Użycie elektrody bipolarnej do stworzenia mysiego modelu padaczki skroniowej poprzez elektryczne rozppalenie ciała migdałowatego

Padaczka skroniowa (TLE) jest najbardziej rozpowszechnionym typem padaczki i wiąże się z wysokim ryzykiem przekształcenia się w padaczkę lekooporną. Chirurgia, taka jak selektywna amygdalohippokampektomia, jest skutecznym sposobem leczenia TLE, a epileptogeneza i ictogeneza choroby są nadal badane^1,2. Wykazano, że patogeneza TLE występuje nie tylko w hipokampie, ale także w szerokim zakresie w ciele migdałowatym^3,4. Na przykład, zarówno stwardnienie ciała migdałowatego, jak i powiększenie ciała migdałowatego były często zgłaszane jako źródło napadów TLE^5,6. Nie można lekceważyć znaczenia ciała migdałowatego; Model ciała migdałowatego jest niezbędny do badania epileptogenezy i pilnie potrzebna jest wyraźna ilustracja tego modelu.

Zaproponowano kilka podejść do wywoływania napadów w modelach zwierzęcych. W przeszłości leki przeciwdrgawkowe wstrzykiwano dootrzewnowo we wczesnym stadium⁷. Chociaż metoda ta była wygodna, lokalizacja ognisk padaczkowych była niepewna. Wraz z rozwojem technologii stereotaktycznej i szczegółowego atlasu mózgów zwierząt, zastosowano wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie leków w celu rozwiązania problemu lokalizacji⁸. Jednak brak interwencji w przypadku ciężkich napadów w fazie ostrej skutkował wysoką śmiertelnością, a przewlekłym napadom spontanicznym towarzyszył problem niestabilnej częstości napadów międzynapadowych i napadów^9,10. Wreszcie opracowano metodę rozpalania elektrycznego; Metoda ta okresowo kilkakrotnie stymuluje określone obszary mózgu, umożliwiając wywołanie napadów z określoną kontrolą zarówno lokalizacji, jak i czasu wystąpienia¹¹.

Zaletą tej metody jest to, że wewnątrzczaszkowe wszczepienie elektrod jest minimalnie inwazyjne¹². Co więcej, nasilenie napadu można kontrolować poprzez ustanie bodźców, co zmniejsza śmiertelność spowodowaną napadami. Zmiany te rozwiązały niedociągnięcia poprzednich podejść. Warto zauważyć, że model ten może odpowiednio naśladować napady padaczkowe u ludzi i jest szczególnie odpowiedni do badania stanu padaczkowego (SE) ze względu na jego zdolność do szybkiego wywoływania SE¹³. Może być również stosowany do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych¹⁴ oraz w badaniach nad mechanizmem padaczki. Wreszcie, dobrze wiadomo, że ciało migdałowate jest ściśle związane z modulacją pamięci, przetwarzaniem nagrody i emocjami¹⁵. Zaburzenia tych funkcji psychicznych są często spotykane u pacjentów z padaczką, dlatego model padaczki ciała migdałowatego może być lepszym wyborem do badania problemów emocjonalnych w padaczce¹⁶.

Ten eksperyment został zatwierdzony przez Komisję Etyki Zwierząt Doświadczalnych Szpitala Xuanwu Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Wszystkie myszy trzymano w laboratorium zwierzęcym szpitala Xuanwu Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Protokół ten podzielony jest na cztery części. Dwie pierwsze części wprowadzają w sposób budowy elektrody i obwodu elektrycznego za pomocą pierścienia ślizgowego do połączenia elektrod z aparaturą rejestrującą/stymulującą EEG. W trzeciej części opisano sposób działania implantacji elektrody, a w czwartej przedstawiono parametry zapisu i stymulacji EEG wykorzystane w modelu padaczki ciała migdałowatego.

1. Produkcja elektrod

1. Przygotuj następujące wcześniej przygotowane materiały: dwa kawałki drutu wolframowego pokrytego teflonem o długości 3 cm (nieosłonięta średnica: 76,2 μm), jeden kawałek srebrnego drutu (goła średnica: 127 μm) o tej samej długości i jeden zestaw kołków rzędowych o grubości 2 x 2.
2. Użyj zapalniczki, aby spalić jeden koniec każdego drutu wolframowego, aby usunąć 5 mm powłoki izolacyjnej.
   UWAGA: Drut wolframowy ze zdjętą izolacją zmienia kolor na; Ta część drutu wolframowego jest określana jako górny koniec.
3. Obierz odcinek bardzo cienkiego drutu wielożyłowego i owiń go od dołu do górnego końca, gdzie zaczyna ciemnieć, kontynuując do góry. Połącz ten bardzo cienki drut (o miękkiej teksturze) z drutem wolframowym, ściskając jeden koniec i delikatnie skręcając drugi koniec, co umożliwia łatwe splatanie ze sobą dwóch materiałów.
4. Delikatnie pociągnij, aby upewnić się, że są szczelnie owinięte i odetnij nadmiar bardzo cienkiego drutu. Staraj się, aby drut wolframowy był prosty przez cały proces.
5. Przymocuj kołek rzędowy do zacisku na stole spawalniczym dłuższym bokiem kołków skierowanym na zewnątrz. Użyj igły strzykawki, aby nabrać trochę pasty lutowniczej i nałóż ją na kołki. Podgrzać palnik spawalniczy do temperatury 320 °C; Rozpuść i posmaruj trochę bezołowiowego drutu cynowego końcówką palnika.
6. Załóż górny koniec drutu wolframowego na jedną igłę kołków rzędowych i użyj lutu na palniku, aby przymocować drut wolframowy do kołka.
   UWAGA: Bardzo trudno byłoby przyspawać drut wolframowy za pomocą kołków bezpośrednio bez pomocy bardzo cienkiego drutu.
7. Przyspawaj kolejny drut wolframowy i kolejny srebrny drut do kołka rzędu w ten sam sposób, tak aby każdy drut odpowiadał igle (patrz Rysunek 1,i).
8. Wytnij dwie rurki termokurczliwe nieco dłuższe niż górny koniec drutu wolframowego. Umieść je na złączu lutowanym dwóch drutów wolframowych, upewniając się, że część przewodząca jest całkowicie pokryta rurką, tak aby obwód dwóch drutów wolframowych nie był umieszczony szeregowo.
   UWAGA: Chociaż są trzy przewody, jeśli dwa z nich są izolowane, trzy przewody nie będą połączone szeregowo; Do srebrnego drutu można również dodać rurkę.
9. Wyjmij elektrodę z zacisku stołu spawalniczego i delikatnie przytrzymaj elektrodę dużymi szczypcami, ponieważ elektrody łatwo tracą swój kształt podczas podgrzewania rurki termokurczliwej, używając zacisku o dobrej przewodności cieplnej z nieco większą siłą.
10. Włącz kanał powietrzny i podgrzewaj, aż do osiągnięcia temperatury 320 °C. Przedmuchaj rurkę termokurczliwą przez kilka sekund, aż zostanie dokręcona (patrz Rysunek 1,ii).
11. Jeśli igły oddzielą się od plastikowego korpusu podczas procesu spawania, połącz część spawalniczą i plastikowy korpus za pomocą kleju topliwego (patrz Rysunek 1,iii). Uważaj, aby nie rozmazać go na interfejsie, ponieważ wpłynęłoby to na wstawianie interfejsu.
12. Przytrzymaj dwa druty wolframowe i skręć je razem, trzymając ich końce w rozkroku (patrz Rysunek 1,iv). Przyciąć skręcone druty wolframowe do długości około 10 mm tak, aby odstęp na końcach nie przekraczał 0.5 mm.
    UWAGA: Ten krok można również wykonać przed implantacją elektrody, aby umożliwić elastyczną regulację długości elektrody.
13. Podgrzej pistolet do klejenia i równomiernie nałóż klej wokół elektrody.
14. Sprawdź elektrody za pomocą multimetru: umieść jeden pręt multimetru po niespawanej stronie kołków rzędu i delikatnie dotknij końcem drutu wolframowego lub drutu srebrnego do drugiego pręta, sprawdzając, czy obwód jest gładki. Upewnij się, że linie nie są umieszczone szeregowo.

2. Połączenie pierścienia ślizgowego i opis obwodu

UWAGA: Gdy elektrody myszy są podłączone do urządzenia EEG za pomocą w stanie swobodnego ruchu, mogą się splątać, gdy myszy poruszają się i obracają. Powoduje to, że stają się krótsze, co ostatecznie utrudnia myszom poruszanie się lub powoduje, że spadają z głów. W opisanej tutaj metodzie wprowadza się czterokanałowy pierścień ślizgowy, aby zapobiec wypadaniu. Cztery kanały są reprezentowane w czterech kolorach w Rysunek 1B.

1. Oderwij 5 mm powłoki izolacyjnej na każdym końcu, aby odsłonić metalowy drut wewnątrz.
2. Dodaj odcinek rurki termokurczliwej do każdego przewodu stojana.
3. Zespawaj każdy przewód za pomocą wtyczki złącza urządzenia EEG.
4. Rurkę termokurczliwą obkurczyć gorącym powietrzem.
5. Dodaj odcinek rurki termokurczliwej do każdego drutu wirnika.
6. Skręć ze sobą przewodzące części czerwonego i pomarańczowego drutu i przyspawaj je do złącza w głowicy, aby pasowały do kołka rzędowego.
7. Przyspawaj pozostałe dwa druty na głowicy do każdego złącza.
   UWAGA: Brązowy kanał, który odpowiada srebrnemu przewodowi, jest podłączony do urządzenia EEG w celu uziemienia. Kanały czerwony i pomarańczowy odbierają sygnały z tego samego przewodu wolframowego, a kanał pomarańczowy służy jako odniesienie dla urządzenia EEG. Sygnały w kanale czerwonym są bez znaczenia, ale muszą współistnieć z kanałem czarnym, aby utworzyć bodziec prądowy. Sygnały w czarnym kanale są prawdziwymi sygnałami elektrycznymi w mózgu. Różne obwody mogą być zaprojektowane z wielokanałowymi pierścieniami ślizgowymi, aby pasowały do różnych urządzeń.

3. Chirurgia implantacji

1. zwierzęta
   1. Do operacji należy użyć 8-tygodniowych samców myszy C57BL/6 typu dzikiego o wadze 24-26 g.
   2. Trzymaj je w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym (czas świecenia: 8:00-20:00) w środowisku o kontrolowanej temperaturze (22 ± 1 °C) i zapewnij wodę i paszę ad libitum.
   3. Użyj dodatkowej maty grzewczej, aby utrzymać zwierzęta w cieple podczas operacji.
   4. Po zabiegu należy wstrzyknąć meloksykam podskórnie (10 mg/kg) jako pierwsze podanie leków przeciwbólowych. Następnie umieść zwierzęta w oddzielnych klatkach, aby zoptymalizować regenerację. Dodaj meloksykam do diety zwierzęcia przez pierwszy tydzień po zabiegu.
   5. Po eksperymencie wstrzyknij do lewej komór myszy 4% paraformaldehydu w znieczuleniu i zbierz tkanki mózgowe w celu histologicznej weryfikacji celu elektrody.
2. Zważ mysz i znieczul ją przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1% roztworu pentobarbitalu. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i materiały eksploatacyjne, które mają być używane, w tym wiertła, elektrody, cement dentystyczny itp., przez autoklawowanie.
3. Gdy mysz jest całkowicie znieczulona, ogol włosy od oka do ucha za pomocą brzytwy.
4. Umieść mysz na ramce stereotaktycznej. Włóż przednie górne zęby do siekacza i włóż oba nauszniki równie głęboko do uszu. Nałóż maść do oczu z erytromycyną na oczy, aby zapobiec suchości i ślepocie spowodowanej jasnym światłem podczas zabiegu.
5. Zdezynfekuj obszar operacyjny trzema naprzemiennymi wacikami z jodoforu i 75% alkoholu okrężnymi ruchami. Następnie wykonaj strzałkowe nacięcie do przodu od środka tego nacięcia i odetnij skórę po obu stronach nacięcia, aby utworzyć trójkątne okno.
6. Zwiń mały kawałek bawełny w kulkę i zwilż go 3% wodą utlenioną. Usuń tkankę miękką przyczepioną do czaszki, delikatnie pocierając odsłonięty obszar małym wacikiem, aż przednie i tylne ciemiączko będą wyraźnie widoczne.
7. Dostosuj wysokość przednią i tylną tak, aby ciemiączko przednie i tylne znajdowało się w pozycji poziomej. Rozważ położenie przedniego ciemiączka jako początek osi.
8. Przymocuj ze stali nierdzewnej do lewej czaszki móżdżku, używając wiertła, aby uzyskać płaską powierzchnię. Upewnij się, że śruba wystaje do połowy z czaszki.
9. Upewnij się, że współrzędne rozpałki ciała migdałowatego to −1.67 mm z tyłu, −2.7 mm bocznie i −4.9 mm brzusznie od bregmy. Dostosuj urządzenie stereotaktyczne, aby zlokalizować to miejsce i oznaczyć je.
10. Wywierć otwór w zaznaczonym miejscu za pomocą wiertła do czaszki o średnicy 0,5 mm.
11. Przymocuj elektrody do pręta ustalającego urządzenia stereotaktycznego, umieść elektrodę pionowo nad otworem i powoli opuść pozycję do -4.9 mm. Owiń srebrny drut wokół trzy razy, uważając, aby nie potrząsnąć korpusem elektrody podczas pracy.
12. Wymieszaj cement dentystyczny i delikatnie nałóż go na elektrodę i powierzchnię czaszki. Gdy cement dentystyczny stwardnieje, zmodyfikuj zewnętrzną stronę, aż cement otaczający stałą elektrodę zamieni się w stożek.
13. Gdy cement stwardnieje, zwolnij elektrodę z urządzenia stereotaktycznego. Podskórnie podawać meloksykam w dawce 10 mg/kg mc. w celu złagodzenia dyskomfortu spowodowanego bólem u zwierząt. Meloksykam należy podawać do pokarmu dla zwierząt w celu uzyskania efektu przeciwbólowego w pierwszym tygodniu po zabiegu. Wyjmij mysz i umieść ją z powrotem w klatce, trzymając ją oddzielnie od innych myszy.

4. Rozpałka elektryczna

1. Pozwól myszom odpocząć przez co najmniej 1 tydzień po zabiegu przed rozpaleniem, aby umożliwić powrót do zdrowia po operacji i ustąpienie stanu zapalnego.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, myszy, które nie wyzdrowiały odpowiednio, nie reagują dobrze na rozpałkę.
2. Umieść mysz w specjalnie zaprojektowanym pudełku z wsuwanymi łączącymi elektrodę na głowie myszy z urządzeniem EEG. Przeprowadź przez otwór w pokrywie pudełka i dostosuj długość pozostawioną w pudełku, aby umożliwić swobodne poruszanie się myszy.
3. Włącz urządzenie EEG i sprawdź, czy działa prawidłowo. Ustaw stymulator tak, aby dostarczał monofazowe impulsy fali prostokątnej o długości 1 ms przy 60 Hz przez czas trwania ciągu 1 s.
4. Zacznij od natężenia prądu 50 μA dla pierwszej stymulacji; monitoruj EEG pod kątem wyładowań, które charakteryzują się skokami o wysokiej częstotliwości. Jeśli nie obserwuje się wyładowania wtórnego, dodaj 25 μA do następnego bodźca i kontynuuj ten proces co 10 minut, aż do zaobserwowania wyładowania końcowego i trwającego 5 s.
   UWAGA: Jeśli eksperyment nie wymaga rozładowania, krok 4.4 można pominąć; 300 μA jest wystarczająco mocne do rozpalenia.
5. Stymuluj mysz prądem o intensywności określonej w kroku 4.3 co 15 minut, nie częściej niż 20 razy dziennie.
6. Monitoruj reakcje behawioralne na bodziec.
   UWAGA: Wystąpienie trzech następujących po sobie epizodów stopnia V jest uważane za pełne rozpałkę, w połączeniu z rangą Racine standard¹⁷.

Elektroda i obwód umożliwiają rejestrację EEG i pełnienie funkcji stymulacji (Rysunek 1); ta konfiguracja pozwala uniknąć złożoności wszczepiania elektrod rejestrujących i stymulujących oddzielnie oraz minimalizuje uszkodzenia tkanki mózgowej. Zastosowanie pierścieni ślizgowych umożliwia połączenie elektrod ze wszystkimi typami urządzeń.

Przeprowadziliśmy operację wszczepienia elektrody sześciu zdrowym dorosłym samcom myszy C57BL/6, a stymulacja elektryczna została przeprowadzona 2 tygodnie po operacji. Poziom napadów behawioralnych stopniowo wzrastał wraz ze wzrostem liczby bodźców, stopniowanie opiera się na skali Racine'a: 1 = automatyzmy ust lub twarzy; 2 = dwa lub mniej szarpnięć mioklonicznych; 3 = trzy lub więcej szarpnięć mioklonicznych i/lub klonus kończyn przednich; 4 = toniczno-kloniczny wyprost kończyny przedniej i tylnej; 5 = toniczno-kloniczny wyprost kończyny przedniej i tylnej z podnoszeniem i zapadaniem; 6 = toniczno-kloniczny wyprost kończyny przedniej i tylnej z dzikim bieganiem lub skakaniem14. Rejestrowano liczbę bodźców potrzebnych do całkowitego rozpalenia (tab. 1).

Reprezentatywne wyniki EEG do stymulacji po całkowitym rozpaleniu są zilustrowane w Rysunek 2. Wyładowania końcowe trwają 5-15 s; Następnie nasilają się samoistne wyładowania wewnątrzczaszkowe i zaczynają się objawy behawioralne. Czas trwania napadu jest zwykle krótszy niż 1 minuta, co zmniejsza ryzyko zgonu z powodu ciężkich drgawek prowadzących do bezdechu.

Ekspresja c-Fos w tkance mózgowej została wykryta przez immunohistochemię 2 godziny po całkowitym rozpaleniu (Rysunek 3); zastosowano przeciwciało c-Fos i anty-króliczą IgG skoniugowaną z Alexa Fluor 488. Wyniki wykazały, że ekspresja c-Fos w ipsilateralnym ciele migdałowatym była znacznie zwiększona, co potwierdza wykonalność tego modelu.

Wszystkie zwierzęta przeszły weryfikację histologiczną na końcu eksperymentu, aby upewnić się, że cel stymulacji był dokładny, ścieżka elektrody jest pokazana w Rysunek 4.

Rysunek 1: Kluczowe etapy produkcji elektrod. (A) Wygląd elektrod na różnych etapach; Odpowiednie kroki są zaznaczone na schematach. (B) Pierścień ślizgowy łączy się z wtyczkami interfejsu; Obwód żeńskiego złącza header jest pokazany we wstawce (prawy górny róg). Podziałka = 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki elektroencefalografii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: ekspresja c-Fos w ciele migdałowatym. c-Fos (zielony) w neuronach ciała migdałowatego; DAPI (niebieski) oznacza jądro; podziałka = 100 μm. (A) c-Fos w ipsilateralnym ciele migdałowatym; (B) c-Fos w przeciwległym ciele migdałowatym. Skrót: DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Weryfikacja histologiczna ścieżki elektrody. Czerwone strzałki wskazują ścieżkę elektrody, biały przerywany owal to ciało migdałowate. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Liczba bodźców potrzebnych do pełnego rozpalenia każdej z sześciu myszy.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.