Artykuł metodologiczny

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

DOI:

10.3791/64132

⸱

23 czerwca 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, The George Washington University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lizosomy często komunikują się z różnymi biomolekułami, aby osiągnąć degradację i inne różnorodne funkcje komórkowe. Lizosomy mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania ludzkiego mózgu, ponieważ neurony są postmitotyczne i w dużym stopniu polegają na szlaku autofagia-lizosom w celu utrzymania homeostazy komórkowej. Pomimo postępów w zrozumieniu różnych funkcji lizosomalnych, uchwycenie wysoce dynamicznej komunikacji między lizosomami a innymi składnikami komórkowymi jest technicznie trudne, szczególnie w przypadku wysokiej przepustowości. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół dla niedawno opublikowanej endogennej (knock-in) metody proteomicznego znakowania zbliżeniowego lizosomów w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Zarówno lizosomalne białka błonowe, jak i białka otaczające lizosomy w promieniu 10-20 nm mogą być z pewnością zidentyfikowane i dokładnie określone ilościowo w żywych ludzkich neuronach. Każdy etap protokołu jest szczegółowo opisany, tj. hodowla neuronów hiPSC, znakowanie zbliżeniowe, zbieranie neuronów, mikroskopia fluorescencyjna, wzbogacanie białek biotynylowanych, trawienie białek, analiza LC-MS i analiza danych. Podsumowując, ta unikalna endogenna metoda proteomiki znakowania lizosomalnego zapewnia wysokowydajne i solidne narzędzie analityczne do badania wysoce dynamicznej aktywności lizosomalnej w żywych ludzkich neuronach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lizosomy to organelle kataboliczne, które rozkładają makrocząsteczki poprzez szlak lizosomalno-autofagiczny1. Oprócz degradacji, lizosomy biorą udział w różnych funkcjach komórkowych, takich jak transdukcja sygnałowa, wykrywanie składników odżywczych i wydzielanie2,3,4. Perturbacje w funkcji lizosomalnej są związane z lizosomalnymi zaburzeniami spichrzeniowymi, rakiem, starzeniem się i neurodegeneracją3,5,6,7. W przypadku neuronów postmitotycznych i silnie spolaryzowanych lizosomy odgrywają kluczową rolę w homeostazie komórek neuronalnych, uwalnianiu neuroprzekaźników i transporcie na duże odległości wzdłuż aksonów8,9,10,11. Jednak badanie lizosomów w ludzkich neuronach było trudnym zadaniem. Ostatnie postępy w technologiach neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) umożliwiły hodowlę żywych ludzkich neuronów, które wcześniej były niedostępne, wypełniając lukę między modelami zwierzęcymi a ludzkimi pacjentami w celu zbadania ludzkiego mózgu12,13. W szczególności zaawansowana technologia i3Neuron stabilnie integruje czynnik transkrypcyjny neurogeniny-2 z genomem iPSC pod promotorem indukowanym doksycykliną, powodując różnicowanie się iPSC w czyste neurony korowe w ciągu 2 tygodni14,15.

Ze względu na wysoce dynamiczną aktywność lizosomalną, uchwycenie interakcji lizosomalnych z innymi składnikami komórkowymi jest technicznie trudne, szczególnie w trybie wysokoprzepustowym. Technologia znakowania zbliżeniowego doskonale nadaje się do badania tych dynamicznych oddziaływań ze względu na jej zdolność do wychwytywania zarówno stabilnych, jak i przejściowych/słabych interakcji białkowych o wyjątkowej specyficzności przestrzennej16,17. Zmodyfikowana peroksydaza lub ligaza biotyny może być genetycznie połączona z białkiem przynęty. Po aktywacji wytwarzane są wysoce reaktywne rodniki biotyny, które kowalencyjnie znakują sąsiednie białka, które następnie mogą być wzbogacone o kulki pokryte streptawidyną do dalszej proteomiki bottom-up za pomocą platform chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS)17,18,19,20,21.

Endogenna metoda proteomiki oznaczania bliskości lizosomów została niedawno opracowana w celu uchwycenia dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w i3Neurons22. Zmodyfikowana peroksydaza askorbinianowa (APEX2) została wbita na C-koniec lizosomalnego białka błonowego 1 (LAMP1) w iPSC, które można następnie różnicować w neurony korowe. LAMP1 jest licznie występującym lizosomalnym białkiem błonowym i klasycznym markerem lizosomalnym23. LAMP1 ulega również ekspresji w późnych endosomach, które dojrzewają do lizosomów; Te późne lizosomy endosomów i lizosomy niedegradacyjne są w tym protokole określane jako lizosomy. Ta endogenna sonda LAMP1-APEX, ulegająca ekspresji na poziomie fizjologicznym, może zmniejszyć artefakty błędnej lokalizacji i nadekspresji LAMP1. Setki lizosomalnych białek błonowych i lizosomalnych interaktorów można zidentyfikować i określić ilościowo z doskonałą rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Tutaj opisano szczegółowy protokół proteomiki znakowania bliskosomów w ludzkich neuronach pochodzących z iPSC z dalszymi ulepszeniami w stosunku do niedawno opublikowanej metody22. Ogólny przebieg pracy jest zilustrowany na Rysunek 1. Protokół obejmuje hodowlę neuronów pochodzących z hiPSC, aktywację znakowania zbliżeniowego w neuronach, walidację aktywności APEX za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, określenie optymalnego stosunku kulek streptawidyny do białka wejściowego, wzbogacenie białek biotynylowanych, trawienie białek na kulkach, odsalanie i kwantyfikację peptydów, analizę LC-MS oraz analizę danych proteomicznych. Omówiono również wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i optymalizacje eksperymentalne w celu poprawy jakości i wydajności etykietowania zbliżeniowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję ds. bezpieczeństwa biologicznego i etyki Uniwersytetu George'a Washingtona. Składy pożywek i stosowanych w niniejszym protokole przedstawiono w tabeli 1. Wykorzystane tutaj informacje handlowe o produkcie znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla neuronów pochodzących z ludzkiego iPSC

  1. Posiew iPSC u ludzi i integracja sondy LAMP1-APEX (7 dni)
    1. Rozmrozić roztwór podstawowy Matrigel w wiadrze z lodem w temperaturze 4 °C przez noc, przelać 500 μl roztworu do zimnych sterylnych probówek i przechowywać podwielokrotności w temperaturze −80°C. Przygotować 50 ml roztworu do powlekania, dodając 500 μl bulionu Matrigel do 49,5 ml zimnego podłoża DMEM/F12.
      UWAGA: Utrzymuj Matrigel w niskiej temperaturze i używaj wstępnie schłodzonych stożkowych probówek i końcówek pipet, aby zapobiec polimeryzacji. Roztwór powlekający można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
    2. Pokryć 10 cm naczynie do hodowli komórkowych 4 ml roztworu powlekającego przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Witronektyna może być alternatywnym roztworem powlekającym o stężeniu 5 μg/ml i 2-godzinnym powlekaniu do hodowli iPSC. Witronektyna (pojedynczy składnik białkowy) jest droższa niż Matrigel, ale ma mniej zmian partii i czystsze sygnały tła niż Matrigel, który jest ekstrahowany z guza myszy z licznymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Do powlekania witronektyną potrzebna jest niepoddana działaniu metody hodowli tkankowej. Powłoka Matrigel działa zarówno na płytkach do hodowli tkankowych poddanych obróbce, jak i nie.
    3. Rozmrozić i ułożyć na płytce 1-3 miliony hiPSC na każdej powlekanej 10-centymetrowej szalce wstępnie załadowanej 8 ml kompletnego podłoża Essential E8 uzupełnionego inhibitorem ROCK (końcowe stężenie 10 μM Y-27632 lub 50 nM Chroman1).
      UWAGA: Dodanie inhibitora ROCK (Y-27632 lub Chroman1) do pożywki do hodowli komórek macierzystych minimalizuje apoptozę wywołaną dysocjacją po rozszczepieniu i konserwacji kriogenicznej. Ostatnio wykazano, że Chroman1 jest silniejszy niż Y-27632 w hamowaniu zarówno ROCK1, jak i ROCK224.
    4. Zmień na 10 ml kompletnej pożywki E8 bez inhibitora ROCK po utworzeniu kolonii przez iPSC, zwykle po 1-2 dniach. Utrzymuj kulturę iPSC w kompletnej pożywce E8 i zastępuj supernatant świeżą pożywką co drugi dzień.
    5. Zintegruj enzym znakujący zbliżeniowo, zmodyfikowaną peroksydazę askorbinianową (APEX2), z C-końcem endogennego genu LAMP1 za pomocą inżynierii genomu CRISPR. Aby uzyskać szczegółowe instrukcje generowania stabilnej linii komórkowej, zapoznaj się z wcześniej opublikowaną metodą (Frankenfield i wsp.). 22.
  2. Różnicowanie ludzkich neuronów iPSC (3 dni)
    1. Przed rozdzieleniem pokryć 10-centymetrowe naczynie do hodowli komórkowych 4 ml roztworu powlekającego Matrigel w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Utrzymuj hiPSC do ~70% zbiegu. Delikatnie przemyj hiPSC solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 2x, aby usunąć martwe komórki. Odessać PBS i dodać 3 ml Accutase do 10-centymetrowej szalki z komórkami. Wstrząsnąć płytką w celu równomiernego rozprowadzenia i inkubować przez 8 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 2 ml PBS, aby umyć i podnieść komórki z płytki, a następnie zebrać cały roztwór komórkowy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut. Płytka 2-4 × 106 hiPSC na płytce pokrytej Matrigelem wstępnie załadowanej 8 ml ciepłej pożywki do indukcji neuronów (Tabela 1). Równomiernie rozprowadzić komórki i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Różnicowanie neuronów jest napędzane przez czynnik transkrypcyjny indukowany doksycykliną, neurogeninę-2 (NGN2), który uległ nadekspresji w tej stabilnej linii komórkowej hiPSC15.
    4. Delikatnie przemyj hiPSC za pomocą PBS w 1. dniu różnicowania, aby usunąć martwe resztki komórek. Zastąp 10 ml ciepłej pożywki indukcyjnej bez inhibitora ROCK.
    5. Zmieniać ciepłą pożywką indukcyjną bez inhibitora ROCK codziennie aż do 3 dnia różnicowania.
      UWAGA: Neurony są gotowe do ponownego przekształcenia w pożywkę neuronalną.
  3. Posiewanie neuronów i utrzymanie hodowli neuronów (10 dni)
    1. Przygotować 0,1 mg/ml roztworu powlekającego poli-L-ornityny (PLO) w buforze boranowym (Tabela 1).
    2. Pokryć naczynie do hodowli komórkowych roztworem powlekającym PLO w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc przed posiewem neuronów w 3. dniu. Umyj naczynie trzykrotnie 4 ml sterylnej wody i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Oddziel neurony dnia 3 od każdej 10-centymetrowej płytki za pomocą 3 ml Akutazy i umieść 8-10 milionów komórek na każdym 10-centymetrowym naczyniu pokrytym PLO, wstępnie załadowanym ciepłym podłożem neuronów korowych (Tabela 1).
    4. Wykonuj zmianę połowy pożywki co 2-3 dni z ciepłym podłożem neuronowym, aż i3neurony osiągną dojrzałość w ciągu 2 tygodni po różnicowaniu.

2. Znakowanie zbliżeniowe in situ i liza neuronów (2 h)

  1. Przygotować 500 mM roztworu podstawowego biotyny-fenolu (BP) w dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać w temperaturze -20 °C. W dniu znakowania zbliżeniowego rozcieńczyć roztwór podstawowy BP ciepłym podłożem neuronowym i traktować neurony w końcowym stężeniu 500 μM przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Doksycyklina jest dodawana do pożywki neuronowej, co aktywuje ekspresję enzymu APEX. Dokcyklinę należy dodać co najmniej 24 godziny przed eksperymentem z etykietowaniem zbliżeniowym.
  2. Rozpocząć reakcję znakowania przez dodanieH2O2okońcowym stężeniu do hodowli neuronów i inkubować dokładnie przez 1 minutę. Natychmiast odessać pożywkę i przepłukać 3 razy buforem wygaszającym (Tabela 1).
    UWAGA: RoztwórH2O2powinien być przygotowany na świeżo przed reakcją etykietowania. AktywacjaH2O2musi trwać dokładnie 1 minutę, aby zmniejszyć zmienność eksperymentalną i zminimalizować stres oksydacyjny spowodowany długotrwałym traktowaniemH2O2.
  3. Przechylić płytkę, aby zassać cały pozostały bufor. Dodaj lodowaty bufor do lizy komórek (Tabela 1) bezpośrednio na płytkę neuronową. Użyj 100 μl buforu do lizy komórek na 1 milion neuronów. Zakręć płytką, aby uzyskać wystarczającą lizę komórek i umieść na lodzie.
  4. Zeskrob lizaty komórkowe do zimnych probówek o pojemności 1,5 ml. Sonikacja w lodowatej kąpieli wodnej za pomocą sonografu kąpielowego (>100 W) przez 15 minut z naprzemiennymi cyklami 40 s włączania i 20 s wyłączania.
    UWAGA: Wystarczająco zlizowany roztwór białka powinien być klarowny, bez granulek i nadmiernych pęcherzyków. Wystarczająca sonikacja lizatu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla ścinania kwasów nukleinowych i zmniejszania lepkości lizatu komórkowego w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania w dalszych procedurach. Sonikator sondy może być również używany w celu zapewnienia silniejszej i szybszej lizy komórek, ale mycie sondy między próbkami jest wymagane w celu zminimalizowania zanieczyszczenia krzyżowego i utraty próbki.
  5. Dodać zimny aceton (−20 °C) do próbki w 4-krotnej objętości buforu do lizy. Krótko wirować i inkubować w temperaturze -20 °C przez 3 godziny.
  6. Wirować w temperaturze 16 500 × g przez 10 minut w temperaturze 2 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu białkowego. Przemyć osad 1 ml acetonu o temperaturze -20 °C 2x i usunąć supernatant po odwirowaniu.
  7. Suszyć granulki białkowe za pomocą koncentratora próżniowego przez 1 minutę. Dodaj bufor do lizy komórek, aby całkowicie rozpuścić osad. W razie potrzeby krótko wykonaj sonikę. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Wytrącanie acetonu może usunąć pozostałości biotyny-fenolu w próbce, które mogą zakłócać dalsze wzbogacanie biotynylowanych białek.

3. Mikroskopia fluorescencyjna w celu sprawdzenia lokalizacji i aktywności APEX (1,5 dnia)

  1. Inkubować i3neurony wykazujące ekspresję endogennego LAMP1-APEX z 500 μM BP przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Aktywować znakowanie za pomocą 1 mM H2O2 przez zaledwie 1 s, aby ograniczyć dyfuzję chmury biotyny.
  2. Natychmiast utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w buforze hartowniczym i delikatnie przemyć 3x PBS.
    UWAGA: Na naczynie o średnicy 10 cm potrzeba 4-6 ml do wystarczającego umycia.
  3. Zablokuj i przepuszczalność komórek za pomocą 3% surowicy osła i 0,1% saponiny w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-LAMP1 (mysi monoklonalny H3A4, 1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Umyj neurony 3 x delikatnie PBS. Inkubuj neurony z przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim AF561 (1:1,000) i streptawidyną-680 (1:1,000) przez 1 godzinę w RT.
  6. Przemyć 2x PBS i inkubować z markerem jądrowym Hoechst lub 4',4-diamidino-2-fenyloindolowym (DAPI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki 2x PBS.
  7. Wizualizuj unieruchomione neurony pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obserwuj biotynylowane białka barwione streptawidyną i kolokalizowane z barwieniem LAMP1 na zewnątrz jądra, aby potwierdzić prawidłową lokalizację aktywności APEX.

4. Określanie stosunku kulek streptawidyny do białka wejściowego (1,5 dnia)

  1. Wykonaj test białka kompatybilny z detergentem (DCA) w celu określenia całkowitych stężeń białek w lizatach komórkowych
    1. Rozpuścić wzorcowe białko albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze do lizy komórek w stężeniu 4 mg/ml. Przygotować serię roztworów wzorcowych białek BSA (0,2-2 mg/ml, 5 rozcieńczeń) przy użyciu buforu do lizy komórek.
    2. Przenieść 5 μl z każdej próbki białka, wzorcowego roztworu białka BSA i buforu do lizy ślepych komórek w trzech egzemplarzach do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
    3. Dodać 2 μl odczynnika S na 1 ml odczynnika A, aby otrzymać odczynnik A'. Dodać 25 μl odczynnika A' do każdego dołka. Dodać 200 μl odczynnika B do każdego dołka. Wymieszaj i przebij bąbelki, jeśli są obecne.
    4. Inkubować tę 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, odczytać absorbancję przy 750 nm w czytniku mikropłytek i określić ilościowo stężenia próbek białka w oparciu o krzywą wzorcową BSA.
  2. Test miareczkowania kulek igłowych (1,5 dnia)
    1. Przenieś serię zawiesiny kulek magnetycznych streptawidyny (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) do probówek paskowych PCR. Umieść probówki z paskami PCR na stojaku magnetycznym, umyj kulki 3x 100 μl 2% buforu SDS i całkowicie usuń bufor do płukania na stojaku magnetycznym.
    2. Do każdej probówki dodać 50 μg próbki białka. Dodać więcej buforu do lizy do całkowitej objętości 80 μl. Zamknąć szczelnie każdą probówkę i obracać w temperaturze 4 °C przez noc.
    3. Odwiruj krótko probówki paskowe do PCR na mikrowirówce stołowej. Umieść probówki z paskami PCR na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Umieścić 2 μl supernatantu z każdej probówki na suchej membranie nitrocelulozowej i pozostawić membranę do całkowitego wyschnięcia.
      UWAGA: Jeśli intensywność sygnału jest niska, na membranie można dostrzec więcej niż 2 μl. Objętość można zwiększyć, kilkakrotnie plamiąc w tym samym miejscu po wysuszeniu membrany za każdym razem. Można również użyć aparatu Bio-Dot.
    4. Inkubować błonę w buforze blokującym (TBS) przez 1 godzinę. Inkubować błonę w koniugacie Streptavidin Alexa Fluor 680 (1:1,000 w buforze blokującym) przez 1 godzinę. Następnie umyj membranę TBS-T (Tabela 1) 5x.
      UWAGA: Alternatywą dla testu dot blot jest western blot przy użyciu przeciwciała streptawidyny.
    5. Zmierz sygnał fluorescencyjny każdej kropki na membranie pod długością fali 680 nm i wygeneruj wykres punktowy z sygnałem fluorescencyjnym nad objętością kulek. Wybierz optymalną objętość kulek potrzebną dla 50 μg wejściowej próbki białka w zależności od tego, gdzie kończy się wykładniczy rozpad krzywej .
      UWAGA: Intensywność fluorescencji reprezentuje obfitość biotynylowanych białek w supernatancie, która powinna zmniejszać się wraz ze wzrostem ilości kulek.

5. Wzbogacanie biotynylowanych białek i trawienie na koralikach (3 dni)

  1. Przenieś próbki lizatu białkowego z -80 °C i poddaj je sonikacji w probówkach o pojemności 1,5 ml przez 30 s w sonikatorze kąpielowym, aby szybko rozmrozić roztwory. Przeprowadzić wirowanie i umieścić probówki z próbkami na lodzie.
  2. Przenieś 250 μl zawiesiny kulek magnetycznych streptawidyny (SA) do każdej probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, umyj kulki 3x 1 ml buforu do płukania A (2% SDS) i usuń pozostały bufor.
  3. Na podstawie wyników testu punktowego i testu białka DC obliczyć ilość próbki białka (μg) potrzebną do uzyskania 250 μl zawiesiny kulek magnetycznych streptawidyny.
    UWAGA: W tej endogennie eksprymowanej sondzie LAMP1-APEX na 50 μg białka wejściowego potrzeba 5 μl kulek. Dlatego do 250 μl kulek dodaje się 2,5 mg białka całkowitego. Mniej niż 250 μl kulek SA można użyć do ograniczonej ilości materiału wejściowego próbki.
  4. Dodać bufor do lizy komórek do probówki zawierającej mieszaninę magnetycznego granulki i lizatu do całkowitej objętości 1 ml i obracać w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Próbki z różnych grup lub kontrprób powinny być znormalizowane do tego samego stężenia białka, objętości i ilości kulek w celu zmniejszenia różnic eksperymentalnych.
  5. Odkręć krótko wszystkie probówki na mikrowirówce stołowej i umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Usuń supernatant na stojaku magnetycznym.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby odczekać 1 minutę po każdym umieszczeniu probówek na próbkach na stojaku magnetycznym. Może to zminimalizować utratę kulek z powodu niewidocznej niewielkiej ilości kulek wciąż poruszających się w kierunku magnesu w roztworze.
  6. Umyj kulki 2x 1 ml buforu do płukania A w temperaturze pokojowej (za każdym razem obrót 5 minut). Powtórzyć proces z każdym buforem do przemywania 2 razy kolejno w temperaturze 4 °C. (Bufor B, Bufor C i Bufor D; Tabela 1).
    UWAGA: Wysokie stężenie roztworu SDS może wytrącać się w niskich temperaturach. Pierwsze mycie należy wykonać w temperaturze pokojowej.
  7. Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Umyj kulki 2x za pomocą buforu D, aby całkowicie usunąć resztki detergentu. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl 50 mM buforu Tris i dodać 5 mM TCEP (stężenie końcowe) w celu inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C w mieszalniku o kontrolowanej temperaturze, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  8. Dodać 15 mM jodoacetamidu (IAA, stężenie końcowe) do każdej probówki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w mieszalniku o kontrolowanej temperaturze, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min w ciemności (założona nasadka mieszalnika).
    UWAGA: IAA jest wrażliwy na światło i powinien być świeży 5 minut przed tym krokiem.
  9. Dodać 5 mM TCEP (stężenie końcowe), aby ugasić nadmiar IAA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w mieszalniku o kontrolowanej temperaturze z wytrząsaniem przy 1 200 obr./min (zdjęta nakrętka mieszalnika).
  10. Krótko odwirować probówki z próbkami i umieścić na stojaku magnetycznym na 1 minutę w celu usunięcia supernatantu. Dodaj 200 μl 5 mM TCEP do 50 mM bufora Tris, aby ponownie zawiesić kulki. Dodać 1 μg mieszaniny trypsyny/Lys-C do próbki i inkubować przez 14 godzin w temperaturze 37 °C w mieszalniku o kontrolowanej temperaturze, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  11. Dodaj dodatkowe 0,2 μg mieszanki Trypsyna/Lys-C i traw przez 3 godziny.
  12. Odkręć na chwilę probówki z próbkami i umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Przenieś supernatant peptydowy w celu oczyszczenia probówek na stojaku magnetycznym. Przemyć kulki 50 μl 50 mM buforu Tris (wstrząsając przez 5 minut) i połączyć supernatanty peptydowe.
  13. Dodać 30 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA) do probówki zawierającej supernatant peptydowy, aby uzyskać pH <3.

6. Odsalanie i frakcjonowanie peptydów (2 h)

  1. Zwilżyć płytkę ekstrakcyjną do fazy stałej z odwróconymi fazami (tylko studzienki do użycia) 200 μl metanolu (MeOH) klasy HPLC 3x na kolektorze próżniowym. Dodaj 200 μl 1% TFA do wody klasy HPLC 3x, aby wyrównać płytkę.
  2. Załaduj próbki peptydów do płytki, powoli włączając próżnię, aby uzyskać prędkość przepływu mniejszą niż 3 krople/s, aby zminimalizować utratę próbki.
  3. Umyć płytkę ekstrakcyjną 3x 200 μL 1% TFA. Ponownie przemyć płytkę ekstrakcyjną 200 μl 1% TFA zawierającego 2% MeOH (v/v). Utrzymuj prędkość przepływu poniżej 3 kropli/s.
  4. Zastąp płytkę zbiorczą 96-dołkową płytką zbiorczą. Jeśli frakcjonowanie nie jest potrzebne, wymyj próbki peptydów 3x 100 μl 1% TFA zawierającego 80% MeOH i połącz w nowej probówce na próbkę. Wysuszyć próbki peptydów w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.
    UWAGA: Jeśli pożądane jest frakcjonowanie, próbki peptydów można eluować na 4 frakcje, a następnie użyć 200 μl 1% TFA zawierającego odpowiednio 15%, 35%, 50% i 90% MeOH na innej płytce zbiorczej.

7. Test kwantyfikacyjny peptydów kolorymetrycznych (opcjonalnie) (1 h)

  1. Zawiesić próbki peptydów w 50 μl wody klasy LC-MS i pobrać 20 μl podwielokrotności w celu przeprowadzenia testu peptydowego.
    UWAGA: Ten etap zużywa dużą ilość próbki peptydu, ale może zapewnić dokładne określenie ilościowe stężenia peptydu przed analizą LC-MS. Zazwyczaj przeprowadza się to tylko raz na typ próbki w celu przeprowadzenia testów przed przygotowaniem próbki na dużą skalę.
  2. Przygotować seryjne rozcieńczenia roztworów wzorcowych peptydów (dostarczonych w zestawie do testów kolorymetrycznych) w wodzie klasy LC-MS. Przygotuj odczynnik roboczy, mieszając 50% odczynnika A, 48% odczynnika B i 2% odczynnika C.
  3. Przenieść 20 μl każdego roztworu wzorca peptydu (trzy kontrpróby) i nieznaną próbkę peptydu do 96-dołkowej mikropłytki. Dodać 180 μl odczynnika roboczego do każdego dołka, dobrze wymieszać i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odczytać absorbancję przy 480 nm w czytniku mikropłytek i określić ilościowo stężenia próbek peptydów na podstawie krzywej wzorcowej peptydu.

8. Analiza LC-MS

  1. Zawiesić próbki peptydów w buforze LC A (2% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego, klasa LC-MS). Wirować przy 16 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby pozbyć się ewentualnych cząstek stałych.
  2. Przenieść supernatant do fiolek LC-MS. Analizuj próbki za pomocą przyrządu nanoLC-MS.
    UWAGA: Szczegółowe parametry LC-MS/MS są zależne od instrumentu i zostały opisane wcześniej22,25,26.
  3. Wygeneruj niestandardową listę wykluczeń LC-MS z zakresem czasów retencji dla bardzo obfitych pików peptydów zanieczyszczeń, takich jak streptawidyna i trypsyna, z dokładnością masową 5 ppm22 (np. typowe piki peptydu streptawidyny to m/z 402.5435 [ładunek 3], m/z 603.3117 [ładunek 2], m/z 654.9733 [ładunek 3], m/z 678.6812 [ładunek 3], m/z 1017.5182 [ładunek 2], itd.; Typowe piki peptydu trypsyny to m/z 421.7584 [ładunek 2], m/z 523.2855 [ładunek 2] i m/z 737.7062 [ładunek 3]).

9. Analiza danych proteomicznych

  1. Analizuj surowe dane LC-MS za pomocą oprogramowania do analizy danych proteomicznych, takiego jak Proteome Discoverer, MaxQuant27 lub MS-Fragger28. Dołącz dwie biblioteki FASTA do analizy danych: 1) referencyjną bazę danych Swissprot Homo Sapiens; 2) nowo wygenerowaną uniwersalną bibliotekę FASTA (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), która, jak udowodniono, poprawia identyfikację proteomiki i zmniejsza liczbę fałszywych odkryć29.
  2. Skonfiguruj parametry analizy danych proteomicznych z odcięciem 1% współczynnika fałszywych odkryć (FDR) dla identyfikacji dopasowania spektralnego białek i peptydów (PSM). Wybierz trawienie trypsyny z maksymalnie trzema pominiętymi rozszczepieniami, stałą modyfikacją karbamidometylacji cysteiny oraz zmienną modyfikacją utleniania metioniny i N-końcowej acetylacji białek. Użyj intensywności pików peptydu MS1 do oznaczania ilościowego bez znaczników. Znormalizuj intensywność peptydów do endogennie biotynylowanej karboksylazy, karboksylazy propionylo-CoA (PCCA), aby zmniejszyć różnice w znakowaniu zbliżeniowym, jak opisano wcześniej22.
    UWAGA: Normalizację PCCA można wybrać w oprogramowaniu Proteome Discoverer, dołączając plik FASTA sekwencji białka PCCA. Alternatywnie, normalizację PCCA można przeprowadzić w dalszej analizie danych.
  3. Eksport wyników na poziomie białka z oprogramowania proteomicznego. Usuń białka zanieczyszczające przed analizą statystyczną29. Usuń białka przy zaledwie 1 PSM lub bez wyniku kwantyfikacji. Przeprowadź analizę ontologii genów białek (GO) za pomocą Enrichr30 i analizę sieci białek za pomocą STRING31.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie proteomiczne z etykietowaniem bliskości lizosomów zostało przeprowadzone na ludzkich neuronach pochodzących z iPSC, aby uchwycić dynamiczne mikrośrodowisko lizosomalne in situ w żywych neuronach. Morfologie komórek hiPSC i neuronów pochodzących z hiPSC w różnych punktach czasowych są zilustrowane w Rysunek 2A. Ludzkie iPSC rosną w koloniach na pożywce E8. Różnicowanie jest inicjowane przez posiew iPSC w pożywce indukcyjnej neuronów zawierającej doksycyklinę. Rozszerzenia neurytów s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Za pomocą sondy LAMP1-APEX białka na błonie lizosomalnej i w jej pobliżu są biotynylowane i wzbogacane. Biorąc pod uwagę typową średnicę lizosomów 100-1,200 nm, metoda ta zapewnia doskonałą rozdzielczość wewnątrzkomórkową przy promieniu znakowania 10-20 nm. LAMP1 jest obfitym lizosomalnym białkiem błonowym i klasycznym markerem lizosomów, służącym jako doskonałe białko przynęty do lizosomalnego znakowania APEX na endogennym poziomie ekspresji. Jednak istnieją również ograniczenia w przypadku stosowania LAMP1 do celowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane przez grant NIH (R01NS121608). A.M.F. dziękuje za stypendium ARCS-Metro Washington Chapter oraz Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Dziękujemy laboratorium Michaela Warda w Narodowym Instytucie Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) za wsparcie w zakresie biologii molekularnej i rozwój technologii i3Neuron.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% (w/v) roztwór saponinyAcros Organics419231000Mikroskopia fluorescencyjna
AccutaseLife TechnologiesA1110501roztwór do odrywania komórek, Suplement do hodowli komórkowych
B27Fisher Scientific17504044Cell Culture, Podłoże dla neuronów korowych
BDNFPeproTech450-02Hodowla komórkowa, podłoże
Kwas borowySigma-AldrichB6768Hodowla komórkowa, Bufor boranowy
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA8806Do sporządzania roztworów wzorcowych do pomiaru całkowitych stężeń białek
Pożywka neuronalna BrainphysSTEMCELL Technologies5790Hodowla komórkowa, pożywka dla neuronów korowych
CD45R (B220) Przeciwciało Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Mikroskopia fluorescencyjna
Chroman1 Inhibitor ROCKTocris716310Cell Culture
cOmplete mini inhibitor proteazyRoche4693123001inhibitor koktajlu w buforze do lizy
Zestaw do oznaczania białek DCBio-Rad5000112Do oznaczania całkowitych stężeń białek w lizacie komórkowym
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418Znakowanie zbliżeniowe Reakcja
DMEM/F12 podłoże ThermoFisher Scientific11320082Hodowla komórkowa, Powlekanie naczyń
Pożywka DMEM/F12 z HEPESThermo Fisher Scientific11330057Hodowla komórkowa, Pożywka indukcyjna
Surowica osłaSigma-AldrichD9663Mikroskopia fluorescencyjna
Hykulan doksycykliny, ≥ 98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GHodowla komórkowa, pożywka indukcyjna
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Suplement
Cell Culture Essential 8 (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Cell Culture
Zestaw kolektora próżniowego z płytką ekstrakcyjnąWodyWAT097944Do odsalania peptydów
Kwas mrówkowy (FA)Fisher ScientificA11750Do analizy LC-MS
GDNFPeproTech450-10Hodowla komórkowa, neuron korowy Medium Barwnik
HoechstThermo Fisher Scientific62239Mikroskopia fluorescencyjna
Metanol klasy HPLCFisher ScientificA452Do odsalania peptydów
Woda klasy HPLCFisher ScientificW5do peptydu odsalanie
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzysteCorriell InstituteGM25256Hodowla komórkowa
Nadtlenek wodoru, ACS, 29-32% w/w aq. soln., dźg.Thermo Fisher ScientificAA33323ADReakcja znakowania zbliżeniowego
Jodoacetamid (IAA)Millipore SigmaI6125do trawienia białek
LamininFisher Scientific23017015Hodowla komórkowa, neuron korowy Medium
Acetonitryl klasy LC-MSFisher ScientificA955Do analizy LC-MS
Woda klasy LC-MSFisher ScientificW64Do analizy LC-MS
L-glutaminaFisher Scientific25-030-081Hodowla komórkowa, pożywka indukcyjna
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552matryca błony podstawnej, Hodowla komórkowa, powlekanie naczyń
Mysz anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne LAMP1Badania rozwojowe Hybridoma Bankh4a3Mikroskopia fluorescencyjna
Suplement N-2 ( 100x)Fisher Scientific17-502-048Hodowla komórkowa, pożywka indukcyjna
Membrana nitrocelulozowa, wstępnie przycięta, 0,45 i mikro; m, 7 x 8,5 cmBio-Rad1620145Do przeprowadzania testu punktowego do miareczkowania kulek
Aminokwasy endogenne (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Hodowla komórkowa, pożywka indukcyjna
NT-3PeproTech450-03Hodowla komórkowa, kora mózgowa Neuron Medium
Oasis HLB 96-dołkowa płytka ekstrakcyjna do fazy stałejWody186000309Do odsalania peptydów
Bufor blokujący Odyssey (TBS)LI-COR Biosciences927-50000Do przeprowadzania testu punktowego do miareczkowania kulek
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15710Mikroskopia fluorescencyjna
Fenol Biotyna (1,000x magazyn)Adipogen41994-02-9Znakowanie zbliżeniowe Reakcja
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezuGibco10010049Hodowla komórkowa, reakcja znakowania zbliżeniowego, mikroskopia fluorescencyjna
Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowyThermo Fisher23275Test stężenia peptydów
Poli-L-ornityna (PLO)Milipor SigmaP3655Hodowla komórkowa, powlekanie naczyń
Askorbinian soduSigma-AldrichA4034Znakowanie bliskości Bufor hartowniczy, Bufor do lizy
Sód azydekSigma-AldrichS8032Bufor do znakowania zbliżeniowego, Bufor do lizy, Mikroskopia fluorescencyjna
Chlorek soduThermo Fisher ScientificS271500Hodowla komórkowa, Bufor boranowy
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Bufor do oznaczania kropek, Bufor do płukania kulek
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich415413Hodowla komórkowa, bufor boranowy
Tetraboran soduSigma-Aldrich221732Hodowla komórkowa, bufor boranowy
Koncentratorpróżniowy
Streptawidyna Magnetyczne kulki sefarozyCytiva (formalne GE)28-9857-99Wzbogacenie biotynylowanych białek
Streptawidyna, Alexa Fluor 680 SprzężonyThermo Fisher ScientificS32358Do przeprowadzenia testu punktowego do miareczkowania kulek
Mieszalnik termomieszalnikkontrolowaną temperaturą
Kwas trifluooctowy (TFA)Millipore Sigma302031do odsalania peptydów
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Millipore SigmaC4706do trawienia białek
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Bufor do lizy, Bufor do oznaczania plam punktowych, Bufor do płukania kulek
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Bufor do płukania kulek
TROLOXSigma-Aldrich648471Bufor do znakowania bliskościowego, Bufor do lizy
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5073do trawienia białek
TWEEN  20miliporów SigmaP1379Bufor do oznaczania plam punktowych
MocznikThermo Fisher ScientificBP169500Bufor do mycia i trawienia na kulkach
VitronectinSTEMCELL Technologies7180Hodowla komórkowa, powlekanie naczyń
Y-27632 Inhibitor ROCKSelleckS1049Hodowla komórkowa
dla neuronów korowychBufor do lizy , SpeedVac z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635(2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza proteomicznalizosomy neuronalneneurony pochodz ce z iPSCbia ka b ony lizosomalnejwzbogacanie bia ek biotynilowanychanaliza LC MSmikroskopia fluorescencyjnatrawienie na koralikach

Powiązane artykuły