Artykuł metodologiczny

Izolacja i przetwarzanie mysich białych adipocytów do analiz transkryptomu i epigenomu

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64128

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Van Andel Institute, 2Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 3Department of General and Visceral Surgery, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół podsumowuje uniwersalną metodę izolacji, oczyszczania i przetwarzania mysich białych adipocytów zoptymalizowanych pod kątem sekwencjonowania całkowitego RNA, ekstrakcji jąder metodą SONication (NEXSON) i ChIP-seq.

Streszczenie

Otyłość jest złożoną chorobą, na którą wpływ mają genetyka, epigenetyka, środowisko i ich interakcje. Dojrzałe adipocyty reprezentują główny typ komórek w białej tkance tłuszczowej. Zrozumienie, w jaki sposób adipocyty funkcjonują i reagują na sygnały (epi)genetyczne i środowiskowe, jest niezbędne do zidentyfikowania przyczyny (przyczyn) otyłości. RNA i chromatyna zostały wcześniej wyizolowane z adipocytów za pomocą trawienia enzymatycznego. Ponadto opracowano protokoły izolacji jądrowej, w których oczyszczanie odbywa się poprzez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) transgenicznych reporterów specyficznych dla adipocytów. Jednym z największych wyzwań dla osiągnięcia wysokiej wydajności i jakości podczas takich protokołów jest znaczna ilość lipidów zawartych w tkance tłuszczowej. Niniejszy protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę izolowania dojrzałych adipocytów, która wykorzystuje heptan do oddzielania lipidów od celów zainteresowania (RNA / chromatyna). Otrzymany RNA ma wysoką integralność i generuje wysokiej jakości wyniki sekwencjonowania RNA. Podobnie, procedura ta poprawia wydajność jąder i generuje powtarzalne wyniki sekwencji ChIP-seq we wszystkich próbkach. W związku z tym obecne badanie zapewnia wiarygodny i uniwersalny protokół izolacji mysich adipocytów odpowiedni do badań transkryptomu całego genomu i epigenomu.

Wprowadzenie

Otyłość jest zazwyczaj rozumiana jako choroba nadmiernego gromadzenia tłuszczu, która przyczynia się do zwiększonego ryzyka cukrzycy typu 2, choroby kardiometabolicznej i kilku form nowotworów1,2,3. Podczas gdy obecna wiedza na temat otyłości jest silnie zakorzeniona w genetyce (zarówno z badań na ludziach, jak i na gryzoniach), około 30%-70% predyspozycji do chorób metabolicznych jest pochodzenia niegenetycznego4,5,6,7,8 i pozostaje niezdefiniowany.

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w leczeniu otyłości i innych chorób metabolicznych9,10. Tkanka tłuszczowa składa się z dojrzałych adipocytów i zrębowej frakcji naczyniowej, w tym preadipocytów, komórek śródbłonka i komórek odpornościowych. Nadal nie jest jasne, w jaki sposób każdy typ komórek przyczynia się do otyłości i jak dysregulacja adipocytów przyczynia się do otyłości. Powtarzalne i skuteczne protokoły izolacji i oczyszczania dla badań epigenomu dojrzałych adipocytów są interesujące dla tej dziedziny.

Dojrzałe adipocyty od dawna są izolowane do analiz ekspresji genów11 i badań epigenomu12,13. Istnieją dwie główne strategie izolowania adipocytów. Pierwszym z nich jest zastosowanie trawienia enzymatycznego w celu oddzielenia dojrzałych adipocytów od reszty typów komórek we frakcji naczyniowej zrębu 11,14. Drugim jest odbicie tkanki tłuszczowej w celu uwolnienia nienaruszonych jąder, a następnie odzyskanie jąder w oparciu o fluorescencyjny reporter metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)12,13, co wymaga specjalistycznych transgenicznych modeli reporterowych. Wyzwaniem technicznym w każdym przypadku jest to, że dojrzałe adipocyty zawierają wysokie stężenia lipidów (Rysunek 1), co obniża jakość i/lub wydajność całkowitego RNA15,16 i nuclei17. W tym miejscu opisano zoptymalizowaną procedurę trawienia enzymatycznego do izolowania dojrzałych adipocytów, w której zaletą heptanu jest szybkie i skuteczne rozpuszczenie i usunięcie lipidów18 przed ekstrakcją RNA lub etapami izolacji jąder przez ekstrakcję jąder metodą SONication (NEXSON)19. Protokół zapewnia doskonałe odzyskiwanie i jakość całkowitego RNA do badań całego genomu oraz znacznie poprawia wydajność nienaruszonych jąder w celu uzyskania powtarzalnego sekwencjonowania ChIP.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), numer protokołu: 18-10-028. 12-tygodniowe samce myszy C57BL/6J zostały poddane eutanazji za pomocą CO2 i wypreparowane w celu zebrania poduszeczek tłuszczowych z białej tkanki tłuszczowej najądrza (eWAT).

1. Izolacja adipocytów

  1. Przygotować bufor do wytrawiania (tabela 1) i ogrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Umieść poduszeczkę tłuszczową z białej tkanki tłuszczowej najądrza (eWAT) na szalce Petriego. Pokrój tkankę na małe kawałki (5 mm x 5 mm) za pomocą kleszczy i skalpela w 5 ml DMEM.
    UWAGA: Preferowana jest szalka Petriego, która nie zawiera powłoki adhezyjnej komórek. Ważne jest również, aby delikatnie trzymać poduszkę tłuszczową, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Im bardziej tkanka tłuszczowa jest przetwarzana, tym bardziej obniża się wydajność. Metoda skalpela/kleszczy jest lepsza niż cięcie poduszek tłuszczowych samymi nożyczkami lub kleszczami, ponieważ mogą one uszkodzić adipocyty.
  3. Odcedź nadmiar DMEM, nie naruszając resztek tkanki.
    UWAGA: Nie zbieraj resztek tkanek z powierzchni szalki Petriego.
  4. Dodać 5 ml buforu wytrawiającego do szalki Petriego, zamieszać, aby uwolnić fragmenty tkanek z naczynia i wlać całą zawartość do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Powtarzaj proces, aż wszystkie fragmenty tkanek zostaną przeniesione do probówki wirówkowej.
  5. Dodać pozostały bufor wytrawiający do probówki wirówkowej tak, aby końcowa objętość wynosiła ~20 ml.
  6. Inkubować fragmenty tkanek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 100 obr./min przez 20-30 minut lub do momentu, gdy fragmenty tkanek będą mniejsze niż 1 mm x 1 mm.
  7. Dodać 0,4 ml 0,5 M EDTA i 0,2 ml 0,5 M EGTA do probówki wirówkowej i kontynuować wytrząsanie w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  8. Przenieść zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml przez filtr drobnoziarnisty (420 μm, patrz tabela materiałów) na wierzchu innej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w celu usunięcia niestrawionej tkanki.
  9. Odwirować probówkę wirówkową o pojemności 50 ml przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby oddzielić czyste adipocyty (unoszące się na górze) od frakcji naczyniowej zrębu (osad na dole) (Rysunek 2A).
  10. Wlej pływającą warstwę adipocytów do nowej probówki o pojemności 50 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    UWAGA: Unikaj używania końcówek pipet do przenoszenia pływających adipocytów, ponieważ mogą one przyklejać się do ścianki końcówki pipety (zmniejszając w ten sposób wydajność). Część buforu wytrawiającego zostanie przeniesiona do nowej probówki; Użyj strzykawki i igły, aby usunąć resztki buforu trawiennego spod warstwy adipocytów.
  11. Natychmiast użyj oczyszczonych adipocytów do całkowitej ekstrakcji RNA (krok 2.) i/lub sekwencji ChIP (krok 3 i krok 4.
    UWAGA: Użytkownik może zdecydować się na użycie całego ekstraktu z adipocytów w kroku 2. lub krok 3., w zależności od celu badawczego. Użytkownik może również podzielić cały ekstrakt z adipocytów na dwie porcje i kontynuować krok 2. i krok 3. równolegle w celu uzyskania wyników analiz z biologicznie identycznych próbek.

2. Całkowita ekstrakcja RNA

UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie chemicznym.

  1. Dodać odczynnik do izolacji RNA (1 ml) (patrz tabela materiałów) do oczyszczonych adipocytów w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (krok 1.11).
  2. Pipetować w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby dokładnie rozpuścić adipocyty w odczynniku do izolacji RNA i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
  3. Inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 0,5 ml heptanu do probówki wirówkowej i wirować z pełną prędkością przez 30 s.
    UWAGA: Lipidy rozpuszczą się w heptanie (Rysunek 2B).
  5. Odwirować probówkę o sile 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Pobrać dolną warstwę odczynnika do izolacji RNA za pomocą strzykawki i igły 30 G i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Dodać 0,1 ml 1bromo-3chloropropanu (patrz tabela materiałów) do ekstraktu odczynnika izolującego RNA i wirować z pełną prędkością przez 30 s. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  8. Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety zebrać górną fazę wodną i przenieść ją do nowej probówki.
  9. Dodać 0,5 ml izopropanolu i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować probówkę o sile 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: RNA zostanie wytrącone w postaci osadu na dnie probówki.
  10. Użyć pipety, aby usunąć supernatant, uważając, aby nie dotknąć osadu.
  11. Dodaj 1 ml 75% EtOH i krótko wiruj na pełnych obrotach.
  12. Odwirować probówkę o stężeniu 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety. Nie naruszaj pelletu.
  13. Suszyć granulki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut lub do momentu, gdy granulka stanie się klarowna/przezroczysta.
  14. Rozpuść osad w 50 μl wody wolnej od nukleaz.

3. Fiksacja adipocytów dla ChIP-seq

UWAGA: Wykonaj krok 3. w kapturze chemicznym.

  1. Dodaj 0,3 ml 0,5 M EDTA, 0,2 ml 0,5 M EGTA, 14,8 ml DMEM i 10 ml heptanu do probówki 50 ml zawierającej izolowane adipocyty (krok 1.11).
  2. Dodać 0,7 ml 16% formaldehydu (końcowe 0,7%) i obracać na rotatorze probówki (patrz tabela materiałów) z prędkością 10 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ustaw minutnik i licz przez 5 minut. W przypadku przetwarzania wielu próbek, formaldehyd należy dodawać sekwencyjnie w odstępach 30 sekund, aby umożliwić precyzyjny i porównywalny czas utrwalania we wszystkich próbkach.
  3. Dodać 1,78 ml 1,25 M glicyny (końcowe 0,125 M) i mieszać na rotatorze przy 10 obr./min nie dłużej niż 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Formaldehyd pozostaje aktywny nawet po dodaniu glicyny. Dlatego ważne jest, aby oddzielić warstwy przez odwirowanie (etap 3.4.) natychmiast po 5-minutowym etapie inkubacji. Jeśli jest więcej niż jedna próbka, dodaj glicynę do każdej próbki, aby zatrzymać reakcję sekwencyjnie w odstępach 30 sekund.
  4. Następnie odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Muszą istnieć trzy oczywiste i dyskretne warstwy cieczy (Rysunek 2C). Środkowa biała warstwa zawiera utrwalone adipocyty.
  5. Użyj końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść warstwę adipocytów (białą) do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, minimalizując ilość utrwalacza i heptanu przenoszonych do nowej probówki.
  6. Napełnić probówkę 10 ml (temperatura pokojowa) DMEM uzupełnionym tabletką koktajlu inhibitorów proteazy (, patrz tabela materiałów). Dokładnie wymieszaj przez odwrócenie.
  7. Odwirować probówkę o stężeniu ≤200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Utrzymuj siłę wirowania na poziomie 100 x g, aby zminimalizować pękanie komórek.
  8. Powtórz kroki 3.5.-3.7. 1x przed przejściem do kroku 3.9.
  9. Użyj końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść warstwę adipocytów (białą) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml lub 2 ml.
  10. Odwirować probówkę o sile 100-200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml usunąć heptan (górna warstwa) i DMEM (dolna warstwa).
  11. Utrwalone adipocyty należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy, aż do użycia.

4. Ekstrakcja jąder i ścinanie chromatyny

UWAGA: Ta procedura jest zaadaptowana z Arrigoni et al.19.

  1. Włącz sonikator (patrz Tabela Materiałów) i ustaw moc szczytową na 75 W, współczynnik wypełnienia na 2% i 200 cykli/burst, przy chillerze łaźni wodnej ustawionym na 20 °C.
  2. Dodać koktajl inhibitorów proteazy () do buforu laboratoryjnego Farnham i buforu ścinającego (Tabela 1).
    UWAGA: Zapoznaj się z kilkoma innymi sugerowanymi dźwiękami i parametrami w Arrigoni et al.19.
  3. Ponownie zawiesić utrwalone adipocyty (od kroku 3.) za pomocą 750-800 μl lodowatego buforu laboratoryjnego Farnham w probówce sonikacyjnej o pojemności 1 ml (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Zaleca się, aby nie napełniać rurki do pełnej pojemności. W przeciwnym razie adipocyty będą unosić się do najwyższej części rurki, co zmniejszy skuteczność sonikacji.
  4. Sonizacja próbki przez 2,5 min.
    UWAGA: Sprawdź ekstrakcję jąder pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby określić, czy potrzebna jest dalsza sonikacja. Jądra muszą być okrągłe i nienaruszone, jak pokazano na rysunku Rysunek 2D.
  5. Zanim przejdziesz dalej, ustaw moc szczytową sonikatora na 140 W, współczynnik wypełnienia na 5% i 200 cykli/burst, przy chłodziarce w łaźni wodnej ustawionej na 4 °C.
  6. Za pomocą pipety przenieś supernatant do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant z osadu (jąder) i zachować osad.
  8. Przemyj granulki 1 ml buforu laboratoryjnego Farnham na lodzie.
  9. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant za pomocą pipety i zachować osad.
  10. Powtórz kroki 4.8.-4.9. 1x przed przejściem do kroku 4.11.
    UWAGA: Wyizolowane i przemyte jądra można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 miesiące do czasu dalszego użycia.
  11. Ponownie zawiesić wyizolowane jądra w 1 ml buforu ścinającego i przenieść je do nowej probówki sonicyjnej o pojemności 1 ml. Upewnij się, że w probówce nie ma pęcherzyków powietrza.
  12. Sonikować jądra w sonikatorze z mocą szczytową 140 W, współczynnikiem wypełnienia 5% i 200 cyklami/impulsem przez 12 minut, aby ścinać chromatynę w temperaturze 4 °C.
  13. Przenieś lizat do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Ścięta chromatyna jest uwalniana z jąder i jest zawarta w buforze (lizacie).
  14. Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Przenieść supernatant (chromatynę) do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  15. Ściętą chromatynę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 10 dni lub w temperaturze -80 °C przez 3 miesiące do momentu dalszego użycia.
    UWAGA: Dodatkowa kontrola jakości: Porcja 25 μl ściętej chromatyny w celu odsieciowania i usunięcia RNA za pomocą RNazy wolnej od DNaz zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem19. W niniejszym badaniu otrzymane DNA oczyszczono za pomocą zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta, DNA określono ilościowo za pomocą zestawu do kwantyfikacji DNA na przyrządzie do kwantyfikacji DNA, a rozmiar fragmentu oceniono za pomocą automatycznego przyrządu do elektroforezy (patrz tabela materiałów). Wielkość ściętej chromatyny powinna mieścić się w zakresie 100-800 pz. Reszta chromatyny ścinającej może przejść do dalszej aplikacji ChIP-Seq.

Wyniki

Adipocyty wyizolowano z sześciu poduszek tłuszczowych, przeprowadzono ekstrakcję RNA w oparciu o heptan (krok 2.), a otrzymane RNA przeanalizowano za pomocą automatycznego urządzenia do elektroforezy. Obliczony wskaźnik integralności RNA (RIN) dla wszystkich próbek wynosił >8 (Rycina 3A), co wskazuje na wysoką jakość i powtarzalność preparacji RNA. Następnie wykorzystano zestaw do przygotowania całkowitego RNA w celu stworzenia bibliotek RNA, a każdą próbkę zsekwencjonowano na sekwenatorze nowej generacji, aby osiągnąć głębokość odczytu ≥40 milionów odczytów. Wynik Phred dla wszystkich próbek (Rycina 3B) oraz dla poszczególnych sekwencji (Rycina 3C) wynosił ≥30, co świadczy o wysokiej jakości sekwencji DNA20. Zatem usuwanie heptanu wspiera izolację wysokowydajnego, wysokiej jakości RNA nadającego się do sekwencjonowania RNA.

W etapie fiksacji formaldehydem przeprowadzono również trzy preparacje izolacji jąder zawierające heptan oraz jedną preparację kontrolną bez heptanu. Rozdrobniona chromatyna została następnie przeanalizowana na automatycznym urządzeniu do elektroforezy. W obu przypadkach chromatynę rozdrobniono do zakresu wielkości 100-800 bp (Rysunek 4A), co jest idealne dla późniejszych procedur ChIP-seq19. Co istotne, z próbek traktowanych heptanem uzyskano około 5 razy więcej chromatyny (11,5 ng/µL, 9,42 ng/µL i 9,6 ng/µL) w stosunku do próbek nietraktowanych (2,2 ng/µL). ChIP-seq dla H3K4me3 i H3K27me3 wykonano zgodnie z metodą Arrigoni et al.19. Jak pokazano na Rysunku 4B, ścieżki sygnałów z trzech niezależnych próbek traktowanych heptanem były porównywalne ze ścieżką próbki nietraktowanej heptanem dla obu modyfikacji histonowych. Traktowanie heptanem nie wpływa negatywnie na jakość ChIP-seq, ale znacząco zwiększa wydajność izolacji jąder (i rozdrobnionej chromatyny).

figure-results-1
Rysunek 1: Izolowane adipocyty. Izolowane adipocyty barwiono DAPI (kolor niebieski) w celu uwidocznienia jądra oraz BODIPY (kolor zielony) w celu uwidocznienia lipidów. Cytozolowe krople lipidowe stanowią do 95% objętości adipocytów i stanowią wyzwanie techniczne w uzyskaniu wysokiej wydajności podczas ekstrakcji RNA i chromatyny. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczny przebieg izolacji adypocytów do analizy transkryptomu i epigenomu. Przedstawiono cały proces, od izolacji adypocytów po zastosowania w analizie transkryptomu lub epigenomu. Pokazano kluczowe etapy oraz reprezentatywne wyniki. (A) Izolowane adypocyty unoszą się w górnej warstwie, oddzielając się od frakcji naczyniowo-stromalnej, która tworzy osad na dnie probówki. (B) Wykorzystanie heptanu do usunięcia lipidów przed ekstrakcją RNA przy użyciu odczynnika do izolacji RNA. (C) Wykorzystanie heptanu do usunięcia lipidów podczas fiksacji adypocytów. (D) Reprezentatywny obraz jąder izolowanych adypocytów; muszą być one nienaruszone i okrągłe. Pasek skali = 20 µm. Schemat został przygotowany za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywny elektroferogram integralności RNA oraz oceny jakości po sekwencjonowaniu RNA-seq. (A) Próbki 1-6 reprezentują sześć powtórzeń adipocytów traktowanych heptanem; analiza ich integralności RNA została przeprowadzona na zautomatyzowanym urządzeniu do elektroforezy. Numer integralności RNA (RIN) oparto na stosunkach rybosomalnego RNA 18S i 28S, co reprezentuje jakość RNA. Skala od 1 (silnie zdegradowane) do 10 (najmniej zdegradowane). (B,C) Wynik jakości odczytów sekwencjonowania określono za pomocą analizy multiQC dla średniego wyniku jakości zasad (B) oraz dla wyniku jakości na sekwencję (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywny elektroferogram ścinanej chromatyny oraz piki wzbogacenia z ChIP-seq. (A) Reprezentatywne profile z automatycznego urządzenia do elektroforezy pokazujące rozkłady rozmiarów chromatyny dla próbek kontrolnych (próbka 1, góra po lewej) oraz preparatów chromatyny z adipocytów traktowanych heptanem (próbki 2, 5 i 8, góra po prawej i dwa dolne). Stężenia chromatyny w końcowych preparatach są wskazane w lewym górnym rogu każdego obrazu. (B) Zrzut ekranu z przeglądarki genomu wykonany za pomocą Integrative Genomics Viewer (IGV). Górna część wykresu przedstawia profile ChIP-seq dla H3K4me3 dla trzech próbek traktowanych heptanem (kolor czerwony) oraz jednej kontrolnej (kolor niebieski). Dolny panel przedstawia analogiczne dane dla ChIP-seq H3K27me3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

BuforSkład
Bufor do trawienia (do 3000 mg lub mniej tkanki tłuszczowej / 20 ml)20 ml podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
0,3 g BSA wolnej od kwasów tłuszczowych
0,1 g kolagenazy typu 2 
bufor laboratoryjny Farnham 5 mM PIPES (pH 8)
85 mM KCl
0,5% IGEPAL
Bufor do ścinania10 mM Tris-HCl pH 8
 0,1% SDS
1 mM EDTA

Tabela 1: Skład różnych buforów wykorzystanych w niniejszym badaniu.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół izolacji adipocytów opiera się na dobrze przyjętych metodach trawienia enzymatycznego 11,14 w celu oddzielenia dojrzałych adipocytów (pływających) od pozostałej frakcji zrębu naczyniowego białej tkanki tłuszczowej. Zapewnia proste i uniwersalne podejście do oczyszczania dojrzałych adipocytów w dowolnym modelu myszy. Jak wykazano powyżej, protokół nadaje się do dalszego wykorzystania w analizach całego transkryptomu i sekwencyjnych ChIP. Zapewnia wystarczającą wydajność, aby wygenerować wiele profili epigenomicznych (np. kilka modyfikacji histonów plus sekwencja RNA) z tej samej pojedynczej poduszeczki tłuszczowej.

Aby zapewnić wysoką wydajność, która umożliwia przygotowanie tak dopasowanych danych epigenomowych, kluczowym krokiem jest użycie heptanu do rozpuszczania lipidów z nienaruszonych adipocytów oraz z adipocytów, które ulegają lizie podczas procesu. Z naszego doświadczenia wynika, że ten etap znacznie zwiększa odtwarzalność i wydajność, zapobiegając utracie RNA i jąder do warstwy lipidowej. Równie ważna jest ciągła rotacja probówek zawierających adipocyty ulegające utrwaleniu, ponieważ zwiększa jednorodność, z jaką lipidy są usuwane z adipocytów. Zamiast 1% buforu utrwalającego formaldehyd opisanego w dużej części literatury dotyczącej ChIP-seq21,22, stwierdzono, że konieczne jest zmniejszenie stężenia do 0,7% formaldehydu, aby uniknąć nadmiernego utrwalenia. Czas ścinania chromatyny został również zoptymalizowany do 12 minut, aby uzyskać optymalny zakres wielkości chromatyny (100-800 pz) dla sekwencji ChIP.

Protokół został zoptymalizowany pod kątem masowych badań transkryptomu i epigenomu. Obecny protokół nadal ma swoje własne ograniczenia dotyczące zastosowań transkryptomu i epigenomu pojedynczej komórki. Biorąc pod uwagę heterogeniczność komórek zgłoszoną w polu otyłości23,24, ta metoda izolacji może być dalej rozwijana w celu dostosowania do testów jednokomórkowych. W takich kontekstach markery z ograniczeniami adipocytów, takie jak bor-dipyrrometen (BODIPY)25 i perylipina-1 (PLIN1)26, ASC-127 lub markery jąder specyficzne dla adipocytów, mogą być cenne w umożliwieniu ilościowego określenia dodatkowych, funkcjonalnych, istotnych parametrów komórkowych28. Oprócz zastosowania w badaniach genomicznych, protokół ten może również poprawić badania proteomiczne adipocytów, które mają dodatkową przeszkodę ze względu na wysoką zawartość lipidów w adipocytach29.

Protokół ten może być również stosowany do skutecznej ekstrakcji ludzkich jąder adipocytów (dane nie pokazane), rozszerzając jego zastosowanie na badania nad otyłością u ludzi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni MPI-IE za obrazowanie optyczne, sekwencjonowanie, rdzeń bioinformatyczny i personel. Prace te były finansowane przez MPG, Instytut Badawczy Van Andel, badania Unii Europejskiej w ramach programu Horyzont 2020, NIH (R01HG012444 i R21HG011964), umowę o grant Marie Skłodowska-Curie nr 675610 oraz Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych w ramach projektu o numerze 01KU1216 (Deutsches Epigenom Programm, DEEP).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% roztwór formaldehydu (w/v). Bez metanoluThermoFisher SCIENTIFIC28908
1-bromo-3-chloropropan SIGMAB9673
5 MNaCl invitrogenAM9759
Automatyczny przyrząd do elektroforezy (2100 Bioanalyzer Instrument)Agilent TechnologiesG2939BA
BODIPY ThermoFisher SCIENTIFICD3922
Kolagenaza typu 2Worthington Biochemical Corp.43D14184B
Kompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy () Roche4693159001EDTA za darmo
DAPI ThermoFisher SCIENTIFICD1306
DMEM (+ GlutaMAX) life technologies61965-026
Zestaw do oczyszczania DNA (zestaw do oczyszczania PCR)Qiagen28104
(fluorometr Qubit 4)Fisher SCIENTIFICQ33238
(test wysokiej czułości DNA)Agilent Technologies5067-4626
EDTAFisher chimicalE478-500
EGTAFisher chimicalO2783-100
EtOHPHARMCO111000200
Bez kwasów tłuszczowych BSA SERVA11932.01albumina bydlęca frakcja V, liofilizowana bez kwasów tłuszczowych
GlicynaSIGMAG7126-100G
HeptanSIGMAH2198-1L
Analiza RNA o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-1513
IgepalSIGMA18896-50ML
KClSIGMAP3911-25G
Filtr matrycowy (420um)Tisch ScientificME17238
Sekwencer nowej generacji (HiSeq 3000 Sequencer) Illumina
Woda wolna od nukleaz Invitrogen4387936
PIPESACROS organics5625-37-6
Proteinaza K ThermoFisher SCIENTIFICEO0491
Odczynnik do izolacji RNA (Trizol)ThermoFisher SCIENTIFIC 15596026
RNaza A, bez DNaz ThermoFisher SCIENTIFICEN0531
Rotator (Thermo Scientific Tube Revolver Rotator)ThermoFisher SCIENTIFIC 88881001
SDS, Rurka sonizacyjna dodecylosiarczanu soduSIGMA8170341000
(1 ml miliTUBE z włóknem AFA)Covaris520135
Sonicator (Evolution Focused-ultra-sonicator (S220 lub E220))Covaris500217 lub 500239
zestaw do przygotowania całkowitego RNA (zestaw do przygotowania całkowitego RNA Illumina)Illumina20040525
Tris-HCl Bioodczynniki FisherBP153-500
Przyrząd do kwantyfikacji DNA Zestaw do kwantyfikacji DNA

Bibliografia

  1. Albuquerque, D., Stice, E., Rodríguez-López, R., Manco, L., Nóbrega, C. Current review of genetics of human obesity: From molecular mechanisms to an evolutionary perspective. Molecular Genetics and Genomics. 290 (4), 1191-1221 (2015).
  2. Weihrauch-Blüher, S., Schwarz, P., Klusmann, J. H. Childhood obesity: Increased risk for cardiometabolic disease and cancer in adulthood. Metabolism. 92, 147-152 (2019).
  3. Weihrauch-Blüher, S., Wiegand, S. Risk factors and implications of childhood obesity. Current Obesity Reports. 7 (4), 254-259 (2018).
  4. Gluckman, P. D. Epigenetics, the life-course and metabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 8 (2), 74-76 (2012).
  5. Loh, M., Zhou, L., Ng, H. K., Chambers, J. C. Epigenetic disturbances in obesity and diabetes: Epidemiological and functional insights. Molecular Metabolism. 27, 33-41 (2019).
  6. Sayols-Baixeras, S., et al. DNA methylation and obesity traits: An epigenome-wide association study. The REGICOR study. Epigenetics. 12 (10), 909-916 (2017).
  7. Xia, Q., Grant, S. F. A. The genetics of human obesity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1281 (1), 178-190 (2013).
  8. Yokoi, N. Epigenetic dysregulation in pancreatic islets and pathogenesis of type 2 diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (3), 475-477 (2018).
  9. Frayn, K. N. Obesity and metabolic disease: Is adipose tissue the culprit. Proceedings of the Nutrition Society. 64 (1), 7-13 (2005).
  10. Kawai, T., Autieri, M. V., Scalia, R. Adipose tissue inflammation and metabolic dysfunction in obesity. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (3), 375-391 (2021).
  11. Cat, A. N. D., Briones, A. M. Hypertension: Methods and Protocols. Touyz, R. M., Schiffrin, E. L. , Springer. New York. 283-295 (2017).
  12. Ambati, S., et al. Adipocyte nuclei captured from VAT and SAT. BMC Obesity. 3, 35(2016).
  13. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  14. Jacobsen, M. J., et al. Epigenetic and transcriptomic characterization of pure adipocyte fractions from obese pigs identifies candidate pathways controlling metabolism. Frontiers in Genetics. 10, 1268(2019).
  15. Janke, J., Engeli, S., Gorzelniak, K., Sharma, A. M. Extraction of total RNA from adipocytes. Hormone and Metabolic Research. 33 (4), 213-215 (2001).
  16. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  17. Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, 49501(2019).
  18. Buddrick, O., Jones, O. A. H., Morrison, P. D., Small, D. M. Heptane as a less toxic option than hexane for the separation of vitamin E from food products using normal phase HPLC. RSC Advances. 3 (46), 24063-24068 (2013).
  19. Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: A simple and universal method for ChIP-seq. Nucleic Acids Research. 44 (7), 67(2016).
  20. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. Schmidt, D., et al. ChIP-seq: Using high-throughput sequencing to discover protein-DNA interactions. Methods. 48 (3), 240-248 (2009).
  22. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  23. Rondini, E. A., Granneman, J. G. Single cell approaches to address adipose tissue stromal cell heterogeneity. Biochemical Journal. 477 (3), 583-600 (2020).
  24. Corvera, S. Cellular heterogeneity in adipose tissues. Annu Review of Physiology. 83, 257-278 (2021).
  25. Katz, L. S., Geras-Raaka, E., Gershengorn, M. C. Heritability of fat accumulation in white adipocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 307 (3), 335-344 (2014).
  26. Hansen, J. S., de Maré, S., Jones, H. A., Göransson, O., Lindkvist-Petersson, K. Visualization of lipid directed dynamics of perilipin 1 in human primary adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 15011(2017).
  27. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  28. Onogi, Y., Khalil, A. E. M. M., Ussar, S. Identification and characterization of adipose surface epitopes. Biochemical Journal. 477 (13), 2509-2541 (2020).
  29. Kim, E. Y., et al. Recent advances in proteomic studies of adipose tissues and adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 4581-4599 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja bia ych adipocyt wadipocyty mysieanaliza transkryptomuanaliza epigenomutkanka t uszczowaizolacja RNAizolacja chromatynyizolacja j der kom rkowychsortowanie FACSChIP Seq
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły