Różne modele zwierzęce zwłóknienia płuc zostały stworzone przy użyciu bleomycyny, aby wyjaśnić patogenezę zwłóknienia płuc i znaleźć nowe cele leków. Jednak większość modeli zwłóknienia płuc ukierunkowanych na tkankę płucną ma nierównomierne podawanie leków. W tym miejscu proponujemy model jednolitego zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny nosowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny w nosie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwłóknienie płuc jest charakterystyczne dla wielu chorób płuc u ludzi, które powstają z różnych przyczyn. Biorąc pod uwagę, że możliwości leczenia są dość ograniczone, modele mysie nadal są ważnym narzędziem do opracowywania nowych strategii przeciwzwłóknieniowych. W tym badaniu dopłucne podawanie bleomycyny (BLM) odbywa się za pomocą nebulizacji nosa w celu stworzenia mysiego modelu zwłóknienia płuc, który ściśle naśladuje kliniczne cechy choroby. Myszy C57BL / 6 otrzymywały BLM (7 U / ml, 30 min / dzień) przez nebulizację nosa przez 3 kolejne dni i zostały uśmiercone w 9, 16 lub 23 dniu w celu zaobserwowania zmian zapalnych i zwłóknieniowych w tkance płucnej. BLM w aerozolu nosowym był bezpośrednio skierowany do płuc, powodując rozległe i jednolite zapalenie płuc i zwłóknienie. W ten sposób udało nam się wygenerować eksperymentalny mysi model typowego ludzkiego zwłóknienia płuc. Metoda ta może być z łatwością wykorzystana do zbadania wpływu podawania różnych aerozoli donosowych na patofizjologię płuc i walidacji nowych metod leczenia przeciwzapalnego i przeciwzwłóknieniowego.
Wprowadzenie
Zwłóknienie płuc jest postępującym procesem chorobowym, w którym nadmierne odkładanie się składników macierzy zewnątrzkomórkowej, głównie kolagenu typu I, w śródmiąższu płuc prowadzi do upośledzenia funkcji płuc1. Patofizjologia zwłóknienia płuc jest złożona, a możliwości leczenia są obecnie dość ograniczone. Modele mysie pozostają ważnym narzędziem do badania mechanizmów patogennych, które przyczyniają się do powstawania i postępu choroby, a także nowych strategii opracowywania leków.
Różnorodne modele zwierzęce zwłóknienia płuc polegają na wkropleniu dotchawiczym BLM2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Jednak rozkład zmian zwłóknieniowych, które BLM powoduje w płucach, nie jest jednolity, a zwierzęta są narażone na uduszenie podczas procesu wkraplania. Chociaż dootrzewnowe wstrzyknięcie BLM wywołuje stosunkowo jednolite zmiany zwłóknieniowe w płucach, wymaga wielokrotnych dawek z powodu niewystarczającego ukierunkowania na lek. Podanie aerozolu dotchawiczego za pomocą laryngoskopu nie wymaga tracheotomii ani nakłucia, a wynikająca z tego dystrybucja leku w płucach jest optymalna. Jednak cząstki w aerozolu są duże (5-40 μm), a zatem nie mogą dotrzeć do obszaru podopłucnowego tkanki płucnej.
W tym badaniu, dopłucne podawanie BLM odbywa się metodą nebulizacji nosa. Podczas nebulizacji myszy oddychały spontanicznie i wdychały cząsteczki leku. Cząstki aerozolu miały wielkość 2,5-4 μm, co umożliwiło im nie tylko równomierne rozprowadzenie się w płucach, ale także dotarcie do obszaru podopłucnowego. W małym powiększeniu najważniejszymi cechami histopatologicznymi płuc u pacjentów z idiopatycznym włóknieniem płuc (IPF) są różny stopień nasilenia zmian, niespójne rozmieszczenie, naprzemienne rozmieszczenie zmian w różnych fazach oraz obecność śródmiąższowego zapalenia, zmian zwłóknieniowych i zmian w płucach o strukturze plastra miodu, na przemian z normalną tkanką płucną. Te patologiczne zmiany obejmują głównie obwodowy miąższ podopłucnowy lub przegrodę zrazikową wokół oskrzelików. Tak więc, biorąc pod uwagę, że takie podejście umożliwia cząsteczkom BLM dotarcie do obszaru podopłucnowego płuc, model ten ściśle symuluje kliniczne cechy choroby u ludzi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komitet Badań nad Zwierzętami Szpitala Przyjaźni Chińsko-Japońskiej (Pekin, Chiny) zatwierdził wszystkie procedury z udziałem myszy, które zostały przeprowadzone w ramach tego badania (NO.190108). Myszy trzymano w sterylnym pomieszczeniu dla zwierząt w Instytucie Klinicznych Badań Medycznych Przyjaźni Chińsko-Japońskiej, w temperaturze pokojowej 20-25 °C, wilgotności względnej 40%-70%, natężeniu światła zwierzęcego 15-20 LX i naprzemiennym świetle i ciemności przez 12 godzin/12 godzin. Zwierzęta miały swobodny dostęp do pożywienia i wody.
1. Myszy
- Upewnij się, że wszystkie zwierzęta są zaaklimatyzowane w pomieszczeniu przez 7 dni przed nebulizacją.
- Do nebulizacji należy używać samców myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni.
2. Nebulizacja bleomycyny nosowej
- Preparat bleomycyny
UWAGA: BLM jest trucizną chemiczną, która zabija nowotwory, ale może również uszkadzać normalne komórki i normalne tkanki.- Przygotuj roztwór BLM na czystym stole.
- Aby uzyskać stężenie robocze (7 U/ml), ponownie zawiesić 15 U chlorowodorku BLM w 2,14 ml soli fizjologicznej. Ostrożnie wymieszać ponownie zawieszony BLM aż do całkowitego rozpuszczenia.
- Roztwór roboczy przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie i zużyć w ciągu 1 dnia. Przed nebulizacją doprowadzić roztwór BLM do temperatury pokojowej.
- Przygotuj roztwór BLM na czystym stole.
- znieczulenie
- Przygotuj się do znieczulenia, rozpuszczając 0,1 g pentobarbitalu sodu w 10 ml soli fizjologicznej. Działający roztwór znieczulający przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
- Znieczulić myszy, wstrzykując pentobarbital sodu do jamy brzusznej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G, w końcowej dawce 75 mg/kg masy ciała.
UWAGA: W tym badaniu myszy nie reagowały na tę dawkę przez co najmniej 30 minut. W razie potrzeby dostosuj dawkę w porozumieniu z weterynarzem zgodnie z reakcją myszy. - Po kilku minutach naciśnij palce u nóg znieczulonej myszy palcem wskazującym i kciukiem, aby upewnić się, że odruch wycofania kończyn zniknął.
- Przygotowanie systemu nebulizacji
- Po kalibracji przyrządu zabezpiecz znieczuloną mysz miękką siatkową osłoną ( Rysunek 1A), dodaj działający roztwór BLM do górnej głowicy rozpylającej wieży naświetlającej za pomocą pipety ( Rysunek 1B) i uruchom nebulizator na 30 minut, aby uzyskać stabilną atomizację.
UWAGA: Przepływ pracy jest pokazany w Rysunek 1C,D. Aby uzyskać szczegółowe instrukcje obsługi oprogramowania, patrz rysunek uzupełniający S1 i rysunek uzupełniający S2, które ilustrują kroki 2.3.1.1-2.3.1.9.- Kliknij dwukrotnie ikonę flexiWare 8 (Rysunek uzupełniający S1A), kliknij sesję eksperymentalną (Rysunek uzupełniający S1B) i kliknij przycisk Nowe badanie (Rysunek uzupełniający S1C).
- Edytuj nazwę eksperymentu (rysunek uzupełniający S1D) oraz edytuj tytuł i właściciela (rysunek uzupełniający S1E).
- Wybierz szablon IX-4DIO (rysunek uzupełniający S1F), wprowadź operatora (rysunek uzupełniający S1G), kliknij przycisk Potwierdź (rysunek uzupełniający S1H) | Następny przycisk (Rysunek uzupełniający S1I).
- Wybierz pompę i kliknij dalej (Rysunek uzupełniający S1J) | Następny przycisk (Rysunek uzupełniający S2A) | Następny przycisk (Rysunek uzupełniający S2B) | Przycisk Zakończ (rysunek uzupełniający S2C).
- Kliknij Ustawienia dla Continuous-1Lmin (trzy kropki, rysunek uzupełniający S2D) | DIO1, ustaw Cykl pracy (%) na 25%, a następnie kliknij OK (Rysunek uzupełniający S2E).
- Kliknij DIO2, ustaw Cykl pracy (%) na 25%, a następnie kliknij OK (Rysunek uzupełniający S2F).
- Kliknij DIO3, ustaw Cykl pracy (%) na 25%, a następnie kliknij OK (Rysunek uzupełniający S2G).
- Kliknij DIO4, ustaw Norma Duty Cycle (%) na 25%, a następnie kliknij OK (Rysunek uzupełniający S2H).
- Kliknij górny zielony przycisk (po lewej), aby rozpocząć działanie, a następnie kliknij czerwony przycisk (po prawej), aby zatrzymać pracę. Kliknij x w prawym górnym rogu, aby wyjść (Rysunek uzupełniający S2I).
- W grupie BLM rozpylaj 12 myszy na raz, w sumie cztery razy, aż do łącznej liczby 48 myszy. Atomizuj sześć myszy na raz w normalnej grupie kontrolnej normalną solą fizjologiczną.
- Po kalibracji przyrządu zabezpiecz znieczuloną mysz miękką siatkową osłoną ( Rysunek 1A), dodaj działający roztwór BLM do górnej głowicy rozpylającej wieży naświetlającej za pomocą pipety ( Rysunek 1B) i uruchom nebulizator na 30 minut, aby uzyskać stabilną atomizację.
- Odzyskiwanie zwierząt
- Po leczeniu w nebulizatorze przez 30 minut przenieś mysz do klatki regeneracyjnej wyposażonej w poduszkę grzewczą.
- Obserwuj myszy, aż będą w pełni świadome.
- Po potwierdzeniu, że mysz jest w dobrym stanie, co oznacza, że może się swobodnie poruszać, przywróć ją do pierwotnej klatki. Nie umieszczaj go z innymi zwierzętami, dopóki całkowicie nie wyzdrowieje.
- Sprawdź wskaźniki fizjologiczne, w tym częstość oddechów, przeżycie i wszelkie objawy, dwa razy w ciągu 24 godzin po leczeniu BLM.
3. Przetwarzanie tkanki płucnej
- Po 9, 16 i 23 dniach od podania BLM należy poświębić sześć myszy, wstrzykując im w brzuch pentobarbital sodu (ostateczna dawka 100 mg/kg masy ciała).
- Usunąć tchawicę i płuca i natychmiast spłukać zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami.
- Umieść lewe płuco w 10% neutralnym buforze formalinowym na 24 godziny przed zatopieniem parafiny.
- Barwienie hematoksyliną-eozyną (barwienie H&E)
- Odwodnić utrwaloną tkankę płucną w odwadniaczu.
- Umieścić odwodniony blok tkanki płucnej w pojemniku do rozpuszczania wosku w temperaturze 56 °C na 1 godzinę.
- Do zatapiania wlej stopioną parafinę do pudełka na formę, a następnie szybko umieść nasycony parafiną blok tkanki na dnie pudełka na formę, ostudź i zestal.
- Zamocuj osadzony blok wosku na mikrotomie, ustaw stół do krojenia w górę iw dół do odpowiedniej pozycji, popchnij ostrze, wyreguluj skalę i wytnij plasterek o grubości 4 μm. Użyj pęsety, aby umieścić plasterek w pudełku wystawowym wypełnionym wodą, aby się rozwinął (przednią stroną do góry).
- Plastry połatać i upiec. Po całkowitym rozwinięciu plastra wosku przyłóż szkiełko do plastra wosku pod kątem 135°, za pomocą pęsety przesuń plasterek wosku na szkiełko podstawowe, podnieś szkiełko i wyreguluj położenie plasterka wosku w razie potrzeby. Umieścić szkiełka z osadzonymi plastrami wosku na stole o stałej temperaturze w temperaturze 47 °C na 1 minutę, aby ponownie umożliwić rozwinięcie się plastrów; Gdy plastry są całkowicie płaskie, umieść szkiełka w inkubatorze w temperaturze 62 °C na 1 godzinę.
- W celu odparafinowania umieść upieczone szkiełka w ksylenie na 20 minut dwa razy.
- W celu nawodnienia umieść szkiełka w serii stopniowanych alkoholi, aby nawodnić plastry tkanki płucnej: 100% alkoholu przez 2 min, 95% alkoholu przez 1 min, 90% alkoholu przez 1 min, 85% alkoholu przez 1 min, 75% alkoholu przez 1 min i woda destylowana przez 3 min.
- Wybarwić skrawki w hematoksylinie przez 5 minut. Myć przez 1 min dwa razy, następnie umieścić w 0,5% roztworze alkoholu do różnicowania kwasu solnego na 5 s, dwukrotnie przemyć wodą przez 1 min, umieścić w roztworze barwiącym na niebiesko na 8-10 s, spłukać dwukrotnie wodą z kranu i zabarwić eozyną na 30 s.
- W celu odwodnienia i odbarwienia należy umieścić zabarwione fragmenty w 75% alkoholu na 1 min, 85% alkoholu na 1 minutę, 90% alkoholu na 1 minutę, 95% alkoholu na 1 minutę, 100% alkoholu na 1 minutę, a następnie ksylenu na 1 minutę dwa razy, a pozostałą ciecz usunąć papierem absorpcyjnym.
- Do montażu nałóż kroplę neutralnego roztworu uszczelniającego gumę na środek plastra i zamontuj szkiełko nakrywkowe.
- Wzorzec oceny morfologicznej tkanki płucnej myszy
- Korzystając z metody opisanej przez Ashcrofta i wsp., niech badacz zaślepiony na grupę eksperymentalną losowo wybierze trzy mikroskopijne pola z każdej próbki i obserwuje stopień zwłóknienia płuc przy 100-krotnym powiększeniu: stopień 0, normalne płuca; stopień 1, lekko obrzęknięte pęcherzyki płucne, zlokalizowane łagodne zwłóknienie; stopień 2, wyraźne zwłóknienie (grubość ściany wyrostka zębodołowego większa niż trzykrotność normy), z ogniskami włóknistymi; stopień 3, ciągłe obszary zwłóknienia (grubość ściany wyrostka zębodołowego trzy razy większa niż normalnie); stopień 4, fuzja ognisk włóknistych, przy czym obszar zwłóknienia stanowi mniej niż 10% tkanki płucnej; stopień 5, ogniska włókniste są zrośnięte, obszar zwłóknienia wynosi od 10% do 50%, a struktura wyrostka zębodołowego jest znacznie uszkodzona; stopień 6, duże ciągłe ogniska włókniste (więcej niż 50% tkanki płucnej); stopień 7, przestrzeń pęcherzykowa jest wypełniona tkanką włóknistą, obecne są pęcherze płucne; stopień 8, całkowite zwłóknienie.
- Przypisz wynik odpowiadający ocenie do każdego pola widzenia (np. ocena 4 równa się czterem punktom) i oceń każdą grupę sześciu próbek osobno.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Uszkodzenie płuc wywołano za pomocą nebulizacji BLM, natomiast zwierzęta kontrolne poddano nebulizacji taką samą objętością soli fizjologicznej. Myszy poddawano nebulizacji raz dziennie przez 3 dni, po 30 min dziennie, stosując stężenie BLM wynoszące 7 U/mL. Myszy uśpiono w 9., 16. i 23. dniu po podaniu BLM w celu wykonania barwienia H&E (Rycina 2B). W płucach myszy, które otrzymały BLM, w porównaniu z grupą kontrolną, zaobserwowano rozlane zmiany zapalne płuc z utratą prawidłowej architektury pęcher...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dotchawicze wstrzyknięcie bleomycyny powoduje ostrą reakcję zapalną i zwłóknieniową w obu płucach i może być uważane za skuteczne podejście do ustanowienia eksperymentalnego mysiego modelu ludzkiej śródmiąższowej choroby płuc. Podanie dotchawicze jest najczęściej stosowaną drogą podania 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 92068108).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| bleomycyna | Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd | DP721 | Model zwłóknienia |
| leki 0,9% sól fizjologiczna do wstrzykiwań | Baxter Healthcare(Tianjin)Co., Ltd. | Preparat bleomycyny | |
| 1 ml strzykawka | BD | 300481 | Znieczulenie zwierząt |
| 10% neutralny bufor formalinowy | TechaLab Biotech Company | Fix tkanka płucna | |
| 15 ml probówka wirówkowa | corning | 430790 | Przygotuj się do znieczulenia |
| 20 ° C lodówka | Grupa New-fly | BCD-213K | Przechowywać leki |
| 4 & stopnie C lodówka | New-fly group | BCD-213K | Przechowuj leki |
| Adobe illustrator cc2020 | Adobe | Process obrazy | |
| niebieski płyn z powrotem | Pekin Chemical Works | barwienie tkanek | |
| czysta ławka | Suzhou Sujie Purifying Equipment Co., Ltd. | Preparat bleomycyny | |
| płyn różnicujący | Beijing Chemical Works | barwienie tkanek | |
| Waga elektroniczna | METTLER TOLEDO | AA-160 | Przygotuj się do znieczulenia |
| barwnik eozyny | Beijing Yili Fine Chemicals Co, Ltd. | barwienie tkanek | |
| Poduszka grzewcza | HIDOM | Myszy inkubacja barwienie | |
| hematoksyliną | Beijing Yili Fine Chemicals Co, Ltd. | ||
| bufor soli fizjologicznej buforowany fosforanem do barwienia tkanek (PBS) | Hyclon | SH30256.01 | Czysta tkanka płucna |
| Oprogramowanie do rysowania Photoshop | procesu Adobe | ||
| SCIREQ INEXEX, | EMKA Biotech Beijing Co., Ltd. | Urządzenie atomizujące | |
| Pionowy mikroskop fluorescencyjny | Olympus | BX53 | Obserwuj plasterek |
Bibliografia
- Raghu, G., et al. Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis. An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (5), e44-e68 (2018).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Degryse, A. L., et al. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L442-L452 (2010).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. The American Journal of the Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Peng, R., et al. Bleomycin induces molecular changes directly relevant to idiopathic pulmonary fibrosis: a model for "active" disease. PLoS One. 8 (4), e59348(2013).
- Izbicki, G., et al. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. International Journal of Experimental Pathology. 83 (3), 111-119 (2002).
- Aguilar, S., et al. Bone marrow stem cells expressing keratinocyte growth factor via an inducible lentivirus protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. PLoS One. 4 (11), e8013(2009).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (14), 8407-8411 (2003).
- Rojas, M., et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (2), 145-152 (2005).
- Ortiz, L. A., et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 11002-11007 (2007).
- Foskett, A. M., et al. Phase-directed therapy: TSG-6 targeted to early inflammation improves bleomycin-injured lungs. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), L120-L131 (2014).
- Hecker, L., et al. Reversal of persistent fibrosis in aging by targeting Nox4-Nrf2 redox imbalance. Science Translational Medicine. 6 (231), 231ra47(2014).
- Taooka, Y., et al. Effects of neutrophil elastase inhibitor on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine. 156 (1), 260-265 (1997).
- Gharaee-Kermani, M., Ullenbruch, M., Phan, S. H. Animal models of pulmonary fibrosis. Methods in Molecular Medicine. , 251-259 (2005).
- Orlando, F., et al. Induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin. Journal of Visualized Experiments. (146), e58902(2019).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Gauldie, J., Kolb, M. Animal models of pulmonary fibrosis: how far from effective reality. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L151(2008).
- Jenkins, R. G., et al. An official American thoracic society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 667-679 (2017).
- Moeller, A., et al. The bleomycin animal model: A useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
