Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

Podsumowanie

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Streszczenie

Jednym z ważnych zastosowań CRISPR/Cas 9 jest rozwój linii komórkowych knock-out, specjalnie do badania funkcji nowych genów/białek związanych z chorobą, zidentyfikowanych podczas diagnozy genetycznej. Aby opracować takie linie komórkowe, należy rozwiązać dwie główne kwestie: wprowadzenie narzędzi CRISPR (Cas9 i przewodnika RNA) z wysoką wydajnością do wybranych komórek oraz ograniczenie aktywności Cas9 do specyficznej delecji wybranego genu. Opisany tutaj protokół jest poświęcony wprowadzaniu narzędzi CRISPR do trudnych do transfekcji komórek, takich jak komórki mięśniowe. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu lentiwirusów, wytwarzanych z publicznie dostępnych plazmidów, dla których wszystkie etapy klonowania są opisane tak, aby były ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania. Kontrola aktywności Cas9 została przeprowadzona za pomocą adaptacji wcześniej opisanego systemu o nazwie KamiCas9, w którym transdukcja komórek lentiwirusem kodującym przewodnikowe RNA ukierunkowane na Cas9 pozwala na stopniowe zniesienie ekspresji Cas9. Protokół ten został zastosowany do opracowania linii ludzkich komórek mięśniowych z nokautem RYR1, która została dodatkowo scharakteryzowana na poziomie białkowym i funkcjonalnym, aby potwierdzić nokaut tego ważnego kanału wapniowego zaangażowanego w wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia w mięśniach oraz w sprzężeniu wzbudzenie-skurcz. Opisana tutaj procedura może być łatwo zastosowana do innych genów w komórkach mięśniowych lub w innych trudnych do transfekcji komórkach i dostarczyć cennych narzędzi do badania tych genów w komórkach ludzkich.

Wprowadzenie

Wraz z postępem sekwencjonowania genów i identyfikacją mutacji w genach o nieznanych funkcjach w określonej tkance, rozwój odpowiednich modeli komórkowych do zrozumienia funkcji nowego genu docelowego i potwierdzenia jego udziału w powiązanych mechanizmach patofizjologicznych stanowi niezbędne narzędzie. Ponadto modele te mają ogromne znaczenie dla przyszłego rozwoju terapeutycznego^1,2 i stanowią interesującą alternatywę dla rozwoju modeli zwierzęcych knock-out zgodnie z międzynarodowymi zaleceniami dotyczącymi ograniczenia wykorzystywania zwierząt w eksperymentach. Edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest jednym z najpotężniejszych obecnie dostępnych narzędzi, które pozwoliły na opracowanie wielu modeli knock-out/knock-in, a ukierunkowana walidacja genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest jedną z najczęściej używanych aplikacji CRISPR/Cas9³. Sukces edycji genów zależy od możliwości wprowadzenia narzędzi CRISPR (przewodnika RNA i nukleazy Cas9) do docelowego modelu komórki, co może być wyzwaniem w wielu trudnych do transfekcji komórkach, takich jak komórki mięśniowe⁴. Wyzwanie to można przezwyciężyć za pomocą wirusa, zwykle lentiwirusa, który ma tę wielką zaletę, że skutecznie transdukuje wiele typów komórek i dostarcza ich transgen. Ale jego główną wadą jest integracja transgenu z genomem komórki gospodarza, prowadząca do potencjalnej zmiany genów zlokalizowanych w miejscu integracji i do trwałej ekspresji transgenu, co w przypadku nukleazy Cas9 skutkowałoby szkodliwymi konsekwencjami⁵. Merienne i współpracownicy zaproponowali inteligentne rozwiązanie⁶, które polega na wprowadzeniu do komórek przewodnika RNA ukierunkowanego na sam gen Cas9, co prowadzi do inaktywacji Cas9. Adaptacja tej strategii jest tutaj przedstawiona jako przyjazny dla użytkownika i wszechstronny protokół pozwalający na wyeliminowanie praktycznie każdego genu w trudnych do transfekcji komórkach.

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest wywołanie inaktywacji interesującego genu w unieśmiertelnionych komórkach mięśniowych. Może być używany do wybijania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania, w różnych typach unieśmiertelnionych komórek. Opisany tutaj protokół zawiera kroki mające na celu zaprojektowanie przewodnikowych RNA i ich klonowanie do plazmidów lentiwirusowych, wytworzenie narzędzi CRISPR w wektorach lentiwirusowych, transdukcję komórek za pomocą różnych lentiwirusów oraz klonowanie komórek w celu wytworzenia jednorodnej edytowanej linii komórkowej.

Korzystając z tego protokołu, unieśmiertelnione ludzkie komórki mięśni szkieletowych zostały opracowane z delecją receptora ryanodine typu 1 (RyR1), niezbędnego kanału wapniowego biorącego udział w wewnątrzkomórkowym uwalnianiu wapnia i skurczu mięśni⁷. Nokaut (KO) genu został potwierdzony na poziomie białka za pomocą Western blot oraz na poziomie funkcjonalnym za pomocą obrazowania wapnia.

Protokół

Biopsje mięśni zostały wykonane z Bank of Ttissue for Research (Myobank, partner w sieci UE EuroBioBank, Paryż, Francja) zgodnie z europejskimi zaleceniami i francuskim ustawodawstwem. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich osób. Unieśmiertelnione mioblasty zostały opracowane dzięki uprzejmości dr V. Mouly (Instytut Miologii, Paryż, Francja), a protokoły zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Instytutu Myologii (MESRI, n AC-2019-3502).

1. Projekt przewodnika CRISPR

1. Zidentyfikuj region genu, który ma zostać usunięty. Wyszukaj jego sekwencję genomową za pomocą narzędzi przeglądarki genomu, takich jak ensembl.org lub genome.ucsc.edu, i określ współrzędne chromosomowe dwóch regionów, aby wyszukać przewodnik RNA (gRNA) po obu stronach regionu, który ma zostać usunięty.
   1. Dla zastosowanego tutaj genu należy uzyskać sekwencję FASTA genu RYR1 i sekwencję eksonu 101 w następujący sposób. W ensembl wyszukaj RYR1 w najnowszej wersji ludzkiego genomu, wybierz pierwszy wpis i kliknij transkrypcję sekwencji kodującej białko. Następnie kliknij Eksony, aby przekierować do listy eksonów genu.
   2. Kliknij Pobierz sekwencję i wybierz opcję Tylko sekwencja genomowa, aby pobrać pełną sekwencję konsensusu całego genu. Przewiń w dół listę eksonów i intronów genu i wybierz docelowe.
   3. Znajdź odpowiednią sekwencję nukleotydów w genie. Wybierz sekwencje nukleotydowe intronów znajdujących się bezpośrednio przed i za eksonem, który ma zostać usunięty, które zostaną wykorzystane do poszukiwania gRNA.
2. Zaprojektuj dwa gRNA, zwane tutaj przewodnikiem 1 i przewodnikiem 2, w regionach zidentyfikowanych w kroku 1.1 (introny przed i za regionem, który ma zostać usunięty) za pomocą narzędzi online, takich jak Crispor.tefor.net⁸. Wybierz dwa gRNA oddzielone kilkuset parami zasad (bp), przy czym sekwencja każdego gRNA ma dokładnie 20 nukleotydów bez motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM). Wybierz najlepsze dostępne prowadnice, aby ograniczyć niecelne odchylenia. Zobacz Rysunek 1 dla przykładu projektu przewodnika.
   1. Oczekuje się, że sekwencja między dwoma przewodnikami zostanie usunięta i spowoduje wybicie genu będącego przedmiotem zainteresowania, dlatego wybierz pozycję dwóch przewodników tak, aby usunęła istotną sekwencję lub niezbędny ekson w genie będącym przedmiotem zainteresowania. Upewnij się, że usunięta sekwencja/ekson nie jest obecna wyłącznie w alternatywnym transkryptacie genu i/lub że koduje ważną część białka, a zatem jej delecja spowoduje funkcjonalny nokaut.
      UWAGA: Chociaż przewiduje się, że miejsce rozszczepienia Cas9 wystąpi 3 pz przed motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM), rozszczepienie w większej odległości może również wystąpić, dlatego dobrym rozwiązaniem jest nie poleganie na dokładnej lokalizacji miejsca rozszczepienia, takiej jak rozszczepienie w intronie.
3. Określ sekwencję odwrotnego dopełniacza (RC) dla każdego gRNA, bez PAM, aby uzyskać następujące sekwencje: Przewodnik 1 i Przewodnik 1-RC, Przewodnik 2 i Przewodnik 2-RC.
4. Zamów startery przedstawione w Tabeli 1 w celu przeprowadzenia klonowania plazmidów. W całym protokole należy stosować startery o stężeniu 10 nM w sterylnym_H2O.
   UWAGA: Sekwencje dodane do gRNA w tych starterach (pogrubione i podkreślone) odpowiadają sekwencji plazmidu odpowiednio przed i po przewodniku, promotorze i trans-aktywującym Crispr RNA (tracrRNA) i nie powinny być modyfikowane w celu zapewnienia dobrego nakładania się starterów i plazmidu.

2. Klonowanie plazmidu

UWAGA: W tym kroku, gRNA zostaną wstawione do szkieletu plazmidu w celu produkcji lentiwirusa. Kaseta kodująca dwa gRNA jest najpierw wytwarzana w kolejnych reakcjach łańcuchowych polimerazy (PCR), przy użyciu nakładających się starterów. Nowa kaseta jest następnie wprowadzana do plazmidu szkieletu lentiwirusowego #87919.

1. Uzyskaj następujące plazmidy: plazmid #87919, kodujący RNA przewodnika CRISPR w wektorze lentiwirusowym i plazmid #87904 kodujący sekwencję SpCas9 w wektorze lentiwirusowym.
2. Konstrukcja kasety
   UWAGA: Protokół klonowania jest podsumowany w Rysunek 2.
   1. Uruchom reakcję PCR (A) z 2 μL plazmidu #87919, 2 μL primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide1R, 25 μL mieszaniny polimerazy i 19 μL_H2O. Uruchom następujący program PCR (program 1): początkowa denaturacja 5 min w temperaturze 98 °C, a następnie 30 cykli: 30 s w 98 °C, 30 s w 60 °C, 1 min 45 s w 72 °C i końcowe wydłużenie 7 min w 72 °C. Tm starterów opisanych w kroku 1.4 wynosi 60 °C.
      UWAGA: Chociaż czas wydłużenia w programie 1 wydaje się dość długi, ten czas wydłużenia został wybrany, aby zapewnić produkcję wystarczającej ilości materiału o odpowiednim rozmiarze. Rzeczywiście, ze względu na powtarzające się sekwencje w plazmidzie (sekwencja tracrRNA po przewodnikach RNA jest powtarzana trzykrotnie w plazmidzie #87919) amplifikacja PCR oczekiwanego DNA jest trudna, a w kolejnych PCR wytwarzane są dodatkowe mniejsze prążki. W związku z tym, ze względu na konkurencję między różnymi produktami PCR, albo wydłużono czas wydłużenia (aby faworyzować najdłuższy z nich i mieć wystarczającą ilość oczyszczonego materiału na końcu), albo zastosowano PCR z przyłożeniem (program 2) dla długiego fragmentu (tak jak opisano dla PCR (ostatecznej) w kroku 2.2.6).
   2. Oddzielić produkty PCR od 1% żelu agarozowego w buforze Tris-Boran-EDTA (TBE), wyciąć i oczyścić fragment o stężeniu 300 pz. Przeprowadzić oczyszczanie za pomocą dedykowanego zestawu zgodnie z instrukcją producenta, z elucją, w końcowej objętości 20 μl. Oczyszczony fragment należy użyć bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C dla kroku 2.2.5.
   3. Przeprowadź reakcję PCR (B) z 2 μL plazmidu #87919, 2 μL primer_Guide1F, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL mieszaniny polimerazy i 19 μL_H2Oprzy użyciu programu PCR 1. Oddzielić produkty PCR od 1% żelu agarozowego w TBE, wyciąć i oczyścić fragment o objętości 400 pz w 20 μl buforu elucyjnego. Oczyszczony fragment należy użyć bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C dla punktu 2.2.5.
   4. Uruchom reakcję PCR (C) z 2 μL plazmidu #87919, 2 μL primer_Guide2F, 2 μL primer_BlpIR, 25 μL mieszaniny polimerazy i 19 μL_H2Oza pomocą programu PCR 1. Oddzielić produkty PCR od 1% żelu agarozowego w buforze TBE. Fragment o gęstości 600 pz należy wyciąć i oczyścić w 20 μl buforu elucyjnego. Oczyszczony fragment należy użyć bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C dla etapu 2.2.6.
      UWAGA: Inny fragment przy 900 pz może być widoczny, ze względu na hybrydyzację startera na powtarzających się obszarach plazmidu, jak opisano w UWAGA kroku 2.2.1. Jeśli jest obecny, ten pasek należy wyrzucić.
   5. Przeprowadzić reakcję PCR (D) z 2 μl elucji PCR A (z kroku 2.2.2), 2 μl elucji PCR B (z kroku 2.2.3), 2 μl primer_XmaIF, 2 μl primer_Guide2R, 25 μl mieszaniny polimerazy i 19 μl_H2O, z programem PCR 1. Oddzielić produkty PCR od 1% żelu agarozowego w buforze TBE; wyciąć i oczyścić fragment o objętości 700 pz w 20 μl buforu elucyjnego. Oczyszczony fragment należy użyć bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C dla etapu 2.2.6.
      UWAGA: Inne pasma mogą być widoczne przy >1,000 pz, 400 pz i 300 pz, ze względu na hybrydyzację starterów w powtarzających się regionach i należy je odrzucić.
   6. Przeprowadzić reakcję PCR (końcową) z 4 μl elucji PCR C (z kroku 2.2.4), 4 μl elucji PCR D (z kroku 2.2.5), 4 μl primer_XmaIF, 4 μl primer_BlpIR, 50 μl mieszaniny polimerazy i 34 μl_H2O. Stosowany program jest następujący (program PCR 2): wstępna denaturacja przez 5 minut w temperaturze 98 °C; sześć cykli trwanie: 30 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 66 °C (obniżenie temperatury hybrydyzacji o 1 °C na cykl), 1 min 45 w temperaturze 72 °C; 35 cykli: 30 s w 98 °C, 30 s w 60 °C, 1 min 45 w 72 °C i końcowe wydłużenie 5 min w 72 °C.
      UWAGA: Program PCR dla tej końcowej amplifikacji to PCR z przyłożeniem, różniący się od poprzedniego, ze względu na duży rozmiar końcowej amplifikacji, która zawiera dwie powtarzające się sekwencje tracrRNA tuż po każdym przewodniku.
   7. Oddzielić produkty PCR od 1% żelu agarozowego w buforze TBE; wyciąć i oczyścić kasetę końcową, która migruje w tempie około 1300 pz w 20 μl buforu elucyjnego. Określić ilościowo wymyty produkt. Oczyszczony fragment należy użyć bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C dla etapu 2.3.2.1. Jest to produkt końcowy, który zostanie wprowadzony do plazmidu lentiwirusowego.
      UWAGA: Inne fragmenty mogą być widoczne w >1000 pz, 400 pz i 300 pz, co odpowiada niekompletnym fragmentom PCR, które należy wyrzucić.
3. Wprowadzenie kasety gRNA do szkielecie plazmidu lentiwirusowego.
   1. Linearyzuj plazmid przez podwójne trawienie plazmidu #87919 z enzymami restrykcyjnymi XmaI i BlpI.
      1. Przygotować reakcję z 15 μl zalecanego buforu, 15 μl plazmidu (1 μg/μL), 7,5 μl enzymu BlpI (przy 10 U/μL), 7,5 μL enzymu XmaI (przy 10 U/μL) i 112,5 μL_H2O. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przez 20 minut w temperaturze 65 °C. Załaduj całkowitą ilość na 1% żel agarozowy, wytnij i oczyść plazmid ~10 kb odpowiednim zestawem. Elucję przeprowadza się w 20 μl buforu, a eluowany produkt określa się ilościowo za pomocą pomiaru gęstości optycznej.
         UWAGA: Użyj odpowiedniego protokołu oczyszczania dla dużych fragmentów DNA, takiego jak protokół opisany przez Sun i coll⁹.
   2. Zwiąż kasetę gRNA i plazmid. Przygotować mieszaninę reakcyjną z kasetą gRNA z kroku 2.2.7 i zlinearyzowanym plazmidem z kroku 2.3.1.1, dodać 2 μl enzymu i_H2O, aby uzyskać końcową objętość 10 μL. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 50 °C w celu wytworzenia końcowego plazmidu zwanego p_guides.
      UWAGA: Ilość kasety DNA powinna wynosić od 50 do 100 ng, a ilość plazmidu od 100 do 200 ng, przy stosunku molowym 2:1.
4. Użyj 2 μl świeżo przygotowanego plazmidu do przekształcenia chemicznie kompetentnych bakterii E.Coli, takich jak Stbl3 (50 μL) lub XL10-Gold i rozprowadź na płytce agarowej LB ze 100 μg/ml ampicyliny po 1 godzinie wzrostu w temperaturze 37 °C bez antybiotyku. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Wybierz kilka kolonii i wykonaj mini przygotowanie za pomocą komercyjnego zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Wykonaj amplifikację PCR na DNA miniprep za pomocą Primer_XmaI i Primer_BlpR za pomocą programu PCR 1 (patrz Rysunek 2). Oddzielić produkty PCR od 1% żelu agarozowego w buforze TBE. Wybierz kilka rodzin (~5) z prążkiem o oczekiwanej wielkości około 1300 pz.
6. Wykonaj sekwencjonowanie DNA wybranych kolonii, używając Primer_XmaI lub Primer_BlpR, aby potwierdzić poprawną insercję kasety gRNA.
   UWAGA: Jedna z zweryfikowanych sekwencyjnie kolonii jest dalej wykorzystywana w badaniu, a plazmid nazywa się p_guides.
7. Powtórz czynności od kroku 2.2 (budowa kasety) z Primers-Killer F i R oraz Primers-mCherry F i R. Do dalszej analizy użyj jednej zweryfikowanej sekwencyjnie kolonii. Plazmid nazywa się p_Killer.

3. Produkcja lentiwirusa

1. Wyprodukuj i oczyść dużą ilość wszystkich wymaganych plazmidów za pomocą zestawu maxi-prep wolnego od endotoksyn, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować podwielokrotności w temperaturze 2 μg/μl. Przechowywać w temperaturze -20 °C
2. Przygotowanie komórek (dzień 1)
   1. Przygotować 18 płytek o długości 145 cm, wysianych 1 x 10⁶ komórek HEK293 na płytkę w 16 ml pożywki złożonej ze zmodyfikowanego pirogronianu glukozy o wysokiej zawartości glukozy Dulbecco ze zmodyfikowanym orłem (DMEM), uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną. Amplifikować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 przez} 3 dni.
      UWAGA: Produkcja lentiwirusa musi być przeprowadzana z ostrożnością w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym jednorazowego kombinezonu ochronnego, czapki ochronnej i rękawic. Wszystkie eksperymenty należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym (szafa bezpieczeństwa BSLII) z końcówkami filtrów. Wszystkie roztwory zawierające lentiwirusy i wszystkie zużyte odpady plastikowe/szklane muszą być inaktywowane etanolem 70% lub innym inaktywatorem wirusów.
3. Transfekcja komórek (dzień 4)
   1. Sprawdź zbieg komórek, aby upewnić się, że osiągnęły zbieżność 60%-65%.
   2. Przygotować roztwór do transfekcji zawierający dla każdej płytki: 20,8 μg plazmidu będącego przedmiotem zainteresowania (p-guides lub p-Killer lub pCas9 #87904), 4,8 μg plazmidu kodującego kopertę (VSV-G, #8454), 20,8 μg plazmidu psPAX2 (#12260) do pakowania lentiwirusowego, 136 μl fosforanu wapnia i dostosować za pomocą_H2Odo końcowej objętości 1000 μL. Dodawać ten roztwór kroplami i pod wpływem mieszania do 1 ml 2x sól fizjologiczna buforowana przez HEPS (HBS).
      UWAGA: Nie należy przygotowywać mieszanki dla wszystkich płytek w tym samym czasie, aby zapewnić optymalne przygotowanie odczynników; Przygotuj mieszankę na sześć talerzy w tym samym czasie, np. na 18 talerzy przygotuj trzy razy mieszankę na sześć talerzy.
   3. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 10 minut i dodawać kroplami 2 ml roztworu do komórek. Homogenizować odczynnik do transfekcji, delikatnie mieszając płytkę do tyłu, do przodu, do góry i do dołu, inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez co najmniej 5 h,
      UWAGA: Od tego momentu do końca produkcji lentiwirusa należy nosić dodatkowy sprzęt ochronny, w tym drugą parę rękawic, rękawy ochronne i jednorazowy plastron.
   4. Pięć godzin po transfekcji usuń pożywkę z płytek i spłucz PBS, aby pozbyć się odczynników do transfekcji. Dodać 12 ml świeżej pożywki i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
4. Pobieranie cząsteczek wirusa (dzień 6)
   1. Zbierz i połącz pożywkę ze wszystkich talerzy. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, w celu osadzenia resztek komórkowych. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 μm (wymaganych jest wiele filtrów).
   2. Wirować przy 68 300 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Usuń supernatant i pozostaw probówki do góry nogami pod szafką bezpieczeństwa na papierze na 5-10 minut, aby usunąć jak najwięcej płynu, a następnie dodaj 100 μl pożywki proliferacyjnej HEK na granulkę. Po upływie co najmniej 2 godzin w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić granulki, pipetując w górę i w dół. Zbierz wszystkie zawieszone granulki.
      UWAGA: Granulki można pozostawić w pożywce na noc w temperaturze 4 °C przed porcjowaniem.
   3. Podwielokrotność lentiwirusa w próbce o wielkości 10 μl lub 25 μl (w zależności od zastosowania) i szybkie zamrożenie ciekłym azotem. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Nie zamrażać podwielokrotności, która została rozmrożona.
5. Powtórz kroki od 3.2 do 3.4 z innymi plazmidami będącymi przedmiotem zainteresowania, aby wytworzyć LV-guides, LV-Killer i LV-Cas9.
   UWAGA: Alternatywnie, lentiwirusy można zakupić w firmie lub ośrodku antywirusowym.

4. Miareczkowanie lentiwirusa

UWAGA: Miareczkowanie wirusa jest wykonywane na komórkach HEK293. Miareczkowanie jest ważne, aby w kolejnych etapach uwzględnić dokładną liczbę lentiwirusów na komórkę (niezależnie od partii lentiwirusa) dla komórek będących przedmiotem zainteresowania. Liczba cząstek wirusa, które skutecznie transdukują komórkę, nazywana jest wielokrotnością infekcji (MOI): MOI 10 odpowiada zatem wprowadzeniu 10 cząstek wirusa na komórkę. Ponieważ cykl zamrażania/rozmrażania wpływa na żywotność lentiwirusa, miareczkowanie przeprowadza się przy użyciu zamrożonej podwielokrotności lentiwirusa, a każde kolejne doświadczenie przeprowadza się z nową podwielokrotnością z tej samej puli. Jedna metoda miareczkowania jest opisana tutaj, ale można zastosować inne metody.

1. W dniu 1 wysiewać 1 x 10⁵ komórek na płytkę na pięciu płytkach 35 mm ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi na spodzie i dwóch 35 mm płytkach bez szkiełek nakrywkowych.
2. W dniu 2, z dwóch płytek bez szkiełek nakrywkowych, zbierz i policz liczbę komórek po trypsynizacji i określ średnią ilość komórek na płytce (N).
3. Przygotować 100 μl lentiwirusa rozcieńczonego w stosunku 1:10 w pożywce proliferacyjnej. Wprowadzić transdukcję pięciu hodowanych płytek z różnymi objętościami rozcieńczonego wirusa, od 1 do 50 μl rozcieńczonego wirusa. Do tego protokołu należy użyć następujących objętości do transdukcji pięciu płytek: 1 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl, 50 μl. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .
4. W 4 dniu utrwalić komórki przez inkubację szkiełek nakrywkowych w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut w 4% paraformaldehydzie. W przypadku LV-Cas9 należy przeniknąć do komórek 0,1% Triton X100 w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, nasycić w PBS-0,1% Triton X100-2% koziej surowicy - 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej i znakować przez 45 minut w temperaturze pokojowej pierwszorzędowym przeciwciałem anty-V5 (rozcieńczenie 1/400), a następnie 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym. Oznaczyć jądra za pomocą Hoeschta (10 μg/ml w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym i obserwuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw o powiększeniu 20x. W przypadku prowadnic LV i LV-Killer, po utrwaleniu należy przejść bezpośrednio do znakowania jąder i zamontować szkiełka nakrywkowe. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy policzyć całkowitą liczbę jąder (całkowitą liczbę komórek) w polu widzenia oraz liczbę komórek oznaczonych (za pomocą V5 lub mCherry), a następnie określić stosunek komórek oznaczonych dla każdego szkiełka nakrywkowego.
6. Wybrać szkiełko nakrywkowe, w którym stosunek transdukowanych komórek wynosi co najmniej 10% i nie przekracza 50%. Określić wydajność transdukcji (X) dla tego szkiełka nakrywkowego i zanotować objętość rozcieńczonego wirusa (V, w μl) użytej do uzyskania tej wydajności transdukcji.
   
7. Oznaczyć miano wirusa (w cząstkach zakaźnych, reprezentowanych jako ip/ml) według następującego wzoru:
   
   Współczynnik rozcieńczenia to rozcieńczenie lentiwirusa przeprowadzone w kroku 4.3. Rutynowo uzyskaliśmy końcowe miano 1 x 10⁹ ip / ml dla LV-Cas9 i 1 x^{10 10} ip / ml dla LV-guide, oznaczone w komórkach HEK.

5. Transdukcja mioblastów

UWAGA: Unieśmiertelnione mioblasty są sukcesywnie transdukowane trzema wcześniej wyprodukowanymi lentiwirusami. Są one utrzymywane w gęstości poniżej 50% w pożywce proliferacyjnej składającej się z F10 Hama uzupełnionego 20% FBS, 2% penicyliny/streptomycyny, 2% Ultroser G i hodowane w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

1. Określ objętość lentiwirusa potrzebną do leczenia wybranej liczby komórek za pomocą MOI 10 dla LV-Cas9 i LV przewodników oraz MOI 20 dla LV-killer, zgodnie z następującym wzorem:
   
   UWAGA: W równoległym eksperymencie porównano wydajność transdukcji na mioblastach i HEK, przy użyciu kontrolnego lentiwirusa (lenti-GFP) i ustaliliśmy, że do skutecznej transdukcji mioblastu potrzeba pięć razy więcej lentiwirusów w porównaniu z komórką HEK. Zatem MOI 10 mierzony na HEK odpowiada dwóm cząstkom wirusa na mioblast. Użyte tutaj MOI są obliczane na komórkach HEK.
2. W dniu 1 wysiewaj 96-dołkowe płytki z 10 000 komórek w 100 μl pożywki proliferacyjnej na dołek. W dniu 2 przeprowadź transdukcję komórek pod komorą bezpieczeństwa, dodając odpowiednią objętość prowadnic niskiego napięcia i LV-Cas9 obliczoną w kroku 5.1. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do dnia 7,
   UWAGA: Zastosowanie MOI wyższego niż 25, szczególnie w przypadku LV-Cas9, może nie poprawić liczby edytowanych komórek ze względu na wyższą śmierć komórek przy wysokim stężeniu lentiwirusa.
3. W 7 dniu wykonaj trypsynizację i policz komórki. Wysiewaj komórki z dokładnością od 40% do 50% na nowej płytce i włóż komórki z powrotem do inkubatora. Pięć godzin później transdukuj komórki za pomocą LV-Killer przy MOI 20 (objętość obliczona w kroku 5.1). Amplifikuj komórki przez 5 do 10 dni po transfekcji, przez co najmniej dwa pasaże i zawsze utrzymuj je na niskim poziomie zbiegu <50%. Komórki są gotowe do następnego etapu, klonowania komórek, gdy ich wzrost wraca do normy (szacowany na podstawie czasu podziału).
   UWAGA: Proliferacja może być nieco wolniejsza po transdukcji. Normalny wzrost komórek można określić przed tą procedurą eksperymentalną poprzez oszacowanie czasu podziału komórek.

6. Klonowanie komórkowe

UWAGA: Ponieważ transdukcja mioblastów jest trudna i nigdy nie osiąga 100% skuteczności, nawet przy użyciu lentiwirusa, wymagane jest klonowanie komórek, aby uzyskać w pełni poprawioną linię komórkową. Jest to możliwe tylko w przypadku komórek unieśmiertelnionych lub komórek, które można hodować i amplifikować w ciągu kilku tygodni/miesięcy.

1. Trypsynizuj i policz komórki. Rozcieńczyć komórki w pożywce proliferacyjnej w stężeniu 10 komórek/ml i zasiać komórki w 1 komórce/dołku na 96-dołkowych płytkach zawierających 100 μl/basenik pożywki.
   UWAGA: Liczba płytek do wysiewu zależy od prawdopodobieństwa oczekiwanej edycji genów, rutynowo stosuje się od 2 do 10 płytek.
2. Monitoruj komórki pod kątem wzrostu i stopniowo amplifikuj każdą studzienkę na większej płytce, aż osiągniesz płytkę o średnicy co najmniej 35 mm, utrzymując zbieganie mioblastów poniżej 50%. Ten etap może trwać od 2 do 6 tygodni, w zależności od użytych komórek i ich zdolności do wzrostu po wyizolowaniu w studni.

7. Wybór klonowania

UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu określenia, które z rosnących klonów zostały odpowiednio zmodyfikowane.

1. Zaprojektuj zestaw starterów składający się ze startera umieszczonego przed pierwszym przewodnikiem (Primer_BeforeGuide1F) i drugiego startera umieszczonego za drugim przewodnikiem (Primer_AfterGuide2R) w celu wzmocnienia obszaru otaczającego przypuszczalnie zmodyfikowaną sekwencję. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z zastosowanymi tutaj starterami.
2. Zbierz komórki z każdego klonu, zaoszczędź co najmniej 300 000 komórek do przyszłej amplifikacji i wyekstrahuj genomowe DNA przy użyciu dowolnego standardowego protokołu na pozostałych komórkach.
   1. Jeśli rośnie duża liczba klonów, aby odrzucić te nieedytowane, wykonaj szybki test, łącząc komórki z pięciu klonów w tej samej probówce, aby wyekstrahować DNA z tej puli i przetestuj za pomocą PCR. Powtórz z tyloma klonami, ile to konieczne. Następnie należy dodatkowo rozdzielić pule, które zawierały edytowane komórki, aby przeprowadzić indywidualną analizę.
3. Kontroluj edycję za pomocą PCR w następujący sposób. Przygotować reakcję PCR z 1 μL Primer_BeforeGuide1F, 1 μL Primer_AfterGuide2R, 12,5 μl mieszaniny polimerazy, 3 μl genomowego DNA i 7,5 μl_H2O. Amplifikować w termocyklerze zgodnie z instrukcjami producenta i parametrami starterów. Uruchom na 1% żelu agarozowym, aby zidentyfikować edytowane klony.
4. Kontroluj edycję przez sekwencjonowanie w następujący sposób. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera wybranych klonów, aby potwierdzić usunięcie i określić, w jaki sposób edycja została wykonana w każdym klonie. Zachowaj więcej niż jeden edytowany klon, aby upewnić się, że tylko docelowy gen został zmodyfikowany i jest odpowiedzialny za zaobserwowany efekt fizjologiczny i zachowaj nieedytowany klon, który będzie używany jako klon kontrolny (CTRL) w kolejnych eksperymentach.
5. Rozwiń wybrane klony. Gdy zbieg każdego klonu osiągnie około 50%, trypsynizuj komórki i umieść je w większym naczyniu, aż zostanie wyprodukowana wystarczająca ilość komórek, aby przeprowadzić charakterystykę biochemiczną i funkcjonalną (zwykle więcej niż 1 x 10⁶ na klon) i przechowuj zamrożone porcje każdego klonu do wykorzystania w przyszłości.

8. Charakterystyka edytowanych klonów

UWAGA: Gdy kilka klonów zostanie wybranych i potwierdzonych przez sekwencjonowanie DNA, delecja docelowego genu może być potwierdzona na poziomie białka za pomocą Western blot i na poziomie funkcjonalnym, jeśli dostępny jest funkcjonalny test komórkowy dla tego genu. W przypadku RYR1-KO, ponieważ RyR1 jest kanałem wapniowym, charakterystykę funkcjonalną przeprowadzono za pomocą obrazowania wapnia na hodowanych komórkach.

1. Ekspresja białka w edytowanych klonach
   UWAGA: RyR1 jest wyrażany tylko w zróżnicowanych myotubes¹⁰. Jego ekspresja została oceniona w miotubach za pomocą Western blot, aby potwierdzić delecję na poziomie białka RyR1, a także delecję białka Cas9.
   1. Umieść 200 000 komórek w pożywce proliferacyjnej (opisanej powyżej, krok 5) na powierzchni około 1,76^cm2 na 35-milimetrowej płytce pokrytej lamininą (powierzchnia odpowiadająca 200 μl kropli lamininy w stężeniu 10 mg/ml w PBS z wapniem). Po przyklejeniu komórek do płytki po inkubacji przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ należy przenieść pożywkę hodowlaną na pożywkę różnicującą składającą się z DMEM o niskiej stężeniu glukozy + 10% surowicy końskiej + 1% penicyliny/streptomycyny i zwrócić komórki do inkubatora na 6 dni.
   2. Po 6 dniach różnicowania należy zebrać i poddać komórki lizie za pomocą 200 μl RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy. Określ stężenie białka za pomocą metody Folina Lowry'ego¹¹.
   3. Załaduj 15 μg białka, po denaturacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w buforze denaturacyjnym Laemmli, na żel akrylowy o gradiacji 5%-15%. Po separacji elektroforetycznej przenieś białka na Immobilon P pod napięciem 0,8 V przez 4 godziny¹¹.
   4. Po nasyceniu błony przez 30 minut w temperaturze pokojowej w PBS zawierającej 0,1% Tween 20 i 5% beztłuszczowego mleka w proszku, inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w tym samym buforze przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, przemywać membranę 5 razy przez 5 minut PBS-0,1% Tween 20 i inkubować błonę z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podstawowymi stosowanymi przeciwciałami są: przeciwciała przeciwko znacznikowi V5 (rozcieńczenie: 1/5000) do wykrywania Cas9, anty-GAPDH (rozcieńczenie: 1/1000) jako kontrola obciążenia, przeciwciało anty-RyR1^12,13 (rozcieńczenie: 1/10,000), przeciwciało przeciwko podjednostce alfa 1 DHPR (rozcieńczenie: 1/1000) i przeciwciało przeciwko łańcuchowi ciężkiemu miozyny MF20 (rozcieńczenie: 1/1000).
   5. Przemyć membranę 5x przez 5 min PBS-0,1% Tween 20, osuszyć nadmiar płynu i dodać podłoże chemiluminescencyjne. Postępuj zgodnie z zaleceniami dostawcy substratu, aby wykryć sygnał chemiluminescencyjny.
2. Charakterystyka funkcjonalna edytowanych klonów
   UWAGA: Funkcję RyR1 oceniano za pomocą obrazowania wapnia w zróżnicowanych rurkach mięśniowych, wytworzonych z klonów CTRL lub KO¹⁴.
   1. Umieść 50 000 komórek na powierzchni 0,2^cm2 pośrodku 35-milimetrowych szalek pokrytych lamininą (powierzchnia pokryta kroplą lamininy o wielkości 50 μl, w sile 10 mg/ml w PBS z wapniem) i indukuj różnicowanie przez 6 dni, jak opisano w kroku 8.1.1. Przygotuj trzy płytki do każdej stymulacji, aby uzyskać biologiczną trójkę.
   2. Załadować do miotub 50 μl fluo 4-direct, rozcieńczonego w stosunku 1:1 w pożywce różnicującej i inkubowanego przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem KREBS uzupełnionym glukozą w stężeniu 1 mg/ml.
   3. Zmierz zmiany fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego za pomocą obiektywu 10x. Zamontuj płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij akwizycję z prędkością 1 klatki na sekundę przez 90 s.
   4. Usuń pozostały KREBS i stymuluj komórki w ramce 25 przez dodanie 2 ml KCl do depolaryzacji błony (140 mM stężenie końcowe) lub 2 ml 4 CmC (500 μM stężenie końcowe) do bezpośredniej stymulacji RyR1. Upewnij się, że w nagranym polu znajduje się co najmniej 10 miotub.
   5. Określ ilościowo zmienność fluorescencji w każdej rurki za pomocą dedykowanego oprogramowania. Wybierz do analizy co najmniej 10 miotubek na czaszę (najlepiej 20-30 miotubek na czaszę), narysuj linię (lub obszar zainteresowania (ROI)) na długiej osi każdej miotubki i zbierz fluorescencję F wzdłuż tej linii dla wszystkich ramek.
   6. Określ początkową wartość fluorescencji, F0, odpowiadającą klatkom od 1 do 24. Wykreślić zmienność fluorescencyjną (F-F0)/F0 w funkcji czasu od 0 do 90 s. Powtórz eksperyment trzy razy, aby uzyskać zmienność fluorescencji z co najmniej 90 miotubek z trzech różnych kultur. Zbierz wszystkie wyniki dla 90 miotub i oblicz średnią ± SEM (F-F0)/F0 w każdym przedziale czasowym. Określ ilościowo szczytową amplitudę uwalniania wapnia dla każdej stymulacji i każdego klonu.

Wyniki

Ten protokół został zastosowany do unieśmiertelnionych mioblastów od zdrowego osobnika¹⁵ (tak zwane komórki HM, dla ludzkich mioblastów), w których RyR1 został wcześniej scharakteryzowany¹⁶, w celu wyeliminowania genu RYR1 kodującego białko RyR1. Konstrukcja przewodników RNA została wykonana w celu usunięcia sekwencji obejmującej część eksonu 101 i intronu 101 genu. Przewiduje się, że usunięcie części eksonu 101 spowoduje zakłócenie ramki odczytu. Ponadto ekson 101...

Dyskusja

Ważnym krokiem na drodze do scharakteryzowania genów o nieznanej funkcji zaangażowanych w patologie jest opracowanie odpowiednich modeli komórkowych do badania funkcji tych genów. Wykorzystanie edycji genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest wykładniczo rozwijającą się dziedziną badań, a rozwój modeli knock-out, jak przedstawiono tutaj, jest jednym z najczęściej stosowanych zastosowań. W tym kontekście proponujemy tutaj wszechstronny protokół rozwoju ludzkiej linii komórkowej w dowolnym genie będącym przedmiotem zainteresowania,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-CACNA1S	Sigma-Aldrich	HPA048892	Przeciwciało pierwotne
Blp I	NE BioLabs	R0585S	Enzym restrykcyjny
CalPhos Zestaw do transfekcji ssaków	Takara	631312	Zestaw do transfekcji
Easy blot anty Mysia IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP Przeciwciało wtórne
Easy blot anty IgG królika	GeneTex	GTX221666	Przeciwciało drugorzędowe HRP
Fluo-4 bezpośrednie	sondy molekularne	F10472	Obrazowanie wapnia
GAPDH(14C10) Królik mAb	Technologia sygnalizacji komórkowej	#2118	Przeciwciało pierwotne
HindIII	Fermentas	ER0501	Enzym restrykcyjny
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	Zestaw do ligacji
MasterMix Phusion High Fidelity z GC	ThermoFisher Scientific	F532L	Mix do reakcji PCR z polimerazą Taq o wysokiej wierności i przeciwciałem dNTP
przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny	DHSB	MF20	Przeciwciało pierwotne
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF  740424	Zestaw Maxipreparation do oczyszczania plazmidów
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	oczyszczanie DNA
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	Kit do ekstrakcji DNA z komórki
One Shot Stbl3 Kompetentny chemicznie E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	Chemicznie kompetentne komórki
Plazmid #87904	Addgene	87904	Plazmid lentiwirusowy kodujący SpCas9 (dla LV-Cas9)
Plazmid #87919	Addgene	87919	Szkielet lentiwirusowy do wprowadzenia kasety z prowadnicami (dla celu LV)
Plazmid #12260	Addgene	12260	Plazmid lentiwirusowy kodujący opakowanie lentiwirusowe Plazmid GAG POL
#8454	Addgene	8454	Białko otoczki kodujące plazmid lentiwirusowy do wytwarzania cząstek retrowirusowych lentiwirusowych i MuLV
V5 Tag Przeciwciało monoklonalne	Invitrogene	R96025	Przeciwciało pierwszorzędowe
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	Chemicznie kompetentne komórki
Xma I	NE BioLabs	R0180S	Enzym restrykcyjny