Artykuł metodologiczny

Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych

DOI:

10.3791/64099

⸱

29 czerwca 2022

 ,  , 
1School of Biological Sciences, Georgia Institute of Technology, 2Department of Structural Biology, Genentech, 3School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika peel-blot to metoda przygotowania siatki cryo-EM, która pozwala na rozdzielanie wielowarstwowych i skoncentrowanych próbek biologicznych na pojedyncze warstwy w celu zmniejszenia grubości, zwiększenia koncentracji próbki i ułatwienia przetwarzania obrazu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika przygotowania siatki kriogenicznej typu peel-blot jest znacząco zmodyfikowaną metodą wtrysku wstecznego, której celem jest uzyskanie redukcji warstw wielowarstwowych próbek. Usunięcie warstw przed zamrożeniem wgłębnym może pomóc w zmniejszeniu grubości próbki do poziomu odpowiedniego do zbierania danych krioelektromagnetycznych, poprawie płaskości próbki i ułatwieniu przetwarzania obrazu. Technika peel-blot pozwala na rozdzielenie błon wielopłytkowych na pojedyncze warstwy, warstwowych kryształów 2D na pojedyncze kryształy oraz ułożonych, przypominających arkusze struktur rozpuszczalnych białek, które również są rozdzielane na pojedyncze warstwy. Duża grubość tego typu próbek często stwarza problemy nie do pokonania w gromadzeniu danych krio-EM i przetwarzaniu obrazów krio-EM, zwłaszcza gdy stolik mikroskopu musi być przechylony w celu zbierania danych. Co więcej, siatki o wysokich stężeniach każdej z tych próbek mogą być przygotowane do efektywnego gromadzenia danych, ponieważ stężenie próbki przed przygotowaniem siatki można zwiększyć, a technikę peel-blot dostosować tak, aby uzyskać gęsty rozkład próbki jednowarstwowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika peel-blot została opracowana w celu rozdzielenia dwuwymiarowych kryształów białek błonowych na pojedyncze warstwy, aby uzyskać odpowiednio cienkie próbki do zbierania danych krio-EM 2D i 3D oraz ułatwić przetwarzanie obrazów1. Protokół jest również odpowiedni dla innych typów próbek wielopłytkowych, jak również dla osiągania wysokich stężeń każdego rodzaju próbki na siatce bez zwiększania grubości w Z.

Redukcja warstw próbki do jednej warstwy jest osiągana poprzez zastosowanie kombinacji nacisku kapilarnego i sił ścinających w protokole, który znacznie rozszerza i modyfikuje metodę wtrysku wstecznego2. Pierwszy etap blottingu skutkuje ścisłym warstwowaniem i przyleganiem do folii węglowej oraz pręta siatki po obu stronach wielowarstwowej próbki podczas blottingu na submikronie, a nie o wielkości porów bibuły filtracyjnej 20-25 μm w metodzie wtrysku wstecznego. Oddzielenie lub złuszczanie się pojedynczej warstwy następuje po wymuszeniu rozdzielenia warstw warstwowych, gdy siatka jest dociskana pionowo do kropli trehalozy, wypychając warstwę węglową z dala od pręta siatki (Rysunek 1). Zmiana położenia folii węglowej z dala od pierwotnego punktu styku z prętem siatkowym następuje w następnym kroku, gdy siatka jest ponownie osuszana na submikronowej bibule filtracyjnej. Liczba iteracji tych kroków może być zoptymalizowana dla określonych próbek. Ponadto protokół może być stosowany do zwiększania stężeń próbek przy jednoczesnym unikaniu agregacji w Z. Ze względu na zależność od przylegania do pręta siatkowego i folii węglowej, a także wymuszonej separacji, podejście to może nie być odpowiednie dla bardzo delikatnych cząsteczek, takich jak niektóre delikatne i/lub niestabilne białka i kompleksy białkowe.

Technika peel-blot nie wymaga ani specjalistycznego sprzętu, ani drogich materiałów. Możliwość zastosowania do konkretnych próbek będzie jednak wymagała starannego rozważenia parametrów biologicznych. Decyzja jest łatwiejsza w przypadku kryształów 2D, ponieważ do zapewnienia płaskości wymagana jest warstwa węglowa, jednak manipulacja za pomocą techniki peel-blot może wpłynąć na integralność biologiczną próbki lub porządek krystaliczny. Przydatność techniki peel-blot do pojedynczych cząstek jest ograniczona i może być testowana dla tych, które wymagają filmu węglowego i są odporne na manipulację. Próbki z krytycznymi interakcjami biologicznymi między warstwami mogą nie nadawać się do scharakteryzowania za pomocą techniki peel-blot ze względu na zakłócenie takich interakcji.

Technika peel-blot ("peel-blot") jest najszybciej optymalizowana przez testowanie i przesiewanie z negatywnym zabarwieniem lub niebarwionymi próbkami za pomocą TEM w temperaturze pokojowej. Po zidentyfikowaniu optymalnej liczby iteracji peel-blot można określić czas kontroli grubości przed zeszkleniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etapy przygotowania do techniki peel-blot

UWAGA: Przygotowanie wymaga, aby następujące elementy były umieszczone obok siebie.

  1. Ułóż dwa kawałki bibuły filtracyjnej o porach 20-25 μm (patrz Tabela materiałów).
  2. Umieść folię parafinową o długości ~8 cm x 10 cm obok bibuły filtracyjnej papierem do góry.
  3. Umieść kawałek submikronowej bibuły filtracyjnej na dwóch dodatkowych kawałkach bibuły filtracyjnej #4 (Rysunek 1-1).
  4. Ustaw kleszczyki antykapilarne ze zgiętą nogą skierowaną do góry i wyprostowaną nogą skierowaną w dół. Następnie wybierz siatkę o oczkach 600 gładką/błyszczącą stroną do góry. Umieść kleszcze na szalce Petriego lub innej podniesionej powierzchni, aby uniknąć kontaktu czystej siatki z innymi przedmiotami.
  5. Usuń papier z folii parafinowej i pociągnij boki (~5 mm), aby utworzyć małą obręcz. Odpipetować dwie krople o pojemności 150 μl 4% roztworu trehalozy ~1-2 cm od jednej krótszej strony folii parafinowej i ~1 cm od siebie na folii parafinowej.
  6. Na osobnej ławce lub na podłodze wlej ciekły azot do małego pojemnika z pianki polistyrenowej (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Odbyć szkolenie w zakresie prawidłowego obchodzenia się z rękawicami i osłoną twarzy, aby uniknąć odmrożeń.
  7. Umieść mały pojemnik z siatką cryo-EM w ciekłym azocie i przykryj pojemnik z pianki polistyrenowej niestrzępiącymi się chusteczkami.

2. Umieszczanie folii węglowej na siatce

  1. Użyj kleszczyków Dumont #5 (patrz Tabela materiałów), aby unosić film węglowy z miki, dotykając jednej strony miki pod niewielkim kątem w dół (~20°-40°) jednej z kropli roztworu trehalozy i powoli pozwól, aby napięcie wody podniosło się z filmu węglowego, przesuwając mikę w dół. Uwolnij mikę, gdy film węglowy unosi się na powierzchni kropli.
  2. Sprawdź wzrokowo film węglowy, aby uniknąć użycia węgla z uszkodzeniami w postaci pęknięć.
  3. Włóż siatkę przytrzymywaną przez kleszcze antykapilarne pod kątem (~20°-30°) do kropli trehalozy w pozycji obok, a następnie wyśrodkowanej pod folią węglową. Podnieś folię węglową (Rysunek 1-2).
  4. Utrzymuj siatkę w tej samej orientacji i powoli opuść ją na powierzchnię drugiej kropli trehalozy, nie przerywając napięcia powierzchniowego kropli, aby usunąć niepotrzebną warstwę węglową, która mogła owinąć się wokół krawędzi siatki na szorstką stronę.

3. Rozdzielanie wielowarstwowych kryształów 2D na pojedyncze warstwy

  1. Obróć kleszczyki antykapilarne (patrz Tabela Materiałów) i umieść je na szalce Petriego stroną siatki z węglem skierowaną w dół (Rysunek 1-3).
  2. Pobrać pipetą 1,3 μl próbki do niewielkiej menisku trehalozy znajdującej się na górze siatki. Odpipetować roztwór ~8-10 razy, aby wymieszać i rozprowadzić trehalozę i próbkę po obu stronach siatki.
  3. Podczas inkubacji roztworu przez 1 minutę odpipetować jedną lub więcej kropli 1,7 μl roztworu trehalozy na folię parafinową.
  4. Obróć siatkę z powrotem do pierwotnej pozycji, z folią węglową skierowaną do góry.
  5. Użyj kleszczyków antykapilarnych, aby docisnąć siatkę do submikronowej bibuły filtracyjnej (Rysunek 1-4). Gdy roztwór zostanie wchłonięty przez bibułę filtracyjną, a film węglowy leży płasko, odczekaj 3 sekundy przed podniesieniem siatki i przesunięciem jej pionowo na kroplę 1,7 μl roztworu trehalozy (Rysunek 1-5).
    UWAGA: Powtórz ten krok wiele razy w przypadku mocno ułożonych próbek lub siatka jest przygotowana do witryfikacji w następnych krokach.
  6. Osusz siatkę na dwóch kawałkach bibuły filtracyjnej, a następnie wyjmij siatkę z bibuły filtracyjnej (Rysunek 1-6). Po około 13 sekundach, w zależności od wilgotności i bufora próbki, zanurz siatkę w ciekłym azocie w małym pojemniku styropianowym i umieść siatkę w pojemniku z siatką cryo-EM lub przenieś ją bezpośrednio w celu przesiewania krio-EM lub zbierania danych.
    UWAGA: Aby szybko zoptymalizować protokół, na tym etapie należy negatywnie zabarwić siatkę z oklepioną skórką, zamiast zanurzać ją w ciekłym azocie. Ujemnie zabarwić próbkę, nakładając 3 μl 1% octanu uranylu na siatkę, inkubować siatkę przez 30 s i osuszyć ją podartym kawałkiem bibuły filtracyjnej o wielkości porów 20-25 μm. Siatki kryształów 2D zeszklonych trehalozą, taniną lub glukozą są rutynowo ręcznie zanurzane w celu zeszklenia, ponieważ trehaloza, tanina i glukoza zapobiegają tworzeniu się krystalicznego lodu z szybkością używaną do ręcznego zanurzania2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udany eksperyment z kleksami spowoduje powstanie pojedynczych warstw próbek o często wysokich stężeniach. Należy się spodziewać, że niektóre regiony w większości kwadratów siatki nadal będą zawierać wiele warstw, zwłaszcza przy mniejszej liczbie iteracji kroków peel-blot. Większość kwadratów siatki będzie jednak zawierać rozległe obszary pojedynczych warstw, jak zaobserwowano dla kryształów 2D ludzkiej syntazy leukotrienu C4 (Rysunek 2) i liposomów (dodanych w kroku 3.2,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peel-blot to potężna metoda radzenia sobie z układaniem się w stosy i grubością wielowarstwowych kryształów 2D i podobnych próbek do zbierania danych krio-EM i przetwarzania obrazów. Decyzja o zastosowaniu peel-blot będzie oparta na parametrach biologicznych próbki i będzie również wymagała oceny, gdy dostępny będzie model 3D cryo-EM. W tej ocenie szczególnie ważne będzie biologiczne znaczenie kontaktów i potencjalna elastyczność regionów kontaktowych.

Liczba kleksów zostanie początkowo ustalo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część tej pracy była wspierana przez HL090630 grantowy (ISK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siatki 600SPI2060-C-XA
Kleszczyki antykapilarneTed Pella510-5
Węgiel do powlekania miki
Cryo-EM Siatki Cryo-EMmogą być ekranowane przy napięciu 120 kV lub 200 kV. Dane o wysokiej rozdzielczości zbierane są przy napięciu 300 kV.
Kleszcze Dumpont #5Ted Pella5622
Skrzynka siatkowa do przechowywania krio-EMTed Pella160-40
Kim Wipes
Ciekły azot
MikaTed Pella56Mika jest pokryta węglem i pocięta na kwadraty, które są nieco większe niż siatka TEM.  Grubość węgla może wymagać optymalizacji, aby uniknąć cienkiego węgla, który łatwo pęka przy wielu plamach skórki.
Ujemne barwienie1-2% octan uranylu nadaje się do wielu próbek.  Inne plamy, takie jak kwas fosfowolframowy, można zastąpić.
Parafilm
PojemnikSłuży do zeszklenia siatki peel-blot. Polistyrenowy kontener transportowy można w tym celu poddać recyklingowi i wyłożyć folią aluminiową.
Submikronowa bibuła filtracyjnaMilliporeSigmaDAWP04700
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEOLJEM-1400Każdy TEM działający przy napięciu przyspieszającym 80-120 kV będzie odpowiedni do przesiewania ujemnie zabarwionych siatek.
TrehalozaPrzygotuj 4% roztwór trehalozy.
Bibuła filtracyjna Whatman #4MilliporeSigmaWHA1004150Odpowiada to 20-25 μ bibuła filtracyjna o wielkości porów w protokole.
z polistyrenu

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Separacja jednowarstwowapr bki wielowarstwoweiniekcja wstecznaroztw r trehalozyfolia w glowapapier filtruj cy submikronowykryszta y 2Dprzetwarzanie obrazu

Powiązane artykuły