Ustandaryzowane przygotowanie pierścienia wieńcowego u szczurów i rejestracja w czasie rzeczywistym dynamicznych zmian napięcia wzdłuż średnicy naczynia

Choroba wieńcowa (CAD) jest powszechnie uznawana i uznawana za typową i reprezentatywną chorobę sercowo-naczyniową, stanowiącą główną przyczynę zgonów zarówno w krajach rozwiniętych, jak i rozwijających się^1,2. Jako droga dostarczania krwi i tlenu dla prawidłowych funkcji fizjologicznych serca, krążąca krew dostaje się do serca i odżywia je przez dwie główne tętnice wieńcowe i sieć naczyń krwionośnych na powierzchni mięśnia sercowego^3,4. Złogi cholesterolu i tłuszczu w tętnicach wieńcowych odcinają dopływ krwi do serca i gwałtowną reakcję zapalną układu naczyniowego, powodując miażdżycę, stabilną dławicę piersiową, niestabilną dławicę piersiową, zawał mięśnia sercowego lub nagłą śmierć sercową5^,6. W odpowiedzi na patologiczne zwężenie tętnic wieńcowych, kompensacyjne przyspieszone fizjologiczne bicie serca zaspokaja ukrwienie samego serca lub ważnych narządów ciała poprzez zwiększenie wydatku lewej komory⁷. Jeśli przedłużające się zwężenie tętnicy wieńcowej nie zostanie złagodzone na czas, w niektórych obszarach serca mogą rozwinąć się rozległe nowe naczynia krwionośne ⁸. Obecnie leczenie kliniczne CAD często przyjmuje trombolizę lekową lub chirurgiczną trombolizę mechaniczną i egzogenne bioniczne obejście naczyniowe z częstymi lekami i dużą niepełnosprawnością chirurgiczną⁹. W związku z tym funkcjonalne badanie fizjologicznej aktywności tętnic wieńcowych jest nadal pilnym przełomem w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych¹⁰.

Nie ma dostępnych technicznych środków do wykrywania fizjologicznej aktywności wieńcowej, z wyjątkiem bezprzewodowych systemów telemetrycznych, które mogą dynamicznie rejestrować in vivo ciśnienie wieńcowe, napięcie naczyniowe, nasycenie krwi tlenem i wartości pH¹¹. Dlatego, biorąc pod uwagę tajemniczość i złożoność tekstury tętnic wieńcowych, dokładna identyfikacja i izolacja tętnic wieńcowych są bez wątpienia najlepszym wyborem do zbadania wielu mechanizmów CAD in vitro⁴.

System multimiograficzny serii A, w szczególności detektor napięcia mikronaczyniowego z mikrografem (patrz Tabela Materiałów), jest bardzo dojrzałym urządzeniem rynkowym do rejestrowania in vitro zmian napięcia tkanek małych naczyń krwionośnych, limfatycznych i oskrzelowych o charakterystyce wysokiej precyzji i ciągłego dynamicznego zapisu¹². System ten jest szeroko stosowany do rejestrowania in vitro charakterystyk napięcia tkanek struktur jamowych o średnicach od 60 μm do 10 mm. Ciągłe cechy grzewcze platformy mikrofotografii drucianej w dużej mierze równoważą stymulację niekorzystnego środowiska zewnętrznego. Tymczasem stałe dane wejściowe mieszaniny gazowej i wartości pH pozwalają nam uzyskać dokładniejsze dane dotyczące napięcia naczyń krwionośnych w podobnym stanie fizjologicznym¹³. Jednak biorąc pod uwagę złożoność anatomicznej lokalizacji tętnic wieńcowych szczurów (Ryc. 1), jej izolacja była kłopotliwa i ograniczała badanie mechanizmu zróżnicowanych chorób sercowo-naczyniowych i opracowywanie leków. Dlatego niniejszy protokół szczegółowo przedstawia anatomiczną lokalizację i proces separacji tętnicy wieńcowej szczura, a następnie pomiar napięcia na platformie mikrofotografii drucianej¹⁴.

Protokół dla zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet Zarządzający Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2021-11). W niniejszym badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 tygodniowe). Szczury były trzymane w komorze dla zwierząt i mogły swobodnie pić i jeść podczas eksperymentu.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować fizjologiczny roztwór soli (PSS), rozpuszczając 118 mM NaCl, 4,7 mM K⁺, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D-glukozy i 5 mM HEPES (patrz Tabela materiałów).
2. Przygotować roztwór soli o wysokiej zawartości K⁺, rozpuszczając 58 mM NaCl, 60 mM K⁺, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM KH₂PO4, 1,2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D-glukozy i 5 mM HEPES.
3. Nasącz powyższe dwa roztwory i pęcherzyk zmieszanym gazem o stężeniach 95%_O2 i 5%_CO2. W międzyczasie utrzymuj wartości pH roztworu między 7,38 a 7,42 przy 2 mM NaOH,
   UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przygotowania roztworu można znaleźć w pliku reference¹⁵.

2. Rozwarstwienie tętnicy wieńcowej u szczura

1. Znieczulić szczura przez inhalację 2% izofluranu. Potwierdź głębokie znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi i, jeśli to konieczne, podaj dodatkowe środki znieczulające. Następnie natychmiast otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce na przenośnym stole operacyjnym zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem¹².
2. Po dysocjacji i usunięciu serca spuść pozostałą krew ze wszystkich komór serca, delikatnie ściskając medycznymi kleszczami z tworzywa sztucznego. Szybko umieścić wstępnie przetworzone serce na szalce Petriego zawierającej 95%_O2 + 5% nasyconego CO₂ PSS w temperaturze 4 °C, o wartości pH 7,40.
3. Aby dokładnie określić anatomiczne położenie tętnic wieńcowych, dostosuj pozycję izolowanego serca pod mikroskopem świetlnym zgodnie ze schematem ideowym (Rysunek 2A).
   UWAGA: W widoku z przodu prawa małżowina uszna i tętnica płucna znajdowały się odpowiednio w lewym górnym i prawym górnym rogu.
   1. Wytnij lewą i prawą komorę wzdłuż przegrody międzykomorowej od nasady tętnicy płucnej za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety (Ryc. 2B).
4. Aby oddzielić lewą i prawą tętnicę wieńcową od tkanki mięśnia sercowego, należy rozciąć prawą komorę pod optycznym mikroskopem anatomicznym, aby dokładnie odsłonić prawą gałąź tętnicy wieńcowej. Następnie określ położenie lewej tętnicy wieńcowej, obracając tkankę serca o 45° zgodnie z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 2D).
5. Po usunięciu otaczającej lepkiej tkanki mięśnia sercowego wyraźnie rozróżnij pulsującą lewą (około 5 mm) i prawą (około 5 mm) tętnicę wieńcową. Natychmiast oddzielić tętnice wieńcowe w środku i całkowicie zanurzyć w PSS w temperaturze 4 °C. Uzyskać pierścień tętniczy o średnicy około 2 mm, pionowo przecinając odłączoną tętnicę anatomicznymi nożyczkami, aby zarejestrować napięcie naczyniowe pod wpływem różnych bodźców (Rysunek 2E).

3. Zawieszenie i unieruchomienie pierścienia tętniczego

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego kroku, zobacz reference¹⁴.

1. Przygotować dwa druty ze stali nierdzewnej o średnicy 2 cm (patrz tabela materiałów) i wstępnie zanurzyć w roztworze PSS o temperaturze 4 °C nasyconym 95%_O2 + 5% CO_{2 .} Przeprowadź oba druty równolegle przez pierścień tętniczy zgodnie z kierunkiem naczynia pod optycznym mikroskopem anatomicznym i z drutami o równej długości odsłoniętymi na obu końcach jamy naczyniowej.
2. Zamocuj pierścień tętniczy drutem stalowym z przodu iz tyłu w kąpieli mikrofotografii drutu wypełnionej bulgoczącym PSS o zawartości 95% O₂ + 5% CO_{2 .} Obróć poziome pokrętło, aby uzyskać odpowiedni odstęp z przodu i z tyłu, tak aby oba przewody były poziome, a pierścień tętniczy znajdował się w naturalnym stanie relaksu.
3. Po zainstalowaniu kąpieli DMT na aparacie termostatycznym należy otworzyć oprogramowanie do akwizycji danych (patrz Tabela materiałów), aby upewnić się, że zarejestrowano odpowiedni sygnał ścieżki. Ustaw następujące parametry: kalibracja okularu (mm/dz.): 0.36; ciśnienie docelowe (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Czas uśredniania online: 2 s; Czas opóźnienia: 60 s. Etapy mocowania pierścienia tętniczego są pokazane w Rysunek 3.

4. Standaryzacja napięcia naczyniowego w pierścieniu tętniczym szczura

UWAGA: Dla różnych próbek z jamy, optymalne napięcie początkowe było konieczne, aby naczynia utrzymywały wyjątkową aktywność in vitro. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz reference¹⁵.

1. Osiągnij optymalne napięcie początkowe pierścienia tętniczego, stosując rozsądne napięcie wzdłuż średnicy naczynia.
   UWAGA: Na podstawie poprzedniego badania¹⁶, maksymalne napięcie wywołane przez agonistę zostało osiągnięte przy wartości czynnika k 0,90 przy początkowym naprężeniu rozciągającym 1,16 ± 0,04 mN/mm (wartości referencyjne dla różnych próbek naczyń: wartość k, 0,90-0,95; napięcie początkowe, 1,16-1,52 mN/mm).
2. W tym momencie ustaw wyświetlaną wartość napięcia naczyniowego na zero. Następnie zastosuj bodziec ciągnący o wartości 3 mN do pierścienia tętniczego, obracając spiralną oś wanny.
3. Po inkubacji przez 1 godzinę w nasyconym tlenem buforze PSS w temperaturze 37 °C, pH 7,40, ponownie ustawić wartość naprężenia na 0 mN na panelu kontroli naprężenia mikrografu drutu. Proces ustawiania napięcia początkowego pierścienia tętniczego jest pokazany na rysunku Rysunek 4.

5. Wykrywanie reaktywności pierścienia tętnicy wieńcowej

1. Wykonaj aktywność skurczową pierścienia tętnicy wieńcowej za pomocą techniki miografu drutowego¹⁴ i zweryfikuj w trzech oddzielnych operacjach, stymulując 60 mM roztworu K⁺ przez 10 minut każda.
2. Po każdej stymulacji płukać kąpiel nasyconym tlenem PSS, aż napięcie naczyniowe powróci do stanu początkowego.
   UWAGA: Tylko wtedy, gdy fluktuacja napięcia w trzech równoległych pomiarach była mniejsza niż 10%, a amplituda każdego skurczu była większa niż 1 mN/mm, kwalifikowane i wysoce aktywne pierścienie tętnicze mogły być używane do dalszych eksperymentów. Weryfikacja aktywności pierścienia wieńcowego szczura jest pokazana na Rysunek 5.

6. Leczenie pooperacyjne

1. Po operacji należy poddać zwierzęta eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
   UWAGA: W niniejszym badaniu zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie nadmiaru izofluranu.

Anatomicznie rozmieszczone, szczurze tętnice wieńcowe rozmieszczone i ukryte głęboko w tkance mięśnia sercowego nie były łatwe do rozpoznania. Porównując tętnice wieńcowe ludzi (Rysunek 1A) i szczurów (Rysunek 1B), przeprowadzono szybkie i dokładne oddzielenie tętnic wieńcowych szczurów zgodnie z procesem pobierania próbek w Rysunek 2. Po precyzyjnym zlokalizowaniu prawego małżowiny usznej, tętnicy płucnej i wierzchołka od przodu pod mikroskopem optycznym, mięsień sercowy został wypreparowany wzdłuż ciągłej czarnej linii pokazanej na Rysunek 2A. Około 5 mm odgałęzienia międzykomorowego tętnicy wieńcowej było wyraźnie odsłonięte dla naszego wzroku. Po dokładnym oddzieleniu lepkiego mięśnia sercowego otaczającego tętnicę przegrody międzykomorowej, użyto 2-centymetrowego drutu do przejścia przez 2-milimetrową pętlę tętnicy wieńcowej w kierunku wyrównania naczyniowego. Natychmiast odłączony 2-milimetrowy pierścień wieńcowy został następnie solidnie zamocowany w kąpieli DMT, jak pokazano na Rysunek 3. Po przyłożeniu początkowego napięcia 3 mN do pierścienia tętniczego (Rysunek 4), jego napięcie przekroczyło ponad 2 mN poprzez trzykrotne przyłożenie 60 mM K+ równolegle (Rysunek 5). W ten sposób powyższe procedury doprowadziły do powstania izolowanego pierścienia wieńcowego o doskonałej aktywności fizjologicznej.

Skumulowane K+ (20, 28, 39, 55, 77 i 108 mM) lub U46619 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 i 1 μM) zostały dodane do kąpieli DMT 620M, co spowodowało zależny od stężenia wzrost napięcia naczyniowego in vitro. Następne stężenie K+ lub U46619 (agonista receptora tromboksanu A2 (TP)) 15 zostało dodane, gdy efekt zwężenia naczyń osiągnął plateau. Wyniki eksperymentu są pokazane w Rysunek 6A,B. W przypadku izolowanych pierścieni wieńcowych zwężonych przez K+ (60 mM) i U46619 (0,3 μM), badany lek apigenina (1, 3, 10, 30 i 100 μM) powodował rozszerzenie naczyń krwionośnych w zaskakująco zależny od stężenia sposób (Rysunek 6C).

Rysunek 1: Odręczne rysunki tętnic wieńcowych ludzi i szczurów. (A) przedstawia charakterystykę powierzchownego rozmieszczenia lewej i prawej tętnicy wieńcowej z przodu ludzkiego serca i jest łatwo rozpoznawalny gołym okiem. (B) pokazuje szczurowi lewą i prawą tętnicę wieńcową głęboko w mięśniu sercowym i ich rozgałęzionej przegrodzie międzykomorowej. Skróty: RCA = prawa tętnica wieńcowa; LCA = lewa tętnica wieńcowa; ISB = gałąź przegrody międzykomorowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Diagram separacji tętnic wieńcowych u szczurów. (A) Prawe małżowiny uszne, tętnicę płucną, wierzchołek i linię anatomiczną serca szczura obserwowano z przodu pod mikroskopem świetlnym. (B) Światła lewej i prawej komory zostały nacięte wzdłuż przegrody od nasady tętnicy płucnej. (C) Anatomiczna lokalizacja lewej i prawej tętnicy wieńcowej oraz ich odgałęzienia przegrody międzykomorowej. (D) Pierścień tętnicy o średnicy 2 mm. (E) Pierścień tętniczy jest przymocowany drutem wzdłuż kierunku naczynia. Skróty: RA = prawe małżowina uszna; PA = tętnica płucna; RCA = prawa tętnica wieńcowa; ISB = gałąź przegrody międzykomorowej; LCA = lewa tętnica wieńcowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat procedury montażu tętnicy. Pierścień tętniczy z drutem przeniesiono do (A) i zaciśnięto na kąpieli DMT (B). Stalowy drut został zamocowany i przykręcony zgodnie z ruchem wskazówek zegara do lewego górnego (C) i lewego dolnego (D). (E) Szczęki zostały rozsunięte od siebie, aby zrobić miejsce na przejście drugiego przewodu przez pierścień tętniczy. (F) Drugi przewód przebiegał równolegle przez pierścień tętniczy. Stalowy drut został zamocowany i przykręcony zgodnie z ruchem wskazówek zegara do prawego górnego rogu (G) i prawego dolnego (H). (I) Szczęki rozstawione były luźno przykręcone, aby pozostawić pierścień tętniczy w jego naturalnym stanie. Zielone linie reprezentują przewody, a pomarańczowe cylindry reprezentują izolowany pierścień tętniczy o średnicy 2 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Procedura normalizacji pierścienia tętniczego. Po tym, jak napięcie stałego izolowanego pierścienia tętniczego powróciło do 0 mN, na pierścień tętniczy przykładano jednorazowo siłę ciągnącą 3 mN. Po 5 minutach napięcie naczyniowe zmniejszyło się do 2,5 mN. Zwiększając napięcie do 3 mN i utrzymując je na stałym poziomie przez 5 min, napięcie pierścienia tętnicy wieńcowej inicjowano do 0 mN i odpoczywano przez 1 godzinę do kolejnych badań nad napięciem naczyniowym różnych bodźców. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Badanie reaktywności naczyniowej. Trzy zastosowania 60 mM K+ stymulowały napięcie izolowanego pierścienia tętnicy wieńcowej do ponad 2 mN, a trzy pomiary były mniejsze niż 10%, co sugeruje lepszą aktywność naczyniową. Po każdej stymulacji kąpiel delikatnie spłukiwano nasyconym tlenem roztworem PSS o temperaturze 37 °C, aż do momentu, gdy napięcie wynosiło 0 mN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywny znacznik skumulowanego skurczu dawki tętnicy wieńcowej szczura przez K+ lub U46619. Wraz ze wzrostem dawki K+ (A) i U46619 (B) siła zwiększała się w zależności od dawki. (C) odnosił się do rozkurczającego działania apigeniny na skurczony pierścień tętniczy o stężeniu 60 mM K+- i 0,3 μM U46619 w sposób zależny od stężenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.