Artykuł metodologiczny

Generowanie powtarzalnego modelu aktywacji immunologicznej matki w połowie ciąży przy użyciu poli(I:C) w celu zbadania podatności i odporności u potomstwa

DOI:

10.3791/64095

⸱

17 sierpnia 2022

 , 
1Center for Neuroscience, UC Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie matki jest czynnikiem ryzyka zaburzeń neurorozwojowych. Mysie modele aktywacji immunologicznej matki (MIA) mogą wyjaśnić wpływ infekcji na rozwój i funkcjonowanie mózgu. W tym miejscu przedstawiono ogólne wytyczne i procedurę produkcji niezawodnie odpornego i podatnego potomstwa narażonego na MIA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywacja immunologiczna matki (MIA) podczas ciąży jest konsekwentnie związana ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych u potomstwa. Modele zwierzęce MIA są wykorzystywane do badania przyczynowości, badania mechanizmów oraz opracowywania diagnostyki i leczenia tych zaburzeń. Pomimo ich powszechnego stosowania, wiele modeli MIA cierpi na brak odtwarzalności i prawie wszystkie ignorują dwa ważne aspekty tego czynnika ryzyka: (i) wiele potomstwa jest odpornych na MIA oraz (ii) podatne potomstwo może wykazywać różne kombinacje fenotypów. Aby zwiększyć odtwarzalność i modelować zarówno podatność, jak i odporność na MIA, wyjściową immunoreaktywność (BIR) samic myszy przed ciążą wykorzystuje się do przewidywania, które ciąże zakończą się albo odpornym potomstwem, albo potomstwem ze zdefiniowanymi nieprawidłowościami behawioralnymi i molekularnymi po ekspozycji na MIA. W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę indukowania MIA poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie dwuniciowego RNA (dsRNA) wirusowego mimicznego poli(I:C) w 12,5 dniu ciąży. Metoda ta wywołuje ostrą reakcję zapalną w tamie, co powoduje zaburzenia w rozwoju mózgu u myszy, które mapują się na podobnie dotknięte domeny w ludzkich zaburzeniach psychicznych i neurorozwojowych (NDD).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dowody epidemiologiczne łączą zakażenie matki ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń psychicznych i NDD, w tym schizofrenii (SZ) i zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Mysi model MIA został opracowany w celu zbadania przyczynowości i mechanistycznej roli MIA w etiologii tych zaburzeń, a także w celu identyfikacji biomarkerów molekularnych i opracowania narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych4,6. Pomimo użyteczności tego modelu i jego rosnącej popularności, istnieje znaczna zmienność w protokołach indukcji MIA w tej dziedzinie, co utrudnia porównywanie wyników między badaniami i powielanie wyników8,9. Ponadto większość iteracji modelu nie bada dwóch ważnych aspektów translacyjnych MIA: (i) wiele potomstwa jest odpornych na MIA, oraz (ii) podatne potomstwo może wykazywać różne kombinacje fenotypów8.

Aby wygenerować powtarzalny model MIA, badacze powinni podać przynajmniej jedną ilościową miarę wielkości indukowanego MIA w matkach. Aby wywołać MIA w czasie ciąży, nasze laboratorium wykonuje dootrzewnowe (i.p.) iniekcje dwuniciowego wirusa RNA naśladującego poliinozyt: kwas policytydylowy [poli(I:C)]. Poli(I:C) indukuje kaskadę immunologiczną podobną do wirusów grypy, ponieważ jest rozpoznawany przez receptor toll-podobny 3 (TLR3)10. W rezultacie, poli(I:C) aktywuje odpowiedź ostrej fazy, która powoduje szybki wzrost cytokin prozapalnych8,11,12. Wcześniejsze badania wykazały, że zwiększenie poziomu cytokin prozapalnych, w tym interleukiny-6 (IL-6), jest konieczne do wytworzenia nieprawidłowości behawioralnych i neuropatologii u potomstwa w wyniku MIA11,12,13. Tak więc poziom IL-6 w surowicy matki pobrany podczas jego szczytu po 2,5 godzinie po wstrzyknięciu poli(I:C) jest przekonującą miarą ilościową MIA, którą można wykorzystać do porównania wyników w różnych laboratoriach w terenie.

W celu wygenerowania modelu MIA, który odnosi się do istotnych translacyjnie elementów odporności i podatności za pomocą jednego protokołu indukcji8,14, badacze mogą połączyć typowe podejścia do indukcji z charakterystyką wyjściowej immunoreaktywności matki (BIR) przed ciążą8. Niedawno odkryto, że dziewicze samice myszy C57BL/6 wykazują szeroki zakres odpowiedzi IL-6 na niską dawkę ekspozycji na poli(I:C) przed ciążą8. Jest to tylko podzbiór tych samic, które wydają na świat podatne potomstwo i tylko przy pewnej wielkości aktywacji immunologicznej, zgodnie z kombinacją dawki BIR i poli(I:C)8. MIA indukuje fenotypy w odwróconym wzorze U; Potomstwo wykazuje największe aberracje behawioralne i molekularne, gdy matki są umiarkowanie immunoreaktywne, a skala stanu zapalnego matki osiąga, ale nie przekracza, zakres krytyczny8. W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę, jak niezawodnie tworzyć zarówno odporne, jak i podatne potomstwo o rozbieżnych fenotypach behawioralnych w wyniku wstrzyknięcia poli(I:C) w połowie ciąży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły są wykonywane za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis (IACUC).

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Nabywając zwierzęta, utrzymuj stałe następujące parametry, aby zapewnić maksymalną odtwarzalność.
    1. Dostawca i lokalizacja dostawcy: jak wcześniej informowano, myszy C57BL/6J typu dzikiego wykazują różne reakcje na tę samą dawkę poli(I:C) w zależności od vendor8. Wybierz dostawcę i szczep myszy, które wykazują spójną odpowiedź. W przypadku eksperymentów tutaj, myszy C57BL/6 uzyskane z Charles River wykazywały spójne zmiany w zachowaniu po ekspozycji na MIA w połowie ciąży, podczas gdy te zakupione od Taconic wykazują większą odpowiedź wielkości, z pewnymi różnicami między grupami leczonymi w porównaniu z myszami Charles River8.
    2. Szczep: Myszy C57BL / 6J są najczęściej wykorzystywane, ale myszy BTBR i inne szczepy wykazują zróżnicowane odpowiedzi na MIA9. Należy zwrócić uwagę na te zróżnicowane reakcje, ponieważ zwiększają one odtwarzalność metody i mogą być potencjalną zmienną przyczyniającą się do zróżnicowanych wyników u potomstwa.
    3. Aby zapewnić minimalną zmienność, do badań MIA używaj tylko dziewiczych samic8 i wyraźnie zaznaczaj szczegóły w metodach.
    4. Wiek w momencie wysyłki i okres aklimatyzacji: myszy wysłane przed 7 tygodniem wykazują rozregulowany układ hormonalny15. Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się przez co najmniej 48 h16,17. Zamów myszy z wysyłką po 7 tygodniach (± 2 dniach) i wstrzyknij do BIR po 8 tygodniach (± 2 dniach).
    5. Wiek w momencie krycia: układ odpornościowy zwierząt jest dynamiczny w ciągu ich życia. Zadbaj o to, aby zminimalizować zmienność, utrzymując wiek podczas krycia/iniekcji tak spójny, jak to tylko możliwe18,19,20. Kojarzyć samice myszy w wieku 9 tygodni (± 2 dni). Do krycia nie należy używać samców w wieku powyżej 6 miesięcy.

2. Testowanie i przygotowanie partii poli(I:C)

  1. Przygotuj poli(I:C) o wysokiej masie cząsteczkowej, jak opisano poniżej.
    1. Autoklaw 1,5 ml probówek mikrowirówkowych do przechowywania. Ponownie zawieszony poli(I:C) może być przechowywany w temperaturze -20 °C, ale powtarzające się rozmrażanie przez zamrażanie może wpływać na moc. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 70 °C.
    2. Stosując sterylną technikę, dodaj 10 ml sterylnej soli fizjologicznej (NaCl 0,9%) do liofilizowanego poli(I:C) za pomocą strzykawki. Podgrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez 15 minut, aby umożliwić pełne wyżarzanie. Wyjmij i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    3. W sterylnym kapturze dodaj dodatkowe 40 ml soli fizjologicznej do butelki i kilkakrotnie odwróć do góry nogami w celu wymieszania. Zdjąć górną część butelki z poli(I:C) lub użyć strzykawki, aby podzielić porcję na probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować poli(I:C) o mieszanej masie cząsteczkowej, jak opisano poniżej.
    1. Autoklaw 1,5 ml probówek mikrowirówkowych do przechowywania. Ponownie zawieszony poli(I:C) może być przechowywany w temperaturze -20 °C, ale powtarzające się rozmrażanie przez zamrażanie może wpływać na moc. Ustawić łaźnię wodną na 50 °C.
    2. Stosując sterylną technikę, dodaj 10 ml sterylnego 0,9% NaCl do liofilizowanego poli(I:C) i zabezpiecz pokrywkę. Ogrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C przez 25 minut, aby umożliwić pełne wyżarzanie. Wyjmij i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    3. Stosując sterylną technikę, porcjować do 1,5 ml probówek mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Podawać poli(I:C) przez wstrzyknięcia dootrzewnowe (i.p.), jak opisano poniżej.
    1. Zważ mysz, aby określić dokładne dawkowanie. Za pomocą igły insulinowej o pojemności 0,5 ml narysuj ponownie zawieszony poli(I:C). Przesuń mysz i odwróć tak, aby brzuch był odsłonięty.
    2. Drugą ręką wbić igłę na głębokość około 0,5 cm między dwa przednie brodawki sutkowe pod kątem około 45°.
    3. Należy sporządzić w celu ustalenia, czy do strzykawki nie dostaje się krew ani mocz przed wstrzyknięciem. W przypadku wystąpienia któregokolwiek z tych objawów należy zmienić położenie igły i spróbować ponownie. Wstrzykiwać powoli. Jeśli poli(I:C) wydostanie się na zewnątrz, wstrzyknięcie było prawdopodobnie podskórne. Udane umieszczenie wstrzyknięcia spowoduje, że po wkłuciu igły nie zostanie pobrany żaden przeciek, a po jej usunięciu nie będzie wycieku.
  4. Przetestuj moc partii MMW poly(I:C) zgodnie z opisem poniżej8.
    1. Uzyskaj pożądaną formę poli(I:C). Niektórzy producenci pozwalają badaczom na zatrzymanie pełnej lub częściowej partii, podczas gdy moc jest testowana, aby można było później uzyskać wiele butelek jednocześnie. Zazwyczaj można je przechowywać w liofilii w temperaturze -20 °C przez kilka lat, jeśli unika się zamrażania i rozmrażania.
    2. Pozyskaj lub wyhoduj 30 ciężarnych matek do testów. Przy E12.5 należy wykonać iniekcje dożylne w dawkach 20, 30 i 40 mg/kg mc. co najmniej 10 myszom na dawkę.
    3. Po 2,5 godziny od wstrzyknięcia należy pobrać krew poprzez krwawienie z ogona. Należy pamiętać, że krew obwodowa i krew tułowiowa mogą różnić się poziomem cytokin, więc należy zachować spójność metody pobierania w ramach badania.
    4. Pozwól krwi krzepnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Po 12-24 godzinach odwirowywać próbki krwi w temperaturze 3 768 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Zebrać surowicę i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
    5. Wyizoluj surowicę i zmierz poziom IL-6 za pomocą testu ELISA lub Luminex. Utrzymuj spójność narzędzi pomiarowych, ponieważ istnieje znaczna zmienność całkowitego stężenia mierzonego przy użyciu różnych modalności i producentów. Określ wielkość odpowiedzi IL-6 potrzebnej do indukcji fenotypów przy użyciu kohorty pilotażowej.

3. Podstawowe badanie immunoreaktywności (BIR)

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje schemat kroków. Do badania BIR należy użyć poli(I:C) o innej masie cząsteczkowej w porównaniu z testem ciążowym, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych na związek.

  1. Zamów dziewicze samice myszy do wysyłki w wieku 7 tygodni. Po przybyciu na miejsce grupuj i trzymaj od czterech do pięciu myszy w klatce i trzymaj grupę w domu do momentu krycia. Użyj wycięcia na ucho lub innego systemu identyfikacji.
  2. Wstrzyknąć samice dootrzewnowo w dawce 5 mg/kg poli(I:C) 1 tydzień po przybyciu. Po 2,5 godziny od wstrzyknięcia, gdy krążąca IL-6 jest najwyższa6, należy pobrać pełną krew od wstrzykniętych zwierząt za pomocą obcinacza ogona.
  3. Pozwól krwi krzepnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Po 12-24 godzinach odwirowywać próbki krwi w temperaturze 3 768 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut.
  4. Z każdej próbki należy pobrać co najmniej 32 μl surowicy. Zamrażać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowy do badania na obecność cytokin. Aby jak najbardziej konsekwentnie mierzyć poziom IL-6, użyj testu multipleksowego, takiego jak Luminex. Utrzymuj spójność narzędzi pomiarowych, ponieważ istnieje znaczna zmienność całkowitego stężenia mierzonego przy użyciu różnych modalności i producentów.
    1. Aby zapoznać się z protokołem testu Luminex, zapoznaj się z Bruce et al.21.
  5. Korzystając ze względnych poziomów IL-6, podziel zwierzęta na niskie (dolny kwartyl), średnie (dwa środkowe kwartyle) i wysokie (najwyższy kwartyl) grupy BIR.

4. Metoda krwawienia z ogona do pobierania krwi

UWAGA: Aby uniknąć stosowania potencjalnie immunomodulujących środków uspokajających, użyj metody pobierania krwi z krwawienia z ogona.

  1. Aby ustawić, umieść stojak lutowniczy i kubek przytrzymujący na powierzchni z boku ręki niedominującej. Na szalce Petriego o średnicy 35 mm dodaj 1-2 ml spożywczego oleju jadalnego. Zdejmij nakrętkę z korka do szybkiej krwi i umieść ją w pobliżu zestawu.
  2. Umieść kilka warstw ręcznika papierowego na podstawce lutowniczej i pierwszej rurki kapilarnej w klipsie, umieszczając ją w pobliżu miejsca, w którym będzie trzymana końcówka ogonowa myszy i trzymana równolegle do powierzchni stołu. Miej pod ręką żyletkę.
  3. Aby pobrać krew, wykonaj następujące czynności.
    1. W wymaganym czasie wyjmij mysz z klatki i umieść ją pod kubkiem tak, aby jej ogon wychodził z wycięcia u podstawy. Za pomocą świeżej żyletki odetnij ostatni koniec (1-2 mm) ogona i zbierz pierwszą kroplę krwi w kapilarze przypiętej do podstawki lutowniczej.
    2. Zanurz palce dominującej ręki w jadalnym oleju i użyj do wyciśnięcia od podstawy ogona do czubka, prowadząc końcówkę ogona do rurki kapilarnej, aby zebrać powstałe krople krwi. Kontynuuj, aż zostanie pobrane ~200 μL krwi.
    3. Umieść małą zaślepkę na stożkowym końcu rurki kapilarnej przed górną nasadką. Jeśli górna nasadka zostanie założona jako pierwsza, próbka zostanie usunięta ze stożkowego końca probówki. Umieść rurkę w ochronnej powłoce zewnętrznej.
    4. Pozostawić na noc do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej. Schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C i odwirować krew, jak podano w kroku 3.3.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Harmonogram badania wyjściowej immunoreaktywności i krycia dziewiczych samic. Zamów myszy, aby osiągnęły wiek 7 tygodni i pozwól im zaaklimatyzować się w placówce przez 1 tydzień. Wstrzyknąć zwierzętom 5 mg/kg poli(I:C), a 2,5 godziny później pobrać krew. Pozostawić krew do skrzepnięcia przez noc, a następnie odwirować w temperaturze 3,768 x g, 4 °C przez 8 minut. Zbierz surowicę i oceń względny poziom IL-6 za pomocą testu ELISA lub Multiplex. W wieku 9 tygodni stwórz pary godowe. Utworzono przy użyciu BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Metoda krycia oparta na wadze i iniekcji ciążowej E12.5

UWAGA: Rysunek 2 pokazuje schemat kroków. Do ustawienia par godowych i wyznaczenia punktu czasowego E12.5 można użyć dwóch metod. Pierwsza, czasowe kojarzenie, jest opisana w innym miejscu22. Obliczenia oparte na wadze mogą być również wykorzystane do oceny ciąży E12.5 klasa 23. Zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ono na zablokowanie w czasie wieku matki w momencie krycia, zmniejszając zmienność odpowiedzi immunologicznej. Ta procedura jest stosowana w tym przypadku.

  1. Samce należy umieścić w czystych klatkach i pozwolić im zaaklimatyzować się przez co najmniej 2 godziny. Zmniejsza to prawdopodobieństwo agresji samic, ponieważ samce już tworzą dominujący zapach w klatce.
  2. Stwórz pojedyncze pary hodowlane samców i samic, dodając samicę do klatki samca. Przed umieszczeniem jej w klatce zważ ją i zapisz wagę. Dodaj małą garść nasion słonecznika do każdej klatki, aby zwiększyć wydajność krycia.
  3. Aby określić zakres przyrostu masy ciała, wykonaj następujące kroki.
    1. Zdobądź grupę testową samic i ustaw pary godowe, rejestrując wagę w momencie krycia.
    2. Kiedy samice zaczną wyglądać na widocznie w ciąży, zważ je i podziel na podgrupy 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g i 11,5 g przyrostu masy. Płody w wieku E12,5 właśnie zaczęły rozwijać wyraźne palce w łapach. Użyj morfologii płodu, aby określić średni przyrost masy ciała, aby osiągnąć E12.5.
  4. Po 12 dniach od krycia zważ samice i określ przyrost masy ciała. W placówce testowej samice konsekwentnie przybierają na wadze 9,5-10,5 g od momentu krycia do E12,5. Wstrzyknąć przez i.p. dawkę rozpuszczonego poli(I:C) oznaczoną w kroku 2.3.2, gdy przyrost masy ciała samicy mieści się w ustalonym z góry zakresie.
  5. Obserwuj reakcję na MIA w zaporach, używając następujących parametrów.
    1. Zachowanie chorobowe: Zbierz subiektywne wyniki w skali od 1 do 3 dotyczące tego, jak aktywne stają się matki w odpowiedzi na obchodzenie się z nimi, gdzie 1 oznacza niewielki ruch lub jego brak w odpowiedzi na dotykanie, a 3 jest normalną reakcją na schwytanie i ograniczenie. Zwierzęta z silniejszą odpowiedzią immunologiczną będą wykazywać mniejszą odporność na obchodzenie się z plikiem8.
    2. Reakcja gorączkowa: Za pomocą termometru na podczerwień zmierz temperaturę przed wstrzyknięciem i 2,5 godziny po wstrzyknięciu. Zwierzęta z większą reakcją immunologiczną często wykazują hipotermię w odpowiedzi na większą aktywność immunologiczną8.
    3. Zmiana masy ciała: Zważyć zwierzęta po 24 godzinach od wstrzyknięcia. Zwierzęta z większą reakcją immunologiczną na ogół tracą więcej na wadze8.
    4. Zmierz poziom IL-6 w ciąży w następujący sposób8.
      1. Po 2,5 godziny od wstrzyknięcia należy pobrać krew preferowaną metodą. Pozwól krwi krzepnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Po 12-24 godzinach odwirowywać próbki krwi w temperaturze 3 768 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut.
      2. Zebrać surowicę i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy. Wyizoluj surowicę i zmierz poziom IL-6 za pomocą testu ELISA lub Luminex. Utrzymuj spójność narzędzi pomiarowych, ponieważ istnieje znaczna zmienność całkowitego stężenia mierzonego przy użyciu różnych modalności i producentów.
      3. Po wstrzyknięciu należy umieścić zaporę pojedynczo z odpowiednim urozmaiceniem, takim jak gniazda i urządzenia do wzbogacania. Utrzymuj spójne wzbogacanie, ponieważ zmiany w wzbogacaniu mogą mieć znaczący wpływ na zachowanie gryzoni24,25,26,27,28,29.
  6. Czas ciąży myszy C57 waha się od 18,5-20,5 dnia. Należy przeprowadzić kontrole ściółki, aby ustalić, czy zwierzęta urodziły się w tym zakresie, aby upewnić się, że wstrzyknięcie zostało wykonane we właściwym momencie. Sprawdzając, czy nie ma ściółki, jak najmniej zakłócaj klatkę. Stres zaraz po urodzeniu miotu może zwiększać ryzyko kanibalizacji.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Indukcja MIA. Indukcja MIA wymaga oceny ciąży, wstrzyknięcia poli(I:C) i kontroli miotu, aby zapewnić prawidłowy czas zapalenia matki. Po ocenie dnia ciąży za pomocą krycia czasowego lub metody przyrostu masy ciała, należy podać zastrzyk i.p. poli(I:C) w E12,5. Pobrać próbkę krwi po 2,5 godziny po wstrzyknięciu, aby potwierdzić aktywację immunologiczną i określić poziom aktywacji IL-6. Mioty urodzą się w wieku około E18.5-E20.5. Utworzono przy użyciu BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Badanie zmian w zachowaniu u dorosłego MIA i kontrolnego potomstwa (opcjonalnie)

  1. Począwszy od P60 i przed przeprowadzeniem testów behawioralnych, przyzwyczajaj zwierzęta do kontaktu z człowiekiem z delikatnym obchodzeniem się przez 1 minutę dziennie przez 3 kolejne dni. Upewnij się, że dni zmiany klatki nie występują w tym samym dniu, w którym wykonywane są testy behawioralne.
  2. Zawsze pozwól myszom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez 30-60 minut przed rozpoczęciem testów behawioralnych. Używaj słabo oświetlonych (15-20 luksów) pomieszczeń, aby zminimalizować niepokój.
  3. W przypadku powtarzalnej pielęgnacji umieść myszy same w czystych, pozbawionych ściółki klatkach z pokrywkami. Za pomocą kamery nagrywaj myszy w tych klatkach przez 20 minut. Pierwsze 10 minut funkcjonuje jako okres aklimatyzacji, ostatnie 10 minut to okres testowy.
  4. Korzystając z zapisanych filmów i stopera, oceń łączny czas pielęgnacji dla każdej myszy w ciągu 10-minutowego okresu testowego. Inne zachowania, które można ocenić na podstawie tych filmów, to wstawanie (stanie na tylnych nogach), zastyganie w bezruchu i skakanie8.
  5. Użyj innych typowych testów dla modelu MIA, takich jak hamowanie przedimpulsowe (PPI) 14,30,31,32, open field12,33,34, 3-komorowe podejście społeczne13,35,36, powieść rozpoznawanie obiektów37, y-maze30, elevated plus maze33, oraz context/cued fear conditioning38.
  6. Postnatal immunoblotting8 (opcjonalnie)
    1. W P0 szybko zdekapitacować i wypreparować tkankę mózgową płodu w HBSS, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Rozdrabniać próbki za pomocą sonografu sondowego o amplitudzie 20% przez 5 s w 2x buforze Laemmli, a następnie denaturować w temperaturze 85 °C przez 5 minut. Odwirować lizat przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Zmierz całkowitą zawartość białka za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania białka BCA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, i użyj albuminy surowicy bydlęcej jako wzorca kalibracji.
    4. Dodać ditiotreitol jako środek redukujący do próbek w końcowym stężeniu 100 mM. Podgrzewać do 85 °C przez 2 minuty przed załadowaniem na żel.
    5. Uruchom 5 μg/linię białka w warunkach redukcyjnych na 7,5% żelach TGS i przenieś elektroforetycznie na membrany PVDF. Zablokuj błony buforem blokującym i inkubuj z wybranymi przeciwciałami.
    6. Przemyć trzykrotnie TBS + 0,05% Tween 20 i inkubować membrany przez 45 minut z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi.
    7. Umyj dodatkowe cztery razy w TBS/Tween 20 i uzyskaj wyniki obrazu. Standaryzacja wyników za pomocą β-tubuliny, wykrywanej za pomocą anty-β-tubuliny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie wszystkie zwierzęta narażone na 30 mg/kg poli(I:C) w E12.5 produkują potomstwo ze stałymi nieprawidłowościami behawioralnymi8,31. Chociaż zarówno 30 mg/kg, jak i 40 mg/kg poli(I:C) niezawodnie wywołują zachowania chorobowe u matek, w tym obniżony poziom aktywności, reakcje hipotermiczne i utratę wagi, a także powodują znaczne podwyższenie IL-6, tylko podgrupa miotów narażonych na MIA rozwinie nieprawidłowości behawioralne w domenach podobnych do tych obserwow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie matki zmienia przebieg rozwoju mózgu u ludzi, zarówno u gryzoni, jak i naczelnych 4,5,7. W tym miejscu przedstawiono procedurę indukowania MIA u myszy w połowie ciąży za pomocą poli(I: C). Metoda ta obejmuje ocenę BIR przed ciążą, co zwiększa odtwarzalność i daje szansę na mechaniczne zbadanie mechanizmów, które prowadzą do odporności i podatności potomstwa na MIA8. Po MIA, matki ze średniej gru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Myka Estes za jej wytrwałość w rozwiązywaniu problemów zmienności w mysim modelu MIA oraz wszystkim współtwórcom w Estes et al.8 za ich pracę, która doprowadziła do opracowania opisanego tutaj protokołu metod. Przedstawione tutaj badania były wspierane przez NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) i NIMH T32MH112507 (K.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% NaCl sól fizjologiczna wolna od endotoksynSigma-Aldrich7647-14-5Kontrola i pojazd do szalki Petriego Poly(I:C)
35mmThomas Scientific1219Z45Służy do zatrzymywania oleju podczas krwawienia z ogona
7,5% żele TGXBio-rad4561084Opcjonalnie
Ancare NestletsFisher ScientificNC9365966Opcjonalnie
anty-& beta;-tubulinaMilliporeMAB3408Opcjonalnie
Bio-Plex Pro Standardy cytokin myszy Grupa IBio-rad171I50001
Zestaw odczynników Bio-Plex Pro z płaską płytkąBio-rad171304070M
Albumina surowicy bydlęcejThermoFisher23209Opcjonalnie
WirówkaEppendorf5810ROpcjonalnie
Strzykawka insulinowa Covidien Monoject 1/2 ml o wymiarach 28 G x 1/2 cala. IgłaSpectrum552-58457-083
DithiothreitolSigma-AldrichD9779-10GOpcjonalnie
Wzbogacanie środowiskaBio-servK3327 i K3322Opcjonalnie
EthovisionNoldusEthovisionOpcjonalnie
Znaczniki fluorescencyjneLi-cor925-32213 i 925-68072Opcjonalnie
Olej jadalny spożywczy (np. oliwa z oliwek, rzepak lub olej z pestek winogron)Różni dostawcySłuży do smarowania ogona podczas krwawienia z ogona
HBSSThermoFisher14060040Opcjonalnie
Poliinozytonowy o wysokiej masie cząsteczkowej: kwas policytydylowyInvivogen#tlrl--5Służy do ustanawiania samic BIR
Humane Mouse RestraintAIMS1000Służy do krępowania myszy podczas ogona spady
Oprogramowanie Image StudioLicor5.2Opcjonalny
bufor LaemmliBio-rad1610737EDUOpcjonalnie
Luminex200ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μ l Rurka kapilarna surowicySarstedt16.440.100
Poliinozytowe o mieszanej masie cząsteczkowej: kwas policytydylowySigma-Aldrich#P0913Indukcja ciąży monoklonalnego
anty-MEF2AMIA AbCamab76063Opcjonalny
monoklonalny anty-STAT3Sygnalizacja komórkowa12640SOpcjonalny
obserwatorObserwatorNoldusOpcjonalny
bufor blokujący Odyssey (TBS)Li-cor927-50003Opcjonalny
system obrazowania Odyssey CLxLi-cor9140Opcjonalny
Omnipure PBSMillipore65054LOpcjonalny
zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher23227Opcjonalnie
anti_TH poliklonalnyPel-FreezP4101-150Opcjonalnie
Membrana PVDFBio-rad162-0177Opcjonalnie
Qsonica Sonicator Q500Fisher Scientific15-338-282Opcjonalnie
Szybki korek do krwiPetco17140
Seal-Rite 1,5 ml probówka mikrowirówkowa, naturalna niesterylnaUSA Scientific1615-5500
Podstawka lutowniczaAmazonB08Y12QC73Służy do przytrzymywania rurki kapilarnej podczas krwawienia ogona Nasiona
słonecznikaBio-servS5137-1Służy do zwiększania wydajności hodowli
Zestaw myszy Bio-Plex Pro IL-6,podstawa Bio-rad171G5007M
Tris FisherScientificBP152-1Opcjonalnie
Tween 20Bio-rad23209Opcjonalnie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
  2. Brown, A. S., et al. Serologic evidence of prenatal influenza in the etiology of schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 61 (8), 774-780 (2004).
  3. Brown, A. S., Derkits, E. J. Prenatal infection and schizophrenia: a review of epidemiologic and translational studies. The American Journal of Psychiatry. 167 (3), 261-280 (2010).
  4. Patterson, P. H. Immune involvement in schizophrenia and autism: etiology, pathology and animal models. Behavioural Brain Research. 204 (2), 313-321 (2009).
  5. Patterson, P. H. Maternal infection and immune involvement in autism. Trends in Molecular Medicine. 17 (7), 389-394 (2011).
  6. Estes, M. L., McAllister, A. K. Immune mediators in the brain and peripheral tissues in autism spectrum disorder. Nature Reviews. Neuroscience. 16 (8), 469-486 (2015).
  7. Estes, M. L., McAllister, A. K. Maternal immune activation: Implications for neuropsychiatric disorders. Science. 353 (6301), 772-777 (2016).
  8. Estes, M. L., et al. Baseline immunoreactivity before pregnancy and poly(I:C) dose combine to dictate susceptibility and resilience of offspring to maternal immune activation. Brain, Behavior and Immunity. 88, 619-630 (2020).
  9. Kentner, A. C., et al. Maternal immune activation: reporting guidelines to improve the rigor, reproducibility, and transparency of the model. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 245-258 (2019).
  10. Zhou, Y., et al. TLR3 activation efficiency by high or low molecular mass poly I:C. Innate Immunity. 19 (2), 184-192 (2013).
  11. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain, Behavior and Immunity. 25 (4), 604-615 (2011).
  12. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  13. Choi, G. B., et al. The maternal interleukin-17a pathway in mice promotes autism-like phenotypes in offspring. Science. 351 (6276), 933-939 (2016).
  14. Meyer, U. Neurodevelopmental resilience and susceptibility to maternal immune activation. Trends in Neurosciences. 42 (11), 793-806 (2019).
  15. Laroche, J., Gasbarro, L., Herman, J. P., Blaustein, J. D. Reduced behavioral response to gonadal hormones in mice shipped during the peripubertal/adolescent period. Endocrinology. 150 (5), 2351-2358 (2009).
  16. Aguila, H. N., Pakes, S. P., Lai, W. C., Lu, Y. S. The effect of transportation stress on splenic natural killer cell activity in C57BL/6J mice. Laboratory Animal Science. 38 (2), 148-151 (1988).
  17. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. American Journal of Veterinary Research. 43 (9), 1654-1657 (1982).
  18. Menees, K. B., et al. Sex- and age-dependent alterations of splenic immune cell profile and NK cell phenotypes and function in C57BL/6J mice. Immunity & Ageing. 18 (1), 3(2021).
  19. Shaw, A. C., Goldstein, D. R., Montgomery, R. R. Age-dependent dysregulation of innate immunity. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 875-887 (2013).
  20. Starr, M. E., Saito, M., Evers, B. M., Saito, H. Age-associated increase in Cytokine production during systemic inflammation-II: the role of IL-1beta in age-dependent IL-6 upregulation in adipose tissue. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 70 (12), 1508-1515 (2015).
  21. Bruce, M., et al. Acute peripheral immune activation alters cytokine expression and glial activation in the early postnatal rat brain. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 200(2019).
  22. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  23. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  24. Hutchinson, E., Avery, A., VandeWoude, S. Environmental enrichment for laboratory rodents. ILAR Journal. 46 (2), 148-161 (2005).
  25. Bayne, K. Environmental enrichment and mouse models: Current perspectives. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (2), 82-90 (2018).
  26. Toth, L. A., Kregel, K., Leon, L., Musch, T. I. Environmental enrichment of laboratory rodents: the answer depends on the question. Comparative Medicine. 61 (4), 314-321 (2011).
  27. Sparling, J. E., Barbeau, K., Boileau, K., Konkle, A. T. M. Environmental enrichment and its influence on rodent offspring and maternal behaviours, a scoping style review of indices of depression and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 197, 172997(2020).
  28. Xiao, R., Ali, S., Caligiuri, M. A., Cao, L. Enhancing effects of environmental enrichment on the functions of natural killer cells in mice. Frontiers in Immunology. 12, 695859(2021).
  29. Girbovan, C., Plamondon, H. Environmental enrichment in female rodents: considerations in the effects on behavior and biochemical markers. Behavioural Brain Research. 253, 178-190 (2013).
  30. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  31. Mueller, F. S., et al. neuroanatomical, and molecular correlates of resilience and susceptibility to maternal immune activation. Molecular Psychiatry. 26 (2), 396-410 (2021).
  32. Nyffeler, M., Meyer, U., Yee, B. K., Feldon, J., Knuesel, I. Maternal immune activation during pregnancy increases limbic GABAA receptor immunoreactivity in the adult offspring: implications for schizophrenia. Neuroscience. 143 (1), 51-62 (2006).
  33. Babri, S., Doosti, M. H., Salari, A. A. Strain-dependent effects of prenatal maternal immune activation on anxiety- and depression-like behaviors in offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 164-176 (2014).
  34. Vigli, D., et al. Maternal immune activation in mice only partially recapitulates the autism spectrum disorders symptomatology. Neuroscience. 445, 109-119 (2020).
  35. Malkova, N. V., Yu, C. Z., Hsiao, E. Y., Moore, M. J., Patterson, P. H. Maternal immune activation yields offspring displaying mouse versions of the three core symptoms of autism. Brain, Behavior, and Immunity. 26 (4), 607-616 (2012).
  36. Shin Yim, Y., et al. Reversing behavioural abnormalities in mice exposed to maternal inflammation. Nature. 549 (7673), 482-487 (2017).
  37. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 930-941 (2010).
  38. Zuckerman, L., Weiner, I. Maternal immune activation leads to behavioral and pharmacological changes in the adult offspring. Journal of Psychiatric Research. 39 (3), 311-323 (2005).
  39. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  40. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biological Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  41. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neuroscience. 14, 37(2013).
  42. Spencer, S. J., Meyer, U. Perinatal programming by inflammation. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 1-7 (2017).
  43. Mouihate, A., Kalakh, S. Maternal Interleukin-6 hampers hippocampal neurogenesis in adult rat offspring in a sex-dependent manner. Developmental Neuroscience. 43 (2), 106-115 (2021).
  44. Zhang, Z., van Praag, H. Maternal immune activation differentially impacts mature and adult-born hippocampal neurons in male mice. Brain, Behavior, and Immunity. 45, 60-70 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model Poly I Czaburzenia neurorozwojowemodel ci y u myszypodatno potomstwaodporno potomstwabazowa reaktywno immunologicznainiekcja doszprytnowiczowaostra odpowied zapalnarozw j m zgu

Powiązane artykuły