Zakażenie matki jest czynnikiem ryzyka zaburzeń neurorozwojowych. Mysie modele aktywacji immunologicznej matki (MIA) mogą wyjaśnić wpływ infekcji na rozwój i funkcjonowanie mózgu. W tym miejscu przedstawiono ogólne wytyczne i procedurę produkcji niezawodnie odpornego i podatnego potomstwa narażonego na MIA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie powtarzalnego modelu aktywacji immunologicznej matki w połowie ciąży przy użyciu poli(I:C) w celu zbadania podatności i odporności u potomstwa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aktywacja immunologiczna matki (MIA) podczas ciąży jest konsekwentnie związana ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych u potomstwa. Modele zwierzęce MIA są wykorzystywane do badania przyczynowości, badania mechanizmów oraz opracowywania diagnostyki i leczenia tych zaburzeń. Pomimo ich powszechnego stosowania, wiele modeli MIA cierpi na brak odtwarzalności i prawie wszystkie ignorują dwa ważne aspekty tego czynnika ryzyka: (i) wiele potomstwa jest odpornych na MIA oraz (ii) podatne potomstwo może wykazywać różne kombinacje fenotypów. Aby zwiększyć odtwarzalność i modelować zarówno podatność, jak i odporność na MIA, wyjściową immunoreaktywność (BIR) samic myszy przed ciążą wykorzystuje się do przewidywania, które ciąże zakończą się albo odpornym potomstwem, albo potomstwem ze zdefiniowanymi nieprawidłowościami behawioralnymi i molekularnymi po ekspozycji na MIA. W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę indukowania MIA poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie dwuniciowego RNA (dsRNA) wirusowego mimicznego poli(I:C) w 12,5 dniu ciąży. Metoda ta wywołuje ostrą reakcję zapalną w tamie, co powoduje zaburzenia w rozwoju mózgu u myszy, które mapują się na podobnie dotknięte domeny w ludzkich zaburzeniach psychicznych i neurorozwojowych (NDD).
Wprowadzenie
Dowody epidemiologiczne łączą zakażenie matki ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń psychicznych i NDD, w tym schizofrenii (SZ) i zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Mysi model MIA został opracowany w celu zbadania przyczynowości i mechanistycznej roli MIA w etiologii tych zaburzeń, a także w celu identyfikacji biomarkerów molekularnych i opracowania narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych4,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis.
1. Przygotowanie zwierząt
- Podczas pozyskiwania zwierząt należy zachować spójność następujących parametrów, aby zapewnić maksymalną powtarzalność.
- Dostawca i lokalizacja dostawcy: jak raportowano wcześniej, myszy typu dzikiego C57BL/6J wykazują różne reakcje na tę samą dawkę poly(I:C) w zależności od dostawcy8. Należy wybrać dostawcę i szczep myszy wykazujące spójną odpowiedź. W przypadku tutejszych eksperymentów myszy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nie wszystkie zwierzęta poddane działaniu 30 mg/kg poly(I:C) w dniu E12.5 dają potomstwo z jednolitymi zaburzeniami behawioralnymi8,31. Choć dawki 30 mg/kg i 40 mg/kg poly(I:C) niezawodnie wywołują u matek zachowania chorobowe, w tym obniżony poziom aktywności, reakcje hipotermiczne i utratę masy ciała, a także powodują znaczny wzrost poziomu IL-6, tylko część miotów poddanych MIA wykaże w przyszłości zaburzenia behawioralne w obszarach podobnych do tych obserwow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zakażenie matki zmienia przebieg rozwoju mózgu u ludzi, zarówno u gryzoni, jak i naczelnych 4,5,7. W tym miejscu przedstawiono procedurę indukowania MIA u myszy w połowie ciąży za pomocą poli(I: C). Metoda ta obejmuje ocenę BIR przed ciążą, co zwiększa odtwarzalność i daje szansę na mechaniczne zbadanie mechanizmów, które prowadzą do odporności i podatności potomstwa na MIA8. Po MIA, matki ze średniej gru.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Myka Estes za jej wytrwałość w rozwiązywaniu problemów zmienności w mysim modelu MIA oraz wszystkim współtwórcom w Estes et al.8 za ich pracę, która doprowadziła do opracowania opisanego tutaj protokołu metod. Przedstawione tutaj badania były wspierane przez NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) i NIMH T32MH112507 (K.P.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% NaCl sól fizjologiczna wolna od endotoksyn | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Kontrola i pojazd do szalki Petriego Poly(I:C) |
| 35mm | Thomas Scientific | 1219Z45 | Służy do zatrzymywania oleju podczas krwawienia z ogona |
| 7,5% żele TGX | Bio-rad | 4561084 | Opcjonalnie |
| Ancare Nestlets | Fisher Scientific | NC9365966 | Opcjonalnie |
| anty-& beta;-tubulina | Millipore | MAB3408 | Opcjonalnie |
| Bio-Plex Pro Standardy cytokin myszy Grupa I | Bio-rad | 171I50001 | |
| Zestaw odczynników Bio-Plex Pro z płaską płytką | Bio-rad | 171304070M | |
| Albumina surowicy bydlęcej | ThermoFisher | 23209 | Opcjonalnie |
| Wirówka | Eppendorf | 5810R | Opcjonalnie |
| Strzykawka insulinowa Covidien Monoject 1/2 ml o wymiarach 28 G x 1/2 cala. Igła | Spectrum | 552-58457-083 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779-10G | Opcjonalnie |
| Wzbogacanie środowiska | Bio-serv | K3327 i K3322 | Opcjonalnie |
| Ethovision | Noldus | Ethovision | Opcjonalnie |
| Znaczniki fluorescencyjne | Li-cor | 925-32213 i 925-68072 | Opcjonalnie |
| Olej jadalny spożywczy (np. oliwa z oliwek, rzepak lub olej z pestek winogron) | Różni dostawcy | Służy do smarowania ogona podczas krwawienia z ogona | |
| HBSS | ThermoFisher | 14060040 | Opcjonalnie |
| Poliinozytonowy o wysokiej masie cząsteczkowej: kwas policytydylowy | Invivogen | #tlrl--5 | Służy do ustanawiania samic BIR |
| Humane Mouse Restraint | AIMS | 1000 | Służy do krępowania myszy podczas ogona spady |
| Oprogramowanie Image Studio | Licor | 5.2 | Opcjonalny |
| bufor Laemmli | Bio-rad | 1610737EDU | Opcjonalnie |
| Luminex200 | ThermoFisher APX10031 | ||
| Microvette CB300 300μ l Rurka kapilarna surowicy | Sarstedt | 16.440.100 | |
| Poliinozytowe o mieszanej masie cząsteczkowej: kwas policytydylowy | Sigma-Aldrich | #P0913 | Indukcja ciąży monoklonalnego |
| anty-MEF2A | MIA AbCam | ab76063 | Opcjonalny |
| monoklonalny anty-STAT3 | Sygnalizacja komórkowa | 12640S | Opcjonalny |
| obserwator | Obserwator | NoldusOpcjonalny | |
| bufor blokujący Odyssey (TBS) | Li-cor | 927-50003 | Opcjonalny |
| system obrazowania Odyssey CLx | Li-cor | 9140 | Opcjonalny |
| Omnipure PBS | Millipore | 65054L | Opcjonalny |
| zestaw do oznaczania białek Pierce BCA | ThermoFisher | 23227 | Opcjonalnie |
| anti_TH poliklonalny | Pel-Freez | P4101-150 | Opcjonalnie |
| Membrana PVDF | Bio-rad | 162-0177 | Opcjonalnie |
| Qsonica Sonicator Q500 | Fisher Scientific | 15-338-282 | Opcjonalnie |
| Szybki korek do krwi | Petco | 17140 | |
| Seal-Rite 1,5 ml probówka mikrowirówkowa, naturalna niesterylna | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Podstawka lutownicza | Amazon | B08Y12QC73 | Służy do przytrzymywania rurki kapilarnej podczas krwawienia ogona Nasiona |
| słonecznika | Bio-serv | S5137-1 | Służy do zwiększania wydajności hodowli |
| Zestaw myszy Bio-Plex Pro IL-6, | podstawa Bio-rad | 171G5007M | |
| Tris Fisher | Scientific | BP152-1 | Opcjonalnie |
| Tween 20 | Bio-rad | 23209 | Opcjonalnie |
Bibliografia
- Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
- Brown, A. S., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
