Artykuł metodologiczny

Ustandaryzowane przygotowanie pierścienia wieńcowego u szczurów i rejestracja w czasie rzeczywistym dynamicznych zmian napięcia wzdłuż średnicy naczynia

DOI:

10.3791/64121

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje technikę miografu drutowego do pomiaru reaktywności naczyniowej tętnicy wieńcowej szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako kluczowe zdarzenie chorób układu sercowo-naczyniowego, choroba wieńcowa (CAD) jest powszechnie uważana za głównego winowajcę miażdżycy, zawału mięśnia sercowego i dławicy piersiowej, które poważnie zagrażają życiu i zdrowiu ludzi na całym świecie. Jednak sposób rejestrowania dynamicznych cech biomechanicznych izolowanych naczyń krwionośnych od dawna intryguje ludzi. Tymczasem precyzyjne pozycjonowanie i izolacja tętnic wieńcowych w celu pomiaru dynamicznych zmian napięcia naczyniowego in vitro stała się trendem w opracowywaniu leków na CAD. Niniejszy protokół opisuje makroskopową identyfikację i mikroskopowe oddzielenie tętnic wieńcowych szczurów. Funkcję skurczu i dylatacji pierścienia tętnicy wieńcowej wzdłuż średnicy naczynia monitorowano za pomocą opracowanego systemu multimiografu. Ustandaryzowane i zaprogramowane protokoły pomiaru napięcia pierścienia wieńcowego, od pobierania próbek po akwizycję danych, ogromnie poprawiają powtarzalność danych eksperymentalnych, co zapewnia autentyczność zapisów napięcia naczyniowego po interwencji fizjologicznej, patologicznej i farmakologicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba wieńcowa (CAD) jest powszechnie uznawana i uznawana za typową i reprezentatywną chorobę sercowo-naczyniową, stanowiącą główną przyczynę zgonów zarówno w krajach rozwiniętych, jak i rozwijających się1,2. Jako droga dostarczania krwi i tlenu dla prawidłowych funkcji fizjologicznych serca, krążąca krew dostaje się do serca i odżywia je przez dwie główne tętnice wieńcowe i sieć naczyń krwionośnych na powierzchni mięśnia sercowego3,4. Złogi cholesterolu i tłuszczu w tętnicach wieńcowych odcinają dopływ krwi do serca i gwałtowną reakcję zapalną układu naczyniowego, powodując miażdżycę, stabilną dławicę piersiową, niestabilną dławicę piersiową, zawał mięśnia sercowego lub nagłą śmierć sercową5,6. W odpowiedzi na patologiczne zwężenie tętnic wieńcowych, kompensacyjne przyspieszone fizjologiczne bicie serca zaspokaja ukrwienie samego serca lub ważnych narządów ciała poprzez zwiększenie wydatku lewej komory7. Jeśli przedłużające się zwężenie tętnicy wieńcowej nie zostanie złagodzone na czas, w niektórych obszarach serca mogą rozwinąć się rozległe nowe naczynia krwionośne 8. Obecnie leczenie kliniczne CAD często przyjmuje trombolizę lekową lub chirurgiczną trombolizę mechaniczną i egzogenne bioniczne obejście naczyniowe z częstymi lekami i dużą niepełnosprawnością chirurgiczną9. W związku z tym funkcjonalne badanie fizjologicznej aktywności tętnic wieńcowych jest nadal pilnym przełomem w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych10.

Nie ma dostępnych technicznych środków do wykrywania fizjologicznej aktywności wieńcowej, z wyjątkiem bezprzewodowych systemów telemetrycznych, które mogą dynamicznie rejestrować in vivo ciśnienie wieńcowe, napięcie naczyniowe, nasycenie krwi tlenem i wartości pH11. Dlatego, biorąc pod uwagę tajemniczość i złożoność tekstury tętnic wieńcowych, dokładna identyfikacja i izolacja tętnic wieńcowych są bez wątpienia najlepszym wyborem do zbadania wielu mechanizmów CAD in vitro4.

System multimiograficzny serii A, w szczególności detektor napięcia mikronaczyniowego z mikrografem (patrz Tabela Materiałów), jest bardzo dojrzałym urządzeniem rynkowym do rejestrowania in vitro zmian napięcia tkanek małych naczyń krwionośnych, limfatycznych i oskrzelowych o charakterystyce wysokiej precyzji i ciągłego dynamicznego zapisu12. System ten jest szeroko stosowany do rejestrowania in vitro charakterystyk napięcia tkanek struktur jamowych o średnicach od 60 μm do 10 mm. Ciągłe cechy grzewcze platformy mikrofotografii drucianej w dużej mierze równoważą stymulację niekorzystnego środowiska zewnętrznego. Tymczasem stałe dane wejściowe mieszaniny gazowej i wartości pH pozwalają nam uzyskać dokładniejsze dane dotyczące napięcia naczyń krwionośnych w podobnym stanie fizjologicznym13. Jednak biorąc pod uwagę złożoność anatomicznej lokalizacji tętnic wieńcowych szczurów (Ryc. 1), jej izolacja była kłopotliwa i ograniczała badanie mechanizmu zróżnicowanych chorób sercowo-naczyniowych i opracowywanie leków. Dlatego niniejszy protokół szczegółowo przedstawia anatomiczną lokalizację i proces separacji tętnicy wieńcowej szczura, a następnie pomiar napięcia na platformie mikrofotografii drucianej14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół dla zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet Zarządzający Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2021-11). W niniejszym badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 tygodniowe). Szczury były trzymane w komorze dla zwierząt i mogły swobodnie pić i jeść podczas eksperymentu.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować fizjologiczny roztwór soli (PSS), rozpuszczając 118 mM NaCl, 4,7 mM K+, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgCl2∙6H2O, 25 mM NaHCO3, 11 mM D-glukozy i 5 mM HEPES (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotować roztwór soli o wysokiej zawartości K+, rozpuszczając 58 mM NaCl, 60 mM K+, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgCl2∙6H2O, 25 mM NaHCO3, 11 mM D-glukozy i 5 mM HEPES.
  3. Nasącz powyższe dwa roztwory i pęcherzyk zmieszanym gazem o stężeniach 95%O2 i 5%CO2. W międzyczasie utrzymuj wartości pH roztworu między 7,38 a 7,42 przy 2 mM NaOH,
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przygotowania roztworu można znaleźć w pliku reference15.

2. Rozwarstwienie tętnicy wieńcowej u szczura

  1. Znieczulić szczura przez inhalację 2% izofluranu. Potwierdź głębokie znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi i, jeśli to konieczne, podaj dodatkowe środki znieczulające. Następnie natychmiast otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce na przenośnym stole operacyjnym zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem12.
  2. Po dysocjacji i usunięciu serca spuść pozostałą krew ze wszystkich komór serca, delikatnie ściskając medycznymi kleszczami z tworzywa sztucznego. Szybko umieścić wstępnie przetworzone serce na szalce Petriego zawierającej 95%O2 + 5% nasyconego CO2 PSS w temperaturze 4 °C, o wartości pH 7,40.
  3. Aby dokładnie określić anatomiczne położenie tętnic wieńcowych, dostosuj pozycję izolowanego serca pod mikroskopem świetlnym zgodnie ze schematem ideowym (Rysunek 2A).
    UWAGA: W widoku z przodu prawa małżowina uszna i tętnica płucna znajdowały się odpowiednio w lewym górnym i prawym górnym rogu.
    1. Wytnij lewą i prawą komorę wzdłuż przegrody międzykomorowej od nasady tętnicy płucnej za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety (Ryc. 2B).
  4. Aby oddzielić lewą i prawą tętnicę wieńcową od tkanki mięśnia sercowego, należy rozciąć prawą komorę pod optycznym mikroskopem anatomicznym, aby dokładnie odsłonić prawą gałąź tętnicy wieńcowej. Następnie określ położenie lewej tętnicy wieńcowej, obracając tkankę serca o 45° zgodnie z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 2D).
  5. Po usunięciu otaczającej lepkiej tkanki mięśnia sercowego wyraźnie rozróżnij pulsującą lewą (około 5 mm) i prawą (około 5 mm) tętnicę wieńcową. Natychmiast oddzielić tętnice wieńcowe w środku i całkowicie zanurzyć w PSS w temperaturze 4 °C. Uzyskać pierścień tętniczy o średnicy około 2 mm, pionowo przecinając odłączoną tętnicę anatomicznymi nożyczkami, aby zarejestrować napięcie naczyniowe pod wpływem różnych bodźców (Rysunek 2E).

3. Zawieszenie i unieruchomienie pierścienia tętniczego

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego kroku, zobacz reference14.

  1. Przygotować dwa druty ze stali nierdzewnej o średnicy 2 cm (patrz tabela materiałów) i wstępnie zanurzyć w roztworze PSS o temperaturze 4 °C nasyconym 95%O2 + 5% CO2 . Przeprowadź oba druty równolegle przez pierścień tętniczy zgodnie z kierunkiem naczynia pod optycznym mikroskopem anatomicznym i z drutami o równej długości odsłoniętymi na obu końcach jamy naczyniowej.
  2. Zamocuj pierścień tętniczy drutem stalowym z przodu iz tyłu w kąpieli mikrofotografii drutu wypełnionej bulgoczącym PSS o zawartości 95% O2 + 5% CO2 . Obróć poziome pokrętło, aby uzyskać odpowiedni odstęp z przodu i z tyłu, tak aby oba przewody były poziome, a pierścień tętniczy znajdował się w naturalnym stanie relaksu.
  3. Po zainstalowaniu kąpieli DMT na aparacie termostatycznym należy otworzyć oprogramowanie do akwizycji danych (patrz Tabela materiałów), aby upewnić się, że zarejestrowano odpowiedni sygnał ścieżki. Ustaw następujące parametry: kalibracja okularu (mm/dz.): 0.36; ciśnienie docelowe (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Czas uśredniania online: 2 s; Czas opóźnienia: 60 s. Etapy mocowania pierścienia tętniczego są pokazane w Rysunek 3.

4. Standaryzacja napięcia naczyniowego w pierścieniu tętniczym szczura

UWAGA: Dla różnych próbek z jamy, optymalne napięcie początkowe było konieczne, aby naczynia utrzymywały wyjątkową aktywność in vitro. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz reference15.

  1. Osiągnij optymalne napięcie początkowe pierścienia tętniczego, stosując rozsądne napięcie wzdłuż średnicy naczynia.
    UWAGA: Na podstawie poprzedniego badania16, maksymalne napięcie wywołane przez agonistę zostało osiągnięte przy wartości czynnika k 0,90 przy początkowym naprężeniu rozciągającym 1,16 ± 0,04 mN/mm (wartości referencyjne dla różnych próbek naczyń: wartość k, 0,90-0,95; napięcie początkowe, 1,16-1,52 mN/mm).
  2. W tym momencie ustaw wyświetlaną wartość napięcia naczyniowego na zero. Następnie zastosuj bodziec ciągnący o wartości 3 mN do pierścienia tętniczego, obracając spiralną oś wanny.
  3. Po inkubacji przez 1 godzinę w nasyconym tlenem buforze PSS w temperaturze 37 °C, pH 7,40, ponownie ustawić wartość naprężenia na 0 mN na panelu kontroli naprężenia mikrografu drutu. Proces ustawiania napięcia początkowego pierścienia tętniczego jest pokazany na rysunku Rysunek 4.

5. Wykrywanie reaktywności pierścienia tętnicy wieńcowej

  1. Wykonaj aktywność skurczową pierścienia tętnicy wieńcowej za pomocą techniki miografu drutowego14 i zweryfikuj w trzech oddzielnych operacjach, stymulując 60 mM roztworu K+ przez 10 minut każda.
  2. Po każdej stymulacji płukać kąpiel nasyconym tlenem PSS, aż napięcie naczyniowe powróci do stanu początkowego.
    UWAGA: Tylko wtedy, gdy fluktuacja napięcia w trzech równoległych pomiarach była mniejsza niż 10%, a amplituda każdego skurczu była większa niż 1 mN/mm, kwalifikowane i wysoce aktywne pierścienie tętnicze mogły być używane do dalszych eksperymentów. Weryfikacja aktywności pierścienia wieńcowego szczura jest pokazana na Rysunek 5.

6. Leczenie pooperacyjne

  1. Po operacji należy poddać zwierzęta eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie nadmiaru izofluranu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomicznie rozmieszczone, szczurze tętnice wieńcowe rozmieszczone i ukryte głęboko w tkance mięśnia sercowego nie były łatwe do rozpoznania. Porównując tętnice wieńcowe ludzi (Rysunek 1A) i szczurów (Rysunek 1B), przeprowadzono szybkie i dokładne oddzielenie tętnic wieńcowych szczurów zgodnie z procesem pobierania próbek w Rysunek 2. Po precyzyjnym zlokalizowaniu prawego małżowiny usznej, tętnicy płucnej i wierzchołka od przodu pod mikroskopem optycznym, mięsi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenie mikrokrążenia wieńcowego, które dotyczy szerokiego grona pacjentów z chorobą wieńcową, zostało stopniowo rozpoznane i stało się podstawą do odpowiedniej perfuzji mięśnia sercowego. Biorąc pod uwagę poważne powikłania nagłej choroby niedokrwiennej serca i choroby sercowo-naczyniowej, terminowe zapobieganie i leczenie farmakologiczne są niezwykle ważne dla osoby klinicznej z CAD17. Nieuchronnie tajemnica anatomii tętnic wieńcowych i złożoność jej struktury fizjologicznej poważnie ogranicz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez kluczowy projekt badawczo-rozwojowy Planu Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2022YFS0438), Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (82104533), Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (2020M683273) oraz Departament Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2021YJ0175).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ApigeninSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny150731
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA501330
D-glukozaSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA610219
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinyS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100781
LabChart Professional wersja 8.3 ADInstruments, Australia—
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100288
System Multi miografu Danish Myo Technology, Aarhus, Dania620M
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100865
Druty staloweDanish Myo Technology, Aarhus, Dania400447
U46619Sigma, Stany ZjednoczoneD8174

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malakar, A. K., et al. A review on coronary artery disease, its risk factors, and therapeutics. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 16812-16823 (2019).
  2. Murray, C., et al. national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: A systematic analysis for the global burden of disease Study 2013. The Lancet. 385 (9963), 117-171 (2015).
  3. Zhang, Y., et al. Adenosine and adenosine receptor-mediated action in coronary microcirculation. Basic Research in Cardiology. 116 (1), 22(2021).
  4. Allaqaband, H., Gutterman, D. D., Kadlec, A. O. Physiological consequences of coronary arteriolar dysfunction and its influence on cardiovascular disease. Physiology. 33 (5), 338-347 (2018).
  5. Minelli, S., Minelli, P., Montinari, M. R. Reflections on atherosclerosis: Lesson from the past and future research directions. Journal of Multidisciplinary Healthcare. 13, 621-633 (2020).
  6. Alvarez-Alvarez, M. M., Zanetti, D., Carreras-Torres, R., Moral, P., Athanasiadis, G. A survey of sub-saharan gene flow into the mediterranean at risk loci for coronary artery disease. European Journal of Human Genetics. 25 (4), 472-476 (2017).
  7. LaCombe, P., Tariq, M. A., Lappin, S. L. Physiology, Afterload Reduction. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
  8. Gutterman, D. D., et al. The human microcirculation: regulation of flow and beyond. Circulation Research. 118 (1), 157-172 (2016).
  9. Wang, G., Li, F., Hou, X. Complementary and alternative therapies for stable angina pectoris of coronary heart disease: A protocol for systematic review and network meta-analysis. Medicine. 101 (7), 28850(2022).
  10. Markousis-Mavrogenis, G., et al. Coronary microvascular disease: the "meeting point" of cardiology. European Journal of Clinical Investigation. 52 (5), 13737(2021).
  11. Allison, B. J., et al. Fetal in vivo continuous cardiovascular function during chronic hypoxia. The Journal of Physiology. 594 (5), 1247-1264 (2016).
  12. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
  13. Liu, L., et al. Comparison of Ca2+ handling for the regulation of vasoconstriction between rat coronary and renal arteries. Journal of Vascular Research. 56 (4), 191-203 (2019).
  14. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. Journal of Visualized Experiments. (138), e58064(2018).
  15. Guo, P., et al. Coronary hypercontractility to acidosis owes to the greater activity of TMEM16A/ANO1 in the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 139, 111615(2021).
  16. Ping, N. N., Cao, L., Xiao, X., Li, S., Cao, Y. X. The determination of optimal initial tension in rat coronary artery using wire myography. Physiological Research. 63 (1), 143-146 (2014).
  17. Niccoli, G., Scalone, G., Lerman, A., Crea, F. Coronary microvascular obstruction in acute myocardial infarction. European Heart Journal. 37 (13), 1024-1033 (2016).
  18. Mumma, B., Flacke, N. Current diagnostic and therapeutic strategies in microvascular angina. Current Emergency and Hospital Medicine Reports. 3 (1), 30-37 (2015).
  19. Lanza, G. A., Parrinello, R., Figliozzi, S. Management of microvascular angina pectoris. American Journal of Cardiovascular Drugs. 14 (1), 31-40 (2014).
  20. Zhu, T. Q., et al. Beneficial effects of intracoronary tirofiban bolus administration following upstream intravenous treatment in patients with ST-elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention: The ICT-AMI study. International Journal of Cardiology. 165 (3), 437-443 (2013).
  21. Huang, D., et al. Restoration of coronary flow in patients with no-reflow after primary coronary intervention of acute myocardial infarction (RECOVER). American Heart Journal. 164 (3), 394-401 (2012).
  22. Fu, W. J., et al. Anti-atherosclerosis and cardio-protective effects of the Angong Niuhuang Pill on a high fat and vitamin D3 induced rodent model of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 195, 118-126 (2017).
  23. Li, J., et al. Chinese medicine She-Xiang-Xin-Tong-Ning, containing moschus, corydalis and ginseng, protects from myocardial ischemia injury via angiogenesis. The American Journal of Chinese Medicine. 48 (1), 107-126 (2020).
  24. Wu, W., et al. Three dimensional reconstruction of coronary artery stents from optical coherence tomography: Experimental validation and clinical feasibility. Scientific Reports. 11 (1), 1-15 (2021).
  25. Liu, M., et al. Janus-like role of fibroblast growth factor 2 in arteriosclerotic coronary artery disease: Atherogenesis and angiogenesis. Atherosclerosis. 229 (1), 10-17 (2013).
  26. Hu, G., Li, X., Zhang, S., Wang, X. Association of rat thoracic aorta dilatation by astragaloside IV with the generation of endothelium-derived hyperpolarizing factors and nitric oxide, and the blockade of Ca2+ channels. Biomedical reports. 5 (1), 27-34 (2016).
  27. Guo, Y., et al. Anticonstriction effect of MCA in rats by danggui buxue decoction. Frontiers in Pharmacology. 12, 749915(2021).
  28. Jing, Y., et al. Apigenin relaxes rat intrarenal arteries, depresses Ca2+-activated Cl− currents and augments voltage-dependent K+ currents of the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 115, 108926(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

T tnice wie cowe szczurarejestracja napi cia naczyniowegomyograf drutowypomiar rednicy naczyniaizolacja pier cienia t tniczegoskurcz indukowany potasemtest wazodylatacjimodel chor b uk adu sercowo naczyniowego

Powiązane artykuły