Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie powtarzalnego modelu aktywacji immunologicznej matki w połowie ciąży przy użyciu poli(I:C) w celu zbadania podatności i odporności u potomstwa

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64095

⸱

17 sierpnia 2022

 , 
1Center for Neuroscience, UC Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie matki jest czynnikiem ryzyka zaburzeń neurorozwojowych. Mysie modele aktywacji immunologicznej matki (MIA) mogą wyjaśnić wpływ infekcji na rozwój i funkcjonowanie mózgu. W tym miejscu przedstawiono ogólne wytyczne i procedurę produkcji niezawodnie odpornego i podatnego potomstwa narażonego na MIA.

Streszczenie

Aktywacja immunologiczna matki (MIA) podczas ciąży jest konsekwentnie związana ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych u potomstwa. Modele zwierzęce MIA są wykorzystywane do badania przyczynowości, badania mechanizmów oraz opracowywania diagnostyki i leczenia tych zaburzeń. Pomimo ich powszechnego stosowania, wiele modeli MIA cierpi na brak odtwarzalności i prawie wszystkie ignorują dwa ważne aspekty tego czynnika ryzyka: (i) wiele potomstwa jest odpornych na MIA oraz (ii) podatne potomstwo może wykazywać różne kombinacje fenotypów. Aby zwiększyć odtwarzalność i modelować zarówno podatność, jak i odporność na MIA, wyjściową immunoreaktywność (BIR) samic myszy przed ciążą wykorzystuje się do przewidywania, które ciąże zakończą się albo odpornym potomstwem, albo potomstwem ze zdefiniowanymi nieprawidłowościami behawioralnymi i molekularnymi po ekspozycji na MIA. W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę indukowania MIA poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie dwuniciowego RNA (dsRNA) wirusowego mimicznego poli(I:C) w 12,5 dniu ciąży. Metoda ta wywołuje ostrą reakcję zapalną w tamie, co powoduje zaburzenia w rozwoju mózgu u myszy, które mapują się na podobnie dotknięte domeny w ludzkich zaburzeniach psychicznych i neurorozwojowych (NDD).

Wprowadzenie

Dowody epidemiologiczne łączą zakażenie matki ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń psychicznych i NDD, w tym schizofrenii (SZ) i zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Mysi model MIA został opracowany w celu zbadania przyczynowości i mechanistycznej roli MIA w etiologii tych zaburzeń, a także w celu identyfikacji biomarkerów molekularnych i opracowania narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych4,6. Pomimo użyteczności tego modelu i jego rosnącej popularności, istnieje znaczna zmienność w protokołach indukcji MIA w tej dziedzinie, co utrudnia porównywanie wyników między badaniami i powielanie wyników8,9. Ponadto większość iteracji modelu nie bada dwóch ważnych aspektów translacyjnych MIA: (i) wiele potomstwa jest odpornych na MIA, oraz (ii) podatne potomstwo może wykazywać różne kombinacje fenotypów8.

Aby wygenerować powtarzalny model MIA, badacze powinni podać przynajmniej jedną ilościową miarę wielkości indukowanego MIA w matkach. Aby wywołać MIA w czasie ciąży, nasze laboratorium wykonuje dootrzewnowe (i.p.) iniekcje dwuniciowego wirusa RNA naśladującego poliinozyt: kwas policytydylowy [poli(I:C)]. Poli(I:C) indukuje kaskadę immunologiczną podobną do wirusów grypy, ponieważ jest rozpoznawany przez receptor toll-podobny 3 (TLR3)10. W rezultacie, poli(I:C) aktywuje odpowiedź ostrej fazy, która powoduje szybki wzrost cytokin prozapalnych8,11,12. Wcześniejsze badania wykazały, że zwiększenie poziomu cytokin prozapalnych, w tym interleukiny-6 (IL-6), jest konieczne do wytworzenia nieprawidłowości behawioralnych i neuropatologii u potomstwa w wyniku MIA11,12,13. Tak więc poziom IL-6 w surowicy matki pobrany podczas jego szczytu po 2,5 godzinie po wstrzyknięciu poli(I:C) jest przekonującą miarą ilościową MIA, którą można wykorzystać do porównania wyników w różnych laboratoriach w terenie.

W celu wygenerowania modelu MIA, który odnosi się do istotnych translacyjnie elementów odporności i podatności za pomocą jednego protokołu indukcji8,14, badacze mogą połączyć typowe podejścia do indukcji z charakterystyką wyjściowej immunoreaktywności matki (BIR) przed ciążą8. Niedawno odkryto, że dziewicze samice myszy C57BL/6 wykazują szeroki zakres odpowiedzi IL-6 na niską dawkę ekspozycji na poli(I:C) przed ciążą8. Jest to tylko podzbiór tych samic, które wydają na świat podatne potomstwo i tylko przy pewnej wielkości aktywacji immunologicznej, zgodnie z kombinacją dawki BIR i poli(I:C)8. MIA indukuje fenotypy w odwróconym wzorze U; Potomstwo wykazuje największe aberracje behawioralne i molekularne, gdy matki są umiarkowanie immunoreaktywne, a skala stanu zapalnego matki osiąga, ale nie przekracza, zakres krytyczny8. W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę, jak niezawodnie tworzyć zarówno odporne, jak i podatne potomstwo o rozbieżnych fenotypach behawioralnych w wyniku wstrzyknięcia poli(I:C) w połowie ciąży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Podczas pozyskiwania zwierząt należy zachować spójność następujących parametrów, aby zapewnić maksymalną powtarzalność.
    1. Dostawca i lokalizacja dostawcy: jak raportowano wcześniej, myszy typu dzikiego C57BL/6J wykazują różne reakcje na tę samą dawkę poly(I:C) w zależności od dostawcy8. Należy wybrać dostawcę i szczep myszy wykazujące spójną odpowiedź. W przypadku tutejszych eksperymentów myszy C57BL/6 pozyskane z Charles River wykazały spójne zmiany w zachowaniu po ekspozycji na MIA w połowie okresu ciąży, podczas gdy myszy zakupione w Taconic wykazały silniejszą odpowiedź, z pewnymi różnicami między grupami traktowanymi w porównaniu z myszami z Charles River8.
    2. Szczep: najczęściej wykorzystywane są myszy C57BL/6J, jednak myszy BTBR i inne szczepy wykazują odmienne reakcje na MIA w połowie okresu ciąży9. Należy zwrócić uwagę na te różnice w odpowiedziach, ponieważ zwiększają one powtarzalność metody i mogą stanowić potencjalną zmienną przyczyniającą się do odmiennych wyników u potomstwa.
    3. Aby zapewnić minimalną zmienność, do badań nad MIA należy używać wyłącznie dziewiczych samic8 i wyraźnie zaznaczyć szczegóły w opisie metod.
    4. Wiek w momencie transportu i okres aklimatyzacji: myszy transportowane przed 7. tygodniem życia wykazują rozregulowane układy endokrynne15. Należy pozwolić zwierzętom na aklimatyzację przez minimum 48 h16,17. Zamawiać myszy tak, aby zostały wysłane w 7. tygodniu (± 2 dni) i podawać iniekcje dla BIR w 8. tygodniu (± 2 dni).
    5. Wiek w momencie kojenia: układ odpornościowy zwierząt zmienia się dynamicznie w ciągu ich życia. Należy dbać o zminimalizowanie zmienności, utrzymując wiek w momencie kojenia/iniekcji na możliwie stałym poziomie18,19,20. Kojenie samic przeprowadzać w 9. tygodniu (± 2 dni). Do kojenia nie używać samców w wieku powyżej 6 miesięcy.

2. Testowanie i przygotowanie partii Poly(I:C)

  1. Przygotuj wysokocząsteczkowy poly(I:C) zgodnie z poniższym opisem.
    1. Autoklawować probówki do mikrocentrifugówki o pojemności 1,5 ml przeznaczone do przechowywania. Resuspendowane poly(I:C) można przechowywać w temperaturze -20 °C, jednak wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie może wpłynąć na aktywność. Podgrzać kąpiel wodną do 70 °C.
    2. Stosując technikę sterylną, za pomocą strzykawki dodać 10 ml sterylnej soli fizjologicznej (NaCl 0,9%) do liofilizowanego poly(I:C). Podgrzać w 70 °C inkubować w łaźni wodnej przez 15 min, aby umożliwić pełne prażenie. Wyjąć i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    3. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza należy dodać do butelki kolejne 40 ml soli fizjologicznej i kilka razy odwrócić naczynie, aby wymieszać zawartość. Należy zdjąć górną część butelki z poly(I:C) lub użyć strzykawki, aby rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować poly(I:C) o mieszanej masie cząsteczkowej zgodnie z poniższym opisem.
    1. Autoklawować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml przeznaczone do przechowywania. Resuspendowane poly(I:C) można przechowywać w temperaturze -20 °C jednak powtarzalne zamrażanie i rozmrażanie może wpłynąć na aktywność. Ustawić kąpiel wodną na 50 °C.
    2. Stosując technikę sterylną, dodać 10 ml sterylnego 0,9% NaCl do liofilizowanego poly(I:C) i szczelnie zamknąć pokrywkę. Podgrzewać w 50 °C inkubować w kąpieli wodnej przez 25 min w celu pełnego wyżarzania. Wyjąć i pozwolić ostygnąć do temperatury pokojowej.
    3. Stosując technikę sterylną, rozdzielić na alykwoaty do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Podaj poly(I:C) poprzez iniekcje dospieszniowe (i.p.) zgodnie z poniższym opisem.
    1. Zważ mysz w celu dokładnego ustalenia dawki. Za pomocą igły insulinowej 0,5 cm³ pobierz resuspensowane poly(I:C). Chwyć mysz za kark i odwróć ją tak, aby brzuch był odsłonięty.
    2. Drugą ręką wprowadź igłę na głębokość około 0,5 cm pomiędzy dwa przednie sutki pod kątem około 45°.
    3. Odessać niewielką ilość płynu, aby upewnić się, że do strzykawki nie przedostała się krew ani mocz przed wykonaniem wstrzyknięcia. W przypadku wystąpienia którejkolwiek z tych substancji należy zmienić położenie igły i spróbować ponownie. Wstrzykiwać powoli. Jeśli poly(I:C) wypływa w formie pęcherzyków, wstrzyknięcie prawdopodobnie odbyło się podskórnie. Prawidłowe umiejscowienie wstrzyknięcia objawia się brakiem zasysania jakiegokolwiek płynu po wprowadzeniu igły oraz brakiem wycieku po jej wyjęciu.
  4. Przeprowadź test mocy partii poly(I:C) MMW zgodnie z poniższym opisem8.
    1. Należy uzyskać pożądaną postać poly(I:C). Niektórzy producenci umożliwiają badaczom rezerwację całej lub części partii na czas badania aktywności, aby w późniejszym terminie można było jednocześnie nabyć kilka butelek. Zazwyczaj mogą być one przechowywane w formie liofilizowanej w temperaturze -20 °C przez kilka lat, pod warunkiem unikania cykli zamrażania i rozmrażania.
    2. Należy pozyskać lub wyhodować 30 ciężarnych samic do badań. W dniu E12.5 należy wykonać iniekcje d.o. (dosytnio) w dawkach 20, 30 i 40 mg/kg u minimum 10 myszy na dawkę.
    3. W 2,5 h po wstrzyknięciu pobrać krew poprzez pobieranie krwi z ogona. Należy pamiętać, że poziom cytokin w krwi obwodowej i krwi z tułowia może się różnić, dlatego należy zachować spójność metody pobierania w obrębie jednego badania.
    4. Pozostawić krew do skrzepnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Po 12–24 h odwirować próbki krwi przy 3768 x g w 4 °C przez 8 min. Zebrać surowicę i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu analizy.
    5. Izolacja surowicy i pomiar poziomu IL-6 poprzez ELISA lub Luminex. Należy zachować spójność narzędzi pomiarowych, ponieważ istnieje znaczna zmienność całkowitego stężenia mierzonego za pomocą różnych metod i przez różnych producentów. Wyznaczyć wielkość odpowiedzi IL-6 niezbędną do wywołania fenotypów, wykorzystując kohortę pilotażową.

3. Badanie podstawowej immunoreaktywności (BIR)

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schemat poszczególnych kroków. Do testów BIR należy użyć poly(I:C) o innej masie cząsteczkowej niż w przypadku okresu gestacyjnego, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych na ten związek.

  1. Zamów myszy samice niekopulowane, tak aby zostały dostarczone w wieku 7 tygodni. Po przyjeździe pogrupuj i ulokuj od czterech do pięciu myszy w jednej klatce; utrzymuj je w grupach do momentu kopulacji. Zastosuj nacięcia małżowin usznych lub inny system identyfikacji.
  2. Wstrzyknąć samicom doprzewnownikowo 5 mg/kg poly(I:C) 1 tydzień po przybyciu. 2,5 h po wstrzyknięciu, gdy stężenie krążącej IL-6 jest najwyższe6pobrać krew pełną od wstrzykniętych zwierząt poprzez odcięcie fragmentu ogona.
  3. Pozostawić krew do skrzepnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Po 12–24 h odwirować próbki krwi z prędkością 3768 x g w 4 °C przez 8 min.
  4. Zebrać co najmniej 32 µL surowicy z każdej próbki. Zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia analizy w kierunku cytokin. W celu uzyskania najbardziej powtarzalnych pomiarów poziomu IL-6 należy zastosować analizę multipleksową, np. system Luminex. Należy stosować te same narzędzia pomiarowe, ponieważ istnieje znaczna zmienność całkowitego stężenia mierzonego za pomocą różnych metod i przez różnych producentów.
    1. W celu zapoznania się z protokołem analizy Luminex należy odwołać się do pracy Bruce i współpracowników.21.
  5. Na podstawie względnych poziomów IL-6 podziel zwierzęta na grupy BIR: niską (dolny kwartyl), średnią (środkowe dwa kwartyle) i wysoką (najwyższy kwartyl).

4. Metoda pobierania krwi poprzez nacięcie ogona

UWAGA: Aby uniknąć stosowania środków uspokajających o potencjalnym działaniu immunomodulującym, należy zastosować metodę pobierania krwi z ogona.

  1. W celu przygotowania stanowiska, umieść statyw lutowniczy i kubek stabilizujący na powierzchni po stronie niedominującej ręki. Do szalki Petriego o średnicy 35 mm wlej 1-2 mL jadalnego oleju spożywczego. Zdejmij nasadkę z szybkozłączywa do krwi i połóż ją w pobliżu stanowiska.
  2. Połóż kilka warstw ręcznika papierowego na statywie lutowniczym, a pierwszą kapilarę umieść w uchwycie, pozycjonując ją w miejscu, gdzie będzie znajdować się końcówka ogona myszy, tak aby kapilara była równoległa do powierzchni stołu. Przygotuj żyletkę.
  3. Aby pobrać krew, wykonaj następujące czynności:
    1. W wyznaczonym czasie wyjmij mysz z klatki i umieść pod kubkiem w taki sposób, aby ogon wystawał przez wycięcie w podstawie. Używając nowej żyletki, odetnij sam koniec ogona (1-2 mm) i zbierz pierwszą kroplę krwi do kapilary przymocowanej do statywu lutowniczego.
    2. Zanurz palce dominującej ręki w jadalnym oleju i użyj ich do wyciskania krwi od nasady ogona w kierunku końcówki, kierując końcówkę ogona do kapilary, aby zebrać powstające krople krwi. Kontynuuj czynność, aż zostanie zebrane około 200 µL krwi.
    3. Załóż małą zaślepkę na zwężony koniec kapilary przed założeniem górnej nasadki. Jeśli górna nasadka zostanie założona najpierw, próbka zostanie wypchnięta przez zwężony koniec rurki. Umieść rurkę w ochronnej osłonce zewnętrznej.
    4. Pozostaw krew do ścięcia w temperaturze pokojowej przez noc. Schłodź mikrocentryfugę do 4 °C i odwiruj krew zgodnie z opisem w kroku 3.3.

Schemat procesu pomiaru cytokin u myszy; zastosowanie metody Luminex/ELISA; harmonogram pobierania krwi.
Rysunek 1Harmonogram badania bazowej immunoreaktywności samic dziewiczych oraz ich kojarzenia. Zamów myszy tak, aby dotarły w wieku 7 tygodni, i pozwól im na aklimatyzację w placówce przez 1 tydzień. Wstrzyknij zwierzętom 5 mg/kg poly(I:C), a po 2,5 h pobierz krew. Pozostaw krew do skrzepnięcia przez noc, a następnie odwiruj przy 3768 x g, 4 °C przez 8 min. Należy zebrać surowicę i ocenić względne poziomy IL-6 poprzez ELISA lub Multiplex. W wieku 9 tygodni utworzono pary do kojarzenia. Stworzono przy użyciu BioRender.com Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

5. Metoda oparta na masie ciała dla kojarzenia i iniekcji w dniu E12.5 ciąży

UWAGA: Rycina 2 przedstawia schemat poszczególnych kroków. Do tworzenia par kopulacyjnych i wyznaczania punktu czasowego E12.5 można zastosować dwie metody. Pierwsza, polegająca na kopulacji kontrolowanej czasowo, została opisana w innym opracowaniu22. Do oceny ciąży w stadium E12.5 można również wykorzystać obliczenia oparte na masie ciała23. Zaletą tego podejścia jest możliwość zsynchronizowania wieku samicy w momencie kopulacji, co zmniejsza zmienność odpowiedzi immunologicznej. W niniejszej procedurze zastosowano tę metodę.

  1. Umieść samce w czystych klatkach i pozwól im na aklimatyzację przez minimum 2 h. Zmniejsza to prawdopodobieństwo agresji samic, ponieważ samce zdążą już wyznaczyć dominujący zapach w klatce.
  2. Utworzyć pary hodowlane składające się z jednego samca i jednej samicy, umieszczając samicę w klatce z samcem. Przed umieszczeniem samicy w klatce należy zważyć ją i zapisać masę ciała. Do każdej klatki dodać niewielką garść nasion słonecznika, aby zwiększyć efektywność kojenia.
  3. Aby określić zakres przyrostu masy ciała, należy wykonać następujące kroki.
    1. Należy dobrać grupę testową samic i utworzyć pary do kojarzenia, odnotowując masę ciała w momencie kojarzenia.
    2. Gdy samice zaczną wykazywać widoczne oznaki ciąży, należy je zważyć i podzielić na podgrupy w zależności od przyrostu masy ciała: 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g oraz 11,5 g. Płody w dniu E12.5 zaczęły właśnie rozwijać wyraźne palce w łapach. Na podstawie morfologii płodów należy określić średni przyrost masy ciała niezbędny do osiągnięcia stadium E12.5.
  4. W 12. dniu po kopulacji zważ samice i określ przyrost masy ciała. W warunkach laboratoryjnych samice konsekwentnie przybierają od 9,5 do 10,5 g od momentu kopulacji do dnia E12,5. Wstrzyknij poprzez i.p. dawkę rozpuszczonego poly(I:C) wyznaczoną w kroku 2.3.2, gdy przyrost masy ciała samicy mieści się w predetermined zakresie.
  5. Obserwuj odpowiedź na MIA u matek, posługując się następującymi parametrami.
    1. Zachowanie chorobowe: Zbierz subiektywne oceny w skali od 1 do 3 określające stopień aktywności matek w odpowiedzi na manipulację, gdzie 1 oznacza niewielki lub brak ruchu w odpowiedzi na manipulację, a 3 oznacza normalną reakcję na chwytanie i unieruchomienie. Zwierzęta z silniejszą odpowiedzią immunologiczną będą wykazywać mniejszy opór podczas manipulacji.8.
    2. Reakcja gorączkowa: Za pomocą termometru podczerwonego (IR) zmierz temperaturę przed wstrzyknięciem oraz 2,5 h po wstrzyknięciu. Zwierzęta o silniejszej odpowiedzi immunologicznej często wykazują hipotermię w odpowiedzi na większą aktywność układu odpornościowego.8.
    3. Zmiana masy ciała: Zważ zwierzęta 24 godziny po wstrzyknięciu. Zwierzęta z silniejszą odpowiedzią immunologiczną zazwyczaj tracą więcej masy ciała.8.
    4. Pomiar poziomu IL-6 w okresie ciąży należy przeprowadzić w następujący sposób:8.
      1. W 2,5 h po wstrzyknięciu należy pobrać krew wybraną metodą. Krew pozostawić do skrzepnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Po 12–24 h próbki krwi odwirować przy 3768 x g w 4 °C przez 8 min.
      2. Pobrać surowicę i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy. Wyizolować surowicę i zmierzyć poziom IL-6 poprzez ELISA lub Luminex. Należy zachować spójność narzędzi pomiarowych, ponieważ występuje znaczna zmienność całkowitego stężenia mierzonego za pomocą różnych metod i przez różnych producentów.
      3. Po wstrzyknięciu samicę należy umieścić w pojedynczej klatce, zapewniając odpowiednie wzbogacenie środowiska, takie jak materiały gniazdowe i urządzenia wzbogacające. Całe wzbogacenie powinno pozostać niezmienne, ponieważ zmiany w tym zakresie mogą mieć istotny wpływ na zachowanie gryzoni.24,25,26,27,28,29.
  6. Czas ciąży u myszy szczepu C57 wynosi od 18,5 do 20,5 dnia. Należy przeprowadzać kontrole miotów, aby ustalić, czy zwierzęta urodziły się w tym przedziale czasowym, co pozwoli upewnić się, że iniekcję wykonano w odpowiednim punkcie czasowym. Podczas sprawdzania obecności miotów należy w jak najmniejszym stopniu niepokoić zwierzęta w klatce. Stres bezpośrednio po narodzinach miotu może zwiększyć ryzyko kanibalizmu.

Schemat badania na myszach, metoda pomiaru cytokin, sól fizjologiczna, wstrzyknięcie Poly(I:C), proces sprawdzania miotu.
Rysunek 2indukcja MIA. Indukcja MIA wymaga oceny stanu ciąży, wewnątrzbrzusznego (i.p.) wstrzyknięcia poly(I:C) oraz kontroli miotów w celu zapewnienia prawidłowego czasu wystąpienia stanu zapalnego u matki. Po ocenie dnia gestacji należy albo poprzez w przypadku zapłodnienia kontrolowanego czasowo lub metody przyrostu masy ciała, należy wykonać d.o. iniekcję poly(I:C) w dniu E12,5. Próbkę krwi należy pobrać 2,5 h po iniekcji w celu potwierdzenia aktywacji odpornościowej i oznaczenia poziomu aktywacji IL-6. Mioty urodzą się mniej więcej w dniach E18,5–E20,5. Utworzono przy użyciu BioRender.com Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

6. Badanie zmian w zachowaniu dorosłych potomstwa z grupy MIA i kontrolnej (opcjonalnie)

  1. Zaczynając od 60. dnia życia (P60) i przed przeprowadzeniem testów behawioralnych, aklimatyzuj zwierzęta do kontaktu z człowiekiem poprzez delikatne obchodzenie się z nimi przez 1 min dziennie przez 3 kolejne dni. Upewnij się, że dni wymiany klatek nie pokrywają się z dniami wykonywania testów behawioralnych.
  2. Zawsze pozwól myszom na aklimatyzację w pomieszczeniu testowym przez 30-60 min przed rozpoczęciem testów behawioralnych. Używaj pomieszczeń z przyciemnionym oświetleniem (15-20 lux), aby zminimalizować lęk.
  3. W celu oceny powtarzalnego pielęgnacyjnego czyszczenia ciała (grooming), umieść myszy pojedynczo w czystych klatkach z pokrywkami, bez ściółki. Za pomocą kamery rejestruj myszy w tych klatkach przez 20 min. Pierwsze 10 min służy jako okres aklimatyzacji, a kolejne 10 min jest okresem testowym.
  4. Korzystając z zapisanych nagrań wideo i stopera, określ skumulowany czas pielęgnacyjnego czyszczenia ciała dla każdej myszy podczas 10-minutowego okresu testowego. Inne zachowania, które można ocenić na podstawie tych nagrań, obejmują wspięcie się na tylne łapy (rearing), zastygnięcie (freezing) oraz skakanie8.
  5. Zastosuj inne powszechne testy dla modelu MIA, takie jak hamowanie reakcji na bodziec poprzedzający (PPI) 14,30,31,32, test otwartej przestrzeni (open field)12,33,34, test społecznego zbliżania w trzech komorach13,35,36, test rozpoznawania nowych przedmiotów37, labirynt w kształcie litery Y (y-maze)30, podwyższony labirynt plus (elevated plus maze)33 oraz warunkowanie lękowe kontekstowe/sygnałowe38.
  6. Immunoblotting ponatalny8 (opcjonalnie)
    1. W dniu P0 szybko dokonaj dekapitacji i wyizoluj tkankę mózgu płodowego w HBSS, zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze −80 °C.
    2. Rozbij próbki za pomocą sonikatora z sondą przy amplitudzie 20% przez 5 s w 2x buforze Laemmli, następnie denaturuj w temperaturze 85 °C przez 5 min. Odwiruj lizat przy 16 000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Zbierz supernatant i przechowuj w temperaturze -80 °C.
    3. Zmierzy całkowitą zawartość białka przy użyciu komercyjnego zestawu do analizy białek BCA, zgodnie z instrukcją producenta, stosując albuminę surowicy bydlęcej jako standard kalibracyjny.
    4. Dodaj ditiotreitol jako czynnik redukujący do próbek do uzyskania końcowego stężenia 100 mM. Podgrzej do 85 °C przez 2 min przed nałożeniem na żel.
    5. Rozdziel 5 µg białka na każdą ścieżkę w warunkach redukujących na żelach TGS 7,5% i przenieś elektroforetycznie na membrany PVDF. Zablokuj membrany buforem blokującym i inkubuj z wybranymi przeciwciałami.
    6. Przemyj trzykrotnie roztworem TBS + 0,05% Tween 20 i inkubuj membrany przez 45 min z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi.
    7. Przemyj dodatkowo czterokrotnie w TBS/Tween 20 i wykonaj obrazowanie wyników. Znormalizuj wyniki przy użyciu β-tubuliny, wykrywanej za pomocą przeciwciał anty-β-tubulinowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nie wszystkie zwierzęta poddane działaniu 30 mg/kg poly(I:C) w dniu E12.5 dają potomstwo z jednolitymi zaburzeniami behawioralnymi8,31. Choć dawki 30 mg/kg i 40 mg/kg poly(I:C) niezawodnie wywołują u matek zachowania chorobowe, w tym obniżony poziom aktywności, reakcje hipotermiczne i utratę masy ciała, a także powodują znaczny wzrost poziomu IL-6, tylko część miotów poddanych MIA wykaże w przyszłości zaburzenia behawioralne w obszarach podobnych do tych obserwow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zakażenie matki zmienia przebieg rozwoju mózgu u ludzi, zarówno u gryzoni, jak i naczelnych 4,5,7. W tym miejscu przedstawiono procedurę indukowania MIA u myszy w połowie ciąży za pomocą poli(I: C). Metoda ta obejmuje ocenę BIR przed ciążą, co zwiększa odtwarzalność i daje szansę na mechaniczne zbadanie mechanizmów, które prowadzą do odporności i podatności potomstwa na MIA8. Po MIA, matki ze średniej gru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Myka Estes za jej wytrwałość w rozwiązywaniu problemów zmienności w mysim modelu MIA oraz wszystkim współtwórcom w Estes et al.8 za ich pracę, która doprowadziła do opracowania opisanego tutaj protokołu metod. Przedstawione tutaj badania były wspierane przez NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) i NIMH T32MH112507 (K.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% NaCl sól fizjologiczna wolna od endotoksynSigma-Aldrich7647-14-5Kontrola i pojazd do szalki Petriego Poly(I:C)
35mmThomas Scientific1219Z45Służy do zatrzymywania oleju podczas krwawienia z ogona
7,5% żele TGXBio-rad4561084Opcjonalnie
Ancare NestletsFisher ScientificNC9365966Opcjonalnie
anty-& beta;-tubulinaMilliporeMAB3408Opcjonalnie
Bio-Plex Pro Standardy cytokin myszy Grupa IBio-rad171I50001
Zestaw odczynników Bio-Plex Pro z płaską płytkąBio-rad171304070M
Albumina surowicy bydlęcejThermoFisher23209Opcjonalnie
WirówkaEppendorf5810ROpcjonalnie
Strzykawka insulinowa Covidien Monoject 1/2 ml o wymiarach 28 G x 1/2 cala. IgłaSpectrum552-58457-083
DithiothreitolSigma-AldrichD9779-10GOpcjonalnie
Wzbogacanie środowiskaBio-servK3327 i K3322Opcjonalnie
EthovisionNoldusEthovisionOpcjonalnie
Znaczniki fluorescencyjneLi-cor925-32213 i 925-68072Opcjonalnie
Olej jadalny spożywczy (np. oliwa z oliwek, rzepak lub olej z pestek winogron)Różni dostawcySłuży do smarowania ogona podczas krwawienia z ogona
HBSSThermoFisher14060040Opcjonalnie
Poliinozytonowy o wysokiej masie cząsteczkowej: kwas policytydylowyInvivogen#tlrl--5Służy do ustanawiania samic BIR
Humane Mouse RestraintAIMS1000Służy do krępowania myszy podczas ogona spady
Oprogramowanie Image StudioLicor5.2Opcjonalny
bufor LaemmliBio-rad1610737EDUOpcjonalnie
Luminex200ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μ l Rurka kapilarna surowicySarstedt16.440.100
Poliinozytowe o mieszanej masie cząsteczkowej: kwas policytydylowySigma-Aldrich#P0913Indukcja ciąży monoklonalnego
anty-MEF2AMIA AbCamab76063Opcjonalny
monoklonalny anty-STAT3Sygnalizacja komórkowa12640SOpcjonalny
obserwatorObserwatorNoldusOpcjonalny
bufor blokujący Odyssey (TBS)Li-cor927-50003Opcjonalny
system obrazowania Odyssey CLxLi-cor9140Opcjonalny
Omnipure PBSMillipore65054LOpcjonalny
zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher23227Opcjonalnie
anti_TH poliklonalnyPel-FreezP4101-150Opcjonalnie
Membrana PVDFBio-rad162-0177Opcjonalnie
Qsonica Sonicator Q500Fisher Scientific15-338-282Opcjonalnie
Szybki korek do krwiPetco17140
Seal-Rite 1,5 ml probówka mikrowirówkowa, naturalna niesterylnaUSA Scientific1615-5500
Podstawka lutowniczaAmazonB08Y12QC73Służy do przytrzymywania rurki kapilarnej podczas krwawienia ogona Nasiona
słonecznikaBio-servS5137-1Służy do zwiększania wydajności hodowli
Zestaw myszy Bio-Plex Pro IL-6,podstawa Bio-rad171G5007M
Tris FisherScientificBP152-1Opcjonalnie
Tween 20Bio-rad23209Opcjonalnie

Bibliografia

  1. Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
  2. Brown, A. S., et al. Serologic evidence of prenatal influenza in the etiology of schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 61 (8), 774-780 (2004).
  3. Brown, A. S., Derkits, E. J. Prenatal infection and schizophrenia: a review of epidemiologic and translational studies. The American Journal of Psychiatry. 167 (3), 261-280 (2010).
  4. Patterson, P. H. Immune involvement in schizophrenia and autism: etiology, pathology and animal models. Behavioural Brain Research. 204 (2), 313-321 (2009).
  5. Patterson, P. H. Maternal infection and immune involvement in autism. Trends in Molecular Medicine. 17 (7), 389-394 (2011).
  6. Estes, M. L., McAllister, A. K. Immune mediators in the brain and peripheral tissues in autism spectrum disorder. Nature Reviews. Neuroscience. 16 (8), 469-486 (2015).
  7. Estes, M. L., McAllister, A. K. Maternal immune activation: Implications for neuropsychiatric disorders. Science. 353 (6301), 772-777 (2016).
  8. Estes, M. L., et al. Baseline immunoreactivity before pregnancy and poly(I:C) dose combine to dictate susceptibility and resilience of offspring to maternal immune activation. Brain, Behavior and Immunity. 88, 619-630 (2020).
  9. Kentner, A. C., et al. Maternal immune activation: reporting guidelines to improve the rigor, reproducibility, and transparency of the model. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 245-258 (2019).
  10. Zhou, Y., et al. TLR3 activation efficiency by high or low molecular mass poly I:C. Innate Immunity. 19 (2), 184-192 (2013).
  11. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain, Behavior and Immunity. 25 (4), 604-615 (2011).
  12. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  13. Choi, G. B., et al. The maternal interleukin-17a pathway in mice promotes autism-like phenotypes in offspring. Science. 351 (6276), 933-939 (2016).
  14. Meyer, U. Neurodevelopmental resilience and susceptibility to maternal immune activation. Trends in Neurosciences. 42 (11), 793-806 (2019).
  15. Laroche, J., Gasbarro, L., Herman, J. P., Blaustein, J. D. Reduced behavioral response to gonadal hormones in mice shipped during the peripubertal/adolescent period. Endocrinology. 150 (5), 2351-2358 (2009).
  16. Aguila, H. N., Pakes, S. P., Lai, W. C., Lu, Y. S. The effect of transportation stress on splenic natural killer cell activity in C57BL/6J mice. Laboratory Animal Science. 38 (2), 148-151 (1988).
  17. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. American Journal of Veterinary Research. 43 (9), 1654-1657 (1982).
  18. Menees, K. B., et al. Sex- and age-dependent alterations of splenic immune cell profile and NK cell phenotypes and function in C57BL/6J mice. Immunity & Ageing. 18 (1), 3(2021).
  19. Shaw, A. C., Goldstein, D. R., Montgomery, R. R. Age-dependent dysregulation of innate immunity. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 875-887 (2013).
  20. Starr, M. E., Saito, M., Evers, B. M., Saito, H. Age-associated increase in Cytokine production during systemic inflammation-II: the role of IL-1beta in age-dependent IL-6 upregulation in adipose tissue. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 70 (12), 1508-1515 (2015).
  21. Bruce, M., et al. Acute peripheral immune activation alters cytokine expression and glial activation in the early postnatal rat brain. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 200(2019).
  22. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  23. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  24. Hutchinson, E., Avery, A., VandeWoude, S. Environmental enrichment for laboratory rodents. ILAR Journal. 46 (2), 148-161 (2005).
  25. Bayne, K. Environmental enrichment and mouse models: Current perspectives. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (2), 82-90 (2018).
  26. Toth, L. A., Kregel, K., Leon, L., Musch, T. I. Environmental enrichment of laboratory rodents: the answer depends on the question. Comparative Medicine. 61 (4), 314-321 (2011).
  27. Sparling, J. E., Barbeau, K., Boileau, K., Konkle, A. T. M. Environmental enrichment and its influence on rodent offspring and maternal behaviours, a scoping style review of indices of depression and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 197, 172997(2020).
  28. Xiao, R., Ali, S., Caligiuri, M. A., Cao, L. Enhancing effects of environmental enrichment on the functions of natural killer cells in mice. Frontiers in Immunology. 12, 695859(2021).
  29. Girbovan, C., Plamondon, H. Environmental enrichment in female rodents: considerations in the effects on behavior and biochemical markers. Behavioural Brain Research. 253, 178-190 (2013).
  30. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  31. Mueller, F. S., et al. neuroanatomical, and molecular correlates of resilience and susceptibility to maternal immune activation. Molecular Psychiatry. 26 (2), 396-410 (2021).
  32. Nyffeler, M., Meyer, U., Yee, B. K., Feldon, J., Knuesel, I. Maternal immune activation during pregnancy increases limbic GABAA receptor immunoreactivity in the adult offspring: implications for schizophrenia. Neuroscience. 143 (1), 51-62 (2006).
  33. Babri, S., Doosti, M. H., Salari, A. A. Strain-dependent effects of prenatal maternal immune activation on anxiety- and depression-like behaviors in offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 164-176 (2014).
  34. Vigli, D., et al. Maternal immune activation in mice only partially recapitulates the autism spectrum disorders symptomatology. Neuroscience. 445, 109-119 (2020).
  35. Malkova, N. V., Yu, C. Z., Hsiao, E. Y., Moore, M. J., Patterson, P. H. Maternal immune activation yields offspring displaying mouse versions of the three core symptoms of autism. Brain, Behavior, and Immunity. 26 (4), 607-616 (2012).
  36. Shin Yim, Y., et al. Reversing behavioural abnormalities in mice exposed to maternal inflammation. Nature. 549 (7673), 482-487 (2017).
  37. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 930-941 (2010).
  38. Zuckerman, L., Weiner, I. Maternal immune activation leads to behavioral and pharmacological changes in the adult offspring. Journal of Psychiatric Research. 39 (3), 311-323 (2005).
  39. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  40. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biological Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  41. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neuroscience. 14, 37(2013).
  42. Spencer, S. J., Meyer, U. Perinatal programming by inflammation. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 1-7 (2017).
  43. Mouihate, A., Kalakh, S. Maternal Interleukin-6 hampers hippocampal neurogenesis in adult rat offspring in a sex-dependent manner. Developmental Neuroscience. 43 (2), 106-115 (2021).
  44. Zhang, Z., van Praag, H. Maternal immune activation differentially impacts mature and adult-born hippocampal neurons in male mice. Brain, Behavior, and Immunity. 45, 60-70 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model Poly I Czaburzenia neurorozwojowemodel ci y u myszypodatno potomstwaodporno potomstwabazowa reaktywno immunologicznainiekcja doszprytnowiczowaostra odpowied zapalnarozw j m zgu
Generowanie powtarzalnego modelu aktywacji immunologicznej matki w połowie ciąży przy użyciu poli(I:C) w celu zbadania podatności i odporności u potomstwa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.