Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64114

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Streszczenie

Jednym z ważnych zastosowań CRISPR/Cas 9 jest rozwój linii komórkowych knock-out, specjalnie do badania funkcji nowych genów/białek związanych z chorobą, zidentyfikowanych podczas diagnozy genetycznej. Aby opracować takie linie komórkowe, należy rozwiązać dwie główne kwestie: wprowadzenie narzędzi CRISPR (Cas9 i przewodnika RNA) z wysoką wydajnością do wybranych komórek oraz ograniczenie aktywności Cas9 do specyficznej delecji wybranego genu. Opisany tutaj protokół jest poświęcony wprowadzaniu narzędzi CRISPR do trudnych do transfekcji komórek, takich jak komórki mięśniowe. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu lentiwirusów, wytwarzanych z publicznie dostępnych plazmidów, dla których wszystkie etapy klonowania są opisane tak, aby były ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania. Kontrola aktywności Cas9 została przeprowadzona za pomocą adaptacji wcześniej opisanego systemu o nazwie KamiCas9, w którym transdukcja komórek lentiwirusem kodującym przewodnikowe RNA ukierunkowane na Cas9 pozwala na stopniowe zniesienie ekspresji Cas9. Protokół ten został zastosowany do opracowania linii ludzkich komórek mięśniowych z nokautem RYR1, która została dodatkowo scharakteryzowana na poziomie białkowym i funkcjonalnym, aby potwierdzić nokaut tego ważnego kanału wapniowego zaangażowanego w wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia w mięśniach oraz w sprzężeniu wzbudzenie-skurcz. Opisana tutaj procedura może być łatwo zastosowana do innych genów w komórkach mięśniowych lub w innych trudnych do transfekcji komórkach i dostarczyć cennych narzędzi do badania tych genów w komórkach ludzkich.

Wprowadzenie

Wraz z postępem sekwencjonowania genów i identyfikacją mutacji w genach o nieznanych funkcjach w określonej tkance, rozwój odpowiednich modeli komórkowych do zrozumienia funkcji nowego genu docelowego i potwierdzenia jego udziału w powiązanych mechanizmach patofizjologicznych stanowi niezbędne narzędzie. Ponadto modele te mają ogromne znaczenie dla przyszłego rozwoju terapeutycznego1,2 i stanowią interesującą alternatywę dla rozwoju modeli zwierzęcych knock-out zgodnie z międzynarodowymi zaleceniami dotyczącymi ograniczenia wykorzystywania zwierząt w eksperymentach. Edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest jednym z najpotężniejszych obecnie dostępnych narzędzi, które pozwoliły na opracowanie wielu modeli knock-out/knock-in, a ukierunkowana walidacja genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest jedną z najczęściej używanych aplikacji CRISPR/Cas93. Sukces edycji genów zależy od możliwości wprowadzenia narzędzi CRISPR (przewodnika RNA i nukleazy Cas9) do docelowego modelu komórki, co może być wyzwaniem w wielu trudnych do transfekcji komórkach, takich jak komórki mięśniowe4. Wyzwanie to można przezwyciężyć za pomocą wirusa, zwykle lentiwirusa, który ma tę wielką zaletę, że skutecznie transdukuje wiele typów komórek i dostarcza ich transgen. Ale jego główną wadą jest integracja transgenu z genomem komórki gospodarza, prowadząca do potencjalnej zmiany genów zlokalizowanych w miejscu integracji i do trwałej ekspresji transgenu, co w przypadku nukleazy Cas9 skutkowałoby szkodliwymi konsekwencjami5. Merienne i współpracownicy zaproponowali inteligentne rozwiązanie6, które polega na wprowadzeniu do komórek przewodnika RNA ukierunkowanego na sam gen Cas9, co prowadzi do inaktywacji Cas9. Adaptacja tej strategii jest tutaj przedstawiona jako przyjazny dla użytkownika i wszechstronny protokół pozwalający na wyeliminowanie praktycznie każdego genu w trudnych do transfekcji komórkach.

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest wywołanie inaktywacji interesującego genu w unieśmiertelnionych komórkach mięśniowych. Może być używany do wybijania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania, w różnych typach unieśmiertelnionych komórek. Opisany tutaj protokół zawiera kroki mające na celu zaprojektowanie przewodnikowych RNA i ich klonowanie do plazmidów lentiwirusowych, wytworzenie narzędzi CRISPR w wektorach lentiwirusowych, transdukcję komórek za pomocą różnych lentiwirusów oraz klonowanie komórek w celu wytworzenia jednorodnej edytowanej linii komórkowej.

Korzystając z tego protokołu, unieśmiertelnione ludzkie komórki mięśni szkieletowych zostały opracowane z delecją receptora ryanodine typu 1 (RyR1), niezbędnego kanału wapniowego biorącego udział w wewnątrzkomórkowym uwalnianiu wapnia i skurczu mięśni7. Nokaut (KO) genu został potwierdzony na poziomie białka za pomocą Western blot oraz na poziomie funkcjonalnym za pomocą obrazowania wapnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Biopsje mięśni pozyskano z Banku Tkanek do Badań (Myobank, partner w sieci UE EuroBioBank, Paryż, Francja) zgodnie z europejskimi rekomendacjami i francuskim ustawodawstwem. Od wszystkich osób uzyskano pisemną świadomą zgodę. Unieśmiertelnione mioblasty zostały uprzejmie dostarczone przez dr. V. Mouly'ego (Instytut Miologii, Paryż, Francja), a protokoły zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Instytutu Miologii (MESRI, n AC-2019-3502).

1. Projektowanie przewodników CRISPR

  1. Zidentyfikuj region genu przeznaczonego do usunięcia. Wyszukaj jego sekwencję genomiczną, korzystając z narzędzi przeglądarki genomu, takich jak ensembl.org lub genome.ucsc.edu, i określ współrzędne chromosomowe dwóch obszarów do poszukiwania przewodniego RNA (gRNA), znajdujących się po obu stronach regionu do usunięcia.
    1. W przypadku wykorzystanego tutaj genu uzyskaj sekwencję FASTA genu RYR1 oraz sekwencję eksonu 101 w następujący sposób. W serwisie ensembl wyszukaj RYR1 w najnowszej wersji ludzkiego genomu, wybierz pierwszy wpis i kliknij transkrypcję sekwencji kodującej białko. Następnie kliknij Eksony, aby przejść do listy eksonów genu.
    2. Kliknij Pobierz sekwencję i wybierz Tylko sekwencja genomiczna, aby pobrać pełną sekwencję konsensusu całego genu. Przewiń listę eksonów i intronów genu i wybierz docelowy ekson lub eksony.
    3. Znajdź odpowiadającą im sekwencję nukleotydową w genie. Wybierz sekwencje nukleotydowe intronów znajdujących się bezpośrednio powyżej (upstream) i poniżej (downstream) eksonu do usunięcia; zostaną one wykorzystane do wyszukiwania gRNA.
  2. Zaprojektuj dwa gRNA, nazwane tutaj przewodnim 1 i przewodnim 2, w regionach zidentyfikowanych w kroku 1.1 (introny powyżej i poniżej regionu do usunięcia), korzystając z narzędzi online, takich jak Crispor.tefor.net8. Wybierz dwa gRNA oddalone od siebie o kilkaset par zasad (bp), przy czym sekwencja każdego gRNA musi mieć dokładnie 20 nukleotydów długości, bez motywu PAM (protospacer adjacent motif). Wybierz najlepsze dostępne przewodniki, aby ograniczyć efekty off-target. Przykład projektowania przewodników przedstawiono na Rysunku 1.
    1. Przewiduje się, że sekwencja pomiędzy dwoma przewodnikami zostanie usunięta, co doprowadzi do nokautu interesującego genu; należy zatem dobrać pozycję dwóch przewodników tak, aby usunęły one istotną sekwencję lub kluczowy ekson w badanym genie. Upewnij się, że usunięta sekwencja/ekson nie występuje wyłącznie w alternatywnym transkrypcie genu i/lub że koduje ważną część białka, tak aby jej usunięcie skutkowało funkcjonalnym nokautem.
      UWAGA: Chociaż przewiduje się, że miejsce cięcia Cas9 znajduje się 3 bp powyżej motywu PAM, cięcie może nastąpić w większej odległości, dlatego dobrym rozwiązaniem jest niepoleganie na precyzyjnej lokalizacji miejsca cięcia, na przykład poprzez zaplanowanie cięcia w intronie.
  3. Wyznacz sekwencję odwrotnej komplementarności (RC) dla każdego gRNA, bez motywu PAM, aby uzyskać następujące sekwencje: Przewodnik 1 i Przewodnik 1-RC, Przewodnik 2 oraz Przewodnik 2-RC.
  4. Zamów primery przedstawione w Tabeli 1 w celu przeprowadzenia klonowania plazmidów. W trakcie całego protokołu używaj primerów o stężeniu 10 nM w sterylnym H2O.
    ​UWAGA: Sekwencje dodane do gRNA w tych primerach (pogrubione i podkreślone) odpowiadają sekwencji plazmidu odpowiednio przed i po przewodniku, promotorze oraz transaktywującym CRISPR RNA (tracrRNA) i nie powinny być modyfikowane, aby zapewnić prawidłowe nakładanie się primerów i plazmidu.

2. Klonowanie plazmidów

UWAGA: Na tym etapie gRNA zostaną wprowadzone do szkieletu plazmidu w celu produkcji lentiwirusa. Kaseta kodująca dwa gRNA jest najpierw otrzymywana poprzez następujące po sobie reakcje łańcuchowej polimerazy (PCR) z wykorzystaniem starterów z nakładkami. Następnie nowa kaseta jest wstawiana do lentiwirusowego plazmidu szkieletowego #87919.

  1. Należy pozyskać następujące plazmidy: plazmid #87919, kodujący CRISPR guide RNA w wektorze lentiwirusowym oraz plazmid #87904 kodujący sekwencję SpCas9 w wektorze lentiwirusowym.
  2. Konstrukcja kasety
    UWAGA: Protokół klonowania przedstawiono w skrócie na Rysunku 2.
    1. Przeprowadzić reakcję PCR (A), używając 2 µL plazmidu #87919, 2 µL primer_XmaIF, 2 µL primer_Guide1R, 25 µL mieszaniny polimerazy oraz 19 µL H2O. Zastosować następujący program PCR (program 1): denaturacja wstępna 5 min w 98 °C, następnie 30 cykli: 30 s w 98 °C, 30 s w 60 °C, 1 min 45 s w 72 °C oraz końcowa elongacja 7 min w 72 °C. Tm primerów opisanych w kroku 1.4 wynosi 60 °C.
      UWAGA: Chociaż czas elongacji w programie 1 wydaje się dość długi, wybrano go, aby zapewnić produkcję wystarczającej ilości materiału o odpowiedniej wielkości. Rzeczywiście, ze względu na powtarzające się sekwencje w plazmidzie (sekwencja tracrRNA po RNA guides powtórzona jest trzykrotnie w plazmidzie #87919), amplifikacja PCR oczekiwanego DNA jest trudna, a w kolejnych reakcjach PCR powstają dodatkowe mniejsze prążki. Zatem z powodu konkurencji między różnymi produktami PCR, albo zwiększono czas elongacji (aby faworyzować najdłuższy produkt i uzyskać wystarczającą ilość oczyszczonego materiału na końcu), albo zastosowano touch down PCR (program 2) dla długiego fragmentu (jak opisano dla PCR (final) w kroku 2.2.6).
    2. Rozdzielić produkty PCR na 1% żelu agarozy w buforze Tris-Borate-EDTA (TBE), wyciąć i oczyścić fragment o wielkości 300 bp. Oczyszczanie przeprowadzić przy użyciu dedykowanego zestawu zgodnie z instrukcją producenta, z elucją do końcowej objętości 20 µL. Oczyszczony fragment można wykorzystać bezpośrednio lub przechowywać w -20 °C do kroku 2.2.5.
    3. Przeprowadzić reakcję PCR (B), używając 2 µL plazmidu #87919, 2 µL primer_Guide1F, 2 µL primer_Guide2R, 25 µL mieszaniny polimerazy oraz 19 µL H2O, stosując program PCR 1. Rozdzielić produkty PCR na 1% żelu agarozy w TBE, wyciąć i oczyścić fragment 400 bp w 20 µL buforu do elucji. Oczyszczony fragment można wykorzystać bezpośrednio lub przechowywać w -20 °C do kroku 2.2.5.
    4. Przeprowadzić reakcję PCR (C), używając 2 µL plazmidu #87919, 2 µL primer_Guide2F, 2 µL primer_BlpIR, 25 µL mieszaniny polimerazy oraz 19 µL H2O, stosując program PCR 1. Rozdzielić produkty PCR na 1% żelu agarozy w buforze TBE. Wyciąć i oczyścić fragment 600 bp w 20 µL buforu do elucji. Oczyszczony fragment można wykorzystać bezpośrednio lub przechowywać w -20 °C do kroku 2.2.6.
      UWAGA: Może być widoczny inny fragment o wielkości 900 bp z powodu hybrydyzacji primera z regionami powtórzonymi w plazmidzie, jak opisano w UWAGI do kroku 2.2.1. Jeśli taki prążek występuje, należy go odrzucić.
    5. Przeprowadzić reakcję PCR (D), używając 2 µL eluatu PCR A (z kroku 2.2.2), 2 µL eluatu PCR B (z kroku 2.2.3), 2 µL primer_XmaIF, 2 µL primer_Guide2R, 25 µL mieszaniny polimerazy oraz 19 µL H2O, stosując program PCR 1. Rozdzielić produkty PCR na 1% żelu agarozy w buforze TBE; wyciąć i oczyścić fragment 700 bp w 20 µL buforu do elucji. Oczyszczony fragment można wykorzystać bezpośrednio lub przechowywać w -20 °C do kroku 2.2.6.
      UWAGA: Mogą być widoczne inne prążki przy >1 000 bp, 400 bp i 300 bp z powodu hybrydyzacji primerów z regionami powtórzonymi; należy je odrzucić.
    6. Przeprowadzić reakcję PCR (final), używając 4 µL eluatu PCR C (z kroku 2.2.4), 4 µL eluatu PCR D (z kroku 2.2.5), 4 µL primer_XmaIF, 4 µL primer_BlpIR, 50 µL mieszaniny polimerazy oraz 34 µL H2O. Zastosować następujący program (program PCR 2): denaturacja wstępna przez 5 min w 98 °C; sześć cykli: 30 s w 98 °C, 30 s w 66 °C (obniżenie temperatury hybrydyzacji o 1 °C na cykl), 1 min 45 s w 72 °C; 35 cykli: 30 s w 98 °C, 30 s w 60 °C, 1 min 45 s w 72 °C oraz końcowa elongacja 5 min w 72 °C.
      UWAGA: Program PCR dla tej końcowej amplifikacji to touch down PCR, różniący się od poprzednich ze względu na dużą wielkość końcowego produktu amplifikacji, który zawiera dwie powtórzone sekwencje tracrRNA bezpośrednio po każdym przewodniku.
    7. Rozdzielić produkty PCR na 1% żelu agarozy w buforze TBE; wyciąć i oczyścić końcową kasetę, która migruje na poziomie około 1 300 bp, w 20 µL buforu do elucji. Oznaczyć ilość eluowanego produktu. Oczyszczony fragment można wykorzystać bezpośrednio lub przechowywać w -20 °C do kroku 2.3.2.1. Jest to produkt końcowy, który zostanie wstawiony do plazmidu lentiwirusowego.
      UWAGA: Mogą być widoczne inne fragmenty przy >1000 bp, 400 bp i 300 bp, odpowiadające niepełnym fragmentom PCR, które należy odrzucić.
  3. Wstawienie kasety gRNA do szkieletu plazmidu lentiwirusowego.
    1. Zlinearyzować plazmid poprzez podwójne trawienie plazmidu #87919 enzymami restrykcyjnymi XmaI i BlpI.
      1. Przygotować reakcję z 15 µL zalecanego buforu, 15 µL plazmidu (1 µg/µL), 7,5 µL enzymu BlpI (w stężeniu 10 U/µL), 7,5 µL enzymu XmaI (w stężeniu 10 U/µL) oraz 112,5 µL H2O. Inkubować przez 1 h w 37 °C, a następnie przez 20 min w 65 °C. Nałożyć całą ilość na 1% żel agarozy, wyciąć i oczyścić plazmid o wielkości ~10 kb za pomocą odpowiedniego zestawu. Elucję przeprowadzić w 20 µL buforu, a ilość eluowanego produktu oznaczyć za pomocą pomiaru gęstości optycznej.
        UWAGA: Należy zastosować odpowiedni protokół oczyszczania dużych fragmentów DNA, np. protokół opisany przez Sun i współpracowników9.
    2. Zligować kasetę gRNA i plazmid. Przygotować mieszaninę reakcyjną z kasetą gRNA z kroku 2.2.7 oraz zlinearyzowanym plazmidem z kroku 2.3.1.1, dodać 2 µL enzymu i H2O, aby uzyskać końcową objętość 10 µL. Inkubować przez 15 min w 50 °C, aby otrzymać końcowy plazmid nazwany p_guides.
      UWAGA: Ilość kasety DNA powinna wynosić od 50 do 100 ng, a ilość plazmidu od 100 do 200 ng, przy stosunku molowym 2:1.
  4. Użyć 2 µL świeżo przygotowanego plazmidu do transformacji chemicznie kompetentnych szczepów E. coli, takich jak Stbl3 (50 µL) lub XL10-Gold, i wysiać na płytki agarowe LB z 100 µg/mL ampicyliny po 1 h wzrostu w 37 °C bez antybiotyku. Inkubować w 37 °C przez noc. Wybrać kilka kolonii i przeprowadzić mini prep przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Przeprowadzić amplifikację PCR DNA z mini prepu z użyciem Primer_XmaI oraz Primer_BlpR, stosując program PCR 1 (patrz Rysunek 2). Rozdzielić produkty PCR na 1% żelu agarozy w buforze TBE. Wybrać kilka kolonii (~5) z prążkiem o oczekiwanej wielkości około 1300 bp.
  6. Przeprowadzić sekwencjonowanie DNA wybranych kolonii przy użyciu Primer_XmaI lub Primer_BlpR, aby potwierdzić prawidłowe wstawienie kasety gRNA.
    UWAGA: Jedna z kolonii z potwierdzoną sekwencją jest dalej wykorzystywana w badaniu, a plazmid nazywany jest p_guides.
  7. Powtórzyć od kroku 2.2 (konstrukcja kasety) z Primerami-Killer F i R oraz Primerami-mCherry F i R. Do dalszych analiz wykorzystać jedną kolonię z potwierdzoną sekwencją. Plazmid ten nazywa się p_Killer.

3. Produkcja lentiwirusów

  1. Wyprodukować i oczyścić dużą ilość wszystkich wymaganych plazmidów, używając zestawu do maxi-prepu pozbawionego endotoksyn, zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować alikwoty o stężeniu 2 µg/µL. Przechowywać w temperaturze -20 °C
  2. Przygotowanie komórek (Dzień 1)
    1. Przygotować 18 płytek o powierzchni 145 cm, wysiewając 1 x 106 komórek HEK293 na płytkę w 16 mL pożywki składającej się z pożywki DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) z wysoką zawartością glukozy i pirogronianem, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Namnażać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 3 dni.
      UWAGA: Produkcja lentiwirusów musi być przeprowadzana z zachowaniem ostrożności w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym jednorazowego kombinezonu ochronnego, czepka ochronnego i rękawiczek. Wszystkie eksperymenty muszą być wykonywane pod laminarnym dygestorium (komora bezpieczeństwa BSLII) z użyciem końcówek z filtrem. Wszystkie roztwory zawierające lentiwirusy oraz wszystkie zużyte odpady plastikowe i szklane muszą zostać inaktywowane 70% etanolem lub innym inaktywatorem wirusów.
  3. Transfekcja komórek (Dzień 4)
    1. Sprawdzić konfluencję komórek, aby upewnić się, że osiągnęły one 60%-65% konfluencji.
    2. Przygotować roztwór do transfekcji zawierający dla każdej płytki: 20.8 µg plazmidu docelowego (p-guides, p-Killer lub pCas9 #87904), 4.8 µg plazmidu kodującego otoczkę (VSV-G, #8454), 20.8 µg plazmidu psPAX2 (#12260) do pakowania lentiwirusów, 136 µL fosforanu wapnia i uzupełnić H2O do końcowej objętości 1,000 µL. Roztwór ten dodawać kroplami przy mieszaniu do 1 mL 2x soli w buforze HEPES (HBS).
      UWAGA: Nie przygotowywać mieszaniny dla wszystkich płytek jednocześnie, aby zapewnić optymalne przygotowanie reagentów; przygotowywać mieszaninę dla sześciu płytek naraz, np. dla 18 płytek przygotować trzy razy mieszaninę dla sześciu płytek.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 10 min, a następnie dodawać 2 mL roztworu kroplami do komórek. Homogenizować reagent do transfekcji poprzez delikatne potrząsanie płytką w przód, w tył, w górę i w dół; inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 5 h.
      UWAGA: Od tego momentu aż do zakończenia produkcji lentiwirusów należy nosić dodatkowe środki ochrony, w tym drugą parę rękawiczek, ochraniacze na przedramiona oraz jednorazowy fartuch ochronny.
    4. Pięć godzin po transfekcji usunąć pożywkę z płytek i przepłukać PBS, aby pozbyć się reagentów do transfekcji. Dodać 12 mL świeżej pożywki i inkubować przez 48 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  4. Zbiór cząstek wirusowych (Dzień 6)
    1. Zebrać i połączyć pożywkę ze wszystkich płytek. Wirować przy 800 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby osadzić szczątki komórkowe. Przefiltrować nadsącz za pomocą filtra 0.45 µm (może być wymagane użycie kilku filtrów).
    2. Wirować przy 68,300 x g przez 2 h w temperaturze 4 °C w rotorze z koszyczkami odchylanymi. Usunąć nadsącz i pozostawić probówki odwrócone dnem do góry pod dygestorium na papierze przez 5-10 min, aby usunąć jak najwięcej cieczy, a następnie dodać 100 µL pożywki do proliferacji HEK na każdy osad. Po co najmniej 2 h w temperaturze 4 °C resuspendować osady poprzez pipetowanie w górę i w dół. Połączyć wszystkie resuspendowane osady.
      UWAGA: Osady można pozostawić w pożywce przez noc w temperaturze 4 °C przed rozdzieleniem na alikwoty.
    3. Rozdzielić lentiwirusy na alikwoty o objętości 10 µL lub 25 µL (w zależności od przeznaczenia) i zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Nie zamrażać ponownie alikwotu, który został rozmrożony.
  5. Powtórzyć kroki od 3.2 do 3.4 z innymi plazmidami docelowymi w celu wyprodukowania LV-guides, LV-Killer i LV-Cas9.
    ​UWAGA: Alternatywnie lentiwirusy można zakupić w firmie zewnętrznej lub w ośrodku wirusologicznym.

4. Miareczkowanie lentiwirusa

UWAGA: Miareczkowanie wirusa przeprowadza się na komórkach HEK293. Miareczkowanie jest istotne, aby w kolejnych krokach wprowadzić precyzyjną liczbę lentiwirusów na komórkę (niezależnie od partii lentiwirusa) dla badanych komórek. Liczba cząsteczek wirusa, które efektywnie transdukują komórkę, nazywana jest wielokrotnością infekcji (MOI): MOI 10 odpowiada zatem wprowadzeniu 10 cząsteczek wirusa na komórkę. Ponieważ cykl zamrażania i rozmrażania wpływa na żywotność lentiwirusa, miareczkowanie przeprowadza się z wykorzystaniem zamrożonej porcji lentiwirusa, a każdy kolejny eksperyment wykonuje się z nową porcją z tej samej puli. Tutaj opisano jedną metodę miareczkowania, jednak można stosować również inne metody.

  1. W dniu 1. wysiać 1 x 105 komórek na płytkę w pięciu płytkach 35 mm z szklanymi szkiełkami nakrywkowymi na dnie oraz w dwóch płytkach 35 mm bez szkiełek nakrywkowych.
  2. W dniu 2. z dwóch płytek bez szkiełek nakrywkowych zebrać i policzyć komórki po trypsynizacji, a następnie wyznaczyć średnią liczbę komórek na płytkę (N).
  3. Przygotować 100 µL lentiwirusa rozcieńczonego 1/10 w pożywce do proliferacji. Przetransdukować pięć hodowlanych płytek różnymi objętościami rozcieńczonego wirusa, od 1 do 50 µL rozcieńczonego wirusa. W tym protokole do transdukcji pięciu płytek należy użyć następujących objętości: 1 µL, 5 µL, 10 µL, 20 µL, 50 µL. Inkubować przez 48 h w 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  4. W dniu 4. utrwalić komórki poprzez inkubację szkiełek nakrywkowych w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 do 30 min w 4% paraformaldehydzie. Dla LV-Cas9 przeprowadzić permeabilizację komórek przy użyciu 0,1% Triton X100 w buforze fosforanowym z solą (PBS) przez 10 min w RT, nasycić w PBS-0,1% Triton X100-2% surowicy koziej-0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 20 min w RT, a następnie znakować przez 45 min w RT przeciwciałem pierwszorzędowym anty-V5 (rozcieńczenie 1/400), po czym inkubować przez 30 min w RT z fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym. Jądra komórkowe znakować barwnikiem Hoescht (10 µg/mL w PBS) przez 10 min w RT.
  5. Zamontować szkiełka nakrywkowe na preparacie i obserwować przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20x. W przypadku LV-guides i LV-Killer, po utrwaleniu przejść bezpośrednio do znakowania jąder i zamontować szkiełka nakrywkowe. Dla każdego szkiełka nakrywkiego policzyć całkowitą liczbę jąder (całkowitą liczbę komórek) w polu widzenia oraz liczbę komórek znakowanych (V5 lub mCherry) i wyznaczyć stosunek komórek znakowanych dla każdego szkiełka.
  6. Wybrać szkiełko nakrywkowe, w którym stosunek komórek przetransdukowanych wynosi co najmniej 10% i nie przekracza 50%. Wyznaczyć wydajność transdukcji (X) dla tego szkiełka i odnotować objętość rozcieńczonego wirusa (V, w µL) użytą do uzyskania tej wydajności transdukcji.
    Wzór na stosunek transdukcji X=Komórki przetransdukowane/Wszystkie komórki; równanie w notacji matematycznej.
  7. Wyznaczyć miano wirusa (w cząstkach infekcyjnych, reprezentowanych jako ip/mL) zgodnie z następującym wzorem:
    Wzór na obliczenie miana, Miano = X.N. Współczynnik rozcieńczenia × 1000/V, stosowany do analizy stężenia roztworu.
    Współczynnik rozcieńczenia to rozcieńczenie lentiwirusa wykonane w kroku 4.3. Rutynowo uzyskiwano końcowe miano 1 x 109 ip/mL dla LV-Cas9 oraz 1 x 1010 ip/mL dla LV-guide, wyznaczone w komórkach HEK.

5. Transdukcja mioblastów

UWAGA: Unieśmiertelnione mioblasty są sukcesywnie transdukowane trzema wcześniej przygotowanymi lentiwirusami. Są one utrzymywane przy gęstości poniżej 50% w pożywce proliferacyjnej składającej się z Ham's F10 uzupełnionej o 20% FBS, 2% penicyliny/streptomycyny oraz 2% Ultroser G i hodowane w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.

  1. Oblicz objętość lentiwirusa niezbędną do zakażenia wybranej liczby komórek przy MOI 10 dla LV-Cas9 i LV-guides oraz MOI 20 dla LV-killer, zgodnie z poniższym wzorem:
    Wzór na ilość wirusa, Objętość=MOI×(liczba komórek/Miano), równanie dla eksperymentów z wirusami.
    UWAGA: W równoległym eksperymencie porównano wydajność transdukcji w mioblastach i komórkach HEK, używając kontrolnego lentiwirusa (lenti-GFP), i ustalono, że do efektywnej transdukcji mioblastu potrzeba pięciokrotnie więcej lentiwirusów niż w przypadku komórki HEK. Zatem MOI 10 zmierzone na HEK odpowiada dwóm cząstkom wirusa na mioblast. Tutaj użyte MOI są obliczone dla komórek HEK.
  2. W 1. dniu wysiej na płytki 96-dołkowe 10 000 komórek w 100 µL medium proliferacyjnego na dołek. W 2. dniu przeprowadź transdukcję komórek w komorze z laminarnym przepływem powietrza, dodając odpowiednią objętość LV-guides i LV-Cas9 obliczoną w kroku 5.1. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora aż do 7. dnia.
    UWAGA: Zastosowanie MOI wyższego niż 25, szczególnie dla LV-Cas9, może nie zwiększyć liczby zmodyfikowanych komórek ze względu na wyższą śmiertelność komórek przy wysokim stężeniu lentiwirusa.
  3. W 7. dniu przeprowadź trypsynizację i policz komórki. Wysiej komórki w nowej płytce przy konfluencji od 40% do 50% i przenieś je z powrotem do inkubatora. Pięć godzin później przeprowadź transdukcję komórek LV-Killer przy MOI 20 (objętość obliczona w kroku 5.1). Namnażaj komórki od 5 do 10 dni po transfekcji, przez co najmniej dwa pasażowanie, utrzymując je zawsze przy niskiej konfluencji <50%. Komórki są gotowe do następnego kroku, klonowania komórkowego, gdy ich wzrost powróci do normy (oceniany na podstawie czasu podziału).
    ​UWAGA: Proliferacja może być nieco wolniejsza po transdukcji. Normalny wzrost komórek można ustalić przed tą procedurą eksperymentalną poprzez oszacowanie czasu podziału komórek.

6. Klonowanie komórkowe

UWAGA: Ponieważ transdukcja mioblastów jest trudna i nigdy nie osiąga 100% wydajności, nawet przy użyciu lentiwirusa, w celu uzyskania w pełni skorygowanej linii komórkowej konieczne jest klonowanie komórkowe. Jest to możliwe jedynie w przypadku komórek unieśmiertelnionych lub komórek, które można hodować i namnażać przez kilka tygodni/miesięcy.

  1. Przeprowadzić trypsynizację i policzyć komórki. Rozcieńczyć komórki w pożywce do proliferacji do stężenia 10 cells/mL i wysiać je w zagęszczeniu 1 cell/well na płytki 96-dołkowe zawierające 100 µL/well pożywki.
    UWAGA: Liczba wysiewanych płytek zależy od prawdopodobieństwa oczekiwanej edycji genów; rutynowo stosuje się od 2 do 10 płytek.
  2. Monitorować wzrost komórek i sukcesywnie przenosić zawartość każdego dołka na większe płytki, aż do osiągnięcia płytki o średnicy co najmniej 35 mm, utrzymując stopień konfluencji mioblastów poniżej 50%. Ten etap może trwać od 2 do 6 tygodni, w zależności od rodzaju użytych komórek oraz ich zdolności do wzrostu po izolacji w dołku.

7. Wybór klonów

UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu zidentyfikowania, które z rosnących klonów zostały odpowiednio zmodyfikowane.

  1. Zaprojektuj zestaw starterów składający się ze startera zlokalizowanego przed pierwszym przewodnikiem (Primer_BeforeGuide1F) oraz drugiego startera zlokalizowanego po drugim przewodniku (Primer_AfterGuide2R), aby przeprowadzić amplifikację regionu obejmującego domniemaną zmodyfikowaną sekwencję. Startery wykorzystane w niniejszym protokole przedstawiono w Tabeli 1.
  2. Zabierz komórki z każdego klonu, odkładając co najmniej 300 000 komórek do przyszłej amplifikacji, a z pozostałych komórek wyizoluj DNA genomowe zgodnie z dowolnym standardowym protokołem.
    1. W przypadku hodowli dużej liczby klonów, aby odrzucić te niezmodyfikowane, przeprowadź szybki test, łącząc komórki z pięciu klonów w jednej probówce, wyizoluj DNA z tej puli i poddaj analizie PCR. Powtórz czynność dla tak wielu klonów, jak to konieczne. Następnie oddziel pule, które zawierały zmodyfikowane komórki, w celu przeprowadzenia analizy indywidualnej.
  3. Weryfikację edycji za pomocą PCR przeprowadź w następujący sposób. Przygotuj reakcję PCR z 1 µL Primer_BeforeGuide1F, 1 µL Primer_AfterGuide2R, 12,5 µL mieszanki polimerazy, 3 µL DNA genomowego oraz 7,5 µL H2O. Amplifikację przeprowadź w termocyklerze zgodnie z instrukcjami producenta i parametrami starterów. Produkty rozdziel w 1% żelu agarozowym, aby zidentyfikować zmodyfikowane klony.
  4. Weryfikację edycji za pomocą sekwencjonowania przeprowadź w następujący sposób. Wykonaj sekwencjonowanie metodą Sangera dla wybranych klonów, aby potwierdzić delecję i zidentyfikować sposób przeprowadzenia edycji w każdym klonie. Zachowaj więcej niż jeden zmodyfikowany klon, aby upewnić się, że zmodyfikowano wyłącznie docelowy gen i to on odpowiada za obserwowany efekt fizjologiczny, oraz zachowaj klon niezmodyfikowany, który będzie służył jako klon kontrolny (CTRL) w kolejnych eksperymentach.
  5. Namnoż wybrane klony. Gdy konfluencja każdego klonu osiągnie około 50%, ztrypsynizuj komórki i wysiej je na większe naczynie, aż do momentu uzyskania wystarczającej liczby komórek do przeprowadzenia charakterystyki biochemicznej i funkcjonalnej (zazwyczaj więcej niż 1 x 106 na klon), a mrożone alikwoty każdego klonu przechowuj do dalszego wykorzystania.

8. Charakterystyka edytowanych klonów

UWAGA: Po wybraniu kilku klonów i potwierdzeniu ich sekwencjonowaniem DNA, delecję docelowego genu można potwierdzić na poziomie białka za pomocą techniki Western blot, a na poziomie funkcjonalnym, jeśli dla danego genu dostępny jest funkcjonalny test komórkowy. W przypadku RYR1-KO, ponieważ RyR1 jest kanałem wapniowym, charakterystyka funkcjonalna została przeprowadzona przy użyciu obrazowania wapnia w hodowlach komórkowych.

  1. Ekspresja białka w edytowanych klonach
    UWAGA: RyR1 jest ekspresjonowany tylko w zróżnicowanych miotubach10. Jego ekspresję oceniono w miotubach za pomocą metody Western blot, aby potwierdzić delecję RyR1 na poziomie białka, a także delecję białka Cas9.
    1. Wysiać 200 000 komórek w pożywce do proliferacji (opisanej powyżej w kroku 5) na powierzchni około 1,76 cm2 w płytce 35 mm powlekanej lamininą (powierzchnia odpowiadająca kropli 200 µL lamininy w stężeniu 10 mg/mL w PBS z wapniem). Po przytwierdzeniu się komórek do płytki po inkubacji przez 2-3 h w 37 °C, 5% CO2, zmienić pożywkę hodowlaną na pożywkę do różnicowania składającą się z DMEM z niską zawartością glukozy + 10% surowicy konia + 1% penicyliny/streptomycyny i pozostawić komórki w inkubatorze na 6 dni.
    2. Po 6 dniach różnicowania zebrać i lizować komórki w 200 µL buforu RIPA uzupełnionego o inhibitory proteaz. Oznaczyć stężenie białka metodą Folina-Lowry11.
    3. Nanieść 15 µg białka, po denaturacji przez 30 min w temperaturze pokojowej w buforze denaturującym Laemmliego, na żel akrylamidowy z gradientem 5%-15%. Po rozdziału elektroforetycznym przenieść białka na membranę Immobilon P przy 0,8 V przez 4 h11.
    4. Po nasyceniu membrany przez 30 min w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 0,1% Tween 20 i 5% odtłuszczonego mleka w proszku, inkubować membranę z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w tym samym buforze przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C, wypłukać membranę 5x przez 5 min w PBS-0,1% Tween 20 i inkubować membranę z przeciwciałami wtórnymi przez 1 h w temperaturze pokojowej. Wykorzystane przeciwciała pierwszorzędowe to: przeciwciała przeciwko znacznikowi V5 (rozcieńczenie: 1/5000) do detekcji Cas9, anty-GAPDH (rozcieńczenie: 1/1000) jako kontrola załadunku, przeciwciało anty-RyR112,13 (rozcieńczenie: 1/10 000), przeciwciało przeciwko podjednostce alfa 1 DHPR (rozcieńczenie: 1/1000) oraz przeciwciało przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny MF20 (rozcieńczenie: 1/1000).
    5. Wypłukać membranę 5x przez 5 min w PBS-0,1% Tween 20, osuszyć nadmiar cieczy i dodać substrat chemiluminescencyjny. Postępować zgodnie z zaleceniami dostawcy substratu w celu detekcji sygnału chemiluminescencyjnego.
  2. Charakterystyka funkcjonalna edytowanych klonów
    UWAGA: Funkcję RyR1 oceniono za pomocą obrazowania wapnia w zróżnicowanych miotubach, uzyskanych z klonów CTRL lub KO14.
    1. Wysiać 50 000 komórek na powierzchni 0,2 cm2 w centrum szalek 35 mm powlekanych lamininą (powierzchnia pokryta kroplą 50 µL lamininy w stężeniu 10 mg/mL w PBS z wapniem) i indukowć różnicowanie przez 6 dni, zgodnie z opisem w kroku 8.1.1. Przygotować trzy płytki dla każdej stymulacji, aby uzyskać powtórzenia biologiczne w trzech kopiach.
    2. Obciążyć miotuby 50 µL fluo 4-direct, rozcieńczonego 1:1 w pożywce do różnicowania i inkubowanego przez 30 min w 37 °C. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem KREBS uzupełnionym o glukozę w stężeniu 1 mg/mL.
    3. Pomiar zmian fluorescencji przeprowadzić za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego z użyciem obiektywu 10x. Umieścić płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocząć akwizycję z częstotliwością 1 klatka na sekundę przez 90 s.
    4. Usunąć pozostały bufor KREBS i stymulować komórki w klatce 25 poprzez dodanie 2 mL KCl w celu depolaryzacji błony (stężenie końcowe 140 mM) lub 2 mL 4 CmC (stężenie końcowe 500 µM) w celu bezpośredniej stymulacji RyR1. Upewnić się, że w rejestrowanym polu znajduje się co najmniej 10 miotub.
    5. Ilościowo określić zmianę fluorescencji w każdej miotubie przy użyciu dedykowanego oprogramowania. Wybrać do analizy co najmniej 10 miotub na szalkę (idealnie 20-30 miotub na szalkę), wyznaczyć linię (lub obszar zainteresowania (ROI)) wzdłuż długiej osi każdej miotuby i zebrać wartości fluorescencji F wzdłuż tej linii dla wszystkich klatek.
    6. Wyznaczyć początkową wartość fluorescencji, F0, odpowiadającą klatkom od 1 do 24. Wykreślić zmianę fluorescencji (F-F0)/F0 jako funkcję czasu od 0 do 90 s. Powtórzyć eksperyment trzy razy, aby uzyskać zmianę fluorescencji z co najmniej 90 miotub z trzech różnych kultur. Połączyć wszystkie wyniki dla 90 miotub i obliczyć średnią ± SEM z (F-F0)/F0 dla każdego przedziału czasowego. Ilościowo określić amplitudę szczytu uwalniania wapnia dla każdej stymulacji i każdego klonu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół ten zastosowano w przypadku unieruchomionych mioblastów od zdrowego dawcy15 (tzw. komórki HM, od ang. human myoblasts), w których wcześniej scharakteryzowano RyR116, w celu wywołania nokautu genu RYR1 kodującego białko RyR1. Projekt gRNA został opracowany tak, aby usunąć sekwencję obejmującą część eksonu 101 oraz intronu 101 tego genu. Przewiduje się, że delecja części eksonu 101 doprowadzi do przesunięcia ramki odczytu. Ponadto ekson 101 koduje por białka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ważnym krokiem na drodze do scharakteryzowania genów o nieznanej funkcji zaangażowanych w patologie jest opracowanie odpowiednich modeli komórkowych do badania funkcji tych genów. Wykorzystanie edycji genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest wykładniczo rozwijającą się dziedziną badań, a rozwój modeli knock-out, jak przedstawiono tutaj, jest jednym z najczęściej stosowanych zastosowań. W tym kontekście proponujemy tutaj wszechstronny protokół rozwoju ludzkiej linii komórkowej w dowolnym genie będącym przedmiotem zainteresowania,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantów Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) oraz Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-CACNA1SSigma-AldrichHPA048892Przeciwciało pierwotne
Blp INE BioLabsR0585SEnzym restrykcyjny
CalPhos Zestaw do transfekcji ssakówTakara631312 Zestaw do transfekcji
Easy blot anty Mysia IgGGeneTexGTX221667-01HRP Przeciwciało wtórne
Easy blot anty IgG królikaGeneTexGTX221666Przeciwciało drugorzędowe HRP
Fluo-4 bezpośredniesondy molekularneF10472Obrazowanie wapnia
GAPDH(14C10) Królik mAb Technologia sygnalizacji komórkowej#2118Przeciwciało pierwotne
HindIIIFermentasER0501Enzym restrykcyjny
InFusion HD Precision PlusTakara638920Zestaw do ligacji
MasterMix Phusion High Fidelity z GCThermoFisher ScientificF532LMix do reakcji PCR z polimerazą Taq o wysokiej wierności i przeciwciałem dNTP
przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozynyDHSBMF20Przeciwciało pierwotne
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-NagelREF  740424Zestaw Maxipreparation do oczyszczania plazmidów
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609oczyszczanie DNA
NucleoSpin TissueMacherey-Nagel740952Kit do ekstrakcji DNA z komórki
One Shot Stbl3 Kompetentny chemicznie E. coliThermoFisher ScientificC737303Chemicznie kompetentne komórki
Plazmid #87904Addgene87904Plazmid lentiwirusowy kodujący SpCas9 (dla LV-Cas9)
Plazmid #87919Addgene87919Szkielet lentiwirusowy do wprowadzenia kasety z prowadnicami (dla celu LV)
Plazmid #12260Addgene12260Plazmid lentiwirusowy kodujący opakowanie lentiwirusowe Plazmid GAG POL
#8454Addgene8454Białko otoczki kodujące plazmid lentiwirusowy do wytwarzania cząstek retrowirusowych lentiwirusowych i MuLV
V5 Tag Przeciwciało monoklonalneInvitrogeneR96025 Przeciwciało pierwszorzędowe
XL10-Gold Ultracompetent CellsAgilent200317Chemicznie kompetentne komórki
Xma INE BioLabsR0180SEnzym restrykcyjny

Bibliografia

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473(2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34(2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103(2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja CRISPR Cas9linie kom rkowe z nokautem genutransdukcja lentiwirusowaedycja kom rek mi niowychprojektowanie gRNAklonowanie plazmidowetransdukcja mioblast wobrazowanie wapniaWestern blotcharakterystyka funkcjonalna
Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.