Obecny protokół opisuje technikę oczyszczania pędów ryżu, które są trudne do przygotowania do wewnętrznych obserwacji strukturalnych ze względu na twardą, grubą lub warstwową naturę tkanek. Metoda ta ułatwia ciągłe i głębokie obserwacje fluorescencyjne, nawet u dorosłych roślin ryżu.
Artykuł metodologiczny
Głęboka obserwacja fluorescencji pędów ryżowych za pomocą technologii oczyszczania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedawno opracowana technologia oczyszczania, która eliminuje niedopasowania indeksu refrakcji i zmniejsza materiał autofluorescencyjny, umożliwiła obserwację tkanek roślinnych w trzech wymiarach (3D) przy zachowaniu ich wewnętrznych struktur. W przypadku ryżu (Oryza sativa L.), rośliny jednoliściennej i rośliny uprawnej o znaczeniu globalnym, technologia oczyszczania została opisana w organach, które są stosunkowo łatwe do zaobserwowania, takich jak korzenie i liście. Odnotowano również zastosowania technologii oczyszczania w merystemie wierzchołkowym pędów (SAM) i łodygach, ale tylko w ograniczonym stopniu ze względu na słabą penetrację roztworu oczyszczającego (CS) w tych tkankach. Ograniczoną skuteczność roztworów oczyszczających w tych tkankach przypisuje się autofluorescencji, pogrubieniu i stwardnieniu tkanek w łodydze w miarę rozwoju wiązek naczyniowych i naskórka oraz nakładaniu warstw SAM z wodoodpornymi liśćmi. Niniejszy protokół informuje o optymalizacji podejścia do oczyszczania w celu ciągłej i 3D obserwacji ekspresji genów od SAM/młodej wiechy do podstawy pędów podczas rozwoju. Utrwalone próbki tkanek wykazujące ekspresję reportera białka fluorescencyjnego zostały przycięte na sekcje za pomocą wibrującego mikrokrajalnika. Po uzyskaniu odpowiedniej grubości nałożono CS. Dzięki specyficznemu celowaniu w tkankę centralną, szybkość penetracji i jednorodność CS wzrosła, a czas potrzebny do uczynienia tkanki przezroczystą skrócił się. Dodatkowo wyczyszczenie przyciętych fragmentów umożliwiło obserwację wewnętrznej struktury całego ujęcia w perspektywie makro. Metoda ta ma potencjalne zastosowanie w głębokim obrazowaniu tkanek innych gatunków roślin, które są trudne do oczyszczenia.
Wprowadzenie
Niedawno opracowana technologia oczyszczania umożliwiła obserwację głębokich tkanek roślin przy jednoczesnym zachowaniu ich wewnętrznej struktury1,2,3. W modelowej roślinie Arabidopsis przeprowadzono wiele badań nad obrazowaniem białek fluorescencyjnych przy użyciu technologii oczyszczania w celu wyeliminowania niedopasowania współczynnika załamania światła i usunięcia materiałów autofluorescencyjnych4,5,6. Chociaż zastosowanie technologii clearingu7,8 i obrazowania 3D w rozdzielczości komórkowej9 zostało zgłoszone w przypadku ryżu (Oryza sativa L.), rośliny jednoliściennej i uprawy o znaczeniu globalnym, są one ograniczone do stosunkowo cienkich i miękkich organów, takich jak korzenie, liście i merystem wierzchołkowy pędów (SAM), które są łatwe do zaobserwowania.
Pęd jest głównym organem stanowiącym nadziemne części roślin naczyniowych. W ryżu pędy składają się z szeregu pionowo ułożonych "fitomerów", składających się z pąków pachowych, liści i łodygi10. Na końcu pędu SAM składa się z niezróżnicowanych komórek macierzystych pośrodku. Fitomery powstają w wyniku różnicowania komórek pochodzących z SAM. Po przejściu roślin z fazy wegetatywnej do fazy reprodukcyjnej, łodygi ryżu wydłużają się, a SAM różnicuje się w młode wiechy10. Tej zmianie rozwojowej towarzyszą wahania ekspresji różnych genów w łodygach i SAM/młodych wiechach. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw różnicowania komórek w różne tkanki, ważne jest strukturalne obserwowanie morfologii komórek i ekspresji genów w wewnętrznych tkankach pędów. Jednak głębokie obrazowanie łodyg (węzłów i międzywęźli) w pędzie stanowi wyzwanie ze względu na nieskuteczność roztworów oczyszczających do penetracji tkanki. Pędy natychmiast ulegają szybkiemu wzrostowi objętości w wyniku wzrostu bocznego po różnicowaniu się od SAM. Stwardnienie tkanek węzła ryżowego spowodowane pogrubieniem wiązek naczyniowych i poziomym złożonym ogniwem węzłowego zespolenia naczyniowego, oprócz wysokiej odporności pędów ryżu, przyczyniają się do ograniczenia penetracji CS w łodygach10.
To badanie miało na celu zaobserwowanie zmian w ekspresji genów w tkankach pędów ryżu za pomocą techniki strukturalnej głębokiej fluorescencji. Praca ta optymalizuje protokół oczyszczania ryżu w celu ciągłej obserwacji ekspresji genów od SAM/młodej wiechy do podstawy w strukturze 3D, a nie na płaskiej powierzchni, przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego.
Protokół
1. Przygotowanie roztworu utrwalającego
- Przenieś 70 ml sterylnej wody do szklanej butelki i dodaj 10 g paraformaldehydu (PFA).
UWAGA: PFA jest toksyczny; Dlatego zaleca się noszenie rękawiczek. - Dodać 2 ml 1 N NaOH, aby rozpuścić roztwór PFA.
- Rozpuścić roztwór PFA, ciągle mieszając (300-500 obr./min) w temperaturze 60 °C przez około 1 godzinę, aż roztwór PFA stanie się przezroczysty.
- Dodaj wysterylizowaną wodę, aby zwiększyć objętość roztworu PFA do 100 ml.
UWAGA: Roztwór PFA został przygotowany świeżo przed użyciem. Ponadto roztwór PFA przechowywany w temperaturze 4 °C może być używany przez około 2 miesiące. - Bezpośrednio przed pobraniem próbki dodać 25 ml 60 ml 60 mM HEPES (pH 7,4), 3 ml 1 M sacharozy i 2 ml sterylnej wody do 20 ml 10 % PFA, aby przygotować 50 ml roztworu utrwalającego.
2. Przygotowanie roztworu czyszczącego (CS)
- Zważyć i wymieszać 7,5 g dezoksycholanu sodu, 5 g ksylitolu i 12,5 g mocznika (patrz tabela materiałów) w 50 ml sterylnej wody.
UWAGA: Deoksycholan sodu w proszku zważono w ogólnej komorze roboczej laboratorium, aby zapobiec dyspersji w powietrzu. - Rozpuścić składniki (krok 2.1.) za pomocą mieszadła magnetycznego w celu przygotowania CS.
UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano opracowane przez siebie rozwiązanie clearingowe (CS), ale można również zastosować dostępne na rynku rozwiązanie clearingowe ClearSee (patrz tabela materiałów). - Przenieś CS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowuj w temperaturze pokojowej (15-30 °C) w ciemności.
UWAGA: CS może być przechowywany dłużej niż 1 rok.
3. Pobieranie próbek
- Ostrożnie odetnij korzenie, nie uszkadzając roślin. Umyj rośliny wodą, aby usunąć brud.
UWAGA: W tej metodzie badano obserwację tkanek od stadium trzech liści (LS) do oznaczenia LS. W niniejszym badaniu wykorzystano odmiany ryżu Nipponbare (Nip) i Taichung 65 (T65) w 8-10 LS. - Oderwij stare zewnętrzne liście rękami i pęsetą. Zostały około 2-3 liście.
- Przetnij tkankę od SAM/młodej wiechy do podstawy za pomocą jednosiecznej brzytwy, wykonując ruch ślizgowy, aby uniknąć zmiażdżenia komórek (Rysunek 1A-C). Jeśli pozycja SAM/młodej wiechy nie jest widoczna, przytnij ją dłużej.
- Ponieważ przekrój poprzeczny pędu ryżu ma owalny kształt (Rysunek 1D), należy cienko ogolić jedną stronę owalu w kierunku jego długiej osi za pomocą obosiecznej brzytwy (Rysunek 1E-F).
UWAGA: Ten krok ułatwił wnikanie roztworu utrwalającego do próbki. Pozioma powierzchnia cięcia ułatwia przyklejenie próbki do wibrującej tacy mikrokrajalnicy (patrz tabela materiałów). - Potwierdź położenie SAM/młodej wiechy poprzez pojawienie się białawego koloru w próbce (Rysunek 1G). Odetnij nadmiar tkanki.
UWAGA: Długość próbki należy dostosować do maksymalnej długości, którą można przyciąć za pomocą wibracyjnego mikrokrajalnicy. Jeśli próbka jest zbyt długa, podziel ją na kilka części.
4. Utrwalenie próbek
- Pobrać pipetą 1 ml roztworu utrwalającego (przygotowanego w kroku 1.) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieścić w próbkach.
UWAGA: Upewnij się, że ilość próbki nie przekracza 20% objętości roztworu utrwalającego. - Pokrój kawałek folii parafinowej na 2,5 cm2. Uformuj folię parafinową w kulki i umieść je na próbkach, aby zapobiec ich wypływaniu z roztworu utrwalającego.
- Umieścić probówkę zawierającą próbkę w eksykatorze. Następnie zamknij pokrywę eksykatora i uruchom pompę próżniową, aby powoli rozhermetyzować wnętrze eksykatora do -0,095 MPa.
- Po zamknięciu eksykatora przy ciśnieniu -0,095 MPa należy wyłączyć pompę próżniową i pozostawić ją na 30 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Poziom próżni był taki, że pęcherzyki pojawiały się stopniowo w próbkach. - Lekko otwórz eksykator i powoli przywróć go do ciśnienia atmosferycznego. Zmniejszyć ciśnienie eksykatora do -0,095 MPa, wyłączyć pompę próżniową i pozostawić mieszaninę na 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Lekko otwórz eksykator i powoli przywróć go do ciśnienia atmosferycznego. Jeśli próbka jest prawidłowo zamocowana, zanurza się w roztworze utrwalającym. Jeśli nie zatonął, ponownie zmniejsz ciśnienie.
- Usuń folię parafinową, zamknij pokrywę i trzymaj probówki przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Próbki utrwalano w roztworze utrwalającym przez co najmniej 2 godziny. Może być przechowywany przez ~1 tydzień.
5. Przycinanie ustalonej próbki
- Usunąć nadmiar roztworu utrwalającego z próbki za pomocą niestrzępiących się chusteczek.
UWAGA: Nadmiar roztworu utrwalającego zapobiega prawidłowemu przyklejaniu się próbki do tacki. - Umieść próbkę na wibrującej tacy z mikrokrajalnicą za pomocą kleju błyskawicznego. Umieść go na tacy płaską stroną do dołu, która została ogolona podczas pobierania próbek.
UWAGA: Ze względu na budowę pędu ryżu, należy go przyciąć od podstawy w kierunku SAM/młodej wiechy. - Ustaw warunki przycinania zgodnie z ustaloną próbką.
UWAGA: W tym badaniu przycinanie ustawiono na GRUBY, 130 μm; SZEROKA, 15 mm; CZĘSTOTLIWOŚĆ, 15%; i PRĘDKOŚĆ CIĘCIA, 32 mm. - Dostosuj sample pozycja za pomocą przycisku RVS lub FWD oraz przycisku GÓRA lub DÓŁ. Napełnij tackę wodą dejonizowaną, aż wszystkie próbki zostaną zanurzone. Po napełnieniu tacki naciśnij przycisk START. Umieścić przycięte próbki na szkiełku podstawowym z kroplą 1x PBS.
UWAGA: Przesuń pozycję próbki na drugą stronę po każdym przycinaniu, ponieważ twarda próbka zużywa żyletkę. - Po sprawdzeniu próbki zawierającej miejsce docelowe pod mikroskopem stereoskopowym, przenieść przyciętą próbkę na płytkę wielodołkową z 1 ml 1x PBS.
UWAGA: Wybierz liczbę studzienek w zależności od wielkości próbki. W tym badaniu użyto 12-dołkowej płytki.
6. Leczenie roztworem oczyszczającym
- Wyjmij 1x PBS z płytki wielodołkowej i dodaj świeży 1x PBS. Odstaw na 1 minutę.
- Usuń 1x PBS i dodaj CS.
UWAGA: Ilość CS musi być pięciokrotnie większa od objętości próbki. - Umieścić płytkę wielodołkową zawierającą próbkę w eksykatorze. Następnie zamknij pokrywę eksykatora i uruchom pompę próżniową, aby powoli rozhermetyzować wnętrze eksykatora do poziomu -0,09 MPa.
- Po zamknięciu eksykatora przy ciśnieniu -0,09 MPa należy wyłączyć pompę próżniową i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Lekko otwórz eksykator i powoli przywróć go do ciśnienia atmosferycznego.
- Wlej wodę dejonizowaną do szczeliny między studzienkami, aby zapobiec parowaniu CS. Przechowuj płytki wielodołkowe w temperaturze pokojowej w ciemności w celu oczyszczenia.
UWAGA: Delikatnie potrząsaj płytką wielodołkową co 1-2 dni, aby rozproszyć chlorofil i inne składniki. - Gdy CS zmieni kolor na zielony, zastąp go świeżym roztworem.
7. Barwienie ścian komórkowych barwnikiem chemicznym
- Odpipetować biały roztwór kalkofluoru (1 ml, stężenie końcowe: 1 mg/ml w roztworze klarującym, patrz tabela materiałów) do płytki wielodołkowej. Umieścić próbki w roztworze barwnika i inkubować przez 1 godz.
UWAGA: Objętość barwnika nie może przekraczać 10% objętości CS. - Przebarwione próbki należy myć na innej płytce wielodołkowej z 1 ml CS przez co najmniej 1 godzinę.
8. Obserwacja za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego
- Umieść kroplę CS na szkiełku mikroskopowym i przenieś próbki poddane działaniu CS (z CS) na szkiełko.
UWAGA: Ponieważ poddane działaniu substancji próbki są miękkie, należy się z nimi ostrożnie obchodzić za pomocą pęsety. - Przykryć próbkę szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec parowaniu CS.
UWAGA: CS łatwo się wytrąca. - Badane próbki należy obserwować pod konfokalnym mikroskopem laserowym.
UWAGA: Po obserwacji poddane działaniu substancji próbki można zwrócić do CS w celu dalszych obserwacji w późniejszym terminie.
Wyniki
W pierwszej kolejności zweryfikowano, w jakim stopniu twarde i grube tkanki dorosłych roślin ryżu mogą zostać uczynione przezroczystymi dzięki zabiegowi przejaśniania. Wykorzystano pędy w stadium 9-10 LS (etap formowania paniki) oraz wycięte fragmenty tkanek o długości 12-16 mm, obejmujące obszar od młodej paniki do podstawy pędu. Próbki te, w tym młoda panika, zostały utrwalone w roztworze utrwalającym i obserwowane przed oraz po 1-4 tygodniach zabiegu przejaśniania (Rysunek 2). Próbki nietrzymowane pozostały zielone i nie stały się przezroczyste po 4 tygodniach, ani nawet po 3 miesiącach traktowania roztworem przejaśniającym (Rysunek 2A). W próbkach, z których usunięto wszystkie liście, międzywęźle stały się białe po 1 tygodniu traktowania CS, choć węzły pozostały zielone. Próbka ta nie stała się przezroczysta po 4 tygodniach (Rysunek 2B). Po 3 miesiącach traktowania CS tylko młoda panika stała się przezroczysta. Próbki przycięte ręcznie zmieniły kolor na biały, z wyjątkiem liści zewnętrznych i wiązek naczyniowych, po 1 tygodniu traktowania CS. Niektóre części liści, młoda panika oraz międzywęźle stały się półprzezroczyste, ale nie stały się całkowicie przezroczyste po 4 tygodniach (Rysunek 2C). Po 3 miesiącach tylko młoda panika i liście wewnętrzne stały się przezroczyste. Próbki przycięte do grubości 130 µm za pomocą wibrującego mikrokrojnika stały się półprzezroczyste po 1 tygodniu traktowania CS, przy czym liście stały się przezroczyste. Po 2 tygodniach próbka była prawie przezroczysta i nie uległa zmianie po 4 tygodniach (Rysunek 2D). Po 3 miesiącach próbki stały się całkowicie przezroczyste.
Następnie zweryfikowano głębokość, na której zabieg przejaśniania umożliwił obserwacje ekspresji genów w pędzie T65 na poziomie 8 LS. Wykorzystano pędy wykazujące ekspresję UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN, patrz Tabela materiałów). Próbki tkanek utrwalono w roztworze utrwalającym, a następnie przycięto do grubości 130 µm za pomocą wibracyjnego mikrotomego. Próbki obserwowano pod konfokalnym mikroskopem laserowym (laser: 488 nm/13%, obiektyw: 20x, pinhole: 0,93 AU, uśrednianie: 16, wzmocnienie detektora: 800) w odstępach 10 µm wzdłuż osi z w każdym tygodniu od 0 do 4 tygodni traktowania CS. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 3. Wszystkie obrazy poddano tej samej obróbce w celu porównania intensywności fluorescencji. W węźle bez zastosowania zabiegu słabe sygnały fluorescencyjne zaobserwowano na głębokości −40 µm (Rysunek 3A). Głębokość obserwacji wynosiła −60 µm po 1 tygodniu traktowania CS i −90 µm po 2 tygodniach, jednak w obu tych tygodniach na głębokości −20 µm zauważalna była autofluorescencja cytoplazmy. Autofluorescencja stała się nieco słabsza po 3 tygodniach, a po 4 tygodniach przestała być widoczna. Sygnały fluorescencyjne zaobserwowano na głębokości −80 µm w 3. tygodniu oraz na głębokości −100 µm w 4. tygodniu. W międzywęźlu sygnały fluorescencyjne zaobserwowano na głębokości −60 µm bez traktowania CS (Rysunek 3B). Głębokość obserwacji wynosiła −90 µm od 1. do 3. tygodnia traktowania CS oraz −100 µm po 4 tygodniach, jednak po 1 tygodniu autofluorescencja w cytoplazmie była zauważalna na głębokości −20 µm. Autofluorescencja nie była już widoczna po 2 tygodniach. W liściach sygnały fluorescencyjne zaobserwowano na głębokości −90 µm bez traktowania CS (Rysunek 3C). Sygnały fluorescencyjne w liściach były widoczne głębiej niż w węzłach i międzywęźliach, jednak były słabsze. Sygnały fluorescencyjne stały się wyraźne po 1 tygodniu traktowania CS i zaobserwowano je na głębokości −120 µm. Po 2 i 3 tygodniach sygnały fluorescencyjne zaobserwowano na głębokości −110 µm, a po 4 tygodniach na głębokości −120 µm.
Na koniec zaobserwowano ekspresję czynnika transkrypcyjnego OsMADS1511 połączonego z mOrange12, który reguluje przejście SAM z fazy wegetatywnej do reprodukcyjnej13. Próbki tkanek z linii Nip na etapie 10 LS z OsMADS15-mOrange zostały utrwalone, przycięte do grubości 130 µm i poddane działaniu CS przez 2 tygodnie. Rycina 4 pokazuje, że roztwór przejrzystości można stosować jednocześnie do obserwacji białek fluorescencyjnych (OsMADS15-mOrange) naturalnej ekspresji genów oraz barwienia barwnikiem fluorescencyjnym (calcofluor white). Obserwowano cały kwiatek na głębokościach od 0 do −130 µm, a obraz 3D zrekonstruowano z 43 obrazów z serii z-stack w odstępach 3 µm (Rycina 4E).
Rysunek 1: Pozycja pobierania próbek i obróbka. (A) Siewka Nip w stadium 8 LS w warunkach krótkiego dnia. (B) Powiększony widok podstawy. (C) Wycinek próbki od SAM/młodej wiechy do podstawy. (D) Owalny przekrój poprzeczny z C (wstawka). (E) Cienkie odcinanie jednej strony pędu za pomocą ostrza. (F) Cienko ścięta powierzchnia. (G) Próbka wykazująca wydłużenie międzywęźla. Białawy odcinek wskazany grotami strzał to węzły. Górna strona górnego węzła zawiera młodą wiechę. Paski skali: (A) 10 cm, (B-C,E-G) 1 cm, (D) 0.5 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Przejaśnianie tkanek zależy od grubości próbki i czasu traktowania CS. (A) Nieprzycięte próbki z częściowymi pędami, w tym młodą panikulą. Maksymalna grubość: 4 mm. (B) Wszystkie liście usunięte z próbek w celu odsłonięcia młodej panikuli. Maksymalna grubość: 2,5 mm. yp: młoda panikula, in: międzywęźle; groty strzałek wskazują węzeł. (C) Próbki przycięte ręcznie do grubości 1 mm. (D) Próbki przycięte wibrującym mikrokrojone do grubości 130 µm. Pasek skali: 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Głębokość obserwacji fluorescencji zależy od typu tkanki i okresu traktowania CS. Głębokie obrazowanie UBQpro::NGCN w (A) węźle, (B) międzywęźle i (C) liściu. „Merge” oznacza, że obrazy zostały połączone z obrazem kontrastu różnicowego (DIC) oraz wszystkimi obrazami ze stosu z (z-stack). Obrazy, w których nie zaobserwowano fluorescencji, oznaczono jako „n.d.” (nie wykryto). Ustawienia konfokalnej mikroskopii laserowej są następujące: laser: 488 nm/13%, obiektyw: 20x, pinhole: 0,93 AU, uśrednianie: 16, wzmocnienie detektora: 800, interwał: 10 µm. Paski skali: 50 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 4: Głęboka obserwacja fluorescencyjna OsMADS15-mOrange. (A) Obraz DIC odmiany Nip w 10 LS. yp: młoda wiecha, le: liść, no: węzeł, in: międzywęźle; groty strzałek wskazują kwiatki. (B) Obraz fluorescencyjny OsMADS15-mOrange. Żółte kropki wskazują białka fluorescencyjne OsMADS15-mOrange w jądrach komórkowych. Ściana komórkowa została zabarwiona na kolor cyjan roztworem calcofluor white. (C) Powiększony widok młodej wiechy. (D) Głębokie obrazowanie kwiatka. pa: palea, le: lemma, fm: merystem kwiatowy; gwiazdki wskazują primordia pręcików. Konfokalny mikroskop laserowy został ustawiony następująco: OsMADS15-mOrange; laser: 555 nm/13%, obiektyw: 20x, pinhole: 0,96 AU, uśrednianie: 16, wzmocnienie detektora: 800, interwał: 3 µm. Calcofluor white; laser: 405 nm/3%, obiektyw: 20x, pinhole: 0,93 AU, uśrednianie: 16, wzmocnienie detektora: 470, interwał: 3 µm. (E) Obraz 3D z rysunku (D) zbudowany z obrazów serii z-stack. Paski skali: (A-B) 1 mm, (C) 500 µm, (D) 40 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Krytyczne etapy protokołu
Krytycznymi krokami w tym protokole są utrwalanie i przycinanie. Pędy ryżu mają twarde, grube lub warstwowe tkanki, które ograniczają przenikanie roztworu utrwalającego. Aby poprawić przepuszczalność roztworu utrwalającego, jedna strona tkanki została cienko ogolona podczas pobierania próbek, jak pokazano na rysunku 1E-F. Ponadto zabiegi próżniowe powtórzono dwukrotnie przy użyciu wyższego ciśnienia. Ponadto próbki utrwalano przez noc w temperaturze 4 °C zamiast zwykłego utrwalania w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
Kluczowym punktem na etapie przycinania jest określenie grubości tkanek, które mają być przygotowane do obserwacji białek fluorescencyjnych przy jednoczesnym zachowaniu ich wewnętrznej struktury po krótkim okresie leczenia CS. Jak pokazano na rysunku 2C, próbki o grubości 1 mm, ręcznie przycięte tak cienkie, jak to możliwe, stały się przezroczyste tylko w ograniczonej liczbie tkanek nawet po 3 miesiącach leczenia CS. Dlatego etap przycinania jest niezbędny do głębokiej obserwacji fluorescencyjnej dorosłych pędów ryżu. W tym badaniu próbki zostały przycięte do grubości 130 μm, jak pokazano na rysunku 2D. Grubość 130 μm pozwoliła na oczyszczenie liści po 1 tygodniu zabiegu CS, a całej próbki po 2 tygodniach. W tym badaniu wykorzystano dorosłe pędy ryżu w 9-10 LS. Grube, ale bardziej miękkie tkanki z młodszych pędów ryżu mogą zostać szybciej usunięte dzięki zabiegowi CS. Grubość próbek i czas trwania zabiegu CS należy dostosować do rodzaju tkanki, stanu i grubości obserwowanej struktury 3D.
Modyfikacje i metody rozwiązywania problemów
CS łatwo wytrącał się w niskich temperaturach. Wytrącony CS nie może zachować białek fluorescencyjnych; W związku z tym należy zachować ostrożność podczas przechowywania próbek w odpowiedniej temperaturze. Ponadto zarówno CS, jak i roztwór utrwalający nie mają działania antyseptycznego; W związku z tym białka fluorescencyjne ulegną degradacji, jeśli zostaną zanieczyszczone. Ryż uprawiany w glebie jest podatny na rozwój grzybów; W związku z tym pobieranie próbek i obchodzenie się z nimi musi być wykonywane z ostrożnością, aby uniknąć zanieczyszczenia.
Nadmiar barwników fluorescencyjnych w buforze może wydzielać fluorescencję tła i zakłócać obserwacje mikroskopowe. Na przykład wcześniej stosowano biały roztwór kalkofluoru zawierający niebieski barwnik Evansa. Po barwieniu przez 1 godzinę i myciu przez 1 godzinę, białka fluorescencyjne OsMADS15-mOrange obserwowano za pomocą lasera o długości fali 555 nm. Jednak nie można było zaobserwować białek fluorescencyjnych ze względu na fluorescencję tła pochodzącą z niebieskiego barwnika Evansa. Ta fluorescencja tła została prawie wyeliminowana przez mycie próbek przez 2 godziny. Co więcej, białka fluorescencyjne były wyraźniejsze, jeśli próbki pozostawiono na noc. Dlatego w tym badaniu użyto czystego roztworu bieli kalkofluorowej. Przed obserwacjami należy sprawdzić fluorescencję tła pochodzącą z barwnika fluorescencyjnego przy użyciu różnych długości fal lasera.
Ograniczenia metody
Jak pokazano na rycinie 3, białka głębokiej fluorescencji zaobserwowano w próbkach o grubości 130 μm po 2 tygodniach leczenia CS. Jest to zgodne z wynikami pokazanymi na rysunku 2D, gdzie próbka o grubości 130 μm stała się przezroczysta po 2 tygodniach leczenia CS. Jednak, jak pokazano na rycinie 3A, autofluorescencja cytoplazmy była nadal zauważalna w węzłach po 2 tygodniach i została całkowicie usunięta dopiero po 4 tygodniach leczenia CS. Węzły mają dużą gęstość komórek i dlatego wymagają dłuższego czasu na usunięcie materiałów autofluorescencyjnych.
Jak pokazano na rysunku 3C, głębokie białka fluorescencyjne zaobserwowano w liściach bez traktowania CS, ale jasność była słabsza niż w węzłach i międzywęźlach na tej samej głębokości 20 μm. Po 1 tygodniu leczenia CS białka fluorescencyjne były jaśniejsze. Chlorofil występuje obficie w liściach i pochłania 488 nm światła wzbudzającego. Mają również pomarańczowo-czerwoną autofluorescencję, która może zakłócać obserwację białek fluorescencyjnych za pomocą lasera o długości fali 555 nm. Po 1 tygodniu leczenia CS usunięto chlorofil i inne materiały autofluorescencyjne, co dało obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu.
Głębokości, które można było zaobserwować w tkankach po 2 tygodniach i 4 tygodniach leczenia CS, nie różniły się istotnie, chociaż białka fluorescencyjne wydawały się słabsze po 4 tygodniach (ryc. 3). Zwykle jasność białek fluorescencyjnych i autofluorescencja słabnie z czasem, co skutkuje wyższym stosunkiem sygnału do szumu. W związku z tym białka fluorescencyjne można obserwować wyraźniej, dostosowując warunki mikroskopowe i przetwarzanie obrazu. Na podstawie tych wyników stwierdzono, że 2 tygodnie leczenia CS mogą ułatwić obserwację głębokich białek fluorescencyjnych, biorąc pod uwagę warunki naszej próbki. Potrzebne są jednak 4 tygodnie, aby zaobserwować wyraźniejsze obrazy, które całkowicie wykluczają materiały autofluorescencyjne.
Struktury o silnej autofluorescencji, takie jak wiązki naczyniowe i komórki wieloramienne, nie mogą być usuwane w CS. Aby zaobserwować te struktury bez autofluorescencji, konieczne jest zastosowanie metody bramkowania w czasie12 lub uzyskanie obrazów widma fluorescencji za pomocą spektroskopii. Mikroskop dwufotonowy może być bardziej odpowiedni do obserwacji głębszych tkanek, jeśli obserwuje się grubsze tkanki.
Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących i alternatywnych metod
Ogólnie rzecz biorąc, wewnętrzne struktury roślin ryżu obserwowano za pomocą kriostatu lub wibratomu. Kriostat nadaje się do przygotowywania cienkich skrawków, które umożliwiają łatwiejszą obserwację, ale przygotowanie próbek i obsługa sprzętu są czasochłonne. Trudno jest również zrekonstruować oryginalną konstrukcję 3D z cienkich przekrojów. Wibratom jest stosunkowo łatwy w obsłudze i nadaje się do produkcji grubych sekcji. Jednak grube odcinki tkanek docelowych pozwalają na obserwację tylko powierzchni cięcia, a nie głębokich tkanek, do których światło nie może dotrzeć. Z tych powodów żadna z metod nie nadaje się do głębokich obserwacji fluorescencyjnych.
W badaniu tym zajęto się wyzwaniami związanymi z obserwacją głębokiej fluorescencji pędów ryżu, takimi jak ograniczona penetracja tkanki CS i słaba rozdzielczość obiektu pod mikroskopem konfokalnym, poprzez połączenie istniejących metod. Jak pokazano na rycinie 4, zaobserwowaliśmy białka fluorescencyjne (OsMADS15-mOrange) ulegające ekspresji w głębokich tkankach dorosłych pędów ryżu od młodej wiechy do podstawy. Rysunek 4D skupia się na różyczce i pokazuje głębokie białka fluorescencyjne w odstępach 3 μm. Tkanki o głębokości powyżej −130 μm obserwowano po 2 tygodniach leczenia CS, ale tylko tkanki o głębokości −27 μm (dane nie pokazane) w różyczce o tej samej wielkości i etapie wzrostu bez leczenia CS. Obecny, ulepszony protokół pozwolił na obserwację nie tylko nadekspresji genów, ale także naturalnej ekspresji genów w głębokich tkankach dorosłych pędów ryżu.
Znaczenie i potencjalne zastosowania metody w poszczególnych obszarach badawczych
Protokół ten, który optymalizuje obserwację głębokiej fluorescencji dorosłych pędów ryżu, umożliwia skuteczne oczyszczanie twardych, grubych lub warstwowych tkanek poprzez odcięcie zbędnych tkanek i zwiększenie przepuszczalności CS. Ponadto grubość próbek do analizy została zoptymalizowana, aby umożliwić ciągłą i strukturalną obserwację głębokiej fluorescencji za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego, który zwykle nie jest w stanie rozdzielić grubych lub nieprzezroczystych tkanek.
Trudno jest porównywać próbki ryżu na różnych etapach wzrostu, ponieważ białka fluorescencyjne ulegają degradacji w czasie w roztworach utrwalacza i PBS. Jednak białka fluorescencyjne w CS mogą być przechowywane przez ponad 5 miesięcy1. Długi okres trwałości CS jest główną zaletą dla głębokiej obserwacji fluorescencji ryżu.
W ostatnim czasie opracowano wiele technologii oczyszczania, które umożliwiają obserwację głębokich tkanek w 3D przy jednoczesnym zachowaniu ich wewnętrznych struktur. Technologie te nadal ewoluują i opracowywane są nowe rozwiązania w zakresie rozliczeń. Dobrym przykładem jest iTOMEI14, który umożliwia skuteczne usuwanie chlorofilu i jaśniejszą detekcję fluorescencji. Innym przykładem jest ClearSeeAlpha15, który zapobiega brązowieniu tkanek podczas zabiegu oczyszczania i sprawia, że wydają się one przezroczyste. Połączenie tych rozwiązań rozliczeniowych z obecną metodą może pozwolić na bardziej wydajne i skuteczne rozliczanie.
Oczekuje się, że obecna metoda pomoże uzyskać nowe informacje dzięki głębokiemu obrazowaniu nie tylko ryżu, ale także innych roślin.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani i Dr. H. Tsuji za dostarczenie nam nasion OsMADS15-mOrange; Dr. D. Kurihara za dostarczenie nam konstrukcji NGCN; oraz Dr. R. Shim za edycję naszego rękopisu. Praca została sfinansowana przez JSPS KAKENHI (granty nr JP20H05912, 20H05778, 20H05779) oraz przez program SATREPS (nr grantu. JPMJSA1706) wspólnego zespołu nadzorczego i JICA.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka do mikrowirówek 1,5 ml | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-dołkowa płytka | Corning | 353043 | |
| 50 ml probówka stożkowa | Corning | 352070 | |
| Calcofluor biały roztwór | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearPatrz | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | Można to zrobić lub kupić. |
| Konfokalny mikroskop laserowy | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Eksykator | SANPLATEC | Wykonane na zamówienie z akrylu. 30 cm (dł.), 30 cm (szer.), 14,5 cm (wys.) | |
| Szkiełko nakrywkowe szklane (18 & razy; 18 nr 1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Szkiełko mikroskopowe (76 i razy; 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Folia parafinowa | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyd | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Deoksycholan sodu | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sacharoza | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | dostarczone przez Dr. Kurihara | ||
| próżniowa | AS One | AS-01 | |
| Wibracyjna mikrokrajalnica | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Ksylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 | |
Bibliografia
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107(2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23(2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203(2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40(2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K. Science of the Rice Plant: Morphology. Food and Agriculture Policy Research Center. , Tokyo, Japan. (1993).
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484(2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12(2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
Przedruki i uprawnienia
