasu jednozasadowySigma Aldrich71640
Qdot 655 Koniugat streptawidynyInvitrogenQ10121MP
Octan soduFisher ScientificBP334
Kakodylan soduMikroskopia elektronowa Sciences12300
Chlorek soduFisher ScientificBP358
Metaperiodynian soduSigma Aldrich71859
Fosforan sodu dwuzasadowySigma AldrichP9541
Ostrze chirurgiczne (rozmiar 10)Aspen surgical371110
TEM  oprogramowanie do obrazowaniaAMT-V700AMT Systemy
TEM Kamera do obrazowania TEMXR80 Seria TEMobrazowania AMT TEM
Roztwór błękitu toluidynowego O (0,5%)Fisher ScienticS25612
Octan uranyluPolysciences21447
przeciwciało obrazowania Systemy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).">Lidke, D. S., Lidke, K. A. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).
  2. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20(1971).">de Duve, C. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20(1971).
  3. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).">Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).
  4. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).">Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).
  5. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).">Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).
  6. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).">Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  7. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).">Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).
  8. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).">Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  9. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307(2016).">Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307(2016).
  10. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).">Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).
  11. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).">Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  12. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).">Lidke, D. S., et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).
  13. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).">Pleskova, S. N., et al. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).
  14. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).">Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).
  15. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).">Hanaki, K. -i, et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).
  16. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).">Lim, Y. T., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).
  17. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).">Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  18. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).">Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).
  19. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).">Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).
  20. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575(2021).">Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575(2021).
  21. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).">Bohne, B., Harding, G. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).
  22. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).">Roszkowski, M. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).
  23. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988(2021).">Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988(2021).
  24. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).">Jones, W. K., et al. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).
  25. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).">Hunter, E. E. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).
  26. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).">Morris, R. E., Ciraolo, G. M. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).
  27. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).">Brorson, S. H. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).
  28. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).">Lobo, M. V. T., et al. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).
  29. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).">Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).
  30. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).">Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  31. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).">Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).
  32. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233(2021).">Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Subcellular LocalizationQuantum DotsImmunolabeling TechniqueTransmission Electron MicroscopyHeart TissueSigma 1 ReceptorProtein LocalizationElectron MicroscopyAntigen UnmaskingStreptavidin Conjugated QD

Related Articles